专利名称：应用基因表达鉴定产品的方法
技术领域：
一般地，本发明涉及产品鉴定领域；更具体地，涉及生物技术系统在标记产品用于鉴定中的应用。
这些系统被用于药物或新化合物的筛选中。例如，公开于1999年6月3日的国际专利申请WO92/27356涉及到通过将细胞核激素受体、肽传感器和测试化合物混合鉴定该受体功能的调节剂的方法。该传感器提供了与该受体的直接结合，然后进行测试试验以确定该测试化合物是否影响该传感蛋白与该受体的结合。此外，Evans的美国专利5,071,773涉及到激素受体相关的生物分析，该生物分析作为筛选方法用于确定蛋白质是否是激活转录的受体或测试药剂是否是激活已知受体的配体。
这些受体系统已被提议用于“指纹法”或作为生物传感器来标识产品用于鉴定。例如，已建议，将经突变与其天然配体的结合发生改变的某些G蛋白偶联细胞表面受体、酪氨酸canasta受体以及离子通道受体和它们的各种非天然配体之间的相互作用用于产生样品指纹。该指纹被认为使得可以对产品进行验证和监测以便实现安全性、可靠性、假货和质量的控制。见1999年10月14日公开的国际专利申请WO 99/51777；1997年10月2日公开的国际专利申请WO97/35985。1995年1月26日公开的国际专利申请WO95/02823涉及通过如下方式鉴定配体的方法，该方式是用编码能够响应配体而影响细胞扩增的受体的DNA转染细胞，并将该细胞与作为该受体潜在激动剂或拮抗剂的测试底物一起孵育。然后采用标记这些细胞扩增的标记物评价是否发生了细胞扩增。
这些现有检测系统的一些缺点包括需要在标记的产品中有高浓度的配体，以及能够用于此检测方法的配体的数量和特性受到限制。
本领域需要在产品的鉴定中应用其它能够在低浓度下产生简单快速信号的受体-配体相互作用。
另一方面，本发明提供类似于上述方法的另一种方法，但其中该检测组合物还含有编码与所述配体依赖性转录因子相互作用激活或阻遏所述报道基因表达的辅激活物或辅阻遏物的第三核苷酸序列。在本发明方法的再一实施方案中，将产品接触该检测组合物及通过和该配体依赖性转录因子的相互作用激活或阻遏所述报道基因表达的辅激活物或阻遏物。
另一方面，本发明提供含有与以下将作详细描述的指定配体标记物相联系的液体、固体、分散体(dispersion)、乳剂或胶乳的标记产品。
再一方面，本发明提供含有上述第一核苷酸序列和上述第二核苷酸序列，以及任选的辅激活物或辅阻遏物的一种或多种细胞或稳定的细胞系用于本发明方法。
再一方面，本发明提供用于鉴定标记产品的试剂盒，其包含含有上述第一和第二核苷酸序列的检测组合物，以及检测和测量所述信号的方法。
再一方面，本发明提供用于这些用途的检测组合物。
本发明的其它方面和优点将在以下本发明优选实施方案的详细描述中作进一步阐述。
发明详述本发明提供应用参与配体-受体相互作用的天然或合成的配体依赖性转录因子从而使得可以快速有效地鉴定产品的方法和组合物。本发明的这些方法和组合物可以在低浓度时产生简单而快速的信号，因此是安全的，并适用于多种产品和工业。
本发明提供鉴定产品的新方法。根据该方法，首先使产品与配体标记物相联。作为鉴定该产品来源和/或验证该产品的真实性的一种手段，在其后的时间点检测在该产品或该产品的提取物或部分之中或之上是否存在配体标记物和/或存在的量。配体标记物的检测通过采用“体内”步骤，即通过产品与如下检测组合物的接触来进行，其中该检测组合物含有编码一或多个天然或合成的配体依赖性转录因子并任选地处于第一启动子的调节控制之下的一或多个第一核苷酸序列。这些转录因子含有三种功能区配体结合域、DNA结合域和反式激活域。该检测组合物的另一部分是编码处于受体效应元件或修饰或合成的效应元件，以及第二启动子的调节控制之下的报道基因的第二核苷酸序列。所述配体标记物和至少一个配体结合域的相互作用是高度特异的，并且诱导该报道基因表达的改变。由此该报道基因表达的改变产生可检测信号，从而可以鉴定产品中配体的存在。更具体地，该配体标记物与该检测组合物中的配体结合域的结合触发所述DNA结合域与所述效应元件的结合。当该效应元件发生结合之后，它将激活或抑制该报道基因的表达。任选地，在该方法或该检测组合物中加入辅激活物或辅阻遏物蛋白或其编码核苷酸序列。
与上述参考文献的方法相比，本发明方法的一个优点是人工小分子配体标记物的高度特异性，当存在于消费品中时它们是无害的。此外，配体结合域与配体之间的特异性使得干扰该方法的可能性极低。而且这些配体标记物易于合成和制备。此外，与其它标记系统不同，本发明能够采用多种标记物。而且，该方法灵敏度高，能检测到产品中极低浓度的配体标记物，例如十亿分之几(ppb)到万亿分之几(ppt)的水平。实际上，在该方法中配体标记物的浓度能够低至常规化学色谱或质谱分析方法所不能检测到的浓度。最后，与这些已知方法不同，在此标记物检测的生物学方法中细胞的增殖不依赖配体标记物的存在。
为了完整地理解本发明，所用下列成分的定义如下A.产品在本发明方法和组合物中，加入一或多种配体标记物的“产品”可以是期望对其进行可鉴定的标记以便确定其来源的任何类型产品。例如，为了控制产品的未许可的复制或违法复制或其它安全目的，或者为了能够识别掺假产品以保证消费者的安全，该“标记”可能是必需的。该产品可以是任何物理形式。例如，该产品可以是流体或液体、固体、或它们之间的某种中间物例如分散体、乳剂、胶乳、或半固体基质。
典型的固体产品的实例可以包括但不限于，药物片剂、胶囊和粉剂；农用化学品的固体制剂例如杀昆虫剂、除草剂、杀真菌剂、消毒剂、其它农用化学品，和种子；爆炸物；纺织品如衣服；录制材料如唱片、磁带、软盘和光盘；电器如电视机、计算机和收音机；汽车元件和照相机；纸例如文件、密件、票据、有价证券、标签和包装物；化学制品如墨水、杀生物剂和橡胶；化妆品如面霜；食品；和建筑材料如沥青添加剂、屋顶木瓦、和混凝土块，以及包装材料。
流体或液体产品的实例包括但不限于，以油为基础的产品例如润滑油、液压油、润滑脂、汽油、煤油、原油、柴油、和液化石油产品、汽油酒精混合燃料、生物柴油(biodiesel fuel)、马达油、润滑液；油漆、油漆添加剂、塑料添加剂、粘合剂、涂料、陶瓷制品；包括聚合物在内的油田化工产品；香水和其它化妆品；饮料如瓶装水、牛奶、酒、威士忌酒、雪利酒、杜松子酒和伏特加酒及其它酒精和非酒精饮料；液体药物制剂例如糖浆、乳剂和悬液；水处理用化学制品，例如聚合物、防垢剂、和鏊合剂；液体农用化学制剂，例如杀虫剂、杀昆虫剂和除草剂；以及工业溶剂。所述产品优选是液体。
本领域技术人员可以根据本发明而且无需任何多余的实验容易地选择待引入配体标记物的产品。应当理解，以下详细描述的配体标记物可以以广泛多种方式和产品相联。因此，配体标记物可以存在于产品的全部或部分之中或之上，或存在于与该产品相关的标签、包装材料或容器的全部或部分之中或之上。
优选地，例如当产品是液体或半固体或甚至是粉末时，将配体标记物直接地与产品混合。当产品是固体时，配体标记物可以独立于产品存在，例如配体标记物可以存在于产品的包装材料、标记或标签中。或者，当产品是固体时，可以将配体标记物施用于产品的表面并干燥。将配体标记物施用于固体产品的方法可以包括但不限于，滚筒传送(rollertransfer)或油漆涂布、喷涂、刷涂和浸涂。必需采用该施用方法，以便产品表面在指定温度，例如室温或高于室温下干燥。对这些类型的涂布方法的一般描述可以参见常规教科书，例如现代涂布和干燥技术(ModernCoating and Drying Techniques)，(E.Cohen和E.Gutoff编；VCH出版社)纽约(1992)，以及网络加工和转换技术和设备(Web Processingand Converting Technology and Equipment)，(D.Satas编；VanNostrand Reinhold)纽约(1984)。
