腺病毒的检测与定量方法

专利名称：腺病毒的检测与定量方法
技术领域：
本发明涉及通过实时测量由于多聚酶导致的链式反应(PCR)，在不同生物介质中检测与定量测定腺病毒核酸的方法。本发明还涉及用于实施这种方法的寡核苷酸。
基因治疗目前呈现明显进步。自然地成为一般良性感染反应原因的腺病毒由于其具有许多优点而跻身于被使用的载体中。
在登记和市场准入后，这些处于晚期II和III的腺病毒载体的临床开发的延伸使得有必要研制、确认与实施能够测量腺病毒载体在各种生物区中的定性与定量生物分布与能够检测由于腺病毒载体形成过程的污染物而出现的轻度病毒感染(特别是能够进行复制的重组腺载体)的敏感专用技术。还必需检测因不同血清型的野生型病毒所引起的腺病毒间发感染，而这些野生型病毒是造成绝大多数这些自然感染发病的原因，无论这些感染是鲜红的还是临床上潜伏的，还必需确定在一般人群中或在危险患者(患有癌症、接受移植治疗的，患免疫抑制等的患者)体内，这些野生型感染的病毒动力学与在各种情况下的临床意义。
迄今为止常用的检测技术中，通过在细胞层中致细胞病变效应观察腺病毒在允许的细胞培养物中的存在。为了证明这种致细胞病变效应的确归因于腺病毒，可采用ELISA法检测腺病毒的特异性抗原。
还曾描述过采用PCR扩增从腺病毒提取的核酸的技术。因此，日本专利申请JP 07327700描述了一种PCR类的方法，其中编码六邻体，即被用于编码腺病毒衣壳蛋白的DNA部分被扩增。扩增的产物制成“斑点印迹”，然后与每种血清型的特异性探针杂交。因此，这种方法用于鉴定亚类和血清型，并不用于检测和定量测定存在于试样中的全部病毒。另外，这种方法的灵敏度低，因此不适合于以精确剂量，例如在跟踪经过基因疗法治疗的患者时所需剂量进行的测定。
Pring-Akerblom等人(《医学病毒学杂志》(Journal of MedicalVirology)，1999，第58卷，第87-92页)还描述了在同一PCR反应中使用六对引物(所谓多重聚合酶链式反应)的方法。通过将PCR产物沉积在电泳凝胶上，然后测定PCR产物的尺寸，进行亚类鉴定。
Crawford-Miksza等人(《临床微生物学杂志》(Journal ofClinical Microbiology)，1999，第37卷，第1107-1112页)描述了在某些可变位点非配对的情况下通过使用含有作为核酸碱基的肌苷的共有引物，特异性地检测4、7和21型腺病毒。在该文件中，描述了九种不同的引物。
这些现有技术使用PCR标准以及在出现杂交或无杂交的情况下通常在电泳凝胶上进行的常规分析方法。
这些技术中任何一种均无法以尤其符合基因治疗的需求的灵敏度在大量检测来自大多数已知血清型的腺病毒的同时定量测定其病毒电荷。
因此，本发明的目的是通过提供一种灵敏的、能够检测大多数血清型腺病毒的技术解决这些问题。
申请人出人意料的方式证明通过使用具有有限变性的引物实时扩增由六邻体编码DNA决定的序列，同时通过证明使用非变性探针扩增的产物，就能获得这样一些好处。
首先，本发明涉及在生物试样中检测和/或定量测定腺病毒核酸的方法，其中-使用同义或反义变性引物对，采用实时PCR扩增腺病毒的核苷酸序列，所述引物由具有至少80％同源的寡核苷酸的混合物组成，该引物具有一个包括在5型腺病毒序列(相应于SEQ ID N°4序列)的21000-22000个核苷酸之间的序列或其互补序列，和-在足以能够得到可测量量的扩增产物的若干周期期间，使用非变性探针检测扩增反应产物，该探针由一种或多种具有至少80％同源的寡核苷酸组成，该探针有一个包括在5型腺病毒序列(相应于SEQ ID N°4序列)的21000-22000个核苷酸之间的序列或其互补序列。
《实时PCR》应当理解为能够跟踪扩增反应进展的任何扩增技术。
有利地，引物和/或探针的序列具有至少80％同源，具有一个包括在SEQ ID N°4序列的540-780核苷酸之间的序列，或具有其互补序列。这两类引物分别选自同义和反义股，以便能够扩增DNA片段。该探针的选择方式应使其能与由扩增得到的DNA片段杂交。用于扩增试样靶腺病毒核酸的本发明PCR引物位于人的腺病毒六邻体基因的恒定区，本发明探针的杂交位点位于两种引物之间。优选地，这些腺病毒具有人的向性。
有利地，所述的寡核苷酸包括至少15个核苷酸，探针的理论解链温度Tm高于引物的理论Tm约10℃±0.5。
这样一种方法在下文中被简称为六邻体PGR法。该方法基本上含有包括下述步骤的重复循环-通过加热从试样提取的DNA，分离待扩增的股，-探针杂交，-与如前面定义的引物杂交-通过聚合酶伸长。
