专利名称：一种根瘤菌浓缩液体菌剂的制备方法
技术领域：
本发明属于农业微生物根瘤菌制剂领域。
传统的微生物活菌制剂主要采用液体与固体两种剂型。液体剂型直接采用发酵培养液，虽然生产工艺简单、使用方便，但有效期较短，运输成本较高。固体菌剂在用离心或扳框过滤法分离微生物细胞的基础上添加适量塑性剂后加工成粉剂、片剂或胶囊剂。该剂型适用于芽胞杆菌、霉菌和酵母等活菌制剂，具有保存期较长、运输和使用方便等优点，但生产工艺复杂，成本较高。
经检索仅在国内找到5个与本申请有关的专利申请，在中国专利88105821“苏云金杆菌颗粒混剂”发明专利中，发明者将苏云金杆菌(Bacillus thuringensis)发酵液浓缩后吸附在20-40目的河砂上，再与化学农药颗粒剂混合成杀虫剂(朱邦雄1988)。在中国专利90108094“含乳糖酶干酵母制剂的制备方法”中，发明者将产乳糖酶8的活酵母冰冻干燥后，将半透性和疏水性材料通过低温喷雾蒸发将含酶酵母包膜成粒，再压片包衣成药用微生物酶制剂(邵靖宇等，1990)。在中国专利97117033“沼泽红假单胞菌(Rhodopseudmonas palustris)制剂的制备方法及用途”中，提出了直接采用该菌的液体厌氧培养物为接种剂应用的技术，没有对发酵培养液作进一步的加工处理(李诗洪和牟玉清等，1993)。在中国专利93101239“兽医微生物制剂的制备方法及用途”中，发明者将蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)工业发酵培养物高速离心沉淀后添加无水淀粉制成的粉剂或片剂，主要用于幼年家禽下痢的生物防治。在中国专利97117033“一种枯草芽胞杆菌活菌制剂及其制做方法”系将枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)培养物与无水碳酸钙制备的原菌粉加入一定比例的乳糖和可溶性淀粉后制成粉剂或胶囊制剂，用于消化不良、肠炎和腹泻等的治疗(魏涛和王焕芹，1997)。国内外根瘤菌、固氮菌和钾细菌等微生物活菌制剂亦长期以来主要采用液体和固体两种剂型。液体剂型生产工艺简单、使用方便，但有效期短。固体剂型主要以草炭、蛭石和珍珠岩等为吸附剂，生产工艺复杂、劳动强度大、生产成本较高，但有效期较长。
本发明的目在于克服现有技术之不足，提出一种根瘤菌浓缩液体菌剂的制备方法，使根瘤菌菌剂具有活菌数高、保存期长、生产工艺简单等优点，本发明还适用于以活菌为产品的多种微生物制剂的生产。
本发明通过以下技术方案实施(1)根瘤菌的液体深层通气培养根瘤菌用一种编号为YMA的的甘露醇酵母汁培养基，在培养温度为28-30℃下经斜面菌种培养、液体三角瓶振荡培养、种子罐液体深层通气培养和发酵罐液体深层通气培养并经涂片作革兰氏染色镜检无杂菌污染后即得到合格的根瘤菌工业发酵培养液。(2)根瘤菌培养细胞的离心浓缩、洗涤与再悬浮上述发酵培养液经4℃，5000rpm，20分钟离心后弃上清，按重量加入20倍量无菌水再悬浮洗涤后，依上法再离心并弃去上清液，按重量加入2倍量的无菌生理盐水后制成菌悬液。(3)浓缩细胞液的分装、抽真空与充氮气上述浓缩细胞液按每瓶1-3ml分装灭菌的青霉素小瓶，压铝盖密封后抽真空，并再充以氮气即制成精制浓缩液体根瘤菌剂。
根瘤菌菌剂斜面菌种培养基配比为以下成分(1)甘露醇酵母汁培养基(YMA)配方以下为液体配方，通气培养时另加1ml甘油聚醚，配固体培养基时另加琼脂粉20.0g，其成分包括甘露醇10.0g；酵母粉0.5g；MgSO4·7H2O 0.2g；K2HPO40.5g；NaCl0.1g；CaCl2·6H2O0.1g；根瘤菌微量元素液*4.0ml，加水至1000ml，pH调制6.8-7.0
根瘤菌微量元素液配方(按重量计)H3BO35.0g；Na2MoO45.0g；水1000ml)所述的斜面菌种培养步骤包括将费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)转接于YMA斜面，保温培养后经肉眼与革兰氏染色镜检合格后进入下一步工艺。