在一个实施方案中，配体标记物以万亿分之一(ppt)至约十亿分之500(w/w)配记标记物的浓度存在于产品中。在另一个实施方案中，配体标记物以0.1ppb至约100ppb配记标记物的浓度存在于产品中。在再一个实施方案中，配体标记物以0.1至10ppb配记标记物的浓度存在于产品中。
根据本发明的方法，可以通过检查整个产品、部分产品(例如少量产品)或产品提取物(例如当产品是固体时)，鉴定产品之中或之上配体标记物的存在。
对于产品和产品形式的选择、在选定的产品中或上掺入配体标记物的方法、以及与产品相联的配体标记物的量，本发明均没有进行限制，但它们是本领域技术人员鉴于本文所提供的讲授可以容易地进行选择的变量。
B.配体标记物本发明中有用的配体标记物包括与天然或合成的配体依赖性转录因子的配体结合域特异结合的分子。配体标记物能够特异地与至少一个选定的配体结合域相互作用。优选地，配体标记物是表现出优选与下面详述的配体结合域特异结合的合成化合物或组合物。正常情况下产品中并不存在配体标记物；例如，它不是生产过程的副产品、正常杂质、或用于产品的标准添加剂。用于本发明的配体标记物的另一优点是，在一定意义上该配体标记物是惰性的，即该配体标记物不和它所标记的产品发生反应。
用于本发明的优选配体标记物包括已知的化合物、或本领域技术人员易于合成的化合物，如美国专利4,954,655；4,985,461；5,117,057；5,530,028；5,378,726；和6,013,836中所公开的。为了定义在本发明中用作配体标记物的某些化合物，将这些专利以参考文献形式并入本文。因此，该配体标记物可以包括但不限于，松甾酮、松甾酮A、muristeroneA、烷基替酰肼、N，N’-二酰基酰肼、N-取代-N，N’-二酰基酰肼、N-取代-N，N’-双取代酰肼、二苯甲基酰烷基氰基酰肼、N-烷基-N，N’-二芳酰基酰肼、N-酰基-N-烷基-N’-芳酰基酰肼、3，5-二叔丁基-γ-羟基-N-异丁基苯甲酰胺、8-O-乙酰基哈帕苷。在该配体结合域来源于例如蜕皮激素细胞核受体的实施方案中，可以采用各种烷基替酰肼、N-取代-N，N’-二酰基酰肼、和N-取代-N，N’-双取代酰肼作为配体标记物[见例如美国专利4,954,655；4,985,461；5,530,028；和6,013,836]。用于以下实施例的一个尤其优选的配体标记物是N’-叔丁基-N’-(3，5-二甲基苯甲酰基)-3-甲氧基-2-甲基苯并酰肼，非正式地称为methoxyfenoxide。
其它适合用作配体标记物的化合物公开于未决的美国专利申请09/315，451中，该专利也以参考文献形式并入本文。下式定义了一个这样的配体标记物 其中E是含有叔碳的(C4-C6)烷基，或含有叔碳的氰基(C3-C5)烷基。
R1是H、Me、Et、异丙基(i-Pr)、F、甲酰基、CF3、CHF2、CHCl2、CH2F、CH2Cl、CH2OH、CH2OMe、CH2CN、CN、C≡CH、1-propynyl、2-propynyl、乙烯基、OH、OMe、OEt、环丙基、CF2CF3、CH≡CHCN、烯丙基、叠氮基、SCN或SCHF2；R2是H、Me、Et、正丙基、异丙基、甲酰基、CF3、CHF2、CHCl2、CH2F、CH2Cl、CH2OH、CH2OMe、CH2CN、CN、C≡CH、1-propynyl、2-propynyl、乙烯基、Ac、F、Cl、OH、OMe、OEt、正丙氧基、OAc、NMe2、NEt2、SMe、SEt、SOCF3、OCF2CF2H、COEt、环丙基、CF2CF3、CH≡CHCN、烯丙基、叠氮基、OCF3、OCHF2、异丙氧基、SCN、SCHF2、SOMe、NH-CN，或与R3及R2和R3所连的苯基碳一起形成亚乙二氧基环、氧邻近苯基碳的二氢呋喃环、或氧邻近苯基碳的二氢吡喃环；R3是H、Et、或与R2及R2和R3所连的苯基碳一起形成亚乙二氧基环、氧邻近苯基碳的二氢呋喃环、或氧邻近苯基碳的二氢吡喃环；R4、R5和R6独立地是H、Me、Et、F、Cl、Br、甲酰基、CF3、CHF2、CHCl2、CH2F、CH2Cl、CH2OH、CN、C≡CH、1-propynyl、2-propynyl、乙烯基、OMe、OEt、SMe或SEt；前提是a)当R1是Me且R2是OMe时；则R3是H；并且R4、R5和R6联合起来是3，5-二甲基、3，5-二甲氧基-4-Me、3，5-二氯或2，5-二氟；b)当R1是Me且R2是OEt时；则R3是H；并且R4、R5和R6联合起来是3，5-二甲基、3，5-二甲氧基-4-Me、3，5-二氯、3，5-二氟、2，4-或2，5-二氟、2，4-或2，5-二氯；c) 当R1是Et且R2是OMe或OEt时；则R3是H；并且R4、R5和R6联合起来是i)3，5-二甲氧基-4-Me、3，5-二氯、3，5-二氟、2，4-或2，5-二氟、2，4-或2，5-二氯、3-OMe、2-Cl-5-Me、2-Br-5-Me、2-Cl、2-Br或3-Me；或ii)R6是H，R4是Me且R5是Et、F、Cl、Br、甲酰基、CF3、CHF2、CHCl2、CH2F、CH2Cl、CH2OH、CN、C≡CH、1-propynyl、2-propynyl、乙烯基、OMe、OEt、SMe或SEt；d)当R1是异丙基时；则R2是OMe或OEt；R3是H；而且R4、R5和R6联合起来是3，5-二甲基；e)当R3是Et时；则R2是H，R1是F或Cl、而且R4、R5和R6联合起来是3，5-二甲基；f)当R2和R3以及它们所连的苯基碳一起形成亚乙二氧基环时；则R1是Me或Et，而且R4、R5和R6联合起来是3，5-二甲基；g)当R2和R3以及它们所连的苯基碳一起形成二氢呋喃环或二氢吡喃环时；则R1是Et，而且R4、R5和R6联合起来是3，5-二甲基；h)当R1是甲酰基、CF3、CHF2、CHCl2、CH2F、CH2Cl、CH2OH、CH2OMe、CH2CN、CN、C≡CH、1-propynyl、2-propynyl、乙烯基、OH、环丙基、CF2CF3、CH≡CHCN、烯丙基、叠氮基、SCN或SCHF2时；则R2是OMe或OEt，R3是H，而且R4、R5和R6联合起来是3，5-二甲基；和i)当R2是Me、Et、正丙基、异丙基、甲酰基、CF3、CHF2、CHCl2、CH2F、CH2Cl、CH2OH、CH2OMe、CH2CN、CN、C≡CH、1-propynyl、2-propynyl、乙烯基、Ac、F、Cl、OH、正丙氧基、OAc、NMe2、NEt2、SMe、SEt、SOCF3、OCF2CF2H、COEt、环丙基、CF2CF3、CH≡CHCN、烯丙基、叠氮基、OCF3、OCHF2、异丙氧基、SCN、SCHF2、SOMe或NH-CN；则R1是Et，R3是H，而R4、R5和R6联合起来是3，5-二甲基。
一个尤其理想的配体标记物具有上述指定式，其中E是叔丁基；R1是Me、Et、异丙基或F；R2是OH、OMe、OEt、或与R3及R2和R3所连的苯基碳一起形成氧邻近苯基碳的亚乙二氧基环或二氢呋喃环；R3是H、Et、或与R2及R2和R3所连的苯基碳一起形成氧邻近苯基碳的亚乙二氧基环或二氢呋喃环；而且R4、R5和R6独立地是Me、F、Cl、CH2OH或OMe。另一理想配体具有上述指定式，其中E是叔丁基；R1是Me、Et、异丙基或F；R2是OH、OMe、OEt、或与R3及R2和R3所连的苯基碳一起形成氧邻近苯基碳的亚乙二氧基环或二氢呋喃环；R3是H、Et、或与R2及R2和R3所连的苯基碳一起形成氧邻近苯基碳的亚乙二氧基环或二氢呋喃环；而且R4、R5和R6独立地是Me、F、Cl、CH2OH或OMe。