优选地，使用上述HEX1和HEX2同义和反义引物实施该方法，扩增的产物优选地与上述HEX探针杂交。
特别地，本发明涉及寡核苷酸，其特征在于它包括下述SEQ ID N°1序列的，或具有至少80％、优选地90％、更优选地95％序列同源的序列的至少10个连续核苷酸，所述序列为5’-YCC CAT GGA YGA GCC CAC MCT-3’其中Y代表C或T和M代表A或C。
优选地，所述寡核苷酸包括15-30个核苷酸。
本发明还涉及一种由满足这个定义的寡核苷酸混合物构成的HEX1同义引物。因此，HEX1引物具有能够覆盖大多数血清型的处在1、10和19位的三种变性。
本发明还涉及第二种寡核苷酸，其特征在于它包括下述SEQ ID N°2序列的，或具有至少80％、优选地90％、更优选地95％序列同源的序列的至少10个连续核苷酸，所述序列为5’-GAG AAS GGB GTG CGC AGG TAS AC-3’其中S代表G或C和B代表C、G或T。
优选地，所述寡核苷酸包括15-30个核苷酸。
本发明还涉及一种由满足这个定义的寡核苷酸混合物构成的HEX2反义引物。因此，HEX2引物具有能够覆盖大多数序列化血清型的处在6、9和21位的三种变性。
优选地，所述引物包括至少两个寡核苷酸，更优选地三个或四个寡核苷酸。
位于编码六邻体蛋白的ORF的3′部分中的SEQ ID N°1和2序列的位置，取作参比时是5型腺病毒的完全序列(寄存号M73260)，分别为21565(HEX1)和21656(HEX2)。它们对应于Ad5CMVp53序列(长度为35308碱基对)的21048和21139位。
申请人证明，引物浓度是实时PCR的关键参数。因此，制约了HEX1和HEX2引物的变性。
本发明还涉及第三种寡核苷酸，其特征在于它包括下述SEQ ID N°3序列的，或具有至少80％、优选地90％、更优选地95％序列同源的序列的至少10个连续核苷酸，所述序列，或所述序列的互补序列为5’-CAC CAG CCA CAC CGC GGC GTC ATC GA-3’优选地，所述寡核苷酸包括20-35个核苷酸。
本发明还涉及HEX探针，它包括至少一个具有这种序列的寡核苷酸。
另外，本发明还涉及具有与上述寡核苷酸序列互补的序列的寡核苷酸。
根据本发明的一种优选实施方式，探针包括一种显影剂分子或一种显影剂分子体系。所述显影剂体系优选地由荧光记录着色剂和荧光消色着色剂组成，它们分别固定在探针5′和3′端。根据一种有利的实施方式，该显影体系由分别固定在探针5′和3′端的以6-羧基荧光素(FAM)和6-羧基四甲基若丹明(TAMRA)为代表的“记录/猝灭”对组成。其中一种引物可以这种方式标记，而具有探针作用。
本发明特别优选的探针组成如下5′FAM-CAC CAG CCA CAC CGC GGC GTC ATC GA-TAMRA3′。
这样一种显影剂体系还可以是一种所谓的“拖尾”显影剂体系。该“拖尾”在于在该探针其中一端包含自配对的尾。这种自配对现象可以用在这种构型中专门固定在该序列上的标记物进行证明。在靶存在下，存在非配对现象，并发射一种信号。在没有靶的情况下，不发射信号。也可以使用其他的显影剂体系。
另外，同义和反义引物可以具有显影剂分子或显影剂分子体系。
通过使用SEQ ID N°1和SEQ ID N°2序列的引物经过本发明方法所得到的PCR产物优选地具有114碱基对的尾，具有约58.8％的％GC。
优选地用于本发明的聚合酶是Taq聚合酶，但该酶可以是具有聚合酶活性，在PCR操作条件下可使用的任何其他酶。
本发明还涉及用于检测腺病毒的实时PCR型扩增反应试剂盒，其特征在于它包括一对同义和反义引物和一个上述探针。所述盒有利地还包括两个负对照样和两个正对照样。
本发明还涉及在能够含有腺病毒的待测定试样中检测和/或定量测定腺病毒的PCR方法，其特征在于该方法包括通过使用本发明试剂盒进行实时PCR。
根据本发明方法的一个特别有利的方面，所述的两个正对照样是平行地从一系列待测试样提取的，由一个标准样和校正样组成，该标准样由纯化和测定分析的腺病毒溶液构成，校正样与待测定试样类型相适应。
本发明方法有利地适用于检测和/或定量测定存在于培养液、血浆、尿、口咽洗液、淋巴细胞、精液、肿瘤或非肿瘤活组织检查液、直肠用棉签、粪便、腹水的悬液或上清液类试样中的腺病毒。
本发明还涉及根据腺病毒扩增动力学，采用本发明的检测和/或定量测定方法，通过评价腺病毒复制性能，选择有效腺病毒作为载体的方法。
