专利名称：冰核活性基因、表达载体和工程菌的制作方法
技术领域：
本发明属于生物防治技术领域。进一步，本发明涉及冰核活性基因、其克隆方法、表达载体和工程菌。更进一步，本发明涉及冰核基因序列、冰核活性蛋白的氨基酸序列，冰核基因多宿主转移和染色体整合的表达载体mob-Tn5-iceA。
本发明的研究背景一些细菌能产生在-5℃以上具催化活性的冰核，这些细菌被称为冰核细菌。据报道，细菌中的20多个种或变种可产生自然界活性最强的异质冰核；冰核细菌的冰核活性是由冰核活性基因决定的。克隆的细菌冰核蛋白基因，可在环境安全(environmentally safe)或遗传安全(genetically regarded as safe)菌株中高效表达，可用于细菌细胞表面展示、高敏检测和作报道基因，显示良好应用前景。冰核细菌和冰核基因表达的冰核蛋白可在较高温度(-1～-5℃)下催化水结冰，可以应用在促冻杀虫、人工造雪、制冰、食品的冷冻浓缩、冷冻干燥和质地加工等方面。
自Orser(Orser，C.等，J.Bacteriol.，1985，164359-366)从Erwinia herbicola中克隆到第一个冰核基因iceE以来，已先后有7个细菌冰核基因先后得到克隆和测序。细菌冰核基因克隆通常采取两种方案，早期的Orser等人(Orser，C.等，J.Bacteriol.，1985，164:359-366)构建了P.syringae和E.herbicola的基因文库，并用复制冻结技术(replica freezing technique)直接筛选冰核活性阳性克隆。细菌冰核基因的另一种克隆途径是利用同源冰核基因片段制备探针，从基因组文库中钓取目标基因，如Michigami等(Michigami，Y.等，Biosci.Biotech.Biochem.，1994，58763-764)从E.uredovora KUIN-3中分离到一个新的冰核基因inaU。目前，还无人利用PCR的方法克隆到冰核活性基因，也没有把冰核活性基因整合到染色体DNA上的转基因工程菌。
因此，用PCR的方法获得冰核基因，并把冰核基因整合到染色体DNA上获得转基因促冻杀虫基因工程菌，就具有很强的实用性。
本发明的内容本发明的目的我国“三北”地区重要农林果树害虫包括有玉米螟、棉铃虫、草地螟、大豆食心虫、松毛虫、光肩星天牛等二十几种，此外还有仓储害虫，它们经常造成巨大的经济损失。在人们意识到单纯化学防治所带来的种种弊端后，生物防治措施才得以重视。这些害虫在冷冬季节越冬死亡率高、暖冬季节死亡率低，而越冬死亡率高低是决定翌年危害程度的重要因素，压低越冬虫源基数是控制害虫发生的有效措施。冰核细菌促冻杀虫理论已确凿无疑，但却难以应用现有的这些野生型冰核细菌来冻杀田间和仓储越冬害虫，主要原因有两个其一，目前用于促冻杀虫研究的冰核细菌在昆虫肠道内不能稳定定殖，田间施用后易被虫体排出体外而失去冻杀效果；其二，这些冰核细菌在植物体上附生定殖能力强，田间施用后易诱发霜冻。这两方面原因已成为阻碍促冻杀虫应用中的世界性难题。
本发明利用PCR方法获得细菌冰核基因，然后利用该基因构建一种mob-Tn5-iceA表达载体；进一步，利用该载体和适合的宿主菌构建了适于冻杀田间越冬害虫和仓储害虫的促冻杀虫基因工程菌，并完成对玉米螟和棉铃虫冻杀效果的测试工作。
本发明的技术方案1.菠萝欧文氏菌110菌株中iceA基因的克隆参照《精编分子生物学实验指南》商法提取菠萝欧文氏菌(Erwiniaananas)110的染色体DNA，电泳检测(
图1)。以菠萝欧文氏菌110染色体DNA为模板，用高保真DNA Taq plusI DNA多聚酶进行PCR扩增冰核基因。实验参照《现代分子生物学实验技术》进行。所用引物如下引物1(+)(正向引物)5’CCCTAATGAAAT TTTAGACATG3’27bp引物1(-)(反向引物)5’CCTCTGTTATGGCGATTATTCTTCGGG3’27bp利用琼脂糖电泳检测扩增结果(图2)。按照TaKaRa Biotech公司提供的PCR片断回收试剂盒(Fragment Recovery Kit)，按照说明书从凝胶中回收4.0kb PCR产物，把PCR回收产物与pMD18-T克隆载体连接，转化大肠杆菌JM109，根据冰核活性检测和酶切鉴定得到阳性克隆(表1)，该阳性克隆命名为pINA105。碱裂解法提取该重组质粒，用位于pMD18-T载体克隆位点两侧的EcoRI和SalI进行单、双酶切，鉴定目的基因与克隆载体的连接(图3)。DNA序列测定由上海博亚生物工程公司完成，同源性分析表明，与冰核基因inaA的同源性最大，氨基酸和核苷酸同源性均为94％。该基因命名为iceA，在Genebank上登录，登录号为AF387802。
2.mob-Tn5-iceA(简称pSZice1)质粒构建提取pINA105和pSZ21质粒(该质粒由中科院上海植生所沈炳福先生提供)DNA，分别用BamHI+SalI进行双酶切，回收约4.0Kb的冰核基因片段和约11Kb的pSZ21载体片段。酶切体系于37℃温育2-4小时，用1％琼脂糖电泳检测酶切结果(图7)。采用Tataka PCR片断回收试剂盒回收酶切片段。定向连接酶切回收的冰核基因与载体pSZ21片段，保证反应体系中的pINA105和pSZ21酶切回收片段的摩尔比在3∶1以上。取5uL连接产物用于转化JM109感受态细胞，在LB/Km+Cm平板上涂板。随机挑取几个单菌落提取质粒，分别用BamHI+Sa1I进行双酶切(图8、图9)，筛选保存阳性克隆。挑取阳性克隆JM109(pSZice1)用Vali小液滴冻结法测定冰核活性(表1)。
3.促冻杀虫基因工程菌的构建采用接合转移方法将重组质粒mob-Tn5-iceA导入阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)Enc1.2.022、Enc1.181中。Vali小液滴冻结法测定冰核活性。通过Tn5转座子的转座作用将冰核基因整合至阴沟肠杆菌染色体DNA上，构建冰核活性稳定的转基因工程菌。实现冰核基因组成型表达的重组菌株定名为Enc181ice和Enc2022ice。用Vali小液滴冻结法测工程菌株冰核活性验证冰核基因的稳定性(表1)。
4.促冻杀虫生物活性测定工程菌经LB平板培养后配成菌液。把新鲜棉花叶充分浸沾上步制备的菌液，用风扇吹干后备用。初孵化幼虫用未醮菌新鲜棉叶23±1℃饲养3天，然后用醮菌棉叶继续饲养。棉铃虫饲菌3天后23±1℃下饥饿12小时，再置4℃下预冷24小时，人工霜箱中测定虫体过冷却点。剩余的虫子用未醮菌新鲜棉叶继续于23±1℃下单管饲养，3天后取1次样，样品经饥饿和低温处理后测定过冷却点。此后，依次在第5、7、9天取样测定，每次每处理取10～20头虫子进行实验。从测定完过冷却点的虫子中随机取5头虫子，虫体经75％乙醇表面消毒20秒，灭菌dH2O冲洗3次后在研钵中研碎，dH2O稀释不同倍数后在LB平板(添加20ug/mL Km和1ug/mL两性霉素)上涂布，待长出菌落后通过菌落形态及冰核活性测定来鉴定并统计工程菌数量。玉米嫩茎1～1.5cm小段，放到菌液中浸后吹干备用。初孵玉米螟幼虫用未浸菌玉米嫩茎23±1℃下饲养3天，然后用浸菌玉米嫩茎继续饲养。玉米螟饲菌3天后23±1℃下饥饿12小时，再在4℃下预冷24小时，人工霜箱中测定虫体过冷却点。剩余的虫子用未浸菌玉米嫩茎23±1℃下继续饲养，3天后取1次样，样品经饥饿和低温处理后测定过冷却点。此后，依次在第5、7、9天取样测定，每处理每次取10～20头虫子用于测试。用上述测定棉铃虫肠道内工程菌数量的方法测试玉米螟肠道内的工程菌数量。用饲菌后6天的玉米螟和棉铃虫作低温处理实验，以未饲菌的相近虫龄玉米螟和棉铃虫作对照。将试验昆虫置于人工霜箱内，按10℃/小时的速度降温，待降到所需温度(-5℃、-7℃)后，分别保持不同时间(3小时、6小时、12小时)，轻触虫体以判断是否冻结，待在相应温度下处理12小时后，将虫子取出放在23±1℃下放置1小时，统计死亡率。
