重组腺苷酸环化酶及其用于筛选具有蛋白水解活性的分子的用途的制作方法

专利名称：重组腺苷酸环化酶及其用于筛选具有蛋白水解活性的分子的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及重组腺苷酸环化酶，它所包含的至少一种多肽序列包含具有位点特异性蛋白水解活性的至少一种分子的一个或多个切割位点，所述多肽序列插入到腺苷酸环化酶的催化结构域中，同时保留它的酶活性。本发明还涉及编码这种重组腺苷酸环化酶的DNA片段，和使用上文定义的产物来检测、鉴定、和/或量化分子的蛋白水解活性或对蛋白水解活性抑制剂的抗性的方法。本发明还涉及用于进行这些方法的诊断试剂盒。
在真核生物中，就像在原核生物中一样，蛋白酶参与许多生物学过程。导致凝结和消化的蛋白水解激活级联现在是众所周知的，但是经常发现涉及这些酶的新现象。有些膜受体(蛋白酶激活受体即PAR)通过蛋白水解得到特异激活(Coughlin，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，919200-9202)。在枯草芽孢杆菌中，SpoIIGA和SpoIVFB蛋白酶提供了前σE和前σK向σE和σK的转变，它们是形成孢子所必需的转录因子(Hofmeister等人，1995，Cell，83219-226；Lu等人，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，879722-9726)。caspase，另一种蛋白酶家族，参与凋亡(Villa等人，1997，TIBS，22388-393；Steller，1995，Science，2671445-1449)，而且在发育和稳态中具有重要作用。蛋白酶还参与某些病理学状况认为阿尔茨海默氏病要归咎于丝氨酸蛋白酶对β-淀粉状蛋白的异常切割(Selkoe，1999，Nature，39923-31)。在肿瘤中，金属蛋白酶(MMP)通过降解胞外基质使得细胞转移(Nagase等人，1999，J.Biol.Chem.，27421491-21494)。最后，蛋白酶是许多病毒(有些负责致死感染)成熟所必需的元件(Schwartz等人，1999，Clin.Diagn.Lab.Immunol.，6295-305)。
因而，这些酶的鉴定和研究是说明它们的生理学作用和开发新治疗策略所必需的。用于表征和纯化蛋白酶的传统方法是复杂的，因而开发了大肠杆菌或酵母中的遗传研究系统。这些系统的目的是分离和表征位点特异性蛋白酶。它们的原理基于的是导入了所研究蛋白酶的特异切割位点的报告酶的失活或这种蛋白酶在大肠杆菌中的毒性。
Sices等人(1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，952828-2833)描述了特异切割λ噬菌体遏制子、导致由溶原状态转入裂解状态的系统。还已经将特异切割位点插入大肠杆菌β-半乳糖苷酶和胸苷酸合酶及酵母GAL4转录激活剂中(Baum等人，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，875573-5577；Kupiec等人，1996，J.Biol.Chem.，27118465-18470；Dasmahapatra等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，894159-4162)。然后在体内观察到这些蛋白质的蛋白水解。Baum等人(1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8710023-10027)显示了HIV蛋白酶的过度表达在大肠杆菌菌株BL21(DE3)中有毒，而且已将这种特性用于分离和研究蛋白酶的无毒突变体。这种毒性还用于筛选蛋白酶抑制剂(Buttner等人，1997，Biochem.Biophys.Res.Commun.，23336-38)。然而，这些系统缺乏灵敏性，因而限制了它们的用途。
灵敏性的缺乏源于以下事实当所研究的蛋白酶具有微弱的蛋白水解活性时，靶报告蛋白的蛋白水解是不完全的。在许多情况中，未切割靶蛋白部分的残余酶活性足以赋予与这种蛋白质的活性形式有关的表型。结果，不可能在表型上将表达有切割能力的蛋白酶并灭活靶报告蛋白的生物体与不表达这种特定蛋白酶的生物体区分开来。
目前，正在进行研究以开发用于研究病毒蛋白酶(特别是引起获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的病毒的HIV蛋白酶)的测试法。
事实上，目前可用于治疗HIV感染的最有效分子是HIV蛋白酶抑制剂，它在三联疗法中联合逆转录酶抑制剂使用。这些分子的功效基于如下事实蛋白酶是病毒增殖所必需的；HIV是逆转录病毒，它的衣壳包含一旦导入靶细胞后将由病毒逆转录酶进行逆转录的RNA。获得的DNA整合到真核基因组中，然后由细胞机制将编码病毒结构蛋白和酶的基因转录并翻译成多蛋白。病毒蛋白酶的作用是将这些前体(gag和pol)切割成有活性的蛋白质，以获得成熟且有传染性的病毒。该蛋白酶通过自身蛋白水解由多蛋白上释放下来，然后在8个特异位点(p1-p8，其中p5和p6是蛋白酶侧翼的位点)切割其它蛋白质。
在逆转录的过程中，蛋白酶的序列中可能发生突变。它们通常是沉默的或致死的，但是有时可能导致对蛋白酶抑制剂的抗性(Dulioust等人，1999，J.Virol.，73850-854)，和导致治疗失败(Perrin等人，1998，Science，2801871-1873)。这种抗性通常伴随酶蛋白水解活性的降低。
由于蛋白酶(一般而言)和HIV蛋白酶(具体而言)的重要性，有必要确定能够检测分子(优选蛋白质)的蛋白水解活性(优选“位点特异性的”)的方法。
术语“位点特异性的”意欲指蛋白酶识别多肽中的特定氨基酸序列而且根据氨基酸序列和蛋白酶在某个位点切割所述多肽。这一位点可能位于所述特定序列的两个氨基酸之间，但是也可能位于所述序列的上游或下游。
必须改进目前用于检测蛋白酶的系统。具体而言，必须改进这些系统的灵敏性，从而能够检测有些经突变蛋白酶的较低蛋白水解活性。在HIV的情况中，这一点更加重要，因为其蛋白酶的蛋白水解活性已经相对较低了。
另外，为了能够将测试法用于临床，重要的是它们易于进行，花费较低，且能够在合理的时间内(几天)获得结果。事实上，为了研究HIV蛋白酶，目前使用重组病毒实验(RVA)，包括将待研究病毒的蛋白酶基因导入已知测试病毒，并在细胞系上研究所述重组病毒。这种实验也有缺点，即它只表征患者体内存在的主要病毒群，而且需要几周时间来获得结果。
本发明提供了原创的解决方案，开发用于检测具有蛋白水解活性的分子的实验，即开发基于腺苷酸环化酶(优选百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)的腺苷酸环化酶)通过蛋白水解的失活来检测这些活性的遗传系统。
腺苷酸环化酶是参与由ATP合成环状AMP(cAMP)的酶。cAMP是普遍存在的胞内介质，但是它似乎并非细胞存活或生长所需要的，至少在细菌中在某些生长条件下是如此。因而在本发明中将cAMP用作信号分子。