再一配体标记物具有上述指定式，其中E是叔丁基；R1是Me、Et、异丙基或F；R2是OH、OMe、OEt、或与R3及R2和R3所连的苯基碳一起形成氧邻近苯基碳的亚乙二氧基环或二氢呋喃环；R3是H、Et、或与R2及R2和R3所连的苯基碳一起形成氧邻近苯基碳的亚乙二氧基环或二氢呋喃环；而且R4、R5和R6独立地是Me、F、Cl、CH2OH或OMe。本领域技术人员可以从该指定式选出其它的配体标记物。
这些化合物作为配体标记物是尤其理想的，因为以它们在消费品中例如药物、化妆品、食物、包装材料等中的存在浓度而言它们是无害的。而且，本发明的方法能够检测到产品中浓度极小的这些配体，例如浓度范围在十亿分之几到万亿分之几之间的配体，并对其进行定量。
除了上述分子外，本领域技术人员还可以采用其它分子作为配体标记物，只要该配体标记物能与下述检测组合物天然或合成的配体依赖性转录因子的至少一个选定配体结合域结合即可。
C.检测组合物本发明的检测组合物是指含有编码一或多个天然或合成的配体依赖性转录因子的一或多个“第一”核苷酸序列的组合物。该因子优选处于第一启动子的调节控制之下。该组合物还含有处于受体效应元件或修饰或合成的效应元件，以及第二启动子的调节控制之下编码报道基因的“第二”核苷酸序列。任选地，该检测组合物含有编码辅激活物或辅阻遏物的“第三”核苷酸序列。这些核苷酸序列可以是RNA或DNA。在一个实施方案中，优选将组成该检测组合物的这些DNA序列掺入到一个细胞或多个细胞中。更优选地，含有这些核苷酸序列的检测组合物是稳定的细胞或细胞系。
该检测组合物的细胞可以是任何真核或原核细胞。真核细胞中优选无脊椎动物的细胞(例如昆虫细胞)，因为它们可以对优选的受体例如蜕皮激素受体的配体标记物产生最为灵敏的反应。本领域技术人员可以按照本公开选择其它的细胞和受体组合。故本发明的配体对转化细胞或整个生物体的生理或其它影响将是微不足道的。因此，细胞能够生长并表达期望产品，而基本上不受配体本身存在的影响。优选地，在真核细胞中，该检测组合物的这些核苷酸序列位于细胞核中。
在一个优选实施方案中，含有所述两种核苷酸序列的该检测组合物是一种或多种昆虫细胞，例如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(Sf9)的细胞。昆虫细胞往往对用于该组合物的多种受体极为灵敏，而且具有极强的耐受性。其它昆虫细胞包括来源于棉铃象(Anthomus grandis)的昆虫细胞系BRL-AG2，参见Stiles等，体外细胞发育生物学(In Vitro CellDev.Biol.)，28A355-363(1992)。还可以采用另一种来源于黄猩猩果蝇(Drosophila melanogaster)Kc细胞系的昆虫细胞系L57。本领域技术人员还可以选择其它的昆虫细胞用于该组合物。
在另一个优选实施方案中，该检测组合物是一种或多种酵母细胞，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。在另一个优选的实施方案中，该检测组合物是巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。用于本发明的另一种优选酵母细胞是Pichia methanolica。用于本发明的其它酵母细胞株包括但不限于酵母属(Saccharomyces)、假丝酵母属(Candida)、Ambrosiozyma、Apiotrichum、Arthroascus、汉逊酵母属(Hansenula)、克勒克酵母属(Kloeckera)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、红酵母属(Rhodotorula)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)和有孢圆酵母属(Torulaspora)的多种菌株。
例如，在一个实施方案中，该检测组合物是哺乳动物细胞。理想的哺乳动物细胞包括但不限于，CHO、BHK、MDCK等细胞，及各种鼠源细胞例如l0T1/2和WEHI细胞，非洲绿猴细胞，适合的灵长类细胞如VER0、COS1、COS7、BSC1、BSC40和BMT10，及人类细胞例如WI38、MRC5、A549、人胚胎成视网膜细胞(HER)、人胚胎肾细胞(HEK)、人胚胎肺细胞(HEL)、TH1080细胞。其它适合的细胞可以包括NIH3T3细胞(3T3细胞的亚系)、HepG2细胞(人肝癌细胞系)、Saos-2细胞(人骨原性肉瘤细胞系)、HuH7细胞或HeLa细胞(人癌细胞系)。在一个实施方案中，适当的细胞包括人胚胎肾293T细胞。提供这些细胞的哺乳动物物种的选择和哺乳动物细胞的类型均不构成对本发明的限制。
含有所述两种核苷酸序列的本发明其它组合物可以是植物细胞或藻类细胞，例如以下属的种，这些属包括但不限于Blastocrithidia、头孢藻属(Cephaleuros)、衣藻属(Chlamydomonas)和小球藻属(Chlorella)。
当该细胞是原核细胞时，理想的细菌细胞包括大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)，以及假单孢菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)和志贺菌属(Shigella)或其它肠细菌的各个种。然而，优选真核细胞。
在另一个实施方案中，当该检测组合物的这些核苷酸序列是RNA分子时，还可以将它们作为RNA分子掺入，优选以功能性病毒RNA例如烟草花叶病毒的形式掺入。可以用于本发明组合物中的其它有用病毒包括但不限于痘苗病毒、腺病毒、腺相关病毒、杆状病毒、布尼亚病毒、冠形病毒、黄病毒、嗜肝DNA病毒、疱疹病毒和疱疹样病毒、正粘病毒、乳多空病毒、副粘病毒、细小核糖核酸病毒、痘病毒、呼吸道肠道病毒、逆转录病毒和弹状病毒。
以下对存在于细胞或病毒中形成该检测组合物的这些核苷酸序列进行描述。
1.第一核苷酸序列该第一核苷酸序列含有至少一个配体依赖性转录因子，其优选处于选定启动子的调节控制之下。在一个实施方案中，配体依赖性转录因子是核受体超家族蛋白质或其功能性片段。在另一个实施方案中，配体依赖性转录因子是具有核受体超家族蛋白质的转录激活性质的修饰蛋白质或合成蛋白质。该超家族的成员包括但不限于，修饰的或天然的类固醇/甲状腺激素核受体超家族蛋白质，例如蜕皮激素[见Yao，T.P.等(1993)自然，366476-479；Yao，T.-P.等(1992)，细胞(Cell)，7163-72]、雌激素、视黄醛衍生物X(retinoid X)、孕酮、糖皮质激素、维生素D、视黄酸、及过氧物酶体增殖受体蛋白。任选地，该转录因子具有与类固醇/甲状腺激素核受体超家族相似的功能，但常规并不是该超家族的成员。该“任选的”转录因子中包括来源于四环素诱导型lac操纵子、IPTG诱导型受体蛋白质、内酯受体蛋白、和阿拉伯糖诱导型蛋白的转录因子。
检测组合物中第一核苷酸序列的配体依赖性转录因子含有反式激活域、DNA结合域(“DBD”)、和配体结合域(“LBD”)。每个域可以任选地由具有50-约100个核苷酸任意序列的铰链区分隔开。优选地，该铰链区有100-约500个核苷酸。在一些实施方案中，该铰链区长约200个核苷酸。每个域可以是从其天然来源分离的天然存在的序列，或可以是具有所需功能的天然序列的合成或重组构建序列或片段。优选地，这三个域中的一个或多个的来源可以不同于其它域的来源，以便对于选定的宿主细胞而言“嵌合的”第一核苷酸序列在反式激活活性、与配体的互补结合、及特定效应元件的识别方面获得最优化。