本发明的有益效果利用本发明构建的表达载体mob-Tn5-iceA，可将对昆虫害虫具有促冻杀虫作用的iceA基因转化导入阴沟肠杆菌菌株中，并整合到染色体DNA上，实现基因的高效表达，这种基因表达产物对害虫有促冻杀虫作用；进一步，通过本发明可使iceA基因工程菌冻杀玉米螟和棉铃虫；并且，本发明所涉及的克隆方法、iceA基因序列、氨基酸序列、转基因工程菌、表达载体mob-Tn5-iceA亦为本发明所特有。
其中，道M、1、2、3和4分别代表λDNA/HindIII；菌株94；菌株110；菌株1850；菌株M232A。
图2为冰核基因的PCR扩增结果。
其中，道M、1、2、3和4分别代表λDNA/HindIII；菌株M232A；菌株110；菌株94；菌株1850的扩增结果。
图3为重组质粒的酶切鉴定结果。
其中，道M、1、2、3、4、5、6、7、8和9分别代表λDNA/HindIII；No 1-3transformants/EcoRI；No 1-3/SalI；No 1-3/E+S的酶切结果。
图4为核酸外切酶III消化质粒pINA105不同时间后产生的片段。
其中，道M1、M2、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23和24分别代表λDNA/HindIII；λDNA/EcoRI+HindIII；核酸外切酶III消化质粒pINA105不同时间后产生的片段。
图5为缺失突变体的酶切鉴定结果。
其中，道M1、M2、1、2、3、4、5和6分别代表λDNA/HindIII；λDNA/EcoRI+HindIII；不同突变株的EcoRI+HindIII酶切。
图6为缺失突变体的PCR鉴定结果。
其中，道M1、M2、1、2、3、4、5和6分别代表λDNA/HindIII；λDNA/EcoRI+HindIII；不同突变株的PCR。
图7质粒pSZ21和pINA105的酶切鉴定。
其中，道M、1、2和3分别代表λDNA/HindIII；pSZ21用BamHI酶切；pSZ21用BamHI+SalI酶切；pINA105用BamHI+SalI酶切。
图8为重组质粒pSZice1～6电泳图谱。
其中，道M、1、2、3、4、5和6分别代表λDNA/HindIII；pSZice1～6图9为重组质粒pSZice1～6的酶切分析。
其中，道M、1、2、3、4、5和6分别代表λDNA/HindIII；pSZice1～6用BamHI+SalI酶切。
图10为重组质粒mob-Tn5-iceA(pSZice1)的构建流程图。
图11为重组质粒pSZice1接合转入阴沟肠杆菌并发生转座后的电泳分析。
其中，道M、1、2、3和4分别代表λDNA/HindIII、Enc1.181(pSZice1)、Enc1.2022(pSZice1)、Enc181ice和Enc2022ice。
图12为工程菌株的PCR鉴定结果。
其中，道M、1、2、3和4分别代表λDNA/HindIII、Enc181ice、Enc2022iceEnc1.181和Enc2.2022。
本发明的具体实施方案以下叙述本发明的实施例。应该说明的是，本发明的实施例对于本发明只有说明作用，而没有限制作用。
需特别指出的是，尽管在实施例中详尽描述了冰核基因的克隆、在大肠杆菌中表达、整合到阴沟肠杆菌染色体DNA中并高效表达，然而这并不意味本发明的基因只限于用阴沟肠杆菌菌株进行转化和生产具有对害虫有促冻杀虫作用的工程菌。
因此，使用本发明所描述的iceA基因促冻杀虫，使用本发明所描述表达载体，以本领域普通技术人员所具有的任何一种方法导入任何微生物、植物或其组织或细胞中，以及由此而获得的具有任何冰核活性的微生物、植物，以及该类植物后代的种子、杂交和转育后代，均包括在本发明所要求的权利范围之内。
实施例1、菠萝欧文氏菌110-菌株中iceA基因的克隆参照《精编分子生物学实验指南》(颜子颖、王海林译，科学出版社，北京，1998)提取菠萝欧文氏菌110菌株的染色体DNA，作为PCR扩增模板。以菠萝欧文氏菌94、110、1850和M232A染色体DNA为模板，根据国外已克隆冰核基因设计引物，引物由上海生工生物公司合成。用高保真DNA Taq plusI DNA多聚酶进行PCR扩增冰核基因。
Primer1(+)(正向引物)5’CCCTAATGAAAT TTTAGACATG3’27bpPrimer1(-)(反向引物)5’CCTCTGTTATGGCGATTATTCTTCGGG3’27bp实验参照《现代分子生物学实验技术》(卢圣栋，高等教育出版社，北京，1993)进行。用1％琼脂糖电泳检测扩增结果。对冰核活性菌株扩增出约4Kb的1条特异性条带(图2)。PCR回收产物与pMD18-T克隆载体连接，连接产物转化JM109感受态细胞，转化参照Promega公司的《Protocols and ApplicationsGuide》(1996，Promega Corporation)第51-54页和文献(金冬雁、黎孟枫，分子克隆实验指南(第二版)，北京，科学出版社，1993626～628)进行。在转化平板上用牙签随机挑取数个白色菌落，分别置于加有200uL灭菌dH2O的EP管中制成菌悬液，用Vali小液滴冻结法测定菌悬液冰核活性(Vali，G.J.，Atmos.Sci.，1971，28402-409)。
用碱裂解法提取重组质粒，用位于pMD18-T载体克隆位点两侧的EcoRI和SalI进行单、双酶切重组质粒，鉴定目的基因与克隆载体的连接情况。单酶切均产生1个约6.7Kb(载体和扩增产物长度之和)的片段，双酶切均产生2.6Kb(载体)和4Kb(扩增产物)的2个片段。冰核活性测定和酶切结果表明已得到插有目的片段(冰核基因)的阳性克隆，将转化子所带的重组质粒命名为pINA105。采用Sanger双脱氧链终止法对经酶切鉴定和冰核活性测定均为阳性的重组质粒进行序列测定。测序由上海博亚生物技术有限公司完成，基因中间的高度重复序列(约600bp)采用ExonucleaseIII(Exo III)处理重组质粒生成嵌套缺失突变体后进行定向测序，实验操作参照《分子克隆实验指南》和MBI公司(加拿大)的Exo III使用说明书进行，选取可产生1.6～2.3Kb的克隆用于测序(上海博亚公司完成，采用M13R(-48)引物)(图4，图5，图6)。所克隆基因编码区全长3921bp(SEQ ID NO 1)，编码的蛋白质为1306个氨基酸(SEQ ID NO 2)。二者的对应排列关系列于SEQ ID NO 3。
实施例2、原核表达载体mob-Tn5-iceA(简称pSZice1)的构建提取pINA105和pSZ21质粒DNA，分别用BamHI+SalI进行双酶切和BamHI、SalI单酶切，回收约4.0Kb的冰核基因片段和约11Kb的pSZ21载体片段。反应体系于37℃温育2-4小时，用1％琼脂糖电泳检测酶切结果(图7)。采用TatakaPCR片断回收试剂盒回收酶切片段。定向连接回收的冰核基因与载体pSZ21片段，保证反应体系中的pINA105和pSZ21酶切回收片段的摩尔比在3∶1以上。反应体系在22℃温育2～4小时，65℃处理10分钟灭活T4DNA连接酶，取5uL连接产物用于转化JM109感受态细胞，在LB/Km+Cm平板上涂板，随机挑取几个单菌落提取质粒，分别用BamHI+SalI进行双酶切(图8、图9)，结果表明所选取的克隆均含有11Kb载体和4Kb的外源插入片段，因此均为预期的重组质粒，将1～6号重组质粒分别命名为pSZice1-6，将其中的pSZice1命名为mob-Tn5-iceA(图10)，从该命名可直接看出重组质粒中不同组分(mob片段、Tn5转座子和冰核基因iceA)间的位置关系。挑取阳性克隆JM109(pSZice1)单菌落接种5mL KB液体(含20ug/mL Km和50ug/mL Cm)，25℃、200rpm摇培48小时，4℃冰箱放置2小时，稀释至108CFU/mL，用Vali小液滴冻结法测定冰核活性(表1)。
