专利名称：人源性肝细胞生长刺激因子cDNA克隆和序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及人源性肝细胞生长刺激因子cDNA克隆和序列。
自1975年LabrecgueDR首次分离到肝脏刺激因子以来，近20多年的研究中发现了多种有促肝细胞生长因子(PHGF)、如肝脏刺激生长因子(HSS)及肝再生增强因子(ALR)等促肝细胞生长的物质。我国学者苏先狮等人从乳猪肝组织中抽提得到的肝细胞DNA合成刺激因子(HDSSF)被证实有很强的刺激受损肝细胞增殖作用。已经用于治疗严重肝炎，并在临床应用中表现出很好的降低谷丙转氨酶、胆红素、球蛋白(G)、升高血浆白蛋白(A)，改善A/G比值功效，并测出了部分氨基酸序列。为了证明该物质的本质及探讨人源性HDSSF，根据同源克隆的原则，合成简并引物，通过cDNA文库筛选，获得单个克隆，完成了编码区核苷酸全部序列。
本发明的目的就是提供人源性HDSSF cDNA克隆序列。
本发明采用从乳猪肝组织中纯化的肝脏刺激物质的部分氨基酸序列，合成简并引物，依据同源克隆的原则，利用简并PCR技术从人胎肝cDNA文库扩增出目的片断，并以此为探针进行核酸杂交筛选人胎肝cDNA文库，从而获得目的基因，其cDNA链为792bp，含有594bp的完整开放续码框架和5’及3’末端非编码序列，该序列显示HDSSF为一个含有198个氨基酸残基。测出的序列是一种不同于其他因子的物质AAAAGCTGTA GTGGGTTTGT AGCCAGGATG ACAGCGGTACCTTAACACAG TCCCAACAAC ATACACATCC TCTTTTGTCGGCCTAGGATA TGTTTCCCAG GAAGCATGTG GAATGTCTGGTAAATTAATA CAACTATTGG GCTCACAAGC AGGAGGAGAAGGATTCCATT TGCTATCAGC ATCACAATGA ATTACACTGCTGCCTCTGAG AACAAAACC TTTTTGGCAC TTAAACACAATAGTGTCTTT GTAATTATAG ATGGGTCCAA ATCCAGAGACCATTTCCCCA TGTGAAACAT CTGGCTTGCG ACAGGTGATTTTTTCACAGG TAGGAGGGCTT GGTCTCCAAA CGCCTATTGTTTCATTCTCC ACAGTGCAAG AAATGGAGGC ATGGCCCAAGAGTGAGAAGC GGGGGTCACA GCTGTAGGTG ACAGAAAAGCCGTATGCGTA GAAATTTTCT TCACCGCTGT GCCTTCCATTCCTGATGTCT GGAGGAGGCT TACACTTGAC AATTTCACATTGTGGGAGAG GATGACTCCA GCCAACTCCT CTATCTTGGACTTCACAACG ACTAGTGGTT GAGCCAATTA AGAAAAA
图1为人HDSSF基因核苷酸序列图。
人HDSSF基因核苷酸序列分析结果见附图1。
本发明是通过以下方法获得的1.质检、宿主菌及人胎肝cDNA文库pGEM-T easy vector及E.coli JM109购自Promage公司；人胎肝cDNA文库购自sigma公司。
2.尼龙膜购自美国杜邦公司。
3.简并引物设计根据原测定的乳猪肝抽提物HDSSF，N末端氨基酸部分序列设计上游简并引物5’-GANGANAANTCNTTNAANTGGAANGC-3’，并依据mRNA的特性，确定其下游引物。
4.HDSSF探针制备以cDNA文库为模板进行PCR扩增。反应完成后以1％琼脂糖凝胶电泳，检查有无目的条带。
5.探针的回收与标记由于HDSSF的分子量为21000道尔顿，估计其读码框为600bp左右，因此在凝胶上切下600bp条带回收，按试剂盒方案以地高辛标记探针。
6.人胎肝cDNA文库的筛选购买的cDNA文库经滴度测定后，取100个重组子λgt10进行文库初筛。挑取初筛得到的噬斑在90mm培养皿上种板扩增复筛，挑取单克隆噬斑。PCR增扩HDSSF目的基因以λgt10插入位点两端序列为引物primer15’-CTTTTGAGCAAGTTCAGCCTG GTTAAGT-3’；primer25’-GAGGTGGCTTATGAGTA TTTCTTC CAGGGTA-3’。获得900bp左右条带，这一核苷酸即λgt10文库插入的HDSSF目的基因，它包括两条引物至酶切位点EcorRI的部分λgt10序列和HDSSF全序列。
7.HDSSF核苷酸序列分析在ABI pRISMTM377XL DNA测序仪上以末端终止法进行HDSSF核苷酸序列测定。