在本发明的内容中，术语“腺苷酸环化酶”意欲指与在天然生物体中发现的腺苷酸环化酶具有相同生物学活性即能够将ATP转化成cATP的任何蛋白质；换言之，是依照国际定义EC 4.6.1.1的蛋白质；或者，具有衍生自腺苷酸环化酶的相似生物学活性的任何酶。事实上，本领域技术人员能够，通过某些明智的突变或将腺苷酸环化酶转化成鸟苷酸环化酶，而改变起始蛋白的底物特异性，使之由GTP生成cGMP(EC 4.6.1.2)(Beuve和Danchin，1992，J.Mol.Biol.，225933-938)；反之亦然(Beuve，1999，Methods，19545-550)。由腺苷酸环化酶获得的这种酶因而包括在上文给出的定义中。
本发明开发的系统基于所述腺苷酸环化酶(CYA)催化结构域的蛋白水解失活。这种结构域能够弥补内源腺苷酸环化酶缺陷(cya-)的细菌或真菌(包括酵母)菌株或细胞系，从而将其变回cya+表型。
优选通过对所述菌株或细胞系研究更易于检测且其外观与腺苷酸环化酶的酶活性有联系的第二种表型来检测所述cya+表型。
因而，当存在具有蛋白水解活性的分子且有活性，并识别插入腺苷酸环化酶的切割位点时，后者受到切割且得到弥补的菌株再次变成cya-。
术语“易于检测”意欲指不必采用过多的手段或使用过多的设备来检测表型。事实上，有可能直接检测cya+表型，但是这需要检测cAMP的形成，可以通过ELISA来进行，但是需要某种机器且不能快速进行。因而，优选通过肉眼观察“易于检测的”表型。例如，可以是能够直接在装有合适培养基的培养皿上进行观察。
“易于检测的”表型的一些范例包括对抗生素的抗性(受到cAMP的诱导或遏制)、某些糖(诸如麦芽糖或乳糖)的分解代射、或易于检测的蛋白质(例如β-半乳糖苷酶、萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP))的cAMP诱导性表达。本领域技术人员将能够选择并定义具有相同特性的其它系统。
因而，本发明的主题是重组腺苷酸环化酶，其特征在于包含含具有位点特异性蛋白水解活性的至少一种分子的一个或多个切割位点的至少一种多肽序列，所述多肽序列插入在腺苷酸环化酶的催化结构域中，同时保留它的酶活性。
在本发明的另一个实施方案中，插入的多肽序列还包含对应于具有蛋白水解活性的分子的多肽序列。在这种情况中，蛋白酶必须进行自我蛋白水解。
因而，根据本发明的实施方案，就包含切割位点的序列而言反式(第一种情况)或顺式(第二种情况)导入目的蛋白酶。
优选的是，多肽序列包含病毒蛋白酶(优选HIV蛋白酶)的至少一个特异切割位点，特别是p5(SEQ ID NO1)和/或p6(SEQ ID NO2)。
本发明的另一个优选实施方案涉及包含插入于其催化结构域内的多肽序列同时保留酶活性的重组腺苷酸环化酶，所述多肽序列还包含病毒蛋白酶。优选的是，它是以p5和p6切割序列为界的HIV蛋白酶(SEQID NO3)。
因而，可以将其中能够插入多肽序列同时保留酶活性的任何腺苷酸环化酶用于执行本发明。然而，优选的腺苷酸环化酶是博德特氏菌属细菌(特别是百日咳博德特氏菌)的腺苷酸环化酶，更具体的说是百日咳博德特氏菌腺苷酸环化酶的催化结构域(SEQ ID NO4)。
具体而言，该结构域是由两种片段即T25和T18组成的，二者都是这种腺苷酸环化酶的活性所必需的，而且能够在这两种片段间耐受可观的插入(可多达200个残基)而不影响它的酶活性；另一方面，两种片段在解离后没有活性。这两种片段对应于第1-224位(T25)和第225-400位(T18)氨基酸。
因而，本发明最特别优选的实施方案包括百日咳博德特氏菌的腺苷酸环化酶，它包含插入在第224与225位氨基酸之间的多肽序列，该多肽序列包含对具有位点特异性蛋白水解活性的至少一种分子的一个或多个切割位点。然而，显然不能将本发明仅仅限于这种位点，因为完全能够测定出允许插入外源序列而不灭活蛋白质的其它位点。例如可以提及第137-138位、第228-229位、第235-236位、第317-318位、和第384-385位残基(Ladant等人，1992，J.Biol.Chem.，2672244-2250)。该表并不详尽，还可以将其它位点用于进行本发明。
在本申请中，术语“残基”与“氨基酸”应理解为具有相同含义。
本发明还涉及多核苷酸(优选DNA片段)，其特征在于它编码依照本发明的腺苷酸环化酶；和包含这种DNA片段或这种多核苷酸或者能够表达依照本发明的腺苷酸环化酶的载体。
本发明还涉及依照本发明的重组腺苷酸环化酶(本身或者由DNA片段、多核苷酸、或载体表达的)在用于检测、鉴定、和/或量化分子的蛋白水解活性或对蛋白水解活性抑制剂的抗性的方法中的用途。这些方法也是本发明的一部分。
因而，本发明涉及用于检测分子的蛋白水解活性的依照本发明的方法，其特征为包括下列步骤a.用依照本发明的重组腺苷酸环化酶弥补内源腺苷酸环化酶缺陷的细菌或真菌菌株或细胞系，所述细菌或真菌菌株或细胞系具有其表达与腺苷酸环化酶的酶活性有联系的表型；b.将待测试的所述分子与得到弥补的所述菌株或细胞系接触；c.在用于展示与腺苷酸环化酶的酶活性有联系的表型的条件下培养所述菌株或细胞系；d.监控所述表型的表达。
存在许多内源腺苷酸环化酶缺陷的细菌或真菌菌株或细胞系。具体可以提及大肠杆菌cya-细菌菌株、沙门氏菌属的细菌、酵母属的酵母菌株(Matsumoto等人，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，792355-2359)、GH1(Martin等人，1981，J.Cell.Physiol.，109289-297)、或淋巴瘤衍生(Bourne等人，1975，Science，187750-752)细胞系。优选使用大肠杆菌cya-细菌菌株，特别是DHT1菌株(F-，gln V44(AS)，recA1 endA1 gyrA96(Nalr)，thi1，hsdR17，spoT1，rfbD1，cya-854，ilv-691∷Tn10)。这种菌株或其任何突变体也是本发明的主题之一。
为了本发明的目的，术语细菌菌株DHT1的“突变体”意欲指根据例如RFLP或RAPD方法的测定，与DHT1的相似指数为至少90％、优选95％、98％、或99％且与DHT1具有相同表型即cya-的细菌菌株。
用于弥补菌株或细胞系的优选方法之一是导入依照本发明的DNA片段或多核苷酸。可以由依照本发明的载体来携带这种片段或多核苷酸，但是也可以整合到染色体中。本领域技术人员将根据需要实现的结果来选择一种或其它技术。优选的是，作为附加体将DNA片段或多核苷酸导入依照本发明的载体中。
优选通过将编码具有蛋白水解活性的分子的DNA片段或多核苷酸导入得到弥补的菌株或细胞系，从而通过在所述菌株中表达所述分子，使具有蛋白水解活性的所述分子相接触。
早已提及与腺苷酸环化酶活性有联系的易于检测的表型。在大肠杆菌中，优选选择使糖(诸如麦芽糖或乳糖)发酵的能力。
为了测定具有蛋白水解活性的分子对蛋白水解活性抑制剂的抵抗能力，将进行上述方法，同样在步骤b中将所述分子与所述抑制剂接触。