实施例3、冰核基因工程菌构建采用接合转移方法将重组质粒pSZice1(mob-Tn5-iceA)导入阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)中(表1，图11)。挑取Enc(pSZice1)单菌落接种5mLKB(含Km和Cm)，25℃、200rpm摇培过夜4℃冰箱放置2小时后稀释配成108CFU/mL，Vali小液滴冻结法测定有冰核活性的重组菌株Enc(pSZice1)(表1)。在含Km和Cm的LB培养液中培养15小时，再以2％接种量分别转入5mL新鲜LB(不加抗生素)，培养12-15小时。如此转接5次以上，再转接到5mL含50ug/mL吖啶橙的LB培养液中，于30℃静止培养30小时后，以不同稀释度涂布LB平板，30℃培养过夜，再复印到选择培养基上观察生长情况，具有KmrCms表型的菌株应为冰核基因已整合到染色体上的重组菌(图12)，并实现冰核基因组成型表达的重组菌株定名为Encice。用Vali小液滴冻结法测定工程菌株的冰核活性(表2)。
表1不同菌株的冰核活性测定菌株冻滴率(％)Strains Percentages of freezing droplets(％)-10℃ -5℃ -4℃ -3℃JM109(pSZice1) 100 100 10094Enc1.181(pSZice1) 100 100 100100Enc1.2022(pSZice1) 100 100 10087Enc181ice100 100 100100Enc2022ice100 100 10092E.ananas110 100 100 100100JM109 0 00 0Enc1.1812 00 0Enc1.2022 0 00 0表2基因工程菌Enc181ice和Enc2022ice的冰核基因稳定性测定菌株无选择压力下连续转接不同次数后的Kmr菌落保有率(％)1次 4次 8次 12次Enc181ice100 100 100 100Enc2022ice100 100 100 100
实施例4、促冻杀虫生物活性测定工程菌经LB平板活化后，挑取单菌落接种LB液体(含Km 20ug/mL)，200rpm，33℃摇培12～15小时，离心弃上清，菌体用灭菌dH2O配成108～109cfu/mL菌液。从田间采回5～7叶期的新鲜棉花叶，充分浸沾上步制备的菌液，风扇吹干后备用。用毛笔将初孵化幼虫挑到装有未醮菌新鲜棉叶的玻璃管(2.5×7.5cm)内，每管1～2头，用棉塞封口，23±1℃饲养3天，然后用毛笔将虫子转到装有醮菌棉叶的玻璃管中，每管1头，继续饲养。
棉铃虫饲菌3天后，将部分虫子转移到管盖打孔的1.5mL EP管中，置于23±1℃下饥饿12小时，再置4℃下预冷24小时，然后于人工霜箱中测定虫体过冷却点，结果见表3。剩余的虫子转到装有未醮菌新鲜棉叶的玻璃管中，继续于23±1℃下单管饲养，3天后转1次管(装有未醮菌新鲜棉叶)，同时取1次样，样品经饥饿和低温处理后测定过冷却点。
此后，依次在第5、7、9天取样测定，每次每处理取10～20头虫子进行实验。棉铃虫取食工程菌Enc181ice和Enc2022ice后，棉铃虫取食基因工程菌后过冷却点明显提高，从对照虫体的-10℃左右提高到-3℃～-4℃，提高幅度约为6℃，两种工程菌处理对棉铃虫过冷却点的提高效果无明显差异(表3)。从测定完过冷却点的虫子中随机取5头虫子，虫体经70％乙醇表面消毒20秒，灭菌dH2O冲洗3次后在研钵中研碎，dH2O稀释不同倍数后在LB平板(添加20ug/mL Km和1ug/mL两性霉素)上涂布，待长出菌落后通过菌落形态及冰核活性测定来鉴定并统计工程菌数量。
表3棉铃虫取食基因工程菌(Enc181ice和Enc2022ice)后的过冷却点(SCPs)变化菌株 饲菌后不同时间虫体的过却点(X±SX，℃)0天 3天 5天7天9天Enc181ice-3.54±0.18-3.40±0.17-4.01±0.27-4.01±0.38-4.7±0.49Enc2022ice-4.07±0.19-3.74±0.23-3.70±0.26-4.08±0.34-4.83±0.31CK-9.83±0.87-9.53±0.43-10.04±0.43 -9.39±0.79-9.23±0.82从田间取喇叭口期玉米嫩茎(顶部1～2节)，用剪刀剪成1～1.5cm小段，放到菌液中浸15～20分钟，取出后用风扇吹干备用。用毛笔将初孵幼虫挑到装有未浸菌玉米嫩茎的罐头瓶内，每瓶100～150头，用加了细铁丝网和一层餐巾纸的瓶盖封口，23±1℃下饲养3天，然后将虫子转到装有浸菌玉米嫩茎的罐头瓶内，每瓶50～100头，继续饲养。玉米螟饲菌3天后，将部分虫子转移到管盖打孔的1.5mL EP管中，置于23±1℃下饥饿12小时，再在4℃下预冷24小时，然后于人工霜箱中测定虫体过冷却点。剩余的虫子转到装有未浸菌玉米嫩茎的罐头瓶中，于23±1℃下继续饲养，3天后)转1次瓶(装有未浸菌玉米嫩茎)，同时取1次样，样品经饥饿和低温处理后测定过冷却点。此后，依次在第5、7、9天取样测定，每处理每次取10～20头虫子用于测试。玉米螟取食工程菌后，其过冷却点与对照相比显著提高，从-11℃～-17℃提高到-3℃～-4℃，提高幅度在10℃左右(表4)。从测定完过冷却点的虫子中随机取5头虫子，虫体经70％乙醇表面消毒20秒，灭菌dH2O冲洗3次后在研钵中研碎，dH2O稀释不同倍数后在LB平板(添加20ug/mL Km和1ug/mL两性霉素)上涂布，待长出菌落后通过菌落形态及冰核活性测定来鉴定并统计工程菌数量。
表4玉米螟取食基因工程菌(Enc181ice和Enc2022ice)后的过冷却点(SCPs)变化菌株 饲菌后不同时间虫体的过却点(X±SX，℃)0天3天 5天7天 9天Enc181ice-3.89±0.15-3.77±0.20 -4.24±0.18-3.68±0.35 -4.42±0.28Enc2022ice-3.81±0.17-3.96±0.51 -3.61±0.38-3.91±0.19 -4.51±0.35ck-16.82±1.30 -12.2±0.95 -10.78±0.81 -11.23±0.77 -11.56±1.26工程菌株Enc181ice和Enc2022ice在玉米螟和棉铃虫肠道内均可稳定定殖。在饲菌后7天内，工程菌株在昆虫肠道内的数量高达104～105cfu/虫体，饲菌后9天，两种工程菌在虫体肠道的定殖能力都有所下降，但数量仍在103cfu/虫体以上(表5)。
表5基因工程菌(Enc181ice和Enc2022ice)在玉米螟和棉铃虫肠道定殖能力测定饲菌后不同时间 细菌数量(log cfu/虫体)(天) 玉米螟 棉铃虫Enc181iceEnc2022iceEnc181iceEnc2022ice0 4.8 4.6 4.7 4.43 5.0 4.9 5.1 4.95 5.3 5.2 5.2 5.47 4.7 5.0 4.8 4.69 3.5 3.8 3.4 3.6