本发明还涉及一种对存在于待试验试样中的腺病毒血清型的诊断方法，该方法在于使用本发明的方法，然后使得到的PCR产物序列化。
编码六邻体蛋白的不同血清型核苷酸序列可以由数据库得到，或进行序列化。Ad3、Ad7、Ad12、Ad14、Ad16和Ad21血清型在HEX探针的9位具有残基A。Ad5、Ad1、Ad2、Ad6、Ad13、Ad40和Ad48血清型在这同一位点具有残基G，而Ad4和Ad41血清型则具有残基C。由于与A型和C型序列相对，G型序列具有非常高稳定性的二次结构(DG＝-7.1千卡/摩尔)，在聚合时，这种结构能够干扰其杂交和/或移动和/或降解，人们选择具有残基A的序列。另一方面，A型序列比C型序列出现频率更高。
A/C(Ad5CMVp53和5、1、2、6、13、40和48血清型)或A/G(4和41血清型)非配对表现为δRn降低，而Ct没有很大变化(δRn是在测量的本底噪声荧光与检测的待试验试样的荧光之间检测荧光差；Ct定义为分裂周期数，其中探针分裂产生的荧光大大超过本底噪声，一般10倍)。
Ad5、Ad4、Ad12和Ad14血清型与Ad5CMVp53具有位点补充差异o5，Ad5h和Ad5CMVp53血清型，o24，Ad4和Ad12血清型，o3、12和19，Ad14血清型尽管存在这些差异，仍然能够以出人意料的方式检测这些血清型六邻体蛋白编码的核苷酸序列。
与现有技术所述方法相比，本发明检测和/或定量测定人的腺病毒的方法的优点之一是呈现显著的检测灵敏度，其检测限为10个微粒，或每个PCR反应为1pfu(蚀斑形成单位)。
另一个优点在于该方法的通用性，因为能够检测和定量测定代表全部A-F亚类的人腺病毒的17个不同血清型。
此外，在PCR循环后，通过读出在循环过程中得到的荧光，可直接分析PCR产物。因此，不需要借助会给最后分析带来污染的PCR产物进行操作。
另外，绘制的原始数据是完整的。事实上，每次PCR分析都保存在数据处理文件中，可以长久保存而不会改变。如果分析标准改变了，这些原始数据可以在任何时刻取出再分析。在以Bonnes Pratiques deLaboratoire这一文件名进行操作时，该原始数据的保存是必不可少的。
另外，在反应时定量测定启动的靶数这一过程是非常可靠的并且是可再现的。在PCR循环过程中，可以使用荧光探针检测PCR产物。这种探针对检测PCR产物是很必需的，可在PCR指数期而不是在最后时刻进行检测；因此，这种检测的原理是更为灵敏的，也是更为特效的。
另一个优点在于，借助“热启动”的原理避免了非特效的扩增，实时PCR在最初变性时被活化的热稳定DNA聚合酶存在下进行。
为了实施本发明，可以任选地参考有关PCR技术的一般杂志，特别是参考由Perkin Elmer Applied Biosystems(1999)出版的题为《采用实时PCR检测定量测定DNA/RNA》说明性概述，和PCR方法(学术出版社，纽约，1989)。
通过参看表示本发明六邻体PCR法的标准曲线附图
，通过非限制性实施例说明本发明。
材料与方法腺病毒收集，培养液上清液和细胞系·大部分不同血清型人的腺病毒培养液上清液来自Pr.Freymuth的实验室(service de Virologie，CHU，Caen)。
·某些测定的野生型腺病毒(Ad2和Ad5)来自UMR n°1592(Emmanuelle Vigne，《Unitéde Vectorologie et de Transferde Génes》，Institut Gustave-Roussy)。
·测定的Ad5CMVp53来自于Unitéde Production de RPRGencell，Vitry(Didier Faucher)。以pfu数提供效价(蚀斑形成单位)。这个单位仍是用于定量测定的参比单位。
·293细胞系来自ATCC(CRL 1573)。
·A549细胞系(ATCCCCL 185)由E.Vigne et A.Fallourd，RPRGencell友好提供。
·MRC5细胞系来自bioMerieux(编号84002，法国)。
临床试样·临床试样(血浆、尿、口咽洗液、粪便)来自健康自愿者，或者Institut Gustave-Roussy的住院患者。
·某些血浆来自Centre de Transfusion，或者购自约200名提供者的血浆袋，或者来自不再被用于医疗应用的血浆袋。
储存条件·收集腺病毒和临床抽取样从接受时刻起被送入干冰中，于-80℃储存。
·接受、分装和分析的各个步骤必需若干次冻结和解冻(腺病毒或临床取样)的过程。为了使其处于相同条件下，对照样(标准样和校正样)应与待诊断的临床取样进行同样次数冻结和解冻。