还可以通过量化所观察表型的表达来测量对抑制剂的抗性水平。因而，根据所研究的表型，本领域技术人员将能够测定β-半乳糖苷酶活性，它的表达天然受到cAMP的控制。他们还将能够测定其它蛋白质诸如萤光素酶(在这种情况中，将使用cya-菌株和受到cAMP/CAP依赖性启动子的控制的基因)的活性，或测量对指定抗生素的抗性水平，或使用GFP时发射的荧光。还有可能测定生成的cAMP，这能够精确衡量宿主细胞中腺苷酸环化酶活性。
优选将依照本发明的方法用于检测HIV蛋白酶的蛋白水解活性和/或对抑制剂的抗性。
因而可以证明依照本发明的方法是用于研究HIV感染的极其珍贵的工具，特别是在实验室研究中用于确定新的HIV蛋白酶抑制分子、在开发过程中测试抑制剂的功效、或测定新的突变体，这些研究可能有助于理解病毒抗性的机制。
本发明的主题还有依照本发明的腺苷酸环化酶、DNA片段、或载体用于生成诊断试剂盒的用途，这些诊断试剂盒用于检测具有蛋白水解活性的分子的活性或其对抑制剂的抗性，这些分子是由患者血清或细胞中存在的病毒编码的。
还有可能使用依照本发明的化合物来生成诊断试剂盒，用于量化患者中(具有能够抵抗某种抑制剂的蛋白水解活性的分子/具有不能抵抗所述抑制剂的蛋白水解活性的分子)比例，具有蛋白水解活性的所述分子由存在于所述患者的血清或细胞中的病毒所编码。
这些诊断试剂盒具体包括a.内源腺苷酸环化酶缺陷的细菌或真菌菌株或细胞系；b.编码重组腺苷酸环化酶的依照本发明的DNA片段、纯化的多核苷酸、或载体，在其催化位点中插入了对应于具有蛋白水解活性的分子的一个或多个切割位点。
这些试剂盒还可任选包括c.用于扩增编码目的蛋白水解分子(可能以自我蛋白水解序列为侧翼)的DNA的特异引物，和/或d.其结构使得能够将使用c的引物扩增的、编码目的蛋白水解分子的DNA插入其中的载体，和/或e.与d的载体具有相同基础、编码有活性的蛋白水解分子的载体，目的是作为阳性对照，和/或f.能够允许a的细菌或真菌菌株或细胞系生长并检测与cAMP生成有联系的表型的培养基，和/或g.用于量化所用菌株或细胞系中的cAMP生成的试剂，和/或h.用于量化报告蛋白表达的试剂。
这种试剂盒使之能够研究反式插入的蛋白酶，即将这种蛋白酶在与编码依照本发明的腺苷酸环化酶的载体不同的载体上导入。因而可以理解，可能已经作为附加体或能够整合到基因组中的形式将编码腺苷酸环化酶的载体导入了缺陷型菌株。后一种情况可能是特别优选的，因为它可以提供最初内源腺苷酸环化酶缺陷(a)得到依照本发明的腺苷酸环化酶的稳定弥补(b)的菌株。抗生素的使用不是维持这种选择所必需的，而且依照本发明的方法的执行不受改变。
在另一种情况中，分开提供载体和菌株，而用户必须转化菌株以恢复腺苷酸环化酶活性。
本发明还覆盖包括以下各项的诊断试剂盒a.内源腺苷酸环化酶缺陷的细菌或真菌菌株或细胞系；b.编码腺苷酸环化酶的DNA片段、纯化的多核苷酸、或载体，其结构使得能够在腺苷酸环化酶的催化结构域中插入编码目的蛋白水解分子(任选以自我蛋白水解序列为侧翼)的基因，同时保留它的酶活性；c.用于扩增编码目的蛋白水解分子(任选以自我蛋白水解序列为侧翼)的DNA的特异引物，目的是将其插入b的DNA片段。
这些试剂盒还可任选包括d.与b的载体具有相同基础、编码腺苷酸环化酶的载体，在其催化位点中插入任选以蛋白水解序列位侧翼的有活性的蛋白水解分子，目的是作为阳性对照，和/或e.能够允许a的细菌或真菌菌株或细胞系生长并检测与cAMP生成有联系的表型的培养基，和/或f.用于量化所用菌株或细胞系中的cAMP生成的试剂，和/或g.用于量化报告蛋白表达的试剂。
这种试剂盒使之能够研究顺式蛋白酶的作用，这是特别有利的，特别是用于检测对抑制剂的抗性，正如实施例中所证实的。
优选的是，这些诊断试剂盒使之能够研究病毒蛋白酶，特别是HIV蛋白酶。在这种情况中，选择用于扩增编码这种蛋白酶和p5和p6侧翼区的DNA的特异引物，特别是具有序列SEQ ID NO7和SEQ ID NO8的引物。
这些诊断试剂盒使之能够使用AIDS患者的血清对抵抗蛋白酶抑制剂的突变体进行早期鉴定。因而，预计根据患者所携带的病毒群体选择适合于他(她)的治疗方案将有可能降低治疗失败。
事实上，该系统的使用是简单且快速的(对患者血清进行的PCR，优选衍生自pUC的质粒中的亚克隆，和细菌(可以是DHT1)转化)。因而预计有可能只在几天内获得结果，而非RVA的2-3周。
另外，这种测试法限制了对编码HIV蛋白酶的前病毒DNA片段的操作。因而可以进行这种方法而没有任何污染风险且不需要P3级实验室，这与RVA实验不同。
此外，正如实施例中所证实的，本发明使之能够获得很高灵敏性的检测。具体而言，腺苷酸环化酶是具有相当短的半寿期的蛋白质。另外，包含百日咳博德特氏菌AC第224和225位残基的肽，易于接近外面的蛋白质，因为腺苷酸环化酶是相对柔性的蛋白质。因此，优选在第224与225位残基之间导入的蛋白水解位点导致这些位点很好的暴露于目的蛋白酶。这因而使之能够获得灵敏性。在使用顺式插入蛋白酶并进行自我蛋白水解的系统时，可获得甚至更高灵敏性，因为在这种情况中，切割过程是分子内的，而且与得到弥补的菌株或细胞系(例如大肠杆菌)的其它蛋白质不存在竞争。
这种遗传系统还可用于进行大规模筛选以搜索负责切割特定序列的蛋白酶或指定蛋白酶的靶序列。
因而，本发明还涉及用于在分子文库中鉴定具有位点特异性蛋白水解活性的分子的方法，其特征为在文库的多种分子上进行上述方法，并搜索能够弥补细菌或真菌菌株或细胞系的腺苷酸环化酶，所述菌株或细胞系特征为包含具有蛋白水解活性的可能分子的特异氨基酸靶序列。
相似的，本发明涉及用于鉴定具有蛋白水解活性的分子的靶序列的方法，其特征为在细菌或真菌菌株或细胞系的文库上进行上述方法，所述文库得到依照本发明的腺苷酸环化酶的弥补，所述腺苷酸环化酶包含不同的氨基酸序列，以确定该序列是否包含具有蛋白水解活性的所述分子的切割位点。
下列实施例使之能够通过开发某些优选实施方案来例示本发明。
具体而言，这些实施例使之能够例示本发明的各种优点，特别是依照本发明的方法的高灵敏性和依照本发明的系统的优点(顺式或反式导入具有蛋白水解活性的分子)。
根据这些实施例，本领域技术人员将能够改进某些参数。具体而言，实施例中给出的所有数值只是作为指示，绝不应当认为是对本发明的限制。
图的描述

图1本发明实施方案中所用质粒的示意图。plac乳糖操纵子启动子；T25和T18分别编码百日咳博德特氏菌腺苷酸环化酶T25和T18片段的序列；p5和p6编码HIV蛋白酶切割位点的序列；kanr卡那霉素抗性基因；ampr氨苄青霉素抗性基因。pKT25质粒及其衍生物具有P15A型复制起点，因而与pUCVIH质粒及其衍生物(复制起点ColE1)相容。
图2HIV病毒蛋白酶对腺苷酸环化酶的反式灭活。T25和T18分别对应于AC第1-224位和第225-400位氨基酸。p5是HIV蛋白酶特异切割位点之一(蛋白酶序列上游)。在图A中，在大肠杆菌中表达的重组蛋白ACp5具有不依赖钙调蛋白的基本活性，它导致cAMP的合成和乳糖及麦芽糖操纵子的激活。在图B中，与ACp5共表达的HIV蛋白酶切割该蛋白质，释放无活性的片段T25和T18，不合成cAMP。在图C中，受到特异抑制的蛋白酶不能灭活ACp5，因而能够合成cAMP。
