专利名称：鼠抗氯霉素单克隆抗体及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及检测领域。更具体地，本发明涉及抗氯霉素的特异性单克隆抗体及其应用。
背景技术：
氯霉素是一种广谱抗菌素，在临床中广泛应用于细菌性疾病控制。由于它对人类造血系统的毒副作用，尤其是对儿童的骨髓抑制，已严格控制用于临床治疗。
由于氯霉素的有效性，廉价性，所以仍被用于对各种动物疾病的控制。但是，它会残留在动物的组织和分泌液中(例如肉类，鸡蛋，蜂蜜，牛奶)，导致人们通过食物链间接摄取氯霉素，危害人体健康。(Domenici.C.et a1.Anti-cap antibodies for appliccation to a tirf immunosensor.Lifechemistry Reports.1994，Vol 11 P 409；Everest，S.J.et al.Development of an ELISA for the detection of chlortetracycline，oxytetracyline and tetracycline residues.Food &AgriculturalImmunology(1994)6，55-61.)近几年，各国对进口食品中氯霉素的残留量均有严格控制标准。欧美各国要求食品中氯霉素残留量在10ng/g以下，传统的检测手段已经达不到所需要求，酶联免疫测定法基本可以满足这一要求，而我国全部依赖于进口，且价格昂贵，限制了企业的使用，影响我国兽禽类食品的出口。(Thacker，D.J.et al.Immunoassays(ELISA) for Rapid，quantitative analysis in the food-processing industry.J.Agric Food chem，1996，44，2680-2685)。
由于越来越多的国家对进出口食品中残留药物的检测越来越严格，开发灵敏的检测方法已成为当务之急。目前我国对CAP残留的检测技术，从已公布的技术看，有杯碟法，气相色谱法和液相色谱法三种。其测定低限分别为100ppb及10ppb，均达不到要求。近年多克隆抗体酶联免疫技术的应用，可测到10ng/ml以下，检测低限可达1ng/ml，基本满足了要求。但是多克隆抗体酶联免疫技术灵敏度，特异性较差，因此，本领域迫切需要开发特异性抗氯霉素的单克隆抗体，以及检测氯霉素的有效方法。
发明内容
本发明的目的提供一种特异性抗氯霉素的单克隆抗体。
本发明的另一目的是提供一种特异性检测氯霉素的试剂盒。
在本发明的第一方面，提供了一种免疫球蛋白，其特征在于，它是特异性地结合于氯霉素的单克隆抗体。
在本发明的一个实例中，所述的免疫球蛋白来自鼠。
在本发明的一个实例中，所述的免疫球蛋白是单克隆抗体6A3和1D1。
在本发明的另一实例中，所述的免疫球蛋白由小鼠杂交瘤细胞系6A3，CCTCC No.C200118所产生。
在本发明的第二方面，提供了一种产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，它是小鼠杂交瘤细胞系6A3，CCTCC No.C200118。
在本发明的第三方面，提供了一种检测氯霉素的试剂盒，它含有上述的免疫球蛋白或免疫偶联物，或其活性片段。较佳地，所述的试剂盒还含有氯霉素与下列物质的偶联物蛋白质、酶、天然或合成高分子多聚物，该偶联物可与本发明的免疫球蛋白特异性地结合。
在本发明的第四方面，提供了本发明鼠抗氯霉素单克隆抗体的用途，它被用于检测氯霉素残留量。
图1显示了氯霉素的标准曲线。
具体实施例方式
本发明人经多年研究发现，用半琥珀酸氯霉素(CAP-HS)与BSA偶连成CAP-HS-BSA，并以此作为免疫原，免疫Balb/c小鼠，其脾细胞与SP2/0融合，获得分泌抗CAP抗体的两株细胞株(1D1、6A3)。腹水经Separose-4B-CAP亲和层析纯化。用纯化的抗体包被聚苯乙烯板，以CAP-HRP与CAP或待测样品作竞争ELISA，结果显示，检测灵敏度为0.001ng/ml；与4种常用抗生素交叉反应率＜0.01％，与氯霉素衍生物甲砜霉素交叉反应率＜0.03％；氯霉素添加回收试验表明重复性、准确性好。