对照样与标准样·有两类负对照样PCR或NTC负对照样(“非对照模板”)，这种试样由PCR对照样与蒸馏水(无靶)组成。Ct值应该是50，因为进行50个PCR循环。
第二类负对照样是从提取步骤起就存在的提取负对照样。一般地，它由200微升生理盐水组成，它是与一系列提取过程平行地被提取的(一般每提取10个为1个负对照样)。Ct值也应该是50。
·有两类正对照样由纯化和测定的腺病毒溶液(≈5×105pfu)组成的标准是与一系列待测定试样平行提取的。核酸提取物被稀释(一般以10倍递增的方式)可得到用于构建标准曲线(图)的不同标准点。
第二类正对照样是校正样。根据待诊断试样类型，存在不同类校正样。它由200微升最接近试样的介质和处在标准范围介质中的已知量(一般5×105pfu)腺病毒组成。制造校正样使用的介质是口咽洗涤用的生理盐水、血浆用的200位健康献血者的血浆“库”、尿液来自健康受试者的尿以及培养物上清液来自新培养介质。这些校正样证明其提取技术是正确的。与预期理论值相比，定量测定值能够通过三个简单规则再校正使用待试验试样得到的最后定量测定结果。
设备与定量测定所有PCR反应都是采用ABI Prism 7700型设备(Perkin ElmerApplied Biosystems)进行的，该设备使用荧光探针(TaqManTM)检测PCR循环期间的信号。
7700体系是一种每个孔(n＝96)均与光纤连接的热循环器，光纤与激光相连。CDD相机收集每个孔大约每隔6秒钟发射的荧光。S.D.S软件(序列探测器体系TM)分析荧光数据，确定在试样中靶的复制数。
该定量测定基于实时PCR原理(“实时PCR”)。事实上，PCR产物可以由可以通过与PCR产物积累相连的探针降解检测扩增的PCR循环时间表征。靶的初始复制数越高，用于检测荧光显著升高的PCR循环应该越低。
通过测量Ct值和使用标准曲线(图)，可定量测定试样的靶复制数。在理论上，如果PCR100％地起作用，为了将靶数放大10倍，需要3.22个PCR循环(Ct)。一般地，靶数因子10给出Ct值差为3.4-3.6。
第二个参数(δRn)对检验证实PCR信号正性是重要的。Rn的δ是测量的本底噪声荧光值(一般整个板测量3-15个PCR循环)与检测待分析试样的荧光值之差。
实施例实施例1检测来自尿试样的腺病毒1.1待试验尿试样的制备这种制备使用的所有试剂都来自命名为高纯RNA分离试剂盒(HighPure RNA Isolation Kit)的箱。
以如下方式制备这个试样往200微升在37℃预加热10分钟的尿样以及每个对照样(200微升体积)添加400微升溶胞对照样。
立刻进行涡流操作。在室温下培育15分钟。
把每个柱放入2.0毫升管中，把全部制剂放入柱中心。在20℃于8000转/分(Eppendorf 5417R)离心1分钟。
把该柱放入第二个2.0毫升管中。
添加500微升洗涤对照样I，在20℃于8000转/分(Eppendorf5417R)离心1分钟。
把该柱放入第三个2.0毫升管中。
添加500微升洗涤对照样II，在20℃于8000转/分(Eppendorf5417R)离心1分钟。
把该柱放入第四个2.0毫升管中。
添加200微升洗涤对照样II，在20℃于14000转/分(Eppendorf5417R)离心3分钟。
把该柱放在1.5毫升Eppendorf管(第五个管)上，鉴定收集核酸提取过程的最后洗脱液的Eppendorf管。
添加50微升预热的蒸馏水。
在70℃培育3分钟(干浴)。
在20℃于8000转/分(Eppendorf 5417R)离心1分钟。
核酸提取物保存在4℃下，直到PCR步骤为止。
如上述一样制备“对照样”和“标准样”(“材料与方法”一节)。
至于其他类型试样的制备，请参见表1，其中说明用于检测来自包括本实施例试样类型在内的不同类型试样的腺病毒的优化提取技术。
1.2.本发明六邻体PCR方法的检测条件所有被用于扩增反应中的反应剂的浓度，特别是同义《HEX1》、反义《HEX2》引物、《HEX》探针和氯化镁以及TaqManTMPCR核心试剂盒(Perkin Elmer Applied Biosystems)其他试剂的浓度列于表2。
1.3.结果本发明PCR检测方法的标准曲线示于图上。
实施例2本发明方法的特效性本发明的六邻体PCR方法应用之一是检测培养物上清液中的腺病毒。