玉米螟和棉铃虫的饲养及饲菌方法同上。用饲菌后6天的玉米螟和棉铃虫作低温处理实验，以未饲菌的相近虫龄玉米螟和棉铃虫作对照。将试验昆虫置于人工霜箱内，按10℃/小时的速度降温，待降到所需温度(-5℃，-7℃)后，分别保持不同时间(3小时，6小时，12小时)，轻触虫体以判断是否冻结，待在相应温度下处理12小时后，将虫子取出放在23±1℃下放置1小时，统计死亡率，工程菌处理显著提高了玉米螟在低温处理后的冻结虫体率，并导致昆虫结冰而死。在-5℃下处理3小时，两种工程菌处理的玉米螟冻结虫体率都达80％以上，而未经工程菌处理的对照虫体则无一冻结；经12小时处理后，2个工程菌处理的虫体冻结率均达到90％以上，而对照昆虫仍无冻结；-7℃处理3小时，工程菌处理的玉米螟冻结虫体率达到90％以上，处理6小时后冻结率达100％，而未经工程菌处理的对照玉米螟；在-7℃下处理12小时，其虫体冻结率仅为7.4％。工程菌处理的玉米螟在-5℃处理12小时后，绝大部分虫体(约96％)被冻死，而对照昆虫则全部存活下来；-7℃处理12小时，工程菌处理虫体全部死亡，而对照的虫体的死亡率仅为7.4％(表6)。-5℃处理3小时，工程菌处理棉铃虫的冻结虫体率即达80％左右，继续处理到6～12小时，有92.3～93.7％虫体结冰并被冻死，而对照昆虫仅有7.1％被冻死。-7℃处理3小时，处理昆虫中有93.7～100％冻结，继续处理到6～12小时，全部测试昆虫冻结而死，而对照昆虫仅有14.3％冻结死亡(表7)。
表6工程菌(Enc181ice和Enc2022ice)对玉米螟的低温冻杀效果测定冻结虫体率(％)菌株-5℃-7℃ 冻死率(％) 测试虫头数/3h6h12h3h6h 12h -5℃ -7℃ 温度处理Enc181ice84.6 96.1 96.1 92.3 100 100 96.1 100 26Enc2022ice87.5 91.7 91.7 95.8 100 100 95.8 100 24CK 0.0 0.0 0.03.7 7.4 7.4 0.0 7.4 28
表7工程菌(Enc181ice和Enc2022ice)对棉铃虫的低温促杀效果测定冻结虫体率(％)菌株 -5℃ -7℃冻死率(％) 测试虫头数3h6h12h 3h6h12h -5℃ -7℃ /温度处理Enc181ice76.9 92.3 92.3 100 100 100 92.3 100 13Enc2022ice87.5 93.7 93.7 93.7 100 100 93.7 100 16CK 0.0 7.1 7.1 7.1 14.3 14.3 7.1 14.3 14附本发明所涉及的DNA序列和蛋白质序列(1)SEQ ID NO 1(iceA基因的核苷酸序列)1 ATG AAA GAA GAT AAG GTT TTA ATA TTA CGT ACC TGT GCT AAT AAT ATG GCC GAT CAC GGC GGA ATC ATC6970 TGG CCG TTA AGC GGT ATC GTA GAG TGT AAA TAC TGG AAG CCG GTT AAA GGC TTT GAG AAC GGA CTA ACG138139 GGG CTA ATC TGG GGA AAA GGA TCG GAT TCA CCG CTG AGC CTG CAC GCT GAT GCC AGG TGG GTT GTC GCT207208 GAA GTG GAT GCC GAT GAG TGT ATC GCT ATT GAA ACT CAT GGC TGG ATT AAA TTT CCC CGT GCT GAG GTT276277 CTT CAC GTT GGA ACG AAA ACC AGT GCG ATG CAA TTT ATC CTG CAC CAT CGG GCT GAT TAC GTT GCC TCT345346 ACG GAA ATG CAG GCC GGT CCT GGA GCG CCT GAT GTC ACT TCA GAG GTA AAG GCA GGC AAT CGA TCG CTC414415 CCT GTA ACA GAT GAT ATT GAT GCG ACC ATC GAA TCA GGC AGT ACG CAG CCG ACA CAA ACG ATT GAA ATC483484 GCA ACC TAT GGC AGT ACG CTC AGC GGC ACG CAT CAG AGT CAG CTG ATT GCC GGA TAT GGC AGT ACT GAG552553 ACG GCG GGT GAT AGC AGC ACA TTA ATT GCC GGT TAT GGT AGC ACC GGT ACA GCG GGA TCA GAC AGC ACA621622 TTA GTC GCG GGC TAC GGC AGT ACC CAA ACC GCA GGT GAA GAG AGC AGC CAG ATG GCG GGT TAC GGC AGC690691 ACG CAG ACC GGC ATG AAA GGC AGC GAT CTC ACC GCC GGT TAC GGC AGT ACC GGC ACG GCG GGC GCC GAC759760 AGC TCC CTG ATC GCC GGT TAC GGC AGT ACC CAG ACG GCG GGC GAA GAC AGC TCG CTG ACA GCC GGT TAC828829 GGC AGT ACC CAG ACC GCG CAG AAG GGC AGC GAT CTT ACG GCC GGT TAT GGC AGT ACC GGC ACG GCG GGT897898 GCC GAC AGT TCA TTA ATC GCG GGC TAC GGC AGC ACC CAG ACG GCC GGG GAA GAA AGC ACC CAG ACA GCC966967 GGT TAT GGC AGC ACC CAG ACC GCG CAG AAG GGC AGC GAC CTT ACG GCC GGT TAC GGC AGT ACC GGT ACG10351036 GCC GGT GAC GAC AGC TCC CTG ATC GCC GGT TAC GGC AGT ACC CAG ACG GCG GGC GAA GAC AGC TCG CTG11041105 ACA GCC GGT TAC GGC AGT ACC CAG ACC GCG CAG AAG GGC AGC GAT CTC ACT GCA GGT TAT GGC AGT ACC11731174 GGC ACG GCG GGT GCC GAC AGT TCA TTA ATT GCG GGC TAC GGC AGC ACC CAG ACG GCC GGG GAA GAG AGC12421243 ACC CAG ACA GCC GGT TAT GGC AGC ACC CAG ACC GCG CAG AAG GGC AGC GAC CTT ACG GCC GGT TAC GGC13111312 AGT ACC GGT ACG GCG GGT GAC GAC AGC TCC CTG ATC GCC GGT TAC GGT AGT ACC CAG ACG GCG GGC GAA13801381 GAC AGC TCG CTG ACA GCC GGT TAC GGC AGT ACC CAG ACC GCG CAG AAG GGC AGC GAT CTT ACT GCA GGT14491450 TAT GGC AGT ACC TCT ACG GCA GGC TAT GAA AGT TCA TTG ATC TCG GGC TAT GGC AGT ACC CAG ACA GCG15181519 GGT TAC GGT AGC ACG CTG ACA GCG GGT TAC GGC AGT ACG CAG ACC GCG CAG AAC GAA AGC GAT CTC ATC15871588 ACC GGC TAT GGC AGT ACG TCT ACA GCC GGG GCA AAT AGT TCA CTG ATC GCA GGC TAT GGC AGC ACG CAGl6561657 ACA GCC AGC TAC AAC AGT GTG CTA ACG GCG GGC TAC GGC AGT ACC