人源化肝癌单抗、制备方法及其应用的制作方法

文档序号:594685阅读:400来源:国知局
专利名称:人源化肝癌单抗、制备方法及其应用的制作方法
技术领域
本发明涉及单克隆抗体(简称单抗)领域,尤其是关于人源化肝癌单抗、制备方法及其在临床治疗上的应用。
抗体是由浆细胞分泌的,浆细胞又是由B淋巴细胞转化而来的,每个淋巴细胞株制造它的专有抗体,每株细胞系只能产生一种它专有的、针对一种它能识别的特异性抗原决定族的抗体。这种从一株单一细胞系产生的抗体就叫单克隆抗体(以下简称单抗)。
如所周知,尽管几十年来,人们对肿瘤的认识已有不少重要的突破,可是,手术,放射治疗,化学药物治疗为核心的现代治疗手段,至今还只能挽救少数恶性肿瘤患者的生命。肿瘤的治疗学进展得如此艰难,其原因是多方面的。不少肿瘤由于其部位过于险恶,或由于其已扩散到致命的部位,在发现时已失去了任何手术的可能。
放射治疗对某些局限性的肿瘤病灶非常有效,但并非对所有的恶性肿瘤均敏感,此外,对转移病灶,一般说来放射治疗是无效的。而今天的化学药物治疗至多还只是一种或可缓解病情的辅助手段。即使放射治疗和化学药物治疗今后在疗效上会有进步,也很难说它们是一类理想的治疗方法,因为这类方法无选择地作用于恶性肿瘤细胞和正常细胞,所导致的副作用往往为患者所不能忍受。
因此,很自然地想要寻找一种能选择性杀死恶性肿瘤细胞而对正常细胞无毒害的全新的治疗肿瘤的途径,这种途径,即所谓肿瘤的导向治疗(TargetedTherapy)。由于没有理想的导向载体,长时间以来,导向药物的研究一直进展得十分缓慢。
1975年,1975年Koehler和Milstein用杂交瘤技术制备了世界上第一个鼠源单克隆抗体,为生物技术打开了一个全新的领域,随着生物技术的发展,单克隆抗体技术也有了很大的发展,各种整分子的、小分子的、鸡尾酒的、双功能的以至抗独特性的单克隆抗体均陆续问世;各种单克隆抗体有各种不同的用途,治疗药用的、诊断药用的、分析用的、纯化用的、检验用的等。1985年中科院细胞所谢弘、姚 等研制成功抗人肝癌单克隆抗体Hepama-11(实验生物学报,Vol.18,p 263-270),这是国际上最早报道的肝癌的鼠源单克隆抗体之一。单克隆抗体技术的出现和发展激励了不少人再去探索导向治疗的可行性,重新去寻找本世纪初德国人Paul Ehrlich提出的的“魔弹(magic bullet)”的旧梦。经过十多年的探索和努力,作为生物反应调节治疗(Biological Response Modulizer)的一种重要的内容,导向抗肿瘤药物已成为一百多年来肿瘤免疫学最引人注目的进展之一。
经过二十多年的努力,人们已制备成功多种肿瘤单克隆抗体,作为体外或体内的诊断试剂、或作为体内的治疗药物用于临床实践。其中,作为体内治疗药物的肿瘤单克隆抗体,如抗乳腺癌单抗、抗卵巢癌单抗、抗B淋巴细胞白血病单抗等还刚刚开始用于临床。我国在抗肝癌单抗、抗胃癌单抗等方面的研究也有很大的成功,但迄今为止,我国所研制的肿瘤单克隆抗体绝大部分均为鼠源性的,鼠源性单抗由于不能长期反复注射,其临床应用受到了严重的限制,随着体内治疗药物的单抗日益受到临床重视,人源化单抗的研制势在必行。
本发明人经过多年努力,终于研制成了一种人源化肝癌单抗(命名为rGD-A)并试用于临床,获得了初步成功。
本发明的目的是提供一类人源化的抗人肝癌单克隆抗体,该种单克隆抗体是基因工程产物,可用于识别肝癌细胞,也可作为治疗原发性肝细胞肝癌的单克隆抗体药物的原料。
本发明的人源化的抗人肝癌单克隆抗体是指Fc片段完全人源化而Fab片段能识别人肝癌相关抗原的单克隆抗体。
这一类人源化的抗人肝癌单克隆抗体可以用蛋白A亲和柱纯化,HAMA(人抗鼠抗体)血清反应测定阴性,体外结合活性试验表明rGD-A只保留与人肝癌细胞和组织的结合功能,而与其它的人肿瘤细胞和正常组织没有交叉结合。竞争结合试验表明rGD-A的相对结合活性为对应鼠源抗体结合活性的50%。
rGD-A的制备过程1.对应鼠源肝癌单抗GD-A,系由中科院细胞所生物治疗组制备2.细胞培养肝细胞肝癌细胞系SMMC-7721(中国上海细胞所)和中国仓鼠卵巢细胞系CHO-K1(ATCC CCL 61)分别用RPMI 1640(Gibco)和F12 Ham’s培养液培养,两种培养液都添加10%胎牛血清(Gibco),5%抗生素和抗真菌的溶液(Gibco)和2mM/L谷氨酰胺(Gibco),在37度,5%CO2,无菌条件下培养。