所述的三角瓶振荡培养步骤包括取一环斜面培养物按无菌操作法转接于装量为150ml/250ml的三角瓶培养液，经200rpm振荡培养48小时并镜检合格后进入。
所述的种子罐深层通气培养步骤包括将2-3瓶合格的三角瓶培养液合并至500ml三角瓶中，按无菌操作法接入已灭菌冷却的装量为35L的种子罐培养液中，通气培养36小时经取样镜检合格后用于下一步接种。
所述的发酵罐深层通气培养步骤包括用移罐法经转种管将培养液从种子罐移至已灭菌冷却的500L发酵罐培养液中，通气培养20-24小时，经取样镜检合格后放罐。
所述的离心与洗涤方法步骤包括发酵罐经4℃，5000rpm，20分钟离心后弃上清，按沉淀重加入20倍重量的无菌水再悬浮后，依前法作第二次离心，沉淀用2倍量的0.85％NaCl溶液的无菌生理盐水再悬浮备用。
所述的菌剂的分装、压盖、抽真空与灌氮气的步骤包括上述浓缩溶液按每小瓶1-3ml分装青霉素小瓶，压盖后抽真空，再重新灌入氮气。即制成精制浓缩液体根瘤菌剂。4、浓缩液体菌剂的质量标准、储存、运输与使用方法4.1质量标准活菌数＞500亿个/ml；杂菌率＜5％；有效期在4℃下保存6个月。
4.2储存与运输；均在4℃下进行。
4.3使用方法浓缩液体菌体每1ml可供一亩豆科植物接种用。用前用适量清水将菌剂稀释后拌种，在荫处干燥后即可播种。
本发明的效果本发明与常规根瘤菌剂型相比较的效果如表1所示。
表1本发明的浓缩液体剂型与常规根瘤菌剂型的比较常规剂型 浓缩液体剂型序号 比较项目液体 固体 (本发明)1单位细胞总数 较低 低 高2单位活细胞数 较低 低 高3有效期 1个月 6个月 6个月4生产成本 低 高 低5劳动强度 低 高 低6自动化程度 较高 低 高7运输成本 高 高 低8菌剂质量 难保证 较低高实施例费氏中华根瘤菌浓缩液体菌剂的制备1.培养基与培养条件1.1甘露醇酵母汁培养基(YMA)配方以下为液体配方，通气培养时另加1ml甘油聚醚，配固体培养基时另加琼脂粉20.0g，其成分如下甘露醇10.0g；酵母粉0.5g；MgSO4·7H2O，0.2g；K2HPO40.5g；NaCl0.1g；CaCl2·6H2O0.1g；根瘤菌微量元素液*4.0ml；加水至1000ml；pH值调制为6.8-7.0。
根瘤菌制剂微量元素液配方H3BO35.0g，Na2MoO45.0g，水1000ml)1.2培养条件28-30℃。2.斜面菌种培养
取供试费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)HNO1转接YMA斜面，保温培养后经肉眼与革兰氏染色镜检合格后才能进入下一步工艺。3.三角瓶振荡培养取一环斜面培养物按无菌操作法转接三角瓶培养液(装量150ml/250ml三角瓶)，经200rpm振荡培养48小时并镜检合格后进入下一步。4.50L种子罐深层通气培养将2-3瓶合格的三角瓶培养液合并至500ml三角瓶中，按无菌操作法接入已灭菌冷却的种子罐培养液(装量35L)中，通气培养36小时经取样镜检合格后用于下一步接种。5.500L发酵罐深层通气培养用移罐法经转种管将培养液从种子罐移至已灭菌冷却的发酵罐培养液中，通气培养20-24小时，经取样镜检合格后才能放罐。6.离心与洗涤发酵罐经4℃，5000rpm，20分钟离心后弃上清，按沉淀重加入20倍重量的无菌水再悬浮后，依前法作第二次离心，沉淀用2倍量的无菌生理盐水(0.85％NaCl溶液)再悬浮备用。7.分装、压盖、抽真空与灌氮气上述浓缩溶液按每小瓶1-3ml分装青霉素小瓶，压盖后抽真空，再重新灌入氮气并贴上写有菌剂使用说明与生产日期的标签即为精制浓缩根瘤菌剂成品。8.成品质量检查按发酵罐确定成品批次，从每批产品中任取三瓶作稀释平板测数，活菌数＞500亿/ml、杂菌率＜5％者为合格产品，于4℃下储存准备出厂。