a.配体结合域该第一核苷酸序列的LBD仅特异地与本发明的配体标记物结合。在一个实施方案中，该LBD，一般在其羧基端序列，还含有反式激活域或反式激活功能，以致无需单独的反式激活域。配体标记物与LBD的结合触发DNA结合域与所述效应元件的结合，这将激活或抑制该报道基因的表达，籍此产生或改变信号。在该转录因子的一个实施方案中，该LBD是从类固醇/甲状腺激素核受体超家族成员中获得的分离的天然配体结合域，例如来自昆虫超家族(如蜕皮激素受体蛋白)的LBD。或者，该LBD是来自该超家族成员的该域的合成或重组修饰的配体结合域，或片段。再或者，该LBD是能仅与以上定义的配体标记物结合并触发上述一序列事件的完全合成序列。从以上来源鉴定的LBD可以通过分离、合成或重组制备的方式获得。这些LBD一般长约500-约1000个核苷酸。在一些实施方案中，该LBD长约750个核苷酸。对于本方法尤其优选的LBD包括蜕皮激素受体LBD和USP。该蜕皮激素受体CfEcR的LBD序列描述于R.Kothapali等，Dev.Genet.17(4)319-330(1995)；也参见Genbank登录号U29531。
在本发明的一个实施方案中，单独一个第一核苷酸仅含有一个LBD，该LBD优选与一个配体标记物结合并触发级联事件导致可检测信号的改变(例如可检测信号的产生、抑制、增强或消失)。在另一个实施方案中，多个不同的LBD存在于一个或多个第一核苷酸序列中。例如，两个或多个LBD可以相联(例如形成同二聚体或异二聚体)以产生单一一个针对该配体标记物的转录因子或受体。
b.DNA结合域产品中的配体标记物与检测组合物的一或多个LBD的结合使得该配体依赖性转录因子的一或多个DBD可以以激活的形成与所述第二核苷酸序列的效应元件结合，由此导致所述外源报道基因的改变(例如表达或抑制)。在所述转录因子的一个实施方案中，该DBD是从类固醇/甲状腺激素核受体超家族成员获得的分离的天然DNA结合域，例如来自该昆虫超家族如蜕皮激素受体蛋白质的DBD。或者，该DBD是来自该超家族成员的该域的合成或重组修饰的DNA结合域，或片段。再或者，该DBD可以是来自另一转录因子的DNA结合域。该DBD可以是酵母细胞的DNA结合域例如GAL4 DBD，或来自病毒的DNA结合域，或来自植物细胞的DNA结合域。可以在本发明核苷酸序列中用作DBD的其它DNA结合域包括LexA的DNA结合域或细菌LacZ基因的DNA结合域。该域的其它选择包括人工锌指区。再或者，该DBD是当存在与该LBD结合的配体标记物时介导上述一序列事件的完全合成序列。本发明的DBD还可以包括任何上述来源的天然DBD的合成或重组类似物、组合或修饰。
在一个实施方案中，单独一个第一核苷酸序列含有一个DBD。在另一个实施方案中，一或多个第一核苷酸序列含有不止一个DBD。在该一个或多个第一核苷酸序列中该DBD可以与所述的一或多个LBD异源。或者，该DBD可以与该LBD同源。再或者，当有两个或多个DBD存在于该第一核苷酸序列中时，这些DBD可以相同或不同。该DBD域可以是天然的、修饰的、或异源受体蛋白的不同DNA结合域的嵌合体。从上述来源鉴定的DBD可以通过分离、合成或重组制备的方式获得。这些DBD优选长约100至约1000个核苷酸。在一个实施方案中，该DBD域长约750个核苷酸。作为一个实例，蜕皮激素来源的DBD的特征在于在两个氨基酸基序P盒和D盒两侧存在两个半胱氨酸锌指，它们赋予了对蜕皮激素效应元件的特异性。对于本方法一个尤其优选的DBD是CfEcR的DBD，描述于R.Kothapalli等，Dev.Genet.17(4)319-330(1995)；也参见Genbank登录号U29531。其它DBD序列是本领域已知的。
c.反式激活域当产品中的配体标记物与检测组合物中的LBD结合后，该配体依赖性转录因子的反式激活域将加强该配体依赖性转录因子的构象改变。该反式激活域可以是提供激活功能的LBD的羧基端序列。或者，该反式激活域可以是独立于LBD的序列。可以有一或多个反式激活域存在于一或多个该第一核苷酸序列上。该反式激活域可以是天然的、修饰的、或异源受体蛋白质的不同反式激活域的嵌合体。有用的反式激活域可以来源于类固醇/甲状腺激素核受体的激活域、合成的或嵌合的激活域、聚谷氨酰胺激活域、碱性或酸性氨基酸激活域、病毒激活域、植物病毒激活域、或VP16、GAL4、NF-kB或BP64激活域。同样地，这些域可以通过修饰上述任意一种域来制备，或通过采用任意一种这些激活域的片段来制备。在本发明的第一核苷酸序列中，为了增加激活强度可以采用一个以上的激活域。
有用的反式激活域一般是长约16-约500个核苷酸的核苷酸序列。优选地，为了增加激活的强度在该第一核苷酸序列中采用不止一个激活域。从上述来源鉴定的反式激活域可以通过分离、合成或重组制备的方式获得。用于本发明方法的尤其优选反式激活域是公开于P.E.Pellett等，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)82(17)5870-5874(1985)中的VP16反式激活域，和本领域技术人员已知的其它反式激活域。VP16反式激活域的序列也参见Swiss Prot.登录号PO4486。
d.启动子该第一核苷酸序列还任选地含有调节至少一个配体依赖性转录因子在选定的细胞或病毒中表达的启动子。在本发明方法中，根据期望的最终结果，即控制表达的时间选择和定位，本领域技术人员可以容易地选择用于驱动该配体依赖性转录因子表达的启动子。术语“启动子”是指由RNA聚合酶识别的特定核苷酸序列。该启动子序列是能在适当条件下特异地起始转录的位点。可以选择许多种启动子来调节第一核苷酸序列的转录因子表达，例如组成型启动子、可诱导调节的启动子、组织特异性启动子(仅在特定类型的细胞中表达)或生物体某些发育状态所特异的启动子。
然而，优选地，用于第一核苷酸序列的启动子是组成型启动子。可以选择的组成型启动子的例子包括但不限于逆转录劳斯肉瘤病毒的LTR启动子、巨细胞病毒启动子、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、α-肌动蛋白启动子、甘油磷酸激酶启动子、EF1α启动子、T7聚合酶启动子、蜕皮激素昆虫启动子、骨骼α肌动蛋白启动子、肌球蛋白轻链2A启动子、肌营养不良蛋白启动子、肌肉肌酸激酶启动子、合成的肌肉启动子、肝启动子、乙型肝炎病毒核心启动子、甲胎蛋白启动子、肌动蛋白启动子、IE1启动子、IR2和其它杆状病毒启动子、HSP70启动子、35S植物启动子、CSV植物启动子、酵母GAL1启动子、酵母ADH1启动子、和酵母MET25启动子。目前优选的启动子是存在于AcMNPV序列中的杆状病毒IE1启动子，其描述于M.D.Ayres等，Virol.202(2)586-605(1994)；也参见Genbank登录号NC001623。可以从本领域已知的那些序列中选择其它启动子序列。
优选地在第一核苷酸序列中，该启动子位于LBD的5’端，LBD位于DBD的5’端，而DBD位于反式激活域的5’端。可以通过启动子的3’核苷酸与LBD的5’核苷酸融合，以及LBD的3’核苷酸与DBD的5’核苷酸融合等方式，直接将这些域彼此连接起来。或者，当反式激活域是LBD的部分时，仅将LBD直接地或通过间隔区与DBD连接起来。在另一个可替代方案中，一个“第一”核苷酸序列含有一个LBD和DBD，而另一个“第一”核苷酸序列含有相同的LBD和DBD或不同的LBD和DBD，以及任选的反式激活域，籍此该多个“第一”核苷酸序列的这些LBD和DBD及反式激活域以同二聚体或异二聚体的形式形成单一一个转录因子。该多个LBD、DBD和反式激活域可以存在于单个核苷酸序列或多个分开的核苷酸序列中。或者，每个这些域均优选地由任选的约16-约30个核苷酸的间隔区分隔开。例如，可以采用6-约10个甘氨酸残基，如18-约30个核苷酸作为间隔区。