3.抗体人源化基于与鼠的序列相似性,人框架组织亚群的kappa链(VK)可变区亚群I和重链可变区(VH)亚群II被选用于抗体人源化(14)。不保留kappa链低危位点42、83和106,但保留对应鼠源单抗的与结合有关位置的框架组织残基并人源化(12)。6个GD-A CDRs被嫁接到rGD-A可变区,根据抗体基因表达中最常用的密码子,rGD-A可变区的完整的氨基酸序列转变成DNA序列(14)。NheI位点位于VH的3’末端(GCTAGC),另一个限制性位点,hindIII,则被引入5’末端,以便于克隆至哺乳动物细胞的表达载体。此外,通过改变密码子的用法,一些内部的限制性位点,如KpnI(GGTACC)和XbaI(TCTAGA)也被引入人源化的框架DNA序列中。
4.表达载体的构建人源kappa链和重链的不同区域的DNA片断的合成使用六段长的重叠合成DNA寡聚核苷酸,通过重叠PCR方法即可。六段重叠的寡聚核苷酸分两步组建而成。第一步,六段寡聚核苷酸(5pmole)的每一段都在50μl的反应混合液中退火和延伸。第二步,设计每一段的寡聚核苷酸引物(50pmole)在不同片断的5’和3’端进行杂交。人类恒变区域的cDNA片断可使用变性的引物通过PCR法克隆制得重链恒变区。重链载体(pHeavy)的构建首先用hindIII/NheI和NheI/XhoI分别消化人的可变区DNA片断和人重链不变区cDNA片断,然后连接成一个hindIII/XhoI消化的载体,pSectag2B/Hygro(Invitrogen);kappa链载体(pKappa)的构建用hindIII酶消化人源化的可变区DNA片断,人不变区cDNA片断先5’磷酸化和用XhoI酶消化,然后连接成一个hindIII/XhoI消化的载体,pSectag2B(Invitrogen)。纯化的质粒DNA进行转染和测序,可变区的测序结果与设计的hHP-1 DNA序列比较,共转染至哺乳动物细胞之前,不同的克隆之间通过交换DNA限制片断纠正点突变和缺失。
5.抗体在CHO-K1细胞系中表达两种表达载体(0.75μg pHeavy和0.75μg pKappa)和杂交瘤-SFM(Gibco)中5μl lipofectamine转染至中国仓鼠卵巢CHO-K1细胞(ATCC)中,为了选择稳定的转化子,转染48小时后添加含有250μg/ml潮霉素B的选择培养液,选择致密集落并通过夹心ELISA法筛选分泌hHp-1的抗性克隆的上清,选择分泌抗体达最高水平的抗性克隆,用无血清CHO-S-SFM培养液(Gibco)制备抗体,培养3天后收集上清,用旦白A亲和层析法纯化hHp-1。离心过滤大约500ml混合的细胞上清,用1MTris-HCL(pH8.0)平衡,处理过的上清上样,用旦白A柱纯化,纯化的抗体在PBS溶液中保存在-20℃,或加1%牛血清白旦白和0.02%NaN3(Sigma)保存在4℃。以已知浓度的人抗体IgG1kappa(Sigma)为标准,通过ELISA试验,用两倍系列稀释的纯化的抗体测定浓度,用标准数据作图,校准回归线的斜率和Y-截距用相关系数不少于0.99来计算,hHP-1样品的数据点在标准曲线范围内,用于计算抗体浓度,抗体样品的纯度和亚单位(重链和kappa链)的大小,分别在还原和非还原条件下,用SDS-PAGE分析。
6.rGD-A的鉴定用免疫荧光染色试验证实rGD-A与SMMC细胞的特异性结合,SMMC细胞先与抗体rGD-A和GD-A反应,随后与FITC偶合的二抗反应,在荧光显微镜下观察染色切片。通过间接ELISA法测定rGD-A的结合活性,在96孔ELISA板(Coring)中培养SMMC-7721细胞并用2%多聚甲醛(Sigma)固定,用5μg/ml的正常人体组织样品(Clontech)包被在ELISA板上,1%BSA封闭后,加各种浓度(0-20μg/ml)的rGD-A和非特异的人IgG kappa抗体(Sigma),用HRP标记的鼠抗人IgG单克隆抗体(Pharmingen)检测结合的抗体,人组织样品的成功包被是用鼠抗人的心肌钙旦白I单克隆抗体(HyTest)针对心组织样品。对SMMC-7721细胞,有rGD-A,非特异的人IgG1 kappa抗体(Sigma)和非标记的GD-A抗体三种抗体与生物素标记的GD-A(biotin-GD-A)竞争,接种SMMC细胞,用2%甲醛固定和1%BSA封闭,加各种浓度(0-20μg/ml)的竞争抗体样品,随后加5μg/ml的生物素-GD-A,用抗生旦白链菌素-HRP(Pharmingen)检测生物素-GD-A与SMMC细胞的结合。