根据从乳猪肝组织抽提纯化的生化产品HDSSF的生物学活性可以推测人源性HDSSF将在人体肝脏中发挥更好的肝细胞增殖作用，人源性HDSSF基因克隆成功，为下一步开展人源性HDSSF的重组产品研制和生物学研究以及生产基因产品奠定了决定性的基础。
权利要求
1.一种人源性肝细胞生长刺激因子cDNA克隆和序列，其特征在于采用从乳猪肝组织中纯化的肝脏刺激物质HDSSF测定的部分氨基酸序列，合成简并引物，依据同源克隆的原则，利用简并PCR技术从人胎肝cDNA文库扩增出目的片断，并以此为探针进行核酸杂交筛选人胎肝cDNA文库，从而获得目的基因HDSSF克隆，其cDNA链为792bp，含有594bp的完整开放续码框架和5’及3’末端非编码序列，该序列显示HDSSF为一个含有198个氨基酸残基的促肝细胞生长因子，HDSSF核苷酸序列在ABI PRISMTM377XL DNA测序仪上以末端终止法进行HDSSF核苷酸序列测定，该序列为AAAAGCTGTA GTGGGTTTGT AGCCAGGATG ACAGCGGTACCTTAACACAG TCCCAACAAC ATACACATCC TCTTTTGTCGGCCTAGGATA TGTTTCCCAG GAAGCATGTG GAATGTCTGGTAAATTAATA CAACTATTGG GCTCACAAGC AGGAGGAGAAGGATTCCATT TGCTATCAGC ATCACAATGA ATTACACTGCTGCCTCTGAG AACAAAACC TTTTTGGCAC TTAAACACAATAGTGTCTTT GTAATTATAG ATGGGTCCAA ATCCAGAGACCATTTCCCCA TGTGAAACAT CTGGCTTGCG ACAGGTGATTTTTTCACAGG TAGGAGGGCTT GGTCTCCAAA CGCCTATTGTTTCATTCTCC ACAGTGCAAG AAATGGAGGC ATGGCCCAAGAGTGAGAAGC GGGGGTCACA GCTGTAGGTG ACAGAAAAGCCGTATGCGTA GAAATTTTCT TCACCGCTGT GCCTTCCATTCCTGATGTCT GGAGGAGGCT TACACTTGAC AATTTCACATTGTGGGAGAG GATGACTCCA GCCAACTCCT CTATCTTGGACTTCACAACG ACTAGTGGTT GAGCCAATTA AGAAAAA
2.一种人源性肝细胞生长刺激因子cDNA克隆方法，其特征在于①质检、宿主菌及人胎肝cDNA文库pGEM-T easy vector及E.colj JM109购自Promage公司；人胎肝cDNA文库购自sigma公司。②.尼龙膜购自美国杜邦公司。③.简并引物设计根据原测定的乳猪肝抽提物HDSSFN末端氨基酸部分序列设计上游简并引物5’-GANGANAANTCNTTNAANTGGAANGC-3’，并依据mRNA的特性，确定其下游引物。④.HDSSF探针设备以cDNA文库为模板进行简并PCR扩增。反应完成后以1％琼脂糖凝胶电泳，检查有无目的条带。⑤.探针的回收与标记由于HDSSF的分子量为21000道尔顿，估计其读码框为600bp左右，因此在凝胶上切下600bp条带回收，按试剂盒方案以地高辛标记探针。⑥.人胎肝cDNA文库的筛选购买的cDNA文库经滴度测定后，取100个重组子λgt10进行文库初筛。挑取初筛得到的噬斑在900mm培养皿上种板扩增复筛，挑取单克隆噬斑。PCR增扩HDSSF目的基因以λgt10插入位点两端序列为引物primer15’-CTTTTGAGCAAGTTCAGCCTG GTTAAGT-3’；primer25’-GAGGTGGCTTATGAGTA TTTCTTC CAGGGTA-3’。获得900bp左右条带，这一核苷酸即λgt10文库插入的HDSSF目的基因，它包括两条引物至酶切位点EcorRI的部分λgt10序列和HDSSF全序列。
全文摘要
本发明公开了利用简并PCR技术从人胎肝cDNA文库扩增出目的片断,并以此为探针进行核苷酸杂交筛选人胎肝cDNA文库,成功获得目的基因HDSSF克隆,其cDNA链为792bp,含有594bp的完整开放续码框架和5’及3’末端非编码区序列。本发展为下一步开展人源性HDSSF的重组产品研制和生产该基因产品奠定了基础。
文档编号C12N15/12GK1386857SQ01114478
公开日2002年12月25日 申请日期2001年5月23日 优先权日2001年5月23日
发明者苏先狮, 唐世刚 申请人:苏先狮