图3经pKACp5和pUC19、pKACp5和pUCVIH、或pKT25和pUC19转化的DHT1细菌的β-半乳糖苷酶活性。将经转化细菌在LB培养基+卡那霉素+氨苄青霉素(以指定浓度添加蛋白酶抑制剂)中于30℃培养过夜。然后如实施例3中所述进行测定。
图4细胞中的cAMP合成，作为培养基中蛋白酶抑制剂浓度的函数。用指定质粒转化大肠杆菌DHT1细菌，然后在LB培养基+卡那霉素+氨苄青霉素(以指定浓度添加蛋白酶抑制剂)中于30℃培养过夜。如实施例4中所述进行cAMP测定。
图5插入腺苷酸环化酶中的HIV蛋白酶的自我蛋白水解。T25和T18分别表示百日咳博德特氏菌腺苷酸环化酶的第1-224位和第225-400位氨基酸，p5和p6是HIV蛋白酶的特异切割位点。在图A中，蛋白酶进行自我切割，生成两种无活性的片段T25和T18；细菌保持Cya-。在图B中，蛋白酶抑制剂灭活该蛋白酶，因而不再能够进行自我切割；然后腺苷酸环化酶合成cAMP并恢复Cya+表型。
图6经pKACp5、pKACPr、和pKT25转化的DHT1细菌的β-半乳糖苷酶活性，作为培养基中抑制剂浓度的函数。将经转化细菌在LB培养基+卡那霉素(以指定浓度添加抑制剂)中于30℃培养过夜。然后如实施例3中所述进行活性测定。
图7经pKACp5、pKACPr、和pKT25转化的DHT1细菌的cAMP合成，作为培养基中抑制剂浓度的函数。将经转化细菌在LB培养基+卡那霉素(以渐增浓度添加抑制剂)中于30℃培养过夜。如实施例4中所述进行测定。
实施例实施例1菌株和培养基在大肠杆菌菌株XL1-Blue(endA1，hsdr17，supE44，thi1，λ-，recA1，gyrA96，re1A1，Δ(lac-proB)/F，proAB，lac19ZΔM15，Tn10(tetr))(可以由Stratagene获得)中制备遗传构建物，在大肠杆菌菌株DHT1(F-，gln V44(AS)，recA1，endA1，gyrA96(Nalr)，thi1，hsdR17，spoT1，rfbD1，cya-854，ilv-691∷Tn10)中测定由质粒表达的蛋白质的活性。这种菌株于2000年1月4日保藏于CNCM，保藏号I-2375。
在LB液体或琼脂(15g/L琼脂)培养基中培养细菌。在含1％麦芽糖的McConkey琼脂培养基上测试它们使糖发酵的能力(Miller，1972，Experiments in Molecular Genetics即分子遗传学实验，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约)。以如下浓度使用抗生素氨苄青霉素100μg/ml和卡那霉素50μg/ml。分别将蛋白酶抑制剂indinavir(Crixivan，Merck)和saquinavir(Invirase，Roche)溶于乙醇和水(终浓度20mM)，并在培养基中稀释至指定浓度。
实施例2质粒构建物依照Sambrook等人(1989，Molecular CloningA LaboratoryManual即分子克隆实验室手册，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约)描述的标准方案来构建所有质粒。使用Qiagen试剂盒(QiagenGmbH，德国)纯化质粒DNA，并用适当的限制酶依照供应商(New EnglandBiolabs或Fermentas)的指示进行水解。确定PCR(聚合酶链式反应)条件，作为引物中嘌呤和嘧啶碱基组成的函数(Saiki等人，1988，Science，239487-491)。
质粒pUCVIH是质粒pUC19(Sambrook等人，1989)的衍生物，且在lac启动子的控制下表达HIV病毒的野生型蛋白酶。为了构建它，使用HIV病毒的前病毒DNA作为模板、使用寡核苷酸A1(SEQ ID NO5)和A2(SEQ ID NO6)作为引物而进行PCR。
将获得的PCR产物在琼脂糖凝胶上纯化，用BamHI和SalI酶消化，并亚克隆到pUC19的BamHI和SalI位点之间。
于2000年1月4日将质粒pUCVIH保藏于CNCM，保藏号I-2376。
质粒pUCB1、pUCB3、pUCV1、和pUCV2是pUC19的衍生物，它们都表达突变型HIV蛋白酶。由患者血清扩增编码这些蛋白酶的DNA，并作为模板与引物A1和A2一起用于进行PCR。然后通过将纯化并用BamHI和SalI消化的PCR片段亚克隆到pUC19中而构建质粒。
质粒pKT25是质粒pSU(Bartolomé等人，1991，Gene，10275-78)(与pUC质粒及其衍生物相容)的衍生物，它在lac启动子的控制下只表达无活性的腺苷酸环化酶T25片段。
质粒pKAC表达腺苷酸环化酶的整个催化结构域。它是通过将pCmAHL1(Karimova等人，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，955752-5756)的AatII-EcoRI片段亚克隆到pKT25中而构建的。
质粒pKACPr是pSU的衍生物，且在lac启动子的控制下表达重组蛋白ACp(HIV蛋白酶及其两个侧翼序列p5和p6，插入腺苷酸环化酶催化结构域的第224与225位氨基酸之间)(图1)。它是通过用引物A3(SEQID NO7)和A4(SEQ ID NO8)在HIV病毒的前病毒DNA上进行PCR而构建的。然后将经纯化并消化的PCR产物亚克隆到pACM224p815A(Karimova等人，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9512532-12537)的NheI和KpnI位点之间。然后用AatII和EcoRI消化获得的质粒即pACP，并将消化产物亚克隆到pKT25中。
构建了pKACPr变体，其中用经修饰蛋白酶取代HIV的野生型蛋白酶(pKACB1、pKACB3、pKACV1、和pKACV2)。为此，用引物A3和A4扩增编码突变型蛋白酶的DNA，将经纯化并用NheI和KpnI消化的PCR产物亚克隆到pKACPr的NheI和KpnI位点之间。
质粒pKACp5是通过将两种互补寡核苷酸A5(SEQ ID NO9)和A6(SEQ ID NO10)杂交并将它们亚克隆到pKACPr的NheI和KpnI位点之间而构建的。该序列编码p5多肽，它是HIV蛋白酶切割位点之一。
于2000年1月4日将质粒pKACPr和pKACp5保藏于CNCM，保藏号分别是I-2377和I-2378。
实施例3β-半乳糖苷酶活性测定法通过测量无色邻硝基苯基-β-D-半乳糖苷(ONPG)的水解来测定β-半乳糖苷酶活性，释放的邻硝基苯基在碱性培养基中有颜色，且于420nm吸光(ONP于pH11位于420nm时εmM＝5)。
将细菌在LB培养基中于30℃培养过夜。次日，将悬浮液在63B1培养基(Miller，1972，见上文)中稀释5倍，测量该溶液位于600nm的光密度(OD)，然后向3ml悬浮液中加入1滴甲苯和1滴脱氧胆酸钠(1％)。将管子漩涡震动10秒钟，并于37℃摇动30分钟。这种处理使细菌膜变脆，从而使小分子(ONPG和ONP)得以自由扩散。