理想地该第一核苷酸序列是单链DNA或RNA；或者，它们可以是双链DNA或RNA。可以将该第一序列制备成直链形式，但优选环状质粒。在另一个实施方案中，一个第一序列可以位于一个质粒之上，另一个第一序列可以位于相同的质粒或不同的质粒之上；而所述第二核苷酸序列可以位于再另一个质粒之上。再一个实施方案提供了存在于相同质粒之上的第一核苷酸序列和第二核苷酸序列，前提是它们由一个或多个转录封闭序列或polyA序列分隔开。这些序列的其它实施方案可以采用来源于病毒、噬菌体和其它分子的序列。
2.第二核苷酸序列检测组合物的第二核苷酸序列编码处于受体效应元件(例如天然的、修饰的或合成的)及第二启动子的调节控制之下的报道基因。
a.效应元件术语“效应元件”(“RE”)是指一个或多个顺式作用DNA元件，它们通过与第一核苷酸分子的配体依赖性转录因子的DBD相互作用赋予启动子反应性。当产品中存在配体标记物时，第一核苷酸分子的DBD与该第二核苷酸分子的RE结合，起始或抑制处于该效应元件调节之下的下游报道基因和第二启动子的转录。
该RE可以在其序列中具有回文结构(完全或不完全的)，或由可变数量的核苷酸分隔开的序列基序或半位点组成。这些半位点可以相似或一致，并呈正向或反向重复排列。该RE优选地是从以上所定义的类固醇/甲状腺激素核受体超家族成员获得的受体效应元件，或从鉴定DBD的其它来源中获得，或合成制备。对于本方法尤其优选的RE有来自GAL4的效应元件、来自类固醇/甲状腺激素核受体的效应元件、人工锌指、LexA操纵子、lac操纵子的效应元件、及识别合成DBD的合成或重组制备的效应元件。
从以上来源鉴定的RE可以通过分离、合成或重组制备的方式获得，而且一般长约10-约40个核苷酸。优选地，该RE长约12-约36个核苷酸。作为一个具体例子，天然蜕皮激素受体的RE的DNA序列包括RRGG/TTCANTGAC/ACYY[Chrebas L.等(1991)，Genes Dev.5，120-131]；AGGTCAN(n)AGGTCA，其中N(n)可以是一个或多个间隔区核苷酸[D’Avino PP.等(1995).Mol.Cell Endocrinol.113，1-9]；和GGGTTGAATGAATTT[Antoniewski C.等(1994)，Mol.Cell Biol.14，4465-4474]。此外，效应元件本身可以用针对其它DNA结合蛋白域，例如来自酵母的GAL4蛋白[Sadowski等(1988)自然335563-564]或来自大肠杆菌的LexA蛋白[Brent和Ptashne(1985)，细胞43729-736]的效应元件进行修饰或替代。
b.报道基因第二核苷酸序列的报道基因是表达时能够直接或间接地产生可检测信号的基因。该基因可以容易地从本领域的大量这类报道基因中选出。例如，该报答基因可以编码能够产生光学可检测信号或比色信号的蛋白质或酶。该报答基因可以是编码荧光或发光蛋白质的基因。或者，该报道基因可以编码与底物相互作用产生可检测信号的蛋白质。该报道基因可以直接或间接地引起该检测信号的发射或吸收光谱(例如UV、可见光、NMR等)的红移或蓝移。该报道基因编码的蛋白质可以是能够催化产生可检测信号的酶。
该报道基因的几个具体例子包括编码绿色荧光蛋白、萤光素酶、β-半乳糖苷酶、蓝色荧光蛋白、及分泌型碱性磷酸酶的基因。优选地，该信号由该报道分子本身或通过该报道分子与其底物的相互作用产生。正如本领域技术人员已知的，大多数报答酶具有一种以上的底物。报道酶和底物之间的反应产生通过目测、显微镜检测、紫外光检测、电检测、电容值的改变、杂交、红外检测、荧光检测和核磁共振可以检测到的信号。本领域技术人员可以容易地从大量已知并且是商业上可获得的符合这些描述的报道基因中进行选择。也参见以下的实施例。
c.第二启动子第二核苷酸序列的启动子与效应元件一起控制报道基因的表达。该启动子可以和检测组合物的第一核苷酸分子中的启动子相同。优选地，该第二启动子是不同的诱导型启动子。作为诱导型启动子，该第二启动子调节报道分子在选定细胞中的可诱导表达，并仅在有由该配体标记物、配体依赖性转录因子和效应元件形成的复合物存在时起始或抑制该报道基因的转录。更优选地，该第二启动子可被该效应元件例如蜕皮激素的RE诱导。在一个实施方案中，该第二启动子是RE诱导型最小启动子，例如醇脱氢酶的最小启动子或合成的TATA盒。最优选的启动子是蜕皮激素诱导型启动子。其它诱导型启动子的例子包括但不限于锌指诱导型绵羊金属硫蛋白启动子、地塞米松诱导型小鼠乳癌病毒启动子、四环素阻抑型启动子、四环素诱导型启动子、RU486诱导型启动子和纳巴霉素诱导型启动子。
该启动子的功能是修饰报道基因的表达，以便诱导可检测信号的改变。例如，在某些实施方案中，该第二启动子打开报道基因的表达。在其它实施方案中，该第二启动子关闭报道基因的表达。在再其它的实施方案中，该第二启动子诱导报道基因表达的改变，例如抑制或降低表达或增加表达。
优选地，在第二核苷酸分子中该RE位于第二启动子的5’端，第二启动子位于报道基因的5’端。在一个实施方案中，EcR RE与合成的TATA盒连接，该TATA盒与该报道基因连接。第二核苷酸序列的这些元件可以直接地以3’核苷酸和5’核苷酸进行连接。或者，这些域的每一个均优选地由任选的约16-约30个核苷酸的间隔区分隔开。例如，可以采用约6-约10个甘氨酸残基，如18-约30个核苷酸作为间隔区。第二核苷酸序列可以是单链RNA或DNA，或双链RNA或DNA。可以将该第二序列制备成直链形式，或优选地作为环状质粒。在另一个实施方案中，第一序列可以位于一个质粒之上，而第二核苷酸序列可以位于另一个质粒之上。在再一实施方案中，提供了存在于相同质粒上的第一核苷酸序列和第二核苷酸序列，前提是它们由转录封闭序列或polyA序列分隔开。其它实施方案中，这些序列可以采用来源于病毒、噬菌体和其它分子的序列。
3.任选的辅因子该检测组合物的一个任选部分是编码辅因子的核苷酸序列。取决于该检测组合物转染的细胞类型，这些辅因子可能是有用的或必需的，它们包括一般称作辅激活物(又称衔接子(adapter)或介导子(mediator))或辅阻遏物(又称阻抑物、沉默子或沉默介导子)的蛋白质。
辅激活物不与DNA发生序列特异性结合，也不参与基础转录。本发明检测组合物中的辅激活物与配体依赖性转录因子相互作用，以激活报道基因的表达。它们可以通过多种机制发挥它们的转录激活作用，这些机制包括刺激激活子与DNA的结合、影响染色体结构、或介导激活子与起始复合物的相互作用。这些辅激活物的例子包括RIP140、TIF1、RAP46/Bag-1、ARA70、SRC-1/NCoA-1、TIF2/GRIP/NCoA-2、ACTR/AIB1/RAC3/pCIP以及混栖辅激活物C效应元件B结合蛋白CBP/p300。综述参见CK Glass等，Curr.Opin.Cell Biol.9222-232(1997)。
当缺少配体标记物时，有效地抑制转录激活可能需要辅阻遏物。本发明检测组合物中的辅阻遏物与配体依赖性转录因子相互作用，以抑制报道基因的表达。这些辅阻遏物可以与未结合配体的蜕皮激素受体相互作用，使效应元件的活性沉默。目前的证据提示配体的结合改变了受体的构象，这导致辅阻遏物的释放和上述辅激活物的重新结合，由此消除了辅阻遏物的沉默作用。辅阻遏物的例子包括N-CoR和SMRT。综述参见K.B.Horwitz等，Mol.Endocrinol.101167-1177(1996)。