权利要求
1.一种根瘤菌菌剂的制备方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤(1)根瘤菌的液体深层通气培养根瘤菌用一种编号为YMA的甘露醇酵母汁培养基，经斜面菌种培养、液体三角瓶振荡培养、种子罐液体深层通气培养和发酵罐液体深层通气培养并经涂片作革兰氏染色镜检无杂菌污染后即得到所述的根瘤菌工业发酵培养液；(2)根瘤菌培养细胞的离心浓缩、洗涤与再悬浮上述发酵培养液经4℃，5000rpm，20分钟离心后弃上清，按重量加入20倍量无菌水再悬浮洗涤后，依上法再离心并弃去上清液，按重量加入2倍量的无菌生理盐水后制成菌悬液；(3)浓缩细胞液的分装、抽真空与充氮气上述浓缩细胞液按每瓶1-3ml分装灭菌的青霉素小瓶，压铝盖密封后抽真空，并再充以氮气即制成精制浓缩液体根瘤菌剂。
2.根据权利要求1所述的一种根瘤菌菌剂的制备方法，其特征在于，其中的培养基配比按重量计为以下成分(1)甘露醇酵母汁培养基(YMA)配方以下为液体配方，通气培养时另加1ml甘油聚醚，配固体培养基时另加琼脂粉20.0g，其它成分按重量计是甘露醇10.0g；酵母粉0.5g；MgSO4·7H2O0.2g；K2HPO40.5g；NaCl0.1g；CaCl2·6H2O0.1g；根瘤菌微量元素液*4.0ml，pH调制6.8-7.0根瘤菌微量元素液配方H3BO35.0g；Na2MoO45.0g；水1000ml。
3.根据权利要求1或2所述的一种根瘤菌菌剂的制备方法，其特征在于所述的斜面菌种的培养温度为28-30℃。
4.根据权利要求1或2所述的一种根瘤菌菌剂的制备方法，其特征在于所述的斜面菌种培养包括将费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)转接于YMA斜面，保温培养后经肉眼与革兰氏染色镜检合格后进入下一步工艺。
5.根据权利要求1或2所述的一种根瘤菌菌剂的制备方法，其特征在于所述的三角瓶震荡培养包括取一环斜面培养物按无菌操作法转接于装量为150ml/250ml瓶的三角瓶培养液，经2000rpm振荡培养48小时并镜检合格后进入下一步。
6.据权利要求1或2所述的一种根瘤菌菌剂的制备方法，其特征在于，所述的种子罐深层通培养包括将2-3瓶合格的三角瓶培养液合并至500ml三角瓶中，按无菌操作法接入已灭菌冷却的装量为35L的种子罐培养液中，通气培养36小时经取样镜检合格后用于下一步接种。
7.据权利要求1或2所述的一种根瘤菌菌剂的制备方法，其特征在于所述的发酵罐深层通气培养包括用移罐法经转种管将培养液从种子罐移至已灭菌冷却的500L发酵罐培养液中，通气培养20-24小时，经取样镜检合格后放罐。
8.根据权利要求1或2所述的一种根瘤菌菌剂的制备方法，其特征在于所述的离心与洗涤方法包括发酵罐经4℃，5000rpm，20分钟离心后弃上清，按沉淀重加入20倍重量的无菌水再悬浮后，依前法作第二次离心，沉淀用2倍量的0.85％NaCl溶液的无菌生理盐水再悬浮备用。
9.根据权利要求1或2所述的一种根瘤菌菌剂的制备方法，其特征在于所述的菌剂的分装、压盖、抽真空与灌氮气的步骤包括上述浓缩溶液按每小瓶1-3ml分装青霉素小瓶，压盖后抽真空，再重新灌入氮气。
全文摘要
本发明属于农业微生物根瘤菌制剂技术领域。其特征是，提出一种制备浓缩液体根瘤菌剂的方法。根瘤菌发酵培养液经离心洗涤后的菌体，用2倍量灭菌生理盐水再悬浮并分装青霉素小瓶，压盖后抽真空并再充以氮气即成。本菌剂具有活菌数高、保存期长、生产工艺简单和易于实现自动化生产等优点，适用于以微生物活菌为产品的多种微生物制剂的生产。
文档编号C12N1/20GK1412298SQ01133549
公开日2003年4月23日 申请日期2001年10月11日 优先权日2001年10月11日
发明者周俊初 申请人:华中农业大学