为了测定，将甲苯化悬浮液在1ml PM2缓冲液(70mM Na2HPO4·12H2O、30mM NaH2PO4·H2O、1mM MgSO4、0.2mM MnSO4pH7，并临用时添加100mMβ-巯基乙醇)中稀释。将管子置于28℃，并于t＝0时加入0.25ml ONPG溶液(13mM溶于不含β-巯基乙醇的PM2缓冲液)起始反应。当显色充分时(0.250＜OD420＜1.6)，加入0.5ml 1M Na2CO3(将培养基的pH调至11并灭活酶)终止反应。
参照对照样品(与其它样品经历相同处理的1ml PM2)读取位于420nm的OD。
1个单位的β-半乳糖苷酶对应于于28℃和pH7每分钟水解1纳摩尔ONPG。然后，使用位于600nm的OD，将每毫升的单位数转变成每毫克细菌干重的单位数，已知109个细胞对应于0.3mg细菌干重。
实施例4cAMP测定法通过间接ELISA(酶联免疫吸附实验)免疫酶实验，使用兔抗cAMP血清和与碱性磷酸酶缀合的山羊抗兔抗体，测量由细菌生成的cAMP。所用碱性磷酸酶底物是5’-对硝基苯基磷酸二钠，以0.5mg/ml的浓度溶于PA缓冲液100mM NaCl、5mM MgCl2、10mM Tris-HCl pH9.5。
于37℃保温大约1小时后，读取于405nm的读数，并通过将由样品获得的OD与校准范围的OD进行比较来计算cAMP浓度。然后将浓度由pmol/ml转变成pmol/mg细菌干重(正如β-半乳糖苷酶活性测定法所述)。
实施例5HIV蛋白酶对百日咳博德特氏菌腺苷酸环化酶的反式灭活5.a.系统原理该系统基于将多肽序列插入腺苷酸环化酶的催化结构域而不影响其酶活性的可能性。
可以通过胰蛋白酶将百日咳博德特氏菌腺苷酸环化酶切割成两种片段T25(第1-224位氨基酸)和T18(第225-400位氨基酸)，它们在分开时没有催化活性(Ladant，1988，J.Biol.Chem.，2632612-2618)。另一方面，第224与225位氨基酸之间的插入不损害其生成cAMP的能力。
因此在腺苷酸环化酶第224与225位氨基酸之间导入指定蛋白酶的特异切割位点不削弱其活性。另一方面，若这种重组蛋白与相应的蛋白酶共表达，则它受到特异切割，从而释放两种无活性的结构域即T25和T18。因而不进行cAMP合成(图2)。
为了测试百日咳博德特氏菌腺苷酸环化酶的功能活性，使用内源腺苷酸环化酶(cya)缺陷的大肠杆菌菌株。具体而言，在大肠杆菌中，结合转录激活剂CAP(分解代谢物激活剂蛋白)的cAMP形成能够激活许多基因的复合物，其中包括麦芽糖和乳糖操纵子。
因而，当在该菌株中表达腺苷酸环化酶催化结构域时，cAMP的生成能够弥补cya特征，从而细菌能够使乳糖和麦芽糖发酵。在此相同菌株中作为分开实体表达的T25和T18不能生成cAMP，从而细菌保留它们的cya特征。
可以在指示培养基(添加麦芽糖的McConkey或LB-X-Gal)或选定培养基(包含乳糖或麦芽糖作为唯一碳源的基本培养基)上证实细菌使糖发酵的能力。
5.b.体内系统的开发为了测试该系统，生成依照本发明的重组蛋白ACp5，即在腺苷酸环化酶的第224与225位氨基酸之间插入HIV蛋白酶的p5切割位点。将表达这种蛋白质的质粒(pKACp5，实施例2)共转化到包含携带或不携带野生型HIV蛋白酶的相容质粒(pUCVIH或pUC19)的大肠杆菌cya菌株中。然后在包含或不含蛋白酶抑制剂的McConkey麦芽糖培养基上观察转化体的表型。
这些表型测试的结果指示(i)当在大肠杆菌cya菌株中表达时，ACp5能够恢复Cya+表型(McConkey麦芽糖培养基上呈红色菌落)；因此，在第224与225位氨基酸之间插入p5多肽不削弱腺苷酸环化酶活性；(ii)在缺乏蛋白酶抑制剂时，经pKACp5和pUCVIH共转化的DHT1菌株展示Cya-表型(McConkey麦芽糖培养基上呈白色菌落)；因此，HIV病毒蛋白酶在大肠杆菌中在体内显然有活性；它切割ACp5，后者被灭活，因而不再能够合成cAMP。在体外也显示了HIV蛋白酶对ACp5的切割；(iii)在存在蛋白酶抑制剂时，这些相同转化体具有Cya+表型；因此，ACp5不再受到切割，这清楚显示了蛋白酶受到这些产物的抑制；(iv)最后，为了确认HIV蛋白酶在p5序列处而非蛋白质中的其它位置切割ACp5，用pUCVIH和pKAC共转化DHT1细菌(见实施例2，pKAC是表达野生型即不含p5序列的腺苷酸环化酶的质粒)。这些细菌的Cya+表型显示了HIV蛋白酶只能够切割包含特异位点诸如p5的腺苷酸环化酶。
为了证实抑制剂浓度对腺苷酸环化酶活性的影响，测定这些细胞在液体培养基中的培养物的β-半乳糖苷酶活性，作为培养基中抑制剂浓度的函数(图3)。
在经pKACp5和pUC19转化的DHT1细菌的情况中，无论培养基中的抑制剂的数量是多少，β-半乳糖苷酶活性是高的且恒定的。对于经pKT25和pUC19共转化的细菌，它们具有对应于只表达T25片段的菌株(pKT25)的基础水平的β-半乳糖苷酶活性。对于经pKACp5和pUCVIH转化的大肠杆菌DHT1，β-半乳糖苷酶活性的增加依赖培养基中抑制剂的量，这反映了细胞中蛋白酶的逐渐抑制。
相似的，由经pKACPr和pUCVIH转化的DHT1生成的cAMP的量随培养基中抑制剂的浓度而增加(图4)；而对于阳性对照和阴性对照(分别是pKACp5+pUC19和pKT25+pUC19)，cAMP水平是恒定的。
这些结果显示了这种遗传系统足够灵敏，从而能够使野生型HIV蛋白酶的活性可视化并证实特定化合物对这种活性的抑制。
5.c.在体内系统中检测耐受indinavir和saquinavir的HIV蛋白酶为了确定依照本发明的方法是否足够灵敏从而能够检测较低活性，研究了耐受蛋白酶抑制剂的突变体。
分析了4种临床分离群，2种耐受蛋白酶抑制剂的病毒即B3和V2，2种不展示对蛋白酶抑制剂的耐受性的突变型病毒即B1和V1。表1给出了这4种突变体的基因型和表型特征。
突变是相对于参照病毒蛋白酶的氨基酸序列(第1-99位)而描述的(VVal；IIle；MMet；TThr；LLeu；和PPro)。突变体的耐受性水平对应于抑制50％的病毒增殖所需要的抑制剂浓度的相对增加(与野生型蛋白酶相比)。这些数据是在体外实验(重组病毒实验)中获得的。
将编码经修饰蛋白酶的DNA克隆到载体pUC19中(实施例2)，并将获得的质粒与pKACp5共转化到DHT1菌株中。在包含或不含蛋白酶抑制剂的McConkey麦芽糖培养基上观察经转化细菌的表型。
在这些条件下，B1和V1蛋白酶表现得像野生型蛋白酶(缺乏抑制剂时为白色菌落，存在抑制剂时为红色菌落)，这符合预期，因为依照它们的基因型和表型特征(表1)，它们不展示对蛋白酶抑制剂的耐受性。
突变体V2的情况中，在存在indinavir时，基因型与野生型蛋白酶相同(Cya+，使用50μM indinavir)。在存在saquinavir时，为了使细胞变成Cya+需要较高浓度(20μM而非10μM)。因此，突变体V2展示对saquinavir的耐受性(这确认了表1的数据)。
最后，在突变体B3的情况中，细菌的表型始终是Cya+，培养基中不含抑制剂时也如此。这可以由以下事实得到解释这种突变体具有比野生型蛋白酶低的蛋白水解活性，而且即使它切割一部分腺苷酸环化酶分子，但仍然有足够量来激活导致Cya+表型的调控级联。