当检测组合物所转染的细胞内缺乏内源性的这些辅因子时，可以外来地将编码一个或多个辅因子的核苷酸序列加入该细胞中作为检测组合物的部分。在一个实施方案中，编码辅因子的序列可以作为检测组合物的第一或第二核苷酸序列的部分被包括在内。可以将该辅因子置于受调节的或未受调节的启动子(上述的组成型或诱导型启动子)的控制之下，或可以对该核苷酸序列进行改造使其由上述第一个或第二启动子表达。在另一个实施方案中，可以将该辅因子序列置于单独的“第三”核苷酸序列上，例如置于单独的直链或环状质粒之上。作为第三可选择的方案，可以将选定的辅因子蛋白质加入产品或产品的部分或提取物中作为上述方法的一个独立步骤。
4.检测组合物的制备一旦第一和第二核苷酸分子(及任选的第三核苷酸分子或序列)的各个域或区段成分已按上述讨论的方法选定，即可借助已知的化学合成技术，例如固相化学合成，如描述于Merrifield，J.Amer.Chem.Soc.，852149-2154(1963)，及J.Stuart和J.Young，Solid Phase PeptideSynthelia，Pierce Chemical公司，Rockford，IL(1984)，或详细描述于以下实施例中的方法，常规地制备在本发明方法中有用的核苷酸序列。或者，可以通过已知的重组DNA技术和遗传工程技术，如聚合酶链式反应，在宿主微生物或细胞中克隆和表达携带上述定义的核酸序列的DNA片段等方式[见例如Sambrook等，分子克隆实验室手册(MolecularCloning.A Laboratory Mannal.)，第二版，Cold Spring HarborLaboratory，纽约(1989)；Ausubel等(1997)，当代分子生物学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley & Sons，纽约]，制备和组装在本发明方法中有用的这些核苷酸序列。这些第一和第二分子可以是独立的直链或环状核苷酸结构。或者，它们可以是环状质粒。再或者，它们可以被置于单个分子上。作为另一种可选择的方案，由第一核苷酸序列产生的两个或多个蛋白质可以相联形成同二聚体或异二聚体，以产生单个转录因子。
一旦制备完成，即可以通过任何常观方法例如转染、电穿孔、脂质体递送、膜融合技术、高速的DNA包被丸粒、病毒感染和原生质体融合等，将这些分子导入选定的细胞中。或者，当这些分子被制成RNA分子时，可以通过常规重组技术将它们设计成作为所选病毒的部分。对于昆虫和植物细胞，实施本发明可能仅需要含有LBD、DBD和反式激活域的一个第一核苷酸序列和一个第二核苷酸序列。对于哺乳动物细胞和酵母细胞，可能需要至少两个“第一”核苷酸序列和一个第二核苷酸序列以及任选的辅因子来实施本方法。
为了易于本发明的使用，优选将检测组合物的细胞或病毒制备成活的未冰冻形式或活的冻干形式。上述定义的任何一种细胞一旦转录了第一和第二核苷酸分子之后，即可以通过常规方法例如那些在常规教科书中讲授的方法进行冻干。
甚至更优选地，将该冻干细胞或病毒检测组合物固定在固相支持物上。适合的固相支持物包括微量比色池、微胶囊、微量滴定板、小珠和生物芯片。有用的支持物包括那些尤其是描述于如下文献中的支持物1999年6月3日公开的国际专利申请WO99/27351；或1999年6月3日公开的国际专利申请WO99/27140；美国专利6,096,273；2000年3月16日公开的国际专利申请WO00/14197。用于固定检测组合物的细胞或冻干细胞的这些固相支持物可以从许多已知的商业上可获得类型中进行选择；而且这些支持物的厂商提供了用于将该细胞或病毒结合在这些支持物上的方法。在再一个实施方案中，该支持物可以是用于例如固体产品的粘合剂。
D.方法的实施因此本发明方法依赖于本发明所选产品之中或之上配体标记物的存在。为了检测产品中配体标记物的存在或对其进行定量，将该产品与以上定义的一或多个检测组合物接触。如果将配体标记物施用于固体产品，而非液体产品，则可以从该固体产品中提取配体标记物。为了便于应用，优选该检测组合物含有固定化的上述转染细胞或RNA病毒。例如，当产品试样被置于固定在生物芯片上的检测组合物之上时，配体标记物优选与该固定化细胞中的LBD结合。该结合导致配体依赖性转录因子的构象改变，从而使DBD与第二核苷酸分子上的RE形成复合物。DBD和RE之间形成的复合物激活第二启动子，从而调节外源报道基因的表达。
各种成分彼此结合的顺序，即配体标记物与LBD-DBD-反式激活域序列的结合以及DBD与效应元件的结合的顺序，并不是关键的。然而，标记配体的存在对于开启报道基因表达或关闭报道基因表达或改变报道基因表达，并籍此产生指示该配体标记物存在的可检测信号或可检测的信号改变是绝对必需的。如果产品中不存在配体标记物，则不能检测到信号改变。
E.检测试剂盒可以容易地将本方法的成分制备成试剂盒，该试剂盒含有适于检测液体或固体产品中配体标记物的一或多个检测组合物、用于在适合保存报道基因或报道基因系统所产生信号的可检测性质的环境中容纳样品和/或大量本发明检测组合物的适合容器、和/或与报道基因产物相互作用产生可检测信号的适合底物。本发明的试剂盒可以含有相同或不同的检测组合物，因此可以采用相同的检测组合物或多种检测组合物检测许多样品。此外，如果需要的话，这些试剂盒还可以含有培养所述细胞所必需的试剂；和/或重新活化该冻干细胞或裂解物所必需的试剂；实施检测试验的说明书、该检测组合物所预先吸附的冻干状态的底物、稀释剂和缓冲液、用于比较信号的指示图、一次性手套、排除污染的说明书、敷药签或容器，及样品准备杯。为了方便，优选提供冰冻、冻干、或者其它方式保存的细胞，这些细胞在重新活化后表达本发明的检测组合物。本发明的试剂盒可以含有组成型表达本发明报道蛋白质的完整细胞，或仅在诱导后表达该报道蛋白质的细胞，或只要不加入抑制剂即可表达的细胞。优选地在这些试剂盒中包括相应的诱导剂或抑制剂。而且，该试剂盒优选包括重新活化保存的表达系统所必需的溶液。只要所用的表达系统需要，该试剂盒还优选含有必需的缓冲物质或培养基。
本发明试剂盒对于快速筛选大量样品是否存在配体标记物是有用的。因此，根据本发明的应用与以上已详细讨论的本发明方法一致，由此使用本发明试剂盒使得用户可以以一种简单快速的方式确定产品的来源或掺假，本发明试剂盒优选提供用户所有必需的成分。
F.实施例以下实施例举例说明了本发明的这些方法和组合物的几个实施方案。这些实施例仅是说明性的，并不限制本发明的范围。
受体质粒pIE1VP16CfEcRCDEF含有与VP16激活域融合并且其表达处于杆状病毒IE1启动子的控制之下的CfEcR CDEF域。该质粒的构建有两个步骤。为了构建载体pIE1VP16，采用附有NdeI和Bg1II限制性酶位点的引物扩增AcMNPV(描述于Ayres等，引文同上)的IE1启动子区。将该扩增产物克隆至含有VP16激活域(描述于Pellett等，见上)、和多克隆位点及随后的SV40 polyA信号的质粒载体中。采用附有BamHI和XbaI的引物扩增CfEcR CDEF域(描述于Kothapalli等，见上)。然后将该扩增的CfEcRCDEF克隆至pIE1VP16载体中。
报道质粒pMK43.2含有来自热休克蛋白质27基因(描述于Riddihough和Pelham，EMBO J.63729-3734(1987))的6X蜕皮激素效应元件，其克隆在醇脱氢酶最小启动子和大肠杆菌β-半乳糖苷酶报道基因的上游。该质粒的构建描述于M.R.Koelle等，细胞6759-77(1991)。
