专利名称：利用工程微生物提高草坪草抗旱抗病性的方法
技术领域：
本发明利用转基因根际微生物来提高草坪草的抗旱性。转入的iaaM基因编码色氨酸单加氧酶增加了植物激素吲哚乙酸的积累，促进植物根系的生长，从而有效提高了草坪草的抗旱性，同时也增加了草坪草的抗病性。
本发明的主要创新之点在于(1)采用从土壤中分离得到的一些根际微生物做为外来基因的受体。这些微生物已被证明对镰孢菌和青枯菌这样一些严重侵害植物的致病菌有很强抑制作用。详细研究的有一种细菌(荧光假单孢菌)和一种真菌(彩色豆马勃)；(2)分别采用细菌高效表达的RDR启动子和真菌高效表达的GDP启动子驱动iaaM基因转化细菌和真菌，大大提高了iaaM基因的表达，(3)通过转入iaaM基因产生吲哚乙酸，有促进植物根系生长的作用。
根际微生物与植物根系的互惠共生对于植物的抗旱与耐病性具有双重作用。加入转iaaM基因的荧光假单孢菌和彩色豆马勃的草坪草比对照具有明显的抗旱作用。对转iaaM基因的荧光假单孢菌和彩色豆马勃进行了拮抗性试验，显示对镰孢菌和青枯菌有很强的抑制作用。
本项发明的技术要点之一是分离草坪草根际有益微生物，选择那些对病原菌有拮抗作用的菌株如荧光假单孢菌和彩色豆马勃。上述菌株在实验室条件下接种于几种草坪植物根部未见对植物有毒害作用。以青枯菌和镰刀菌为致病菌通过平板试验研究上述分离菌株对青枯菌和镰刀菌有不同程度抑制作用。
本项发明的要点之二是iaaM基因的克隆。根癌农杆菌所携Ti质粒上T-DNA区段的基因4编码色氨酸单加氧酶。该酶是吲哚乙酸生物合成中的关键酶。利用PCR从Ti质粒上扩增出2.3kb左右片段，PCR引物5’引物为5’-AGGATCCATGGACCTGCATCTAATTTT-3’，3’引物为5’-TAGAGCCTAATACATTCCGAACGGATG-3’。
本项发明的要点之三是细菌高效RDR启动子的克隆。利用PCR从E.coli中扩增出370bp大小片段，PCR引物5’引物为5’-TTTGGGCCCGTAGTCAGCGTGCAATTTCAC-3’3’引物为5’-TTTCCATGGTGCCTCTCACCTTTGATTAATT-3’。
本项发明的要点之四是真菌高效GDP启动子的克隆。利用PCR从香菇中扩增出1.4kb大小片段，PCR引物5’引物为5’-GTAAGCTTGTACTTGGTGGCATATCACAG-3’3’引物为5’-AACTGCAGGGAGGGTATTTAGAATCGAAGG-3’。
本项发明的要点之五是外源基因导入的方法。采用电击法，技术参数为2.5kV，300Ω，25μF，电击两次。
其余技术要领包括微生物的剂量、混合比例等。
在本发明的一个实施方案中，iaaM基因置于细菌高效RDR启动子的调控之下，再转入穿梭载体中。(见
图1大肠杆菌和假单孢菌穿梭质粒pRiaaM构建流程)。
在本发明的一个实施方案中，iaaM基因置于真菌高效GDP启动子的调控之下，再转入穿梭载体中。(见图2大肠杆菌和豆马勃穿梭质粒pGiaaM构建流程)。
此专利涉及的菌种已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，单位地址中国北京中关村，该微生物分类名称为荧光假单孢菌(Pseudomonas fluorescens)，保藏代号为pRiaaM，保藏编号为CGMCCNO.0654，保藏日期为2001年11月28日。
权利要求
1.利用转基因微生物提高植物抗旱性的方法。其中用于转化的微生物除荧光假单孢菌和彩色豆马勃外，还应包括其它细菌、真菌和放线菌。
2.根据权利要求1的方法。植物抗旱性的提高除草坪草外，还包括用于环境美化的各种植物，含其它单子叶植物及双子叶植物。
3.根据权利要求1的方法。其中提到的转基因除了RDR启动子和GDP启动子驱动的iaaM基因，还包括其它启动子驱动的有助于植物与微生物共生的、对植物生长有作用的其它基因。
4.根据权利要求1的方法。其中外源基因导入的方法除了电击法，还包括其它外源基因的导入方法。
5.根据权利要求1的方法。所提到的转基因微生物除提高共生植物的抗旱性，还包括提高与此相关的植物的抗寒性及抗病、抗盐碱、耐热性等其它抗逆性。
6.根据权利要求1的方法。该方法还包括转基因微生物或其它修饰的微生物与其它非转基因微生物混用有助于建立根系与微生物的稳定关系，从而提高植物的抗逆性。
全文摘要
本发明提供了一种利用工程微生物提高草坪草抗旱抗病性的方法。将细菌RDR启动子驱动下的iaaM(色氨酸单加氧酶)基因和真菌GPD启动子驱动下的iaaM基因分别转化荧光假单孢菌和彩色豆马勃等根际微生物,iaaM基因表达的产物促进草坪草根部的生长,使植物根系更深更发达,增强植物的吸水能力,也使根系－土壤－微生物形成一种保护性的结构,在严重干旱的条件下,保护根系不受损伤,从而有效提高了草坪草的抗旱性。这些根际微生物同时有抑制植物病原菌的作用。
文档编号C12N15/87GK1366060SQ01140438
公开日2002年8月28日 申请日期2001年12月7日 优先权日2001年12月7日
发明者林忠平, 毛自朝, 倪挺, 胡鸢雷, 高音 申请人:林忠平