因此，该系统足够灵敏以检测野生型蛋白酶和突变体B1、V1、和V2的活性，但是其灵敏度不足以检测具有较低活性的突变体诸如B3。该系统缺乏灵敏性可能归咎于以下事实切割是生物分子加工的结果；具体而言，一旦合成了蛋白酶，它必须成为二聚体，并且与其底物相互作用。在此过程中，未切割腺苷酸环化酶分子合成cAMP，从而激活分解代谢操纵子。
为了改进该系统的灵敏性，进行另一种方法，其中的反应更直接将整个蛋白酶插入腺苷酸环化酶，以研究这种嵌合分子的自我蛋白水解。
实施例6百日咳博德特氏菌腺苷酸环化酶的顺式灭活，插入腺苷酸环化酶的HIV蛋白酶的自我蛋白水解6.a.原理该系统利用HIV蛋白酶和百日咳博德特氏菌腺苷酸环化酶的特别特性。HIV的酶和结构蛋白是以多蛋白的形式合成的。这些多蛋白的成熟是由能够切割其自身序列的上游和下游序列(位点p5和p6)的蛋白酶进行的。此外，腺苷酸环化酶在片段T25与T18之间耐受可观的插入(可多达200个残基)而不影响它的酶活性。
因此构建嵌合蛋白(ACPr)，其中在腺苷酸环化酶的第224与225位氨基酸之间插入HIV蛋白酶(99个残基)及其两个切割序列p5和p6(每个有8个氨基酸)。在这种情况中，野生型蛋白酶进行自我蛋白水解，释放T25和T18，而它们在分开时没有活性。相反，若蛋白酶无活性，或在存在抑制剂时，它不进行自我切割，腺苷酸环化酶将保留其cAMP合成活性且能够弥补大肠杆菌cya，使之具有Cya+表型(图5)。
6.b.在体内系统中研究野生型蛋白酶观察经pKACPr或者pKT25(阴性对照)或者pKACp5或pKAC(阳性对照)转化的DHT1细菌的表型。
无论条件如何，经pKACp5或pKAC转化的细菌都保持它们的Cya+表型(McConkey麦芽糖上为红色菌落)，因为并不存在蛋白酶。相反，只表达T25的细菌(DHT1+pKT25)始终是Cya-(白色菌落)，因为这种片段没有活性。
最后，经质粒pKACPr转化的细菌在缺乏抑制剂时是Cya-，在存在saquinavir或indinavir时是Cya+。这些结果显示了蛋白酶在插入腺苷酸环化酶后仍然有活性，且它能够受到蛋白酶抑制剂的抑制。
这些定性结果得到通过测定这些细胞的液体培养物中的cAMP和β-半乳糖苷酶活性而获得的定量数据的证实(图6和图7)。
这些数据指示，在野生型蛋白酶的情况中，这种“顺式”系统至少像“反式”系统一样灵敏。这能够证明嵌合蛋白AC/HIV蛋白酶的特异自我蛋白水解和蛋白酶抑制剂对它们的抑制。
然后研究这种方法的灵敏性以确定它是否能够检测具有低活性的蛋白酶，如在耐受抑制剂的突变体的情况中，特别是变体B3。
6.c.在“顺式”系统中检测耐受抑制剂的HIV蛋白酶为了进行这项研究，将B1、B3、V1、和V2蛋白酶插入腺苷酸环化酶的第224与225位氨基酸之间，并在DHT1菌株中表达获得的嵌合蛋白(质粒pKACB1、pKACB3、pKACV1、和pKACV2)。
正如预期的，B1和V1表现得像野生型蛋白酶(缺乏抑制剂时是Cya-表型，存在抑制剂时是Cya+表型)。在缺乏抑制剂时，突变体B3(pKACB3)赋予细菌以Cya-表型。在存在indinavir时，经pKACB3转化的细菌在可高达100μM的浓度下具有Cya-表型(经pKACPr转化的细菌是50μM)，这显示了这种蛋白酶携带使之耐受indinavir的突变。在存在saquinavir时，经pKACB3转化的DHT1细菌在10μM时具有Cya-表型，而经pKACPr(野生型蛋白酶)转化的DHT1细菌在这种培养基上是红色菌落。因此，突变型蛋白酶B3也耐受saquinavir。
在突变型蛋白酶V2的情况中，该系统能够用于证实它对saquinavir和indinavir的灵敏性的降低经pKACV2转化的细菌在含100μM indinavir或20μM saquinavir的培养基上是Cya-，而经pKACPr转化的细菌在这些相同培养基上生成红色菌落。
因此，“顺式”系统比在独立质粒上提供蛋白酶的系统灵敏得多；具体而言，它能够检测很低的蛋白水解活性(诸如B3蛋白酶的活性)，且能够区分耐受性的有限增加(4x)。
实施例7检测耐受抑制剂的HIV蛋白酶的少数类型此实施例显示了本发明能够使用表型测定法在主要是敏感的群体中检测表达耐受抑制剂的蛋白酶的HIV病毒小群。可常规应用于患者血清的这种方法能够在治疗早期检测抗性的出现，并任选据此调整治疗。
为此，制备包含不同量(1/1、1/10、和1/100)的pKACV2和pKACPr的混合物，然后将每一种混合物转化到DHT1菌株中。在含20μMsaquinavir的McConkey麦芽糖培养基上观察转化体的表型，因为这种浓度能够容易的将敏感的野生型蛋白酶与耐受saquinavir的蛋白酶(V2)区分开来。
用pKACPr或pKACV2转化的DHT1细菌在缺乏抑制剂时是白色的。在用这两种质粒的混合物转化这些相同DHT1时，观察到，在存在20μMsaquinavir时，培养皿上的菌落是异质的有白色菌落和红色菌落。
另外，培养皿上红色菌落数目与白色菌落数目的比率符合DHT1菌株中转化的pKACPr与pKACV2的相对量。为了确认白色菌落包含pKACV2、红色菌落包含pKACPr，由4个红色菌落和4个白色菌落纯化质粒，然后用EcoRI和KpnI消化。
由红色菌落纯化的质粒具有与pKACPr相同的消化图谱(3852bp和710bp两种片段)，而由白色菌落衍生的质粒具有与pKACV2相同的消化图谱(只用KpnI消化，因为它们不具有EcoRI位点，在设计时已经消除了该位点以便于区分两种质粒)。
因此，红色菌落对应于用pKACPr转化的细菌，而白色菌落包含pKACV2。因此，本发明描述的方法能够在表型上在主要包含对指定抑制剂敏感的蛋白酶的群体中辨别出耐受这种抑制剂的蛋白酶。
生物学材料的保藏依照布达佩斯条约的规定，于2000年1月4日将下列生物体保藏于Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(CNCM)即国家微生物培养物收藏中心(25rue du Docteur Roux，75724 ParisCedex 15，法国)。
序列表序列表<110>Institut Pasteur即巴斯德研究所<110>CNRS<120>重组腺苷酸环化酶及使用这种腺苷酸环化酶筛选具有蛋白水解活性的分子的方法<130>D18607<150>FR 000 24 48<151>2000-02-28<160>10<170>PatentIn Ver.2.2<210>1<211>12<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<220><223>HIV蛋白酶切割位点p5<400>1Thr Val Ser Phe Asn Phe Pro Gln Ile Thr Leu Trp1 5 10<211>12<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<220><223>HIV蛋白酶切割位点p6Gly Cys Thr Leu Asn Phe Pro Ile Ser Pro Ile Glu1 5 10<210>3<211>150<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<220><223>HIV蛋白酶及其侧翼序列<400>3Gly Arg Asp Asn Asn Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Asp Arg Gln Gly15 10 15Thr Val Ser Phe Asn Phe Pro Gln Ile Thr Leu Trp Gln Arg Pro Leu20 25 30Val Thr Ile Lys Ile Gly Gly Gln Leu Lys Glu Ala Leu Leu Asp Thr