当这两个质粒被转染至宿主细胞中后，该基因开关按如下方式运作。在上述受体质粒中杆状病毒IE1启动子组成型地产生EcR蛋白质，该蛋白质以无活性形式表达在该所选宿主细胞的细胞质中。在另一实施方案中，可以将该EcR蛋白置于组织特异性诱导型或发育调节型启动子的控制之下，以控制EcR在宿主中表达的时间选择和位置。该EcR蛋白向细胞核迁移并与存在于上述报道质粒中的称作效应元件的特异DNA序列结合。该效应元件是宿主DNA中天然所没有的独特DNA序列，被EcR蛋白质特异识别。该效应元件功能上与目的受调节基因相连，在该实施方案中该目的受调节基因是报道基因β-半乳糖苷酶。
当该细胞在例如实施例3或4的分析试验之一暴露于该细胞的样品中与配体标记物接触后，该配体标记物与EcR受体结合，并激活该受体，“打开”该β-半乳糖苷酶基因的表达并由此产生该基因所编码的蛋白质。以下描述的分析试验被设计用于对该报道基因进行鉴定和测量。实施例2标记溶液的制备向100ml容量瓶中加入1.0166g配体标记物，methoxyfenoxide(N’-叔丁基-N’-(3，5-二甲基苯甲酰基)-3-甲氧基-2-甲基苯并酰肼)。用无水乙醇将该溶液稀释至100ml体积，获得溶液A。1ml溶液A含有大约10mg配体标记物。
将10ml(±0.04ml)上述溶液A加入100ml容量瓶中制备溶液B。用无水乙醇将所获得的溶液稀释至100ml体积。所获的溶液B 1ml含有大约1mg配体标记物。
将10ml(±0.04ml)上述溶液B加入100ml容量瓶中制备溶液C。用无水乙醇将所获得的溶液稀释至100ml体积。所获的溶液C 1ml含有大约0.1mg配体标记物。
为了制备用于在以下的酵母和昆虫分析试验中进行测试的样品溶液，将1ml(±0.12ml)A、B或C贮存液加入大约100g汽油或伏特加酒中，总结于下表1中
将表1中的样品以1∶100稀释在乙腈/水(1/1)中后，通过液相色谱/质谱分析(LC/MS)在HP1000-VG平台上对每个汽油和伏特加酒样品中的配体标记物浓度进行定量。LC包括采用25μl的注射体积在3×50mm C-18柱(Polaris Metachem)上进行的梯度分离。该MS采用信号离子监测模式特异检测配体标记物分子的离子。所有的HPLC标准品均在乙腈/水(1/1)中制备。通过分析物浓度(面积)和在每套配体标记物(汽油或伏特加酒的A、B和C溶液)之前和之后分析的5个标准浓度(面积)之间的比较，进行定量。结果总结在表2中。
表2
这些结果说明，可以采用常规分析化学检测(例如色谱方法)检测汽油和伏特加酒样品中配体标记物的存在。实施例3基于昆虫细胞的配体标记物分析试验昆虫细胞系BRL-AG2来源于棉铃象(Anthomus grandis)(参见Stiles等，In Vitro Cell Dev.Biol.，28A355-363(1992))。修饰黄猩猩果蝇Kc细胞系使蜕皮激素受体的表达沉默，制备了另一个昆虫细胞系L57。用以上实施例1描述的受体质粒和报道质粒转染每一个昆虫细胞系。
在该基于昆虫细胞的配体标记物分析试验中，在48孔板的每孔中分配200,000个上述转染的BRL-AG2细胞或L57细胞。向这些细胞中加入0.5μl阴性对照例如BMSO，或实施例2的标记产品(伏特加酒或汽油)。这些细胞在含有实施例2的配体标记物溶液或阳性对照(即溶在乙醇中的methoxyfenoxide)或阴性对照(仅乙醇)的培养基中25℃维持48小时。收获这些细胞并将其重悬在报道裂解缓冲液(Promega公司，Madison，WI)中15分钟。采用Galacto-StarTM化学发光报道基因分析系统(Tropix公司，Bedford，MA)，分析含有该重悬细胞的10μl缓冲液试样的β-半乳糖苷酶活性。通过用无配体标记物时的相对光单位(RLU)除配体标记物存在时的RLU，计算诱导倍数。
结果列表于下表3和4中。
表3伏特加酒中标记物的检测
表4汽油中标记物的检测
这些细胞甚至在50μl伏特加酒或汽油时仍表现健康。配体标记物导致大约20-50倍诱导的报道活性。每ml标记产品含有0.5μl配体标记物已足以观察到报道活性的明显改变。这些结果显示了与实施例3的化学方法相比，配体标记物增加了至少10×的灵敏性。因为该生物学分析试验在所测试的最低浓度时已达到饱和，所以可以对该生物学分析试验中的标记物溶液作进一步稀释。该生物学分析试验结果类似化学分析，因为这些汽油样品也表现出较低的配体标记物浓度。这个迹象可能是由于在计算这些汽油样品中配体标记物浓度时产生的误差所致。
所有以上引用的文献均以参考文献形式并入本文。本发明的多种修改和变动也包括在以上给出的说明书中，并应当是本领域技术人员所明了的。对本发明组合物和方法进行的这些修改和变动被认为包括在此后所附及的权利要求的范围内。
权利要求
1.鉴定产品的方法，所述方法包括步骤(a)使所述产品与配体标记物相联；(b)作为鉴定该产品的一种手段，在其后的时间点通过所述产品与如下组合物接触，检测所述产品、所述产品的部分或所述产品的提取物中的所述配体标记物，其中所述组合物含有(1)编码一个或多个天然或合成的配体依赖性转录因子的一个或多个第一核苷酸序列，其中所述因子含有至少一个配体结合域、至少一个DNA结合域和至少一个反式激活域；和(2)编码处于受体效应元件或者修饰或合成的效应元件、及第二启动子的调节控制之下的报道基因的第二核苷酸序列；其中所述配体标记物和所述至少一个配体结合域之间的相互作用是高度特异的，并诱导所述报道基因表达的改变，所述改变产生可检测信号，从而能够鉴定所述产品中所述配体的存在。
2.根据权利要求1的方法，其中所述转录因子处于第一启动子的调节控制之下。
3.根据权利要求1的方法，其中所述反式激活域是配体结合域增强激活的羧基端部分。
4.根据权利要求1的方法，其中所述反式激活域是独立于所述配体结合域的序列。
5.根据权利要求1的方法，其中所述组合物还含有编码与配体依赖性转录因子相互作用从而激活或抑制所述报道基因表达的辅激活物或辅阻遏物的第三核苷酸序列。
6.根据权利要求1的方法，其中将所述产品与和配体依赖性转录因子相互作用从而激活或抑制所述报道基因表达的辅激活物或辅阻遏物接触。
7.根据权利要求1的方法，其中所述配体依赖性转录因子是核受体超家族蛋白质或其功能性片段。
8.根据权利要求1的方法，其中所述配体依赖性转录因子是具有核受体超家族蛋白质的转录激活性质的修饰蛋白质或合成蛋白质。
9.根据权利要求7的方法，其中所述因子是修饰的昆虫核受体超家族蛋白质。
10.根据权利要求7的方法，其中所述因子选自由蜕皮激素、雌激素、视黄醛衍生物X、孕酮、据皮质激素、维生素D、视黄酸和过氧化物酶体增殖受体蛋白组成的核受体超家族成员。
11.根据权利要求1的方法，其中所述因子选自四环素诱导型lac操纵子和IPTG诱导型受体蛋白、内酯受体蛋白和阿拉伯糖诱导型蛋白。
12.根据权利要求1的方法，其中所述组合物是含有所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列的细胞。
13.根据权利要求12的方法，其中所述细胞是真核细胞。
14.根据权利要求12的方法，其中所述细胞是原核细胞。
15.根据权利要求12的方法，其中将所述细胞被固定在固相支持物上。
16.根据权利要求1的方法，其中所述配体标记物与所述配体结合域的所述结合触发该DNA结合域与所述效应元件的结合，其中所述结合的效应元件激活或抑制所述报道基因的表达。
17.根据权利要求1的方法，其中所述组合物含有多个不同的配体结合域，它们相互联接以提供单个受体。
18.根据权利要求1的方法，其中所述组合物含有单个配体结合域。
19.根据权利要求1的方法，其中所述配体结合域选自类固醇/甲状腺激素核受体超家族成员的配体结合域、其合成或重组修饰的域、所述域的片段、和其类似物。