对于HAMA血清反应试验,三种液相抗体样品(GD-A,rGD-A和人IgGkappa)和固相GD-A竞争与人抗鼠抗体的结合,在ELISA板上先包被5μg/ml的GD-A然后加含有HAMA血清(Type 2SQ,Boehringer,Mannheim)和各种浓度的抗体样品(0-0.5μg/ml)的血清/抗体混合液,随后加2.5μg/ml生物素交联的鼠抗人IgG1单克隆抗体和抗生旦白链菌素-HRP,检测HAMA血清中的人抗鼠IgG抗体和固相GD-A的结合。上述提及的三种试验,都用0.1M碳酸盐缓冲液(pH9.2)包被旦白,结合和检测的温育步骤都是每孔50μl,室温1小时,用封闭液(PBS中1%牛血清白旦白)稀释所有的血清和抗体样品,每步之间用PBS洗板六次,检测之后,加OPO底物溶液(Sigma)显色,吸收光线在450nm。
本发明系一类人源化的抗人肝癌单克隆抗体,下面以人源化的抗人肝癌单克隆抗体rGD-A的制得为实施例,进一步阐明本发明,但并不限制本发明的范围。
实施例1鼠源抗体GD-A的人源化1.在人框架组织亚群的VH框架组织亚群II和VK框架亚群I被用于人源化过程。
2.携带13个鼠氨基酸残基的VK框架组织与人kappa链框架组织亚群I有84%(67/80)相似,携带16个鼠氨基酸残基的人源化重链框架组织与人重链框架组织亚群II有84%(81/97)的相似,所以人源化以后,鼠框架组织和人框架组织之间的重链和kappa链的相似性增加到84%。在人源化抗体设计中,从抗体序列数据库中得到29个保存的鼠残基(16个来自重链,13个来自kappa链)的发生频率,29个保存的鼠残基中,发现其中8个(VH27,VH73,VH76,VH82,VH82a,VH82c,VK3和VK4)保存在其他人框架组织亚群中,10个(VH6,VH48,VH67,VH71,VH78,VK43,VK70,VK78,VK100和VK104)在人的发生频率不低于10%。在检查数据库中包含有的抗体序列时,一种含有24个残基的人重链框架组织序列与已发现的人重链框架组织序列不同,对于kappa链,有40种完整的或几乎完整的人kappa链框架组织序列,其中4种显示有13个以上的残基与人kappa链框架组织序列不同,与rGD-A框架序列比较,rGD-A只有16个重链残基和13个kappa链残基与人框架序列不同,rGD-A与人框架有更高的序列同源性。
实施例2人源化抗体rGD-A的表达1.为了筛选含有人IgG不变区亚类I的重链表达载体,来自4个独立克隆的重链区用序列引物测序,通过把测序结果与不同的人IgG亚类保存的人绞链序列比较,进一步证实了重链不变区的亚类。
2.人化的IgG1重链和人化的kappa链DNA片断以及从人脾cDNA克隆得到的两个不变区在共转染前测序,然而,通过PCR重叠合成的可变区,从4个独立的kappa链克隆中得到的1114对碱基中发现有5处突变,从7个独立的重链克隆中得到的1988对碱基中发现有22处突变,除了错配和缺失外,突变位置没有均匀分布,并且在重链可变区的中间部分(H165-H200)发现有突变的“热点”领域。
3.表达载体的序列设计的所有突变都通过限制片断重组纠正,而且重链和kappa链表达载体都共转染至CHO-K1细胞中,用潮霉素B选择稳定的转染子,通过夹心ELISA法为人IgG kappa抗体分泌筛选抗性克隆,阴性对照的ELISA读数与本底相似,在选择的68个抗性克隆中,7%(5/68)显示高水平抗体分泌(0D450>8×本底),显示最高表达水平(ELISA读数×16>本底水平)的克隆用于制备rGD-A抗体。纯化的rGD-A进行SDS-PAGE电泳证明样品的纯度,一条带显示测得的完整的rGD-A分子的大小,当加入β-硫基乙醇(Sigma)时,重链和kappa链的分子量分别为50kDa和25kDa与人IgG kappa抗体相似。rGD-A抗体样品通过夹心ELISA法定量,用已知浓度的人IgG kappa抗体样品作标准进行校准,表达水平为从1升培养3天的上清中得到约100μg分泌的rGD-A。