根据现有技术，通常通过细胞层中致细胞病变效应目视观察细胞培养物中(许可的)腺病毒的存在。为了证明这种致细胞病变效应完全因腺病毒所致，检测这种腺病毒的特异性抗原(通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)，来自编号K6021，Dako Diagnostic LTD，Denmark House，英国)。
曾试验过来自用于细胞诊断人的腺病毒的基本细胞系(在前面《材料与方法》一节中描述的Hep2、MRC5、293和A549)的核酸提取物，以证实本发明的六邻体PCR负性。所有评价的DNA提取物都是负性的，从而证明其检测特效性。
对于本发明的六邻体PCR方法，非常重要的是证明对于不同血清型人的腺病毒均呈现出检测“通用”特性。
曾评价17种不同的血清型(表3)，列出了所有亚类(A、B1、B2、C、D、E、F)。
用两个细胞系MRC5(编号84002，bioMerieux，法国)和A549(ATCCCCL185)试验了收集的17种血清型，给出了类似的结果。用A549得到的结果列于表3。可以看到，除了血清型12、18和40外，这些Ct值都是相近的。这3个血清型相应于具有最低效价的腺病毒。但是，这种很大的Ct差值尤其归因于对本发明的引物和TaqManTM探针的选择。事实上，Ad12对于本发明HEX1同义引物呈现出两个错配对，对于本发明HEX探针呈现出一个错配对。同样地，Ad40对于本发明HEX2反义引物呈现出一个非配对，对于本发明HEX探针呈现出一个非配对。血清型18的六邻体基因序列不是可用的。由Ad18得到的这些结果很可能也归因于错配对。
值得指出的是，尽管存在这些核苷酸序列的(二或三个)非配对，但培养液上清液仍是在很大程度上呈现正性。
若人们认为这17个试验血清型代表了全部已知的51个血清型，这些结果非常好地证实六邻体PCR的“通用”特性。
实施例3本发明方法的灵敏度
3.1.微粒数检测限的估算表3列出了17个腺病毒的血清型与得到的Ct值结果随采用HPLC技术测量的每毫升微粒数的变化。除了3个具有低效价的血清型(Ad12、Ad18和Ad40)外，微粒数为1.1-8.5×1010/毫升时，这些Ct值是在8.1-9.1之间。
如果人们认为正性限的Ct值是约40，并且对于靶数因子为10而言，取差值为3.5Ct时，这表示31个单位Ct值的可能偏差。这个偏差表示约9的自然对数。因此，根据血清型，检测限可以估算为每个PCR反应为10-80个微粒。
3.2.101个标准范围的平衡在18个月时间里，使用与在200微升含有5×105pfu Ad5CMVp53的标准样无关的101个提取物，试验了101个标准范围。洗脱的最后体积是50微升。分析了10微升这种标准样提取物，其稀释液范围以10倍递增(纯的，10-1、10-2、10-3、10-4、10-5)，构建一个标准范围。最后的试验稀释液在理论上相应于在PCR管中1pfu的Ad5CMVp53。所有范围的点进行2次PCR试验(Ct1和Ct2，表5)。
所有含有1pfu Ad5CMVp53的点所得到的值Ct均被列于表5中。在202个PCR反应中，8个反应是负的(Ct＝50)，这只占4％。在大多数情况下，1pfu的Ad5CMVp53的量在六邻体PCR中呈正性。
这些结果很好地证实检测的良好灵敏度。根据这些Ad5CMVp53的制备批次，1pfu当量相应于10-40个病毒微粒(≈靶)，这样证实使用收集的野生型腺病毒所估算的检测限。
实施例4腺病毒培养的动力学两个实验证明了采用本发明的六邻体PCR方法跟踪腺病毒增殖动力学的可能性。这两个实验或者利用Ad5作用于MRC5细胞系，或者利用Ad2作用于A549细胞系(表4)。两个实验得到的结果是相近的。
使用含有105-1pfu腺病毒的稀释液感染瓶装25毫升培养液中的细胞。抽取培养液(5毫升)，这些细胞用体积2毫升不同浓度的病毒感染2小时(在37℃)。在2小时后，换去培养液。在感染后，每天(J0-J11)抽取瓶中的培养液250微升用于ELISA试验，200微升用于本发明的PCR检测。450微升新培养液再加入培养瓶中。
ECP(致细胞病变效应)(表4)出现在105pfu点的4天至10pfu点的8天。在培养瓶中接种病毒的量与正性持续时间之间存在相关性。正性限是10pfu/培育瓶。
ECP与六邻体抗原细胞同时出现(ELISA试验)。对于任何一个被研究的稀释液而言，ELISA正性均未出现的在ECP之前。