20.根据权利要求1的方法，其中所述DNA结合域介导所述配体依赖性转录因子与所述第二核苷酸序列的所述效应元件结合。
21.根据权利要求20的方法，其中所述DNA结合域与所述配体结合域异源。
22.根据权利要求20的方法，其中所述DNA结合域选自GAL4的DNA结合域、LexA的DNA结合域、转录因子的DNA结合域、类固醇/甲状腺激素核受体超家族成员的DNA结合域、细菌LacZ的DNA结合域、酵母细胞的DNA结合域、植物细胞的DNA结合域、病毒的DNA结合域、人工锌指区、它们的合成或重组的类似物、组合或修饰。
23.根据权利要求1的方法，其中当该配体与所述配体结合域结合时，所述反式激活域加强了该配体依赖性转录因子的构象改变。
24.根据权利要求23的方法，其中所述反式激活域选自类固醇/甲状腺激素核受体激活域、合成的或嵌合的激活域、聚谷氨酰胺激活域、碱性或酸性氨基酸激活域、病毒激活域、植物病毒激活域、或VP16、GAL4、NF-kB或BP64激活域、修饰的激活域、任一所述激活域的片段和它们的修饰物。
25.根据权利要求24的方法，其中采用一个以上的激活域来增加激活的强度。
26.根据权利要求1的方法，其中所述效应元件选自GAL4、类固醇/甲状腺激素核受体的效应元件、人工锌指、LexA操纵子、lac操纵子的效应元件、以及合成的或重组制备的识别DNA结合域的效应元件。
27.根据权利要求1的方法，其中所述第一启动子调节所述因子在所选择的宿主细胞或病毒中的表达。
28.根据权利要求2的方法，其中所述第一启动子是组成型启动子。
29.根据权利要求1的方法，其中所述第二启动子调节所述报道分子在选择的宿主细胞中的诱导型表达，并仅当存在由该配体标记物、该配体依赖性转录因子和所述效应元件形成的复合物时起始或抑制所述报道基因的转录。
30.根据权利要求2的方法，其中所述第一个和第二启动子相同。
31.根据权利要求30的方法，其中所述第二启动子是诱导型启动子。
32.根据权利要求1的方法，其中所述报道基因所产生的信号可以通过选自以下的方法来检测目测、显微镜检测、紫外光检测、电检测、电容值的改变、杂交、红外检测、荧光检测和核磁共振。
33.根据权利要求32的方法，其中所述报道基因是编码荧光蛋白或发光蛋白的基因。
34.根据权利要求32的方法，其中所述报道基因编码与底物相互作用产生可检测信号的蛋白质。
35.根据权利要求32的方法，其中所述报道基因直接或间接地导致所述可检测信号的发射光谱的红移或蓝移。
36.根据权利要求34的方法，其中所述蛋白质是能够催化产生可检测信号的酶。
37.根据权利要求1的方法，其中所述配体标记物是与所述配体结合域特异结合的分子。
38.根据权利要求37的方法，其中所述配体标记物是能够特异地与选定的配体结合域相互作用的小分子。
39.根据权利要求35的方法，其中所述配体是合成的化合物。
40.根据权利要求38的方法，其中所述配体标记物选自松甾酮A、muristerone A、烷基替酰肼、N，N’-二酰基酰肼、N-取代-N，N’-二酰基酰肼、N-取代-N， N’-双取代酰肼、二苯甲酰烷基氰基酰肼、N-烷基-N，N’-二芳酰基酰肼、N-酰基-N-烷基-N’-芳酰基酰肼、3，5-二叔丁基-γ-羟基-N-异丁基苯甲酰胺、8-O-乙酰基哈帕苷。
41.根据权利要求1的方法，其中所述产品选自液体、固体、分散体、乳剂或胶乳。
42.根据权利要求41的方法，其中所述配体标记物直接与所述产品相混合。
43.根据权利要求41的方法，其中该产品是固体，将该配体标记物施加在该产品的表面，或与该产品相关的标签或包装材料上。
44.根据权利要求41的方法，其中所述配体以十亿分之0.1至10的浓度存在于所述液体产品中。
45.根据权利要求41的方法，其中所述配体以十亿分之10至约500的浓度存在于所述固体产品中。
46.含有与如下配体标记物相联的液体、固体、分散体、乳剂或胶乳的标记产品，其中所述配体标记物选自松甾酮A、muristerone A、烷基替酰肼、N，N’-二酰基酰肼、N-取代-N，N’-二酰基酰肼、N-取代-N，N’-双取代酰肼、二苯甲酰烷基氰基酰肼、N-烷基-N，N’-二芳酰基酰肼、N-酰基-N-烷基-N’-芳酰基酰肼、3，5-二叔丁基-γ-羟基-N-异丁基苯甲酰胺、8-O-乙酰基哈帕苷。
47.一或多种细胞，其含有(a)编码一个或多个天然或合成的配体依赖性转录因子的一个或多个第一核苷酸序列，其中所述因子含有至少一个配体结合域、至少一个DNA结合域和至少一个反式激活域；和(b)编码处于受体效应元件或者修饰或合成的效应元件、及第二启动子的调节控制之下的报道基因的第二核苷酸序列；其中所述配体标记物和所述至少一个配体结合域之间的相互作用是高度特异的，并诱导所述报道基因表达的改变，所述改变产生鉴定所述配体标记物存在的可检测信号。
48.鉴定标记产品的试剂盒，其含有(a)检测组合物，其含有(1)编码一个或多个天然或合成的配体依赖性转录因子的一个或多个第一核苷酸序列，其中所述因子含有至少一个配体结合域、至少一个DNA结合域和至少一个反式激活域；和(2)编码处于受体效应元件或者修饰或合成的效应元件、及第二启动子的调节控制之下的报道基因的第二核苷酸序列；其中所述配体标记物和所述至少一个配体结合域之间的相互作用是高度特异的，并诱导所述报道基因表达的改变，所述改变产生鉴定所述配体标记物存在的可检测信号；和(b)检测和测量所述信号的方法。
49.根据权利要求48的试剂盒，其中所述组合物(a)选自一种或多种细胞和一种或多种冻干细胞。
50.根据权利要求48的试剂盒，其还含有至少一种选自以下的成分培养所述一种或多种细胞所必需的试剂、重新活化所述一种或多种冻干细胞或细胞裂解物所必需的试剂；实施检测分析试验的说明书、该组合物预先吸附的冻干状态的底物、稀释剂和缓冲剂、用于信号比较的指示图、一次性手套、消除污染的说明书、敷药签或容器、和样品准备杯。
51.检测组合物，其含有(a)活细胞，其含有(1)编码一个或多个天然或合成的配体依赖性转录因子的一个或多个第一核苷酸序列，其中所述因子含有至少一个配体结合域、至少一个DNA结合域和至少一个反式激活域；和(2)编码处于受体效应元件或者修饰或合成的效应元件、及第二启动子的调节控制之下的报道基因的第二核苷酸序列；其中所述配体标记物和所述至少一个配体结合域之间的相互作用是高度特异的，并诱导所述报道基因表达的改变，所述改变产生鉴定所述配体标记物存在的可检测信号；和(b)固定所述细胞的固相支持物。
52.根据权利要求51的组合物，其中所述支持物选自微量比色池、微胶囊、微量滴定板、小珠和生物芯片。
53.根据权利要求51的组合物，其中所述一种或多种细胞是冻干的。
全文摘要
鉴定产品的方法,其包括步骤:(1)使该产品与配体标记物联接;和(2)作为鉴定该产品的一种手段在其后的时间点通过该产品与检测组合物接触,检测该产品中的配体标记物。该检测组合物含有编码一个或多个天然或合成的配体依赖性转录因子的一个或多个第一核苷酸序列,其中所述因子含有至少一个配体结合域、至少一个DNA结合域和至少一个反式激活域;和编码处于受体效应元件或者修饰或合成的效应元件,及第二启动子的调节控制之下的报道基因的第二核苷酸序列。该检测组合物、含有该第一和第二核苷酸序列的细胞系、采用它们的试剂盒、及用该特异配体标记物标记的产品在此方法中均是有用的。
文档编号C12Q1/02GK1350062SQ01135800
公开日2002年5月22日 申请日期2001年10月17日 优先权日2000年10月17日
发明者B·温斯坦, L·H·凯勒, S·R·帕里 申请人:罗姆和哈斯公司