35 40 45Gly Ala Asp Asp Thr Val Leu Glu Glu Met Ser Leu Pro Gly Arg Trp50 55 60Lys Pro Lys Met Ile Gly Gly Ile Gly Gly Phe Ile Lys Val Arg Gln65 70 75 80Tyr Asp Gln Ile Leu Ile Glu Ile Cys Gly His Lys Ala Ile Gly Thr85 90 95Val Leu Val Gly Pro Thr Pro Val Asn Ile Ile Gly Arg Asn Leu Leu100 105 110Thr Gln Ile Gly Cys Thr Leu Asn Phe Pro Ile Ser Pro Ile Glu Thr115 120 125Val Pro Val Lys Leu Lys Pro Gly Met Asp Gly Pro Lys Val Lys Gln130 135 140Trp Pro Leu Thr Glu Glu145 150<210>4<211>400<212>PRT<213>百日咳博德特氏菌<220><223>百日咳博德特氏菌腺苷酸环化酶的催化位点<400>4Met Gln Gln Ser His Gln Ala Gly Tyr Ala Asn Ala Ala Asp Arg Glu1 5 10 15Ser Gly Ile Pro Ala Ala Val Leu Asp Gly Ile Lys Ala Val Ala Lys20 25 30Glu Lys Asn Ala Thr Leu Met Phe Arg Leu Val Ash Pro His Ser Thr35 40 45Ser Leu Ile Ala Glu Gly Val Ala Thr Lys Gly Leu Gly Val His Ala50 55 60Lys Ser Ser Asp Trp Gly Leu Gln Ala Gly Tyr Ile Pro Val Asn Pro65 70 75 80Asn Leu Ser Lys Leu Phe Gly Arg Ala Pro Glu Val Ile Ala Arg Ala85 90 95Asp Asn Asp Val Asn Ser Ser Leu Ala His Gly His Thr Ala Val Asp100 105 110Leu Thr Leu Ser Lys Glu Arg Leu Asp Tyr Leu Arg Gln Ala Gly Leu115 120 125Val Thr Gly Met Ala Asp Gly Val Val Ala Ser Asn His Ala Gly Tyr130 135 140Glu Gln Phe Glu Phe Arg Val Lys Glu Thr Ser Asp Gly Arg Tyr Ala145 150 155 160Val Gln Tyr Arg Arg Lys Gly Gly Asp Asp Phe Glu Ala Val Lys Val165 170 175Ile Gly Asn Ala Ala Gly Ile Pro Leu Thr Ala Asp Ile Asp Met Phe180 185 190Ala Ile Met Pro His Leu Ser Asn Phe Arg Asp Ser Ala Arg Ser Ser195 200 205Val Thr Ser Gly Asp Ser Val Thr Asp Tyr Leu Ala Arg Thr Arg Arg210 215 220Ala Ala Ser Glu Ala Thr Gly Gly Leu Asp Arg Glu Arg Ile Asp Leu225 230 235 240Leu Trp Lys Ile Ala Arg Ala Gly Ala Arg Ser Ala Val Gly Thr Glu245 250 255Ala Arg Arg Gln Phe Arg Tyr Asp Gly Asp Met Asn Ile Gly Val Ile260 265 270Thr Asp Phe Glu Leu Glu Val Arg Asn Ala Leu Asn Arg Arg Ala His275 280 285Ala Val Gly Ala Gln Asp Val Val Gln His Gly Thr Glu Gln Asn Asn290 295 300Pro Phe Pro Glu Ala Asp Glu Lys Ile Phe Val Val Ser Ala Thr Gly305 310 315 320Glu Ser Gln Met Leu Thr Arg Gly Gln Leu Lys Glu Tyr Ile Gly Gln325 330 335Gln Arg Gly Glu Gly Tyr Val Phe Tyr Glu Asn Arg Ala Tyr Gly Val340 345 350Ala Gly Lys Ser Leu Phe Asp Asp Gly Leu Gly Ala Ala Pro Gly Val355 360 365Pro Ser Gly Arg Ser Lys Phe Ser Pro Asp Val Leu Glu Thr Val Pro370 375 380Ala Ser Pro Gly Leu Arg Arg Pro Ser Leu Gly Ala Val Glu Arg Gln385 390 395 400<210>5<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于扩增HIV蛋白酶的引物A1gcggtcgact catatgggac tgtatccttt aac33<210>6<211>23<212>DNA<223>人工序列<220><223>用于扩增HIV蛋白酶的引物A2<400>6cgcggatcca gtttcaatag gac 23<210>7<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于扩增HIV蛋白酶及其p5和p6区的引物A3<400>7ggggctagcg gtagagacaa caactcc 27<210>8<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于扩增HIV蛋白酶及其p5和p6区的引物A4<400>8cccggtacct tcttctgtca atggcc26<210>9<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于构建质粒pKACp5的寡核苷酸<400>9gtaccccaaa gagtgatctg agggaagtta aaggatacag tg 42<210>10<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于构建质粒pKACp5的寡核苷酸<400>10ctagcactgt atcctttaac ttccctcaga tcactctttg gg 4权利要求