本发明包括具有抗氯霉素单克隆抗体(如6A3)的相应氨基酸序列的单克隆抗体、具有抗氯霉素单克隆抗体6A3可变区链的单克隆抗体，以及具有这些链的其他蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物。具体地，本发明包括具有含超变区(互补决定区，CDR)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该超变区与本发明的轻链和重链的超变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与抗氯霉素单克隆抗体或其片段结合的而形成的偶联物。本发明还包括与抗氯霉素单克隆抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。
对于本发明抗氯霉素单克隆抗体重链和轻链序列，可以用常规方法测定。抗氯霉素单克隆抗体V链的超变区或互补决定区(complementarity determiningregion，CDR)特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的免疫球蛋白轻链和重链可变链的分子，只要其CDR与抗氯霉素单克隆抗体CDR具有90％以上(较佳地95％以上)的同源性。
本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab或(Fab’)2片段；抗体重链；抗体轻链。
本发明还提供了上述免疫球蛋白或其片段的DNA分子。这些DNA分子的序列可以如上用常规技术，利用小鼠杂交瘤细胞系6A3(CCTCC No.C200118)获得。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔，脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
此外，本发明还提供了一种检测氯霉素的试剂盒，它含有上述的免疫球蛋白或免疫偶联物，或其活性片段。一种氯霉素诊断试剂盒，检测低限可达0.01ng/g。
本发明的优点在于灵敏度高，特异性强，简便快捷。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例材料(A)试剂半琥珀酸氯霉素(CAP-HS)，BSA，N-羟基琥珀酰亚胺，N.，N.-二环己碳二亚胺，二甲基甲酰胺，羊抗小鼠IgG-HRP，PEG均系SIGMA产品，HAT为GIBCO产品。
(B)动物雌性Balb/c小鼠，6-8周令，体重20克左右，购自上海实验动物中心。
实施例1抗氯霉素单抗的制备和纯化(A)免疫抗原，检测抗原，氯霉素酶标记物的制备按照Domenici.C.et al.Anti-cap antibodies forappliccation to a tirf immunosensor.Life chemistry Reports.1994，Vol 11 P 409中所述的方法，将半琥珀酸氯霉素分别与BSA，兔IgG，HRP按碳二亚胺活化脂法进行偶联，从而制得CAP-HS-BSA作为免疫抗原，CAP-HS-IgG作为检测抗原，CAP-HS-HRP作为氯霉素酶标记物。
(B)抗CAP杂交瘤细胞株的建立每只小鼠以50μg量的抗原乳化后腹内和颈背注射，共免疫8次，然后将小鼠的脾细胞与SP2/0融合。免疫BALB/c小鼠血清效价达1∶15000，细胞融合率为95％以上，共筛选出46个阳性克隆，阳性率为8.2％。克隆化后，选出两株分泌高效价抗体的细胞(1D1，6A3)。经4个月的传代，腹腔接种，液氮冻存，复苏，两株杂交瘤细胞均能稳定分泌mAb。分泌抗CAP抗体的这两株细胞株分别命名为1D1和6A3。
(C)单克隆抗体的制备按常规杂交瘤技术制备腹水，腹水经Separose-4B-CAP亲和层析纯化后，获得单克隆抗体1D1和6A3。
实施例2单克隆抗体的特性鉴定(A)亚型鉴定采用常规的双夹心ELISA法进行亚型筛选鉴定。
(B)亲和常数的测定按Friguet B，et alMeasurement of the true affinity constantin solution of antigen-antibody by enzyme-linked immunosorbent assay.J immunol Meth 1985；77305所述的方法进行亲和常数测定。
Ig亚型和亲合常数鉴定结果列于表1。
表1 Ig亚类及亲和常数测定结果
(C)竞争ELISA的建立和回收试验竞争ELISA的建立分别取50μl CAP标准液(55，25，10，5，1，0.1ng/ml)，和50ul CAP-HRP酶标记物(1∶10000)与包被聚苯乙烯板条上的抗CAP单抗进行竞争，TMB-H2O2显色，测450nm吸收值，绘制标准曲线。