对于六邻体PCR(表4)，负对照样(T)的Ct值稍微呈正性(37.6-37.8)。这种结果可解释为或者在培养瓶接种时被气溶胶轻微污染，或者在提取时轻微污染。第一种假设似乎是可能性更大，因为在第10天，Ct值超过31.2(差值为6,5Ct)，这说明腺病毒复制数增加100倍。本发明的六邻体PCR方法表明，在没有ECP与未检测出六邻体抗原时存在病毒增殖(Ct显著降低)。
根据试验的稀释液，本发明的六邻体PCR方法非常令人惊奇地证明了病毒增殖的“无定向”2-4。
显然，这些结果表明本发明的六邻体PGR方法正性比ECP或六邻体ELISA更早些。另外，本发明的六邻体PCR方法与常规细胞培养试验(10天培养+ELISA试验)相比灵敏度至少高10倍。
采用本发明的六邻体PCR方法非常意外得到的这些结果，尤其可被用于方便快捷地了解病毒周期时间及其扩增水平。这后两个参数对于评价病毒复制性能是非常重要的。
因此，本发明的六邻体PCR方法非常有助于为生物技术的应用，特别是在基因表达和/或基因治疗中，选择载体。
实施例5本发明方法的重复性和再现性以六邻体PCR评价的101个标准样的结果(表5)能够同时确定重复性(试验内重复)和再现性(试验间重复)。对于1pfu，Ct值的平均值是37.2±1.8。这种变化水平是相对低的，当该变化水平是两个步骤(提取和六邻体PCR)的变化结果时更是如此。
对于10pfu(未给出)，Ct值的平均值是33.7±1.7。变化水平非常接近，因为得到的误差是非常接近的。可以指出，用1pfu和10pfu得到的2个平均值之Ct差是3.5Ct。这个差有效地相应于靶数乘以10的误差。
实施例6临床抽样使用独立的提取物和在不同的六邻体PCR系列中，试验了临床抽样。8个血浆样和20个尿样的六邻体PCR结果(Ct值)汇于表6。
一般地，Ct值低于或等于36时，同一核酸提取物的Ct变化(Ct1和Ct2)很少超过1Ct值(对于定量测定因子2)。正是由于这种原因，Ct值≤36的所有抽取样都被认为是可定量的(可定量的正性状态)，在36-43之间，这些抽取样被认为是正的，但非定量的(可检测的正性状态)。
对于血清(表6)，在同一核酸提取物中，除了第3289号血浆的第1号提取物和第3579号血浆的第3号提取物外，很少有1Ct以上的差。在这后一种情况下，Ct1的44.6值是异常的。当然，在不同的核酸提取物中，Ct变化比较大，但很少超过2Ct值(定量测定因子4)。
对于尿(表6)，在同一的核酸提取物中，除了Ct值高于36时外，不存在1Ct以上的差。事实上，对于Ct高于36的值，正性水平是足够低的，这样解释了比较高的变化水平。
在不同的核酸提取物中，Ct的变化同样比较大，在两个不同的提取物之间超过2Ct值只是少数，但第2403号尿除外，它有3Ct差(定量测定因子8)。当然，某些尿样(第2029、2626、3736、3763、3765和5399号)的Ct值非常高(一般＞40)，证明了非常低的正性。在这些后面的情况下，可理解有可能很容易从正信号转为负信号(Ct＝50)。
总之，本发明六邻体PCR检测方法的临床取样结果表明，正性足够高时(Ct≤36，“可定量的”正性状态)，呈现非常好的再现性(对于这些Ct值)。对于Ct值＞36并且直到43为止，人们可以认为该靶存在得很好(正)，但对于给出可靠的定量测定值，其变化水平过高。
实施例7定量测定的线性标准曲线通常是通过两次试验的PCR反应用1-105pfu中的12个点绘制的。对于每次重复，扩增曲线和PCR循环值是非常具有再现性的(见图)。相反地，在最后的点，荧光信号是非常可变的(直到因子10)，这也是在信号出现(PCR循环Ct)时而不是在最后点如在“通常的”PCR时分析PCR产物的意义之所在。
用这些标准点得到的标准曲线绘制在图上。相关系数0.999表明极佳的线性。在绝大多数情况下，这个系数处于0.98-1之间。使用一种比较大的标准范围(0.5-106pfu)操作表明接近的相关系数(未示出)，因此证实了供应者的描述相对于大于6的对数的定量测定线性的资料。
“Y-截距”值表示由检测1pfu Ad5CMVp53的标准曲线所推导的PCR循环数。根据标准曲线，这个Ct值为35-39。
斜率值与PCR产率相关。应提到，对于产率100％的PCR，这个值应该是-3.22。对于本发明的六邻体PCR方法，斜率值是-3.4至-3.9，表明平均产率为90％。
实施例8时临床抽样进行定量测定基于两个基本标准，选择采用六邻体PCR对临床抽样得到的定量测定的实例(表7)。第一个标准是用两个完全独立的PCR系列提取物分析抽样(见表6)。第二个标准是，PCR的结果具有低于或等于36的Ct值，这很好地相应于该抽样可定量测定的状态。