CAG ACG GCG AGA GAA GGC AGT GAC17251726 CTC ACT GCC GGG TAC GGC AGC ACC GGC ACG GCA GGC TCG GAC AGC TCA ATC ATT GCA GGT TAC GGC AGC17941795 ACC CAG ACC GCC AGT TAT CAC AGT AGC CTG ACG GCG GGC TAC GGC AGT ACG CAG ACG GCG CGC GAA CAG18631864 AGT GTG CTG ACA ACC GGC TAC GGC AGC ACC TCA ACC GCC GGC GCC GAC AGT TCC CTG ATT GCA GGC TAT19321933 GGC AGC ACG CAG ACC GCC GGT TAC AAC AGT ATT CTG ACG GCC GGT TAC GGC AGC ACC CAG ACG GCG CAG20012002 GAG GGC AGC GAT CTC ACC GCA GGT TAT GGC AGT ACC TCA ACC GCC GGT GCC GAC AGC TCC CTG ATT GCG20702071 GGC TAC GGC AGC ACC CAG ACC GCC AGC TAT CAC AGT AGC CTG ACG GCG GGT TAC GGC AGT ACG CAG ACG21392140 GCG CGC GAA CAG AGT GTG CTG ACG ACC GGC TAC GGC AGC ACC TCA ACC GCC GGT GCC GAC AGC TCC CTG22082209 ATT GCA GGC TAC GGC AGC ACG CAG ACA GCG GGT TAC AAC AGC ATC CTG ACG GCC GGT TAC GGC AGC ACC22772278 CAG ACG GCG CAG GAG CGC AGC GAT CTC ACC GCA GGT TAT GGC AGC ACC TCA ACC GCC GGT GCC GAC AGC23462347 TCT CTG ATT GCA GGC TAC GGC AGC ACG CAG ACA GCG GGT TAT CAC AGT ATT CTG ACG GCC GGT TAC GGC24152416 AGC ACC CAG ACG GCG CAG GAG CGC AGC GAT CTG ACC ACC GGC TAC GGC AGT ACC TCG ACG GCA GGC TCC24842485 GAC AGC TCC CTG ATC GCG GGC TAC GGC AGC ACG CAG ACA GCG GGT TAC AAC AGC ATC CTG ACG GCC GGT25532554 TAC GGC AGC ACC CAG ACG GCG CAG GAG AAT AGC GAT CTG ACC ACG GGC TAC GGC AGT ACC TCG ACG GCG26222623 GGT TAC GAC AGT TCG TTG ATT GCA GGC TAC GGC AGC ACG CAG ACC GCC GGT TAT CAC AGT ATT CTG ACG 26912692 GCC GGT TAC GGC AGC ACC CAG ACG GCG CAG GAG CGC AGC GAT CTG ACC ACC GGC TAC GGC AGT ACC TCG 27602761 ACG GCA GGC CCC GAC AGT TCC CTG ATC GCG GGC TAC GGC AGC ACG CAG ACC GCC GGT TAC AAC AGT ATT 28292830 CTG ACG GCC GGT TAC GGC AGC ACC CAG ACG GCG CAG GAG AAT AGC GAT CTG ACG ACC GGC TAC GGC AGT 28982899 ACT TCT ACG GCA GGT TAT GAG AGT TCA CTG ATC GCA GGC TAC GGC AGC ACC CAG ACC GCC AGT TTT AAA 29672968 AGT ACG TTG ATG GCT GGT TAC GGG AGT TCG CAG GCT GCC AGA GAA CAG AGT TCG TTG ACT GCC GGA TAC 30363037 GGC AGT ACC TCA ATG GCC GGT TAT GAC AGC TCA TTG ATT GCC GGT TAC GGT AGT ACC CAG ACG GCG GGT 31053106 TAT CAA AGT ACG CTG ACA GCC GGT TAC GGC AGC ACG CAA ACG GCC GAG CAC AGT AGT ACG CTA ACG GCA 31743175 GGT TAC GGC AGT ACC GCA ACG GCG GGC GCC GAC AGC TCC CTG ATC GCA GGC TAC GGC AGT TCG CTG ACC 32433244 AGC GGT ATT CGC AGC TTC CTG ACG GCG GGT TAT GGC AGT ACG TTG ATC AGC GGA CTT CGC AGC GTA CTC 33123313 ACC GCC GGT TAC GGA AGC AGC CTG ATT TCG GGC AGA CGC AGT AGC CTG ACG GCG GGA TAT GGC AGT AAT 33813382 CAG ATC GCC AGC CAC CGA AGC TCG TTG ATT GCT GGC CCG GAA AGC ACC CAG ATC ACC GGC AAC CGC AGC 34503451 ATG CTG ATT GCG GGA AAG GGC AGC TCA CAA ACG GCG GGT TAT CGC AGC ACA TTG ATC TCC GGG GCA GAC 35193520 AGC GTG CAA ATG GCC GGA GAG CGC GGC AAG CTG ATT GCC GGA GCG GAC AGC ACC CAA ACC GCC GGG GAT 35883589 CGC AGC AAG CTT CTG GCA GGC AAC AAC AGC TAC CTC ACC GCT GGC GAT CGC AGC AAA CTC ACG GCA GGC 36573658 AAT GAC TGC ATC CTC ATG GCG GGA GAC CGA AGC AAG CTG ACG GCG GGC ATC AAC AGC ATT CTC ACC GCC 37263727 GGA TGC CGT AGC AAG CTG ATA GGA AGC AAT GGT TCA ACC CTC ACC GCC GGG GAA AAC TCA GTT CTG ATT 37953796 TTT CGC TGC TGG GAT GGA AAG CGC TAC ACT AAC GTG GTC GCT AAA ACC GGA AAG GGG GGA ATA GAA GCG 38643865 GAT ATG CCT TAC CAG ATG GAT GAG GAC AAT AAT ATC GTG AAT AAA CCC GAA GAA TAA 3921(2)SEQ ID NO 2(iceA基因编码的蛋白质的氨基酸序列)1 MKEDKVLILRTCANNMADHGGIIWPLSGIVECKYWKPVKGFENGLTGLIWGKGSDSPLSL 