回收试验取CAP标准品液(55，25，10，5，2.5，1ng/ml)1ml加入匀浆后的10g鸡肉中，混匀。按英国Randox公司试剂盒说明书的淬取方法提取CAP，用竞争法测定CAP的量，在同步的标准曲线上查其回收量。
结果标准曲线和灵敏度采用CAP标准品设定检测范围为0.1-55ng/ml，结果显示随浓度递增光密度呈递减，标准曲线见图1。其检测限可达0.001ng/ml.见表2。
表2 氯霉素检测最低浓度(ng/ml)
重复性试验重复标准曲线4次，每次每标准点3复孔。经计算得批内CV是4.5-8.9％，平均6.7％，批间是5.6-10.7％，平均8.2％。
回收试验提取的CAP与CAP-HRP竞争结果见表3。1D1回收率在83.3-94.4％，平均为88.9％，6A3回收率在84.8-97.9％，平均为91.4％，实际测得CAP浓度与添加浓度接近，表明方法的准确性很好。
表3氯霉素回收率(％)CAP 1D1 6A3(ng/ml)测量值回收率测量值回收率(ng/ml) (％) (ng/ml) (％)55 49.5 90.2 46.65 84.825 20.83 83.3 22.83 91.310 9.03 90.3 9.79 97.95 4.52 90.4 4.68 93.62.52.27 90.8 2.37 94.81 0.944 94.4 0.96 95.6(D)特异性分析将4种常用抗生素和氯霉素的衍生物(甲砜-CAP，HS-CAP)分别与CAP-HRP进行竞争抑制试验，观察单抗与其交叉反应率。
结果表明，本发明mAb与CAP的衍生物及4种常用抗生素(1mg/ml)与CAP-HRP竞争抑制试验，结果显示交叉反应率均＜0.03和＜0.01％(见表4)，说明CAPELISA法特异性强。
表4.Mab与常用抗生素及CAP衍生物的交叉反应率抗生素 交叉反应率1D1 6A3HS-CAP 232.2 189.2CAP 100 100甲砜氯霉素-CAP＜0.03 ＜0.03盘尼西林 ＜0.01 ＜0.01磺胺嘧啶 ＜0.01 ＜0.01链霉素 ＜0.01 ＜0.01四环素 ＜0.01 ＜0.01本发明人首次研制的抗氯霉素的单克隆抗体，能与氯霉素专一性地结合，与氯霉素衍生物以及常用抗生素无交叉反应，其交叉反应率＜0.01％，灵敏度高，检测低限可达0.01-0.001ng/g，添加回收和批内、批间试验表明方法的重复性，准确性符合农畜食品产品的监控标准。
单克隆抗体ELISA不但检测CAP的残留浓度是可行，而且与多克隆抗体比较，前者的灵敏度高，稳定性好。本发明人研制的氯霉素残留量检测方法，完全能够满足我国进出口食品检测的需求。
生物材料的保藏一种阳性杂交瘤细胞为杂交瘤细胞系6A3，该杂交瘤细胞系于2001年12月20日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉市)，保藏号为中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉市)No.C200118。
此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种免疫球蛋白，其特征在于，它是特异性地结合于氯霉素的单克隆抗体。
2.如权利要求1所述的免疫球蛋白，其特征在于，所述的免疫球蛋白来自鼠。
3.如权利要求1所述的免疫球蛋白，其特征在于，它是单克隆抗体6A3和1D1。
4.如权利要求1所述的免疫球蛋白，其特征在于，它由小鼠杂交瘤细胞系6A3，CCTCC No.C200118所产生。
5.一种产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，其特征在于，它是小鼠杂交瘤细胞系6A3，CCTCC No.C200118。
6.一种检测氯霉素残留量的试剂盒，其特征在于，它含有权利要求1所述的免疫球蛋白。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还含有氯霉素与下列物质形成的偶联物蛋白质、酶、天然或合成高分子多聚物。
8.一种权利要求1所述免疫球蛋白的用途，其特征在于，它被用于检测氯霉素残留量。
全文摘要
本发明提供了一种抗氯霉素的特异性单克隆抗体6A3。该单克隆抗体具有与氯霉素结合的特异性强的特点。本发明还提供了6A3免疫球蛋白、及其片段和免疫偶联物。本发明还提供了一种检测氯霉素残留量的检测试剂盒。
文档编号C12N5/18GK1429845SQ0114528
公开日2003年7月16日 申请日期2001年12月30日 优先权日2001年12月30日
发明者魏万贵, 陈登鸿, 罗荣生, 金玫蕾, 胡泰山, 赵国屏 申请人:中国科学院上海生物工程研究中心