六个抽样满足这两个标准(表7)。定量测定结果是非常具有再现性的，对于同样的抽样，变化水平很少超过因子2(表7)。特别有意义的是要指出，对于第2403号尿样，两次提取物之间的3Ct之差(在理论上，这表明该定量测定的因子为8)并未对于采用六邻体PCR测定的定量值产生反应。这个实施例证明平行提取物校正样的意义，这些校正样能够随PCR的微小波动而再调节定量测定(稍微不同的检测限，稍微不同的提取条件等)。
表1用于检测来自不同类试样腺病毒的优化提取技术
表2反应进行的条件
表3在用收集的野生型腺病毒感染后，在收获MRC5细胞上清液的A549细胞上接种后，ECP出现的延迟(天)，在Elisa中DO值，Ct值(六邻体PCR)和HPLC中效价值
ECP致细胞病变效应Elisa+si DO＞0.171。
表4在A549上Ad2培养动力学。ECP出现的延迟(天)，在ELISA中DO值与六邻体PCR的Ct值
第一行ECP致细胞病变效应第二行E1isa(E1isa+siDO＞0.171)第三和第四行六邻体PCR的Ct1和Ct2ND未作；T对照表5在PCR反应(101个试验)中使用1pfu d5CMVp53得到的Ct值
表5(续)
表5(续)
aNEG负的，Ct＝50。
b未作。
表6六邻体PCR与两次收集临床抽样(血浆和尿)的结果，这些抽样有两个或三个独立提取物
a数字表示用同样抽取样进行提取的次数。
bNA，不可利用的；cCt＝50负PCR.
d在2个PCR反应中，每个提取物都进行试验，PCR试验1为Ct1，PCR试验2为Ct2。
表7使用可定量的临床抽样采用六邻体PCR法进行定量测定
a用表6中的Ct值计算出平均值b使用的标准物d5CMVp53的pfu数已知的。这种定量测定是用每毫升起始临床抽样报告的。
序列表<110>阿文蒂斯药物股份有限公司GUSTAVE-ROUSSY研究所<120>腺病毒的检测与定量方法<130>PCR Hexon<140><141><160>4<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>1ycccatggay gagcccacmc t 21<210>2<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>2gagaasggbg tgcgcaggta sac 23<210>3<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述探针<400>3caccagccac accgcggcgt catcga26<210>4<211>1001<212>DNA<213>腺病毒<400>4aggtggccat tacctttgac tcttctgtca gctggcctgg caatgaccgc ctgcttaccc 60ccaacgagtt tgaaattaag cgctcagttg acggggaggg ttacaacgtt gcccagtgta 120acatgaccaa agactggttc ctggtacaaa tgctagctaa ctacaacatt ggctaccagg 180gcttctatat cccagagagc tacaaggacc gcatgtactc cttctttaga aacttccagc 240ccatgagccg tcaggtggtg gatgatacta aatacaagga ctaccaacag gtgggcatcc 300tacaccaaca caacaactct ggatttgttg gctaccttgc ccccaccatg cgcgaaggac 360aggcctaccc tgctaacttc ccctatccgc ttataggcaa gaccgcagtt gacagcatta 420cccagaaaaa gtttctttgc gatcgcaccc tttggcgcat cccattctcc agtaacttta 480tgtccatggg cgcactcaca gacctgggcc aaaaccttct ctacgccaac tccgcccacg 540cgctagacat gacttttgag gtggatccca tggacgagcc cacccttctt tatgttttgt 600ttgaagtctt tgacgtggtc cgtgtgcacc ggccgcaccg cggcgtcatc gaaaccgtgt 660acctgcgcac gcccttctcg gccggcaacg ccacaacata