实施例3人源化抗体rGD-A的生物学性质鉴定1.免疫荧光染色试验当同样浓度的rGD-A和鼠GD-A分别与SMMC细胞反应,都可以观察到荧光显像,只是rGD-A的荧光信号明显更强。通过间接ELISA法检测rGD-A与SMMC-7721细胞系的结合活性,没有任何明确的结合特性的人IgG1 kappa抗体用作阴性对照,随着抗体浓度增加,rGD-A结合吸光率增加,阴性对照没有明显变化。
2.竞争试验用于检测rGD-A是否有与最初的GD-A的抗原结合的能力,比较人源化过程前后的相对的结合亲和力的变化,为了证明竞争的水平,构建了结合抑制曲线,只加生物素-GD-A(如没有任何竞争者)得到的ELISA读数作为无抑制100%抑制的读数为不含生物素-GD-A的孔的本底读数,结果表明rGD-A和GD-A抗体和生物素-GD-A竞争与SMMC细胞的结合,而且随着竞争抗体浓度增加,结合抑制水平也增加,为了与生物素-GD-A竞争,rGD-A抗体需要约比GD-A高四倍的浓度,结果提示rGD-A抗体的亲和力为GD-A的30%。
实施例4人源化抗体rGD-A的专一性间接免疫荧光法组织名称N1 N2P1 P2样品1样品2 样品3大脑- - + + - - -小脑- - + + - - -坐骨神经- - + + - - -肺 - - + + - - -肝 - - + + - - -肾 - - + + - - -膀胱- - + + - - -脾 - - + + - - -胃 - - + + - - -肠 - - + + - - -胰腺- - + + - - -甲状腺 - - + + - - -肾上腺 - - + + - - -心 - - + + - - -横纹肌 - - + + - - -睾丸- - + + - - -皮肤- - + + - - -肝癌- - + + + + ++N1,N2分别为第一和第二阴性对照N1相同浓度的人IgG作为第一抗体,以排除因非特异性吸附所致的假阳性。
N2缓冲液代替第一抗体,以排除溶媒成分所致的假阳性。
P1,P2分别为第一和第二阳性对照P1小鼠抗人肝癌细胞膜全血清(1∶5稀释)作为第一抗体,以检查抗原的活性。
P2人肝癌细胞BEL-7402作为抗原,以检查待检抗体的活性。
权利要求
1.一类人源化肝癌单克隆抗体,其特征在于其Fc片段完全人源化而Fab片段能识别人肝癌相关抗原的单克隆抗体。
2.如权利要求1所述的肝癌人源化单克隆抗体,其特征在于可以用蛋白A亲和柱纯化,HAMA(人抗鼠抗体)血清反应测定阴性,体外结合活性试验表明这类单抗对人肝癌细胞和组织具有高度的专一性,而与其它的人肿瘤细胞和正常组织没有交叉结合。其相对结合活性为对应鼠源抗体结合活性的25-100%。
3.如权利要求1所述的肝癌人源化单克隆抗体,其特征在于所述肝癌人源单克隆抗体包括整分子及构成整分子的小分子片段。
4.如权利要求1所述的肝癌人源化单克隆抗体的制备方法,其特征在于以基因工程技术为基本手段,即以对应鼠源单克隆抗体可变区的氨基酸顺序为构建模板,在合成人源kappa链和重链的不同区域的DNA片断的基础上,分别构建重链和kappa链的表达载体,再在适当的载体细胞中表达。
5.如权利要求1所述的肝癌人源化单克隆抗体的应用,其特征在于所述单抗可用于识别肝癌细胞,也可作为治疗原发性肝细胞肝癌的单克隆抗体药物的原料。
全文摘要
本发明提供了一类人源化肝癌单克隆抗体,其特征在于其Fc片段完全人源化而Fab片段能识别人肝癌相关抗原的单克隆抗体。当然,其生物化学及免疫学特性也完全符合作为一类针对肝癌的单克隆抗体的基本要求,其涵盖范围包括整分子及构成整分子的小分子片段。这是一种用基因工程技术制备的新的抗体分子,可用于识别肝癌细胞,也可作为治疗原发性肝细胞肝癌的单克隆抗体药物的原料。
文档编号C12N15/12GK1385443SQ0111287
公开日2002年12月18日 申请日期2001年5月11日 优先权日2001年5月11日
发明者谢弘, 谢雍, 来文, 王根凤, 陈中健, 王放 申请人:中国科学院上海细胞生物学研究所
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