6061 HADARWVVAEVDADECIAIETHGWIKFPRAEVLHVGTKTSAMQFILHHRADYVASTEMQA 120121 GPGAPDVTSEVKAGNRSLPVTDDIDATIESGSTQPTQTIEI 161162 ATYGSTLSGTHQSQLI AGYGSTETAGDSSTLIAGYGSTGTAGSDSTLV209210 AGYGSTQTAGEESSQM AGYGSTQTGMKGSDLTAGYGSTGTAGADSSLI257258 AGYGSTQTAGEDSSLT AGYGSTQTAQKGSDLTAGYGSTGTAGADSSLI305306 AGYGSTQTAGEESTQT AGYGSTQTAQKGSDLTAGYGSTGTAGDDSSLI353354 AGYGSTQTAGEDSSLT AGYGSTQTAQKGSDLTAGYGSTGTAGADSSLI401402 AGYGSTQTAGEESTQT AGYGSTQTAQKGSDLTAGYGSTGTAGDDSSLI449450 AGYGSTQTAGEDSSLT AGYGSTQTAQKGSDLTAGYGSTSTAGYESSLI497498 SGYGSTQTAGYGSTLT AGYGSTQTAQNESDLITGYGSTSTAGANSSLI545546 AGYGSTQTASYNSVLT AGYGSTQTAREGSDLTAGYGSTGTAGSDSSII593594 AGYGSTQTASYHSSLT AGYGSTQTAREQSVLTTGYGSTSTAGADSSLI641642 AGYGSTQTAGYNSILT AGYGSTQTAQEGSDLTAGYGSTSTAGADSSLI689690 AGYGSTQTASYHSSLT AGYGSTQTAREQSVLTTGYGSTSTAGADSSLI737738 AGYGSTQTAGYNSILT AGYGSTQTAQERSDLTAGYGSTSTAGADSSLI785786 AGYGSTQTAGYHSILT AGYGSTQTAQERSDLTTGYGSTSTAGSDSSLI833834 AGYGSTQTAGYNSILT AGYGSTQTAQENSDLTTGYGSTSTAGYDSSLI881882 AGYGSTQTAGYHSILT AGYGSTQTAQERSDLTTGYGSTSTAGPDSSLI929930 AGYGSTQTAGYNSILT AGYGSTQTAQENSDLTTGYGSTSTAGYESSLI977978 AGYGSTQTASFKSTLM AGYGSSQAAREQSSLTAGYGSTSMAGYDSSLI10251026 AGYGSTQTAGYQSTLT AGYGSTQTAEHSSTLTAGYGSTATAGADSSLI10731074 AGYGSSLTSGIRSFLT AGYGSTLISGLRSVLTAGYGSSLISGRRSSLT11211122 AGYGSNQIASHRSSLI AGPESTQITGNRSMLIAGKGSSQTAGYRSTLI11691170 SGADSVQMAGERGKLI AGADSTQTAGDRSKLLAGNNSYLTAGDRSKLT12171218 AGNDCILMAGDRSKLT AGINSILTAGCRSKLIGSNGSTLTAGENSVLI12651266 FRCWDGKRYTNVVAKTGKGGIEADMPYQMDEDNNIVNKPEE 1306(3)SEQ ID NO 3(iceA基因的核苷酸序列和其编码的蛋白质的氨基酸序列的对应排列)1 M K E D K V L I L R T C A N N M A D H G G I I231ATG AAA GAA GAT AAG GTT TTA ATA TTA CGT ACC TGT GCT AAT AAT ATG GCC GAT CAC GGC GGA ATC ATC 6924W P L S G I V E C K Y W K P V K G F E N G L T4670 TGG CCG TTA AGC GGT ATC GTA GAG TGT AAA TAC TGG AAG CCG GTT AAA GGC TTT GAG AAC GGA CTA ACG 13847G L I W G K G S D S P L S L H A D A R W V V A69139 GGG CTA ATC TGG GGA AAA GGA TCG GAT TCA CCG CTG AGC CTG CAC GCT GAT GCC AGG TGG GTT GTC GCT 20770E V D A D E C I A I E T H G W I K F P R A E V92208 GAA GTG GAT GCC GAT GAG TGT ATC GCT ATT GAA ACT CAT GGC TGG ATT AAA TTT CCC CGT GCT GAG GTT 27693L H V G T K T S A M Q F I L H H R A D Y V A S115277 CTT CAC GTT GGA ACG AAA ACC AGT GCG ATG CAA TTT ATC CTG CAC CAT CGG GCT GAT TAC GTT GCC TCT 345116 T E M Q A G P G A P D V T S E V K A G N R S L138346 ACG GAA ATG CAG GCC GGT CCT GGA GCG CCT GAT GTC ACT TCA GAG GTA AAG GCA GGC AAT CGA TCG CTC 414139 P V T D D I D A T I E S G S T Q P T Q T I E I161415 CCT GTA ACA GAT GAT ATT GAT GCG ACC ATC GAA TCA GGC AGT ACG CAG CCG ACA CAA ACG ATT GAA ATC 483162 A T Y G S T L S G T H Q S Q L I A G Y G S T E184484 GCA ACC TAT GGC AGT ACG CTC AGC GGC ACG CAT CAG AGT CAG CTG ATT GCC GGA TAT GGC AGT ACT GAG 552185 T A G D S S T L I A G Y G S T G T A G S D S T207553 ACG GCG GGT GAT AGC AGC ACA TTA ATT GCC GGT TAT GGT AGC ACC GGT ACA GCG GGA TCA GAC AGC ACA 621208 L V A G Y G S T Q T A G E E S S Q M A G Y G S230622 TTA GTC GCG GGC TAC GGC AGT ACC CAA ACC GCA GGT GAA GAG AGC AGC CAG ATG GCG GGT TAC GGC AGC 690231 T Q T G M K G S D L T A G Y G S T G T A G A D253691 ACG CAG ACC GGC ATG AAA GGC AGC GAT CTC ACC GCC GGT TAC GGC AGT ACC GGC ACG GCG GGC GCC GAC 759254 S S L I A G Y G S T Q T A G E D S S L T A G Y276760 AGC TCC CTG ATC GCC GGT TAC GGC AGT ACC CAG ACG GCG GGC GAA GAC AGC TCG CTG ACA GCC GGT TAC 828277 G S T Q T A Q