1.重组腺苷酸环化酶，其特征为包含含具有位点特异性蛋白水解活性的至少一种分子的一个或多个切割位点的至少一种多肽序列，所述多肽序列插入在腺苷酸环化酶的催化结构域中，同时保留它的酶活性。
2.权利要求1中要求的腺苷酸环化酶，其特征为插入的多肽序列还包含对应于具有蛋白水解活性的分子的多肽序列。
3.权利要求1或2中要求的腺苷酸环化酶，其特征为插入的多肽序列包含HIV蛋白酶的至少一个特异切割位点。
4.权利要求3中要求的腺苷酸环化酶，其特征为所述HIV蛋白酶的特异切割位点是包含对应于SEQ ID NO1的氨基酸系列的p5位点。
5.权利要求3中要求的腺苷酸环化酶，其特征为插入的多肽序列包含以p5和p6切割序列为界、对应于序列SEQ ID NO3的HIV蛋白酶。
6.权利要求1-5之一中要求的腺苷酸环化酶，其特征为腺苷酸环化酶是百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)的腺苷酸环化酶。
7.权利要求6中要求的腺苷酸环化酶，其特征为在序列SEQ ID NO4的第224与225位氨基酸之间插入该多肽序列。
8.多核苷酸，其特征为它编码权利要求1-7之一中要求的腺苷酸环化酶。
9.载体，其特征为它包含权利要求8中要求的多核苷酸，或它能够表达权利要求1-7之一中要求的腺苷酸环化酶。
10.权利要求9中要求的载体，它能够表达权利要求4中要求的腺苷酸环化酶，其特征为它是于2000年1月4日以保藏号I-2378保藏于CNCM的载体pKACp5。
11.权利要求9中要求的载体，它能够表达权利要求5中要求的腺苷酸环化酶，其特征为它是于2000年1月4日以保藏号I-2377保藏于CNCM的载体pKACPr。
12.用于检测分子的蛋白水解活性的方法，其特征为它包括下列步骤a)用权利要求1-7之一中要求的重组腺苷酸环化酶弥补内源腺苷酸环化酶缺陷的细菌或真菌菌株或细胞系，所述细菌或真菌菌株或细胞系具有其表达情况与腺苷酸环化酶的酶活性有联系的表型；b)将待测试的所述分子与被弥补的所述菌株或细胞系接触；c)在显示与腺苷酸环化酶的酶活性有联系的表型的条件下培养所述菌株或细胞系；d)监控所述表型的表达。
13.权利要求12中要求的方法，其特征为内源腺苷酸环化酶缺陷的细菌或真菌菌株或细胞系通过导入权利要求8中要求的多核苷酸或权利要求9-11之一要求的载体而得到弥补。
14.权利要求12或13中要求的方法，其特征为内源腺苷酸环化酶缺陷的细菌菌株是大肠杆菌。
15.权利要求12-14之一中要求的方法，其特征为其表达与腺苷酸环化酶的酶活性有联系的表型是使乳糖或麦芽糖发酵的能力。
16.权利要求12-14之一中要求的方法，其特征为其表达与腺苷酸环化酶的酶活性有联系的表型是抵抗抗生素的能力。
17.权利要求12-14之一中要求的方法，其特征为其表达与腺苷酸环化酶的酶活性有联系的表型是表达易于检测的蛋白质，特别是萤光素酶或GFP，的能力。
18.用于检测具有蛋白水解活性的分子对抑制剂的耐受性的方法，其特征为它包括权利要求12-17之一中要求的方法的步骤，还包括在步骤b中将所述分子接触所述抑制剂。
19.权利要求18中要求的方法，其特征为还通过量化所研究表型的表达来测量所述耐受性的水平。
20.权利要求18或19中要求的方法，其特征为具有蛋白水解活性的所述分子是HIV蛋白酶。
21.用于检测具有蛋白水解活性的分子的诊断试剂盒，其特征为它包括a)内源腺苷酸环化酶缺陷的细菌或真菌菌株或细胞系；b)编码重组腺苷酸环化酶的DNA片段、纯化的多核苷酸、或载体，在该酶的催化位点中插入了对应于具有蛋白水解活性的分子的一个或多个切割位点。
22.用于检测具有蛋白水解活性的分子的诊断试剂盒，其特征为它包括a)内源腺苷酸环化酶缺陷的细菌或真菌菌株或细胞系；b)编码腺苷酸环化酶的DNA片段、纯化的多核苷酸、或载体，其结构使之能够在腺苷酸环化酶的催化结构域中插入编码任选以自我蛋白水解序列为侧翼的目的蛋白水解分子的基因，同时保留它的酶活性；c)用于扩增编码任选以自我蛋白水解序列为侧翼的目的蛋白水解分子的DNA、以便将其插入b的DNA片段的特异引物。
23.权利要求1-7之一中要求的腺苷酸环化酶、权利要求8中要求的多核苷酸、或权利要求9-11之一中要求的载体用于生成诊断试剂盒的用途，这些诊断试剂盒用于检测具有蛋白水解活性的分子的活性或其对抑制剂的耐受性，这些分子是由患者血清或细胞中存在的病毒编码的。
24.权利要求1-7之一中要求的腺苷酸环化酶、权利要求8中要求的多核苷酸、或权利要求9-11之一中要求的载体用于生成诊断试剂盒的用途，这些试剂盒用于量化患者中(具有耐受某种抑制剂的蛋白水解活性的分子/具有不能耐受所述抑制剂的蛋白水解活性的分子)比例，具有蛋白水解活性的所述分子存在于所述患者的血清或细胞中。
25.权利要求23或24中要求的用途，其特征为具有蛋白水解活性的分子是HIV蛋白酶。
26.用于在分子文库中鉴定具有位点特异性蛋白水解活性的分子的方法，其特征为在文库的多种分子上进行权利要求12-17之一中要求的方法，该腺苷酸环化酶可弥补包含待寻求的所述具蛋白水解活性之分子的特异性靶氨基酸序列的细菌菌株。
27.用于鉴定具有蛋白水解活性的分子的靶序列的方法，其特征为在细菌或真菌菌株或细胞系的文库上进行权利要求12-17之一中要求的方法，所述文库得到权利要求1-7之一中要求的腺苷酸环化酶的弥补，所述腺苷酸环化酶包含不同的氨基酸序列以确定该序列是否包含具有蛋白水解活性的所述分子的切割位点。
28.内源腺苷酸环化酶缺陷的大肠杆菌细菌菌株，其特征为它是于2000年1月4日以保藏号I-2375保藏于CNCM的DHT1菌株或其突变体。
29.编码HIV蛋白酶的载体，其特征为它是于2000年1月4日以保藏号I-2376保藏于CNCM的载体pUCVIH。
全文摘要
本发明涉及重组腺苷酸环化酶，它包含含有具有位点特异性蛋白水解活性的分子的一个或几个切割位点的至少一种多肽序列，所述多肽序列插入在腺苷酸环化酶的催化结构域中，同时保留它的酶活性。本发明还涉及使用所述重组腺苷酸环化酶来筛选具有蛋白水解活性的分子的方法。
文档编号C12Q1/37GK1419600SQ0180703
公开日2003年5月21日 申请日期2001年2月28日 优先权日2000年2月28日
发明者G·卡里莫瓦, D·拉丹特, A·乌尔曼, N·道廷 申请人:巴斯德研究所, 国家科研中心