aagaagcaag caacatcaac 720aacagctgcc gccatgggct ccagtgagca ggaactgaaa gccattgtca aagatcttgg 780ttgtgggcca tattttttgg gcacctatga caagcgcttt ccaggctttg tttctccaca 840caagctcgcc tgcgccatag tcaatacggc cggtcgcgag actgggggcg tacactggat 900ggcctttgcc tggaacccgc actcaaaaac atgctacctc tttgagccct ttggcttttc 960tgaccagcga ctcaagcagg tttaccagtt tgagtacgag t 100权利要求
1.在生物试样中检测和/或定量测定腺病毒核酸的方法，其中-使用同义或反义变性的引物对通过实时PCR扩增腺病毒的核苷酸序列，所述引物由具有至少80％同源的寡核苷酸混合物组成，它具有一个包括在5型腺病毒序列的21000-22000个核苷酸之间的序列，和-在足以能够得到可测量量的扩增产物的若干循环期间，使用非变性探针检测扩增反应的产物，该探针由至少一种具有至少80％同源的寡核苷酸组成，它具有一个包括在5型腺病毒序列的21000-22000个核苷酸之间的序列。
2.具有下述SEQ ID N°1序列的寡核苷酸5’-YCC CAT GGA YGA GCC CAC MCT-3’其中Y代表C或T和M代表A或C。
3.HEX1引物，其特征在于它包括下述SEQ ID N°1序列的或具有至少80％序列同源的序列的至少10个连续核苷酸中的至少两个寡核苷酸，所述序列为5’-YCC CAT GGA YGA GCC CAC MCT-3’其中Y代表C或T和M代表A或C。
4.具有下述SEQ ID N°2序列的寡核苷酸5’-GAG AAS GGB GTG CGC AGG TAS AC-3’其中S代表G或C和B代表C、G或T。
5.HEX2引物，其特征在于它包括下述SEQ ID N°2序列的或具有至少80％序列同源的序列的至少10个连续核苷酸中的至少两个寡核苷酸，所述序列为5’-GAG AAS GGB GTG CGC AGG TAS AC-3’其中S代表G或C和B代表C、G或T。
6.权利要求3或5的引物，其特征在于它包括至少三个寡核苷酸。
7.权利要求2或4的寡核苷酸，其特征在于它包括15-30个核苷酸。
8.寡核苷酸，其特征在于它包括下述SEQ ID N°3序列的或具有至少80％序列同源的序列的在少10个连续核苷酸，所述序列为5’-CAC CAG CCA CAC CGC GGC GTC ATC GA-3’。
9.权利要求8的寡核苷酸，其特征在于它包括20-35个核苷酸。
10.HEX探针，其特征在于它包括权利要求8或9的至少一个寡核苷酸。
11.权利要求10的探针，其特征在于它包括显影剂分子或体系。
12.由下述分子组成的探针5′FAM-CAC CAG CCA CAC CGC GGC GTC ATC GA-TAMRA3′。
13.具有与权利要求2、4和7中任一项的寡核苷酸序列互补的序列的寡核苷酸。
14.权利要求1的方法，其特征在于该方法分别使用权利要求3、5和6中任一项的同义和反义引物实施。
15.权利要求1或14的方法，其特征在于该方法由包括下述步骤的重复循环组成-通过加热从试样提取的DNA，分离待扩增的股，-探针杂交，-与这些引物杂交-用聚合酶伸长。
16.权利要求1、14和15中任一项的方法，其特征在于使用权利要求10-12中任一项的探针通过杂交检测扩增产物。
17.用于腺病毒检测的实时PCR类扩增反应的试剂盒，其特征在于它包括权利要求3或5的一对引物和权利要求10-12中任一项的探针。
18.存在于在待试验试样中的腺病毒血清型诊断方法，该方法包括实施权利要求1、14和15中任一项的方法，然后使得到的PCR产物序列化。
19.适用作载体的腺病毒的选择方法，该方法包括实施权利要求1、14和15中任一项的方法。
全文摘要
通过多聚酶导致的链式反应(PCR)检测与定量测定腺病毒的方法。该方法能够在只是不同血清型腺病毒反应中以非常少的量进行检测和定量测定。
文档编号C12Q1/70GK1406285SQ01805849
公开日2003年3月26日 申请日期2001年2月7日 优先权日2000年2月8日
发明者M·维岛德, E·高蒂尔, P·绍尔尼尔 申请人:阿文蒂斯药物股份有限公司, 古斯达威罗斯研究所