K G S D L T A G Y G S T G T A G299829 GGC AGT ACC CAG ACC GCG CAG AAG GGC AGC GAT CTT ACG GCC GGT TAT GGC AGT ACC GGC ACG GCG GGT 897300 A D S S L I A G Y G S T Q T A G E E S T Q T A322898 GCC GAC AGT TCA TTA ATC GCG GGC TAC GGC AGC ACC CAG ACG GCC GGG GAA GAA AGC ACC CAG ACA GCC 966323 G Y G S T Q T A Q K G S D L T A G Y G S T G T345967 GGT TAT GGC AGC ACC CAG ACC GCG CAG AAG GGC AGC GAC CTT ACG GCC GGT TAC GGC AGT ACC GGT ACG 1035346 A G D D S S L I A G Y G S T Q T A G E D S S L3681036 GCC GGT GAC GAC AGC TCC CTG ATC GCC GGT TAC GGC AGT ACC CAG ACG GCG GGC GAA GAC AGC TCG CTG 1104369 T A G Y G S T Q T A Q K G S D L T A G Y G S T3911105 ACA GCC GGT TAC GGC AGT ACC CAG ACC GCG CAG AAG GGC AGC GAT CTC ACT GCA GGT TAT GGC AGT ACC 1173392 G T A G A D S S L I A G Y G S T Q T A G E E S4141174 GGC ACG GCG GGT GCC GAC AGT TCA TTA ATT GCG GGC TAC GGC AGC ACC CAG ACG GCC GGG GAA GAG AGC 1242415 T Q T A G Y G S T Q T A Q K G S D L T A G Y G4371243 ACC CAG ACA GCC GGT TAT GGC AGC ACC CAG ACC GCG CAG AAG GGC AGC GAC CTT ACG GCC GGT TAC GGC 1311438 S T G T A G D D S S L I A G Y G S T Q T A GE 4601312 AGT ACC GGT ACG GCG GGT GAC GAC AGC TCC CTG ATC GCC GGT TAC GGT AGT ACC CAG ACG GCG GGC GAA 1380461 D S S L T A G Y G S T Q T A Q K G S D L T A G4831381 GAC AGC TCG CTG ACA GCC GGT TAC GGC AGT ACC CAG ACC GCG CAG AAG GGC AGC GAT CTT ACT GCA GGT 1449484 Y G S T S T A G Y E S S L I S G Y G S T Q T A5061450 TAT GGC AGT ACC TCT ACG GCA GGC TAT GAA AGT TCA TTG ATC TCG GGC TAT GGC AGT ACC CAG ACA GCG 1518507 G Y G S T L T A G Y G S T Q T A Q N E S D L I5291519 GGT TAC GGT AGC ACG CTG ACA GCG GGT TAC GGC AGT ACG CAG ACC GCG CAG AAC GAA AGC GAT CTC ATC 1587530 T G Y G S T S T A G A N S S L I A G Y G S T Q5521588 ACC GGC TAT GGC AGT ACG TCT ACA GCC GGG GCA AAT AGT TCA CTG ATC GCA GGC TAT GGC AGC ACG CAG 1656553 T A S Y N S V L T A G Y G S T Q T A R E G S D5751657 ACA GCC AGC TAC AAC AGT GTG CTA ACG GCG GGC TAC GGC AGT ACC CAG ACG GCG AGA GAA GGC AGT GAC 1725576 L T A G Y G S T G T A G S D S S I I A G Y G S5981726 CTC ACT GCC GGG TAC GGC AGC ACC GGC ACG GCA GGC TCG GAC AGC TCA ATC ATT GCA GGT TAC GGC AGC 1794599T Q T A S Y H S S L T A G Y G S T Q T A R E Q6211795 ACC CAG ACC GCC AGT TAT CAC AGT AGC CTG ACG GCG GGC TAC GGC AGT ACG CAG ACG GCG CGC GAA CAG 1863622S V L T T G Y G S T S T A G A D S S L I A G Y6441864 AGT GTG CTG ACA ACC GGC TAC GGC AGC ACC TCA ACC GCC GGC GCC GAC AGT TCC CTG ATT GCA GGC TAT 1932645G S T Q T A G Y N S I L T A G Y G S T Q T A Q6671933 GGC AGC ACG CAG ACC GCC GGT TAC AAC AGT ATT CTG ACG GCC GGT TAC GGC AGC ACC CAG ACG GCG CAG 2001668E G S D L T A G Y G S T S T A G A D S S L I A6902002 GAG GGC AGC GAT CTC ACC GCA GGT TAT GGC AGT ACC TCA ACC GCC GGT GCC GAC AGC TCC CTG ATT GCG 2070691G Y G S T Q T A S Y H S S L T A G Y G S T Q T7132071 GGC TAC GGC AGC ACC CAG ACC GCC AGC TAT CAC AGT AGC CTG ACG GCG GGT TAC GGC AGT ACG CAG ACG 2139714A R E Q S V L T T G Y G S T S T A G A D S S L7362140 GCG CGC GAA CAG AGT GTG CTG ACG ACC GGC TAC GGC AGC ACC TCA ACC GCC GGT GCC GAC AGC TCC CTG 2208737I A G Y G S T Q T A G Y N S I L T A G Y G S T7592209 ATT GCA GGC TAC GGC AGC ACG CAG ACA GCG GGT TAC AAC AGC ATC CTG ACG GCC GGT TAC GGC AGC ACC 2277760Q T A Q E R S D L T A G Y G S T S T A G A D S7822278 CAG ACG GCG CAG GAG CGC AGC GAT CTC ACC GCA GGT TAT GGC AGC ACC TCA ACC GCC GGT GCC GAC AGC 2346783S L I A G Y G S T Q T A G Y H S I L T A G Y G8052347 TCT CTG ATT GCA GGC TAC GGC AGC ACG CAG ACA GCG GGT TAT CAC AGT ATT CTG ACG GCC GGT TAC GGC 2415806S T Q T A Q E R S D L T T G Y G S T S T A G S8282416 AGC ACC CAG ACG GCG CAG GAG CGC AGC GAT CTG ACC ACC GGC TAC GGC AGT ACC TCG ACG GCA GGC TCC 2484829D S S L I A G Y G S T Q T A G Y N S I L T A G8512485 GAC AGC TCC CTG ATC GCG GGC TAC GGC AGC ACG CAC ACA GCG GGT TAC AAC AGC ATC CTG ACG GCC GGT 2553852Y G S T Q T A Q E N S D L T T G Y G S T S T A8742554 TAC GGC AGC ACC CAG ACG GCG CAG GAG AAT AGC GAT CTG ACC ACG GGC TAC GGC AGT ACC TCG ACG GCG 2622875G Y D S S L I A G Y G S T Q T A G Y H S I L T8972623 GGT TAC GAC AGT TCG TTG ATT GCA GGC TAC GGC AGC ACG CAG ACC GCC GGT TAT CAC AGT ATT CTG ACG 2691898A G Y G S T Q T A Q E R S D L T T G Y G S T S9202692 GCC GGT TAC GGC AGC ACC CAG ACG GCG CAG GAG CGC AGC GAT CTG ACC ACC GGC TAC GGC AGT ACC TCG 2760921T A G P D S S L I A G Y G S T Q T A G Y N S I9432761 ACG GCA GGC CCC GAC AGT TCC CTG ATC GCG GGC TAC GGC AGC ACG CAG ACC GCC GGT TAC AAC AGT ATT 2829944L T A G Y G S T Q T A Q E N S D L T T G Y G S9662830 CTG ACG GCC GGT TAC GGC AGC ACC CAG ACG GCG CAG GAG AAT AGC GAT CTG ACG ACC GGC TAC GGC AGT 2898967T S T A G Y E S S L I A G Y G S T Q T A S F K9892899 ACT TCT ACG GCA GGT TAT GAG AGT TCA CTG ATC GCA GGC TAC GGC AGC ACC CAG ACC GCC AGT TTT AAA 2967990S T L M A G Y G S S Q A A R E Q S S L T A G Y10122968 AGT ACG TTG ATG GCT GGT TAC GGG AGT TCG CAG GCT GCC AGA GAA CAG AGT TCG TTG ACT GCC GGA TAC 30361013 G S T S M A G Y D S S L I A G Y G S T Q T A G10353037 GGC AGT ACC TCA ATG GCC GGT TAT GAC AGC TCA TTG ATT GCC GGT TAC GGT AGT ACC CAG ACG GCG GGT 31051036 Y Q S T L T A G Y G S T Q T A E H S S T L T A10583106 TAT CAA AGT ACG CTG ACA GCC GGT TAC GGC AGC ACG CAA ACG GCC GAG CAC AGT AGT ACG CTA ACG GCA 31741059 G Y G S T A T A G A D S S L I A G Y G S S L T10813175 GGT TAC GGC AGT ACC GCA ACG GCG GGC GCC GAC AGC TCC CTG ATC GCA GGC TAC GGC AGT TCG CTG ACC 32431082 S G I R S F L T A G Y G S T L I S G L R S V L 11043244 AGC GGT ATT CGC AGC TTC CTG ACG GCG GGT TAT GGC AGT ACG TTG ATC AGC GGA CTT CGC AGC GTA CTC 33121105 T A G Y G S S L I S G R R S S L T A G Y G S N11273313 ACC GCC GGT TAC GGA AGC AGC CTG ATT TCG GGC AGA CGC AGT AGC 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1.一种冰核基因iceA的基因序列，其特征是该序列具有如SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列，编码具有如SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列的蛋白质，且具有冰核活性和促冻杀昆虫作用；
2.权利要求1的基因序列，其中所说的基因序列包括该基因序列的部分序列；
3.权利要求1的基因序列，其中所说的基因序列包括该基因序列的同源序列；
4.一种冰核蛋白质的氨基酸序列，其特征是该氨基酸序列是由权利要求1的基因序列所编码，具有如SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列，且具有冰核活性和促冻杀昆虫作用；
5.权利要求4的氨基酸序列，其中所说的氨基酸序列包括该氨基酸序列的部分序列；
6.权利要求4的氨基酸序列，其中所说的氨基酸序列包括该氨基酸序列的同源序列；
7.一种基因表达载体，其特征是该基因表达载体是由权利要求1-3的基因序列所构建，且可把冰核基因iceA导入宿主菌中并整合到宿主菌染色体上；
8.权利要求7的基因表达载体，其中所说的宿主菌是阴沟肠杆菌；
9.一种转化革兰氏阴性细菌细胞获得工程菌的方法，其特征是该方法应用权利要求7的基因表达载体；
10.一种具有冰核活性的转基因工程菌株，其特征是该菌株是利用权利要求7的表达载体将权利要求1-3的基因序列整合到可在虫体中稳定定殖而在植物体上定殖能力差的宿主菌的染色体DNA上构建而成，且具有促冻杀昆虫作用；
11.权利要求10的转基因工程菌株，其中所说的昆虫是玉米螟或棉铃虫。
全文摘要
本发明为“冰核活性基因、表达载体和工程菌”，属生物防治技术领域。本发明涉及一种冰核基因序列和其编码的冰核蛋白质的氨基酸序列，还涉及可在广泛宿主体内进行转移的原核表达载体mob－Tn5－iceA。利用本发明构建的该载体，可将冰核基因导入其他菌株中，并整合到宿主菌的染色体DNA上，以实现冰核基因的高效表达。本发明在促冻杀昆虫方面，具有很高的应用价值。
文档编号C12N15/63GK1398970SQ01136009
公开日2003年2月26日 申请日期2001年9月28日 优先权日2001年9月28日
发明者赵廷昌, 孙福在, 唐朝荣 申请人:中国农业科学院植物保护研究所