用于大肠杆菌染色体重组的质粒的制作方法

专利名称：用于大肠杆菌染色体重组的质粒的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于向大肠杆菌(Escherichia coli)K-12株以外的埃希氏杆菌属(Escherichia)微生物整合基因的质粒、将基因整合该染色体的方法、用该整合方法得到的重组菌株、以及利用该重组菌株制造有用物质的方法。
而众所周知的是，利用P1噬菌体进行的P1转化是一种有计划性和有针对性的大肠杆菌染色体操作方法，也是最常用的技术[Zinder，N.D.and Lederberg J.，J.Bacteriol.，64，679(1952)]。
P1转导变异以外的染色体操作技术大体可分为2种。
一种方法是，在大肠杆菌以外的微生物内能自主复制但在大肠杆菌内不能自主复制的质粒中整合目标基因、用该质粒转化大肠杆菌的、利用同源重组的原理获得染色体中整合了目标基因的菌株[A.Chen et al.，J.Bacteriol.，176，1542(1994)]。但是，使用这种方法时，由于以大肠杆菌以外的微生物为宿主合成的质粒会被大肠杆菌内的限制酶分解，所以有获得目标染色体重组菌株的有效率非常低的缺点。
另一种方法是，利用在大肠杆菌K-12株中、一般的生长条件下能自主复制而高温等一定条件下不能自主复制的质粒，通过同源重组将目标基因整合染色体中[T.Hashimoto，and M.Sekiguchi，J.Bacteriol.，127，1561(1976)]。
在研究和生产领域被广泛使用的大肠杆菌包括K-12、B、W株等若干个体系，而多数基因重组技术是采用K-12株开发而成的。
大肠杆菌W株适用于氨基酸等有用物质的生产[S.Furukawa et al.，Appl.Microbiol.Biotechnol.，29，253(1988)]，也有蔗糖的代谢性，而且实际上已成功地应用于菌体的高密度培养[I.E.Gleiser and S.Bauer，Biotechnol.Bioeng.，23，1015(1981)]，在发酵生产上有很高的应用价值。
以上这些基因重组技术都是与K-12株有关的，而未见有适用于K-12株以外体系的埃希杆菌属微生物的报道。
本发明涉及以下(1)～(14)条内容。
(1)在大肠杆菌K-12株中10-30℃条件下可自主复制，但在33℃以上时在该菌体内不能自主复制、或该菌株细胞分裂时不能均匀分配、该条件下该菌体内无法稳定保持的温度敏感性质粒，以及在大肠杆菌K-12株以外的埃希氏杆菌属微生物中任何温度下均无法在该菌体内自主复制、或是该菌株细胞分裂时不能均匀分配、该条件下该菌体内无法稳定保持的质粒。
(2)如以上(1)所述的质粒，其中大肠杆菌K-12株以外的埃希氏杆菌属微生物，是指大肠杆菌W株或大肠杆菌B株。
(3)如以上(1)和(2)所述的质粒，其中质粒是含有与大肠杆菌的染色体可以同源重组的DNA片段的质粒。
(4)如以上(1)～(3)中任何一项所述的质粒，其中质粒是具有大肠杆菌DH5α/pMTS11910(FERM BP-6904)、或大肠杆菌DH5α/pMTS11914(FERM BP-6905)的质粒。
(5)在以上(1)～(4)中任何一项所述的质粒中整合任何基因而获得的基因整合用质粒。
(6)基因整合方法，其特征在于，将以上(1)～(5)中任何一项所述的质粒引入到大肠杆菌K-12株以外的埃希氏杆菌属微生物中。
(7)如以上(6)所述的基因整合方法，其中大肠杆菌K-12株以外的埃希氏杆菌属微生物，是指大肠杆菌W株或大肠杆菌B株。
(8)如以上(6)和(7)所述的基因整合方法，其中基因整合是将质粒整合到染色体中。
(9)如以上(6)～(8)中任何一项所述的基因整合方法，其中基因整合时，质粒上的DNA片段通过同源重组与染色体上的DNA片段发生取代。
(10)由以上(6)～(9)中任何一项所述的方法而得到的转化体。
(11)如以上(10)中所述的转化体，其中转化体是指大肠杆菌DH5α/pMTS11910(FERM BP-6904)、大肠杆菌DH5α/pMTS11914(FERM BP-6905)、大肠杆菌WLA-131(FERM BP-6902)以及大肠杆菌WL-1133(FERM BP-6903)等转化体。
(12)有用物质制造方法，其特征在于将以上(10)和(11)所述的转化体放在培养基中培养，使培养物中有用物质生长积聚，再从该培养物中提取出有用物质。
(13)如以上(12)所述的有用物质制造方法，其中有用物质选自氨基酸、有机酸、核酸、核酸相关物质、糖、脂类、维生素、色素、以及这些物质的衍生物之类的有用物质。
(14)如(12)一项所述的有用物质制造方法，其中有用物质为蛋白质。
质粒的变异处理质粒是采用pMW119(日本基因公司销售)或含有与pMW119相同的ori区域、rep基因的质粒。ori域就是含有复制起始点的区域，rep基因就是对复制酶进行编码的基因。
质粒的变异处理方法有采用羟胺这种众所周知的方法[G.O.Humphreys et al.，Mol，Gen Gennet.，145，101(1976)]等。
例如，如果是采用羟胺，则将质粒约10μg溶解到含有0.4mol/l盐酸羟胺的磷酸缓冲液[50mmol/l NaH2PO4，1mmol/l EDTA2Na，pH6.0(NaOH)]中，75℃条件下加热30-60分钟，就可使质粒变异。
获得温度敏感性质粒在大肠杆菌K-12株中表现出温度敏感性的质粒可以用众所周知的方法[T.Hashimoto，and M.Sekiguchi，J.Bacteriol.，127，1561(1976)]获得。
具体来说，采用经过变异处理的质粒，对大肠杆菌K-12株进行转化，获得在10-32℃范围内对氨苄青霉素等药物有耐受性的菌株。其中转化只要是能让大肠杆菌K-12株转化的方法即可，但是优选转化效率高的电穿孔法[W.J.Dower et al.，Nucleic Acids Res.，16，6127(1988)]。
含有标记药物的LB琼脂培养基[Bacto胰蛋白胨(Difco公司制造)1.0％、酵母提取物(Difco公司生产)0.5％、NaCl 1.0％]上涂抹经过转化处理的大肠杆菌K-12株，在10-32℃温度条件下培养6-24小时。
选出转型变异株，就是确因培养而生长的菌株。在33℃以上该转化株能够生长的温度条件下，将此转化株在未添加药物的琼脂培养基上培养。
培养后，将生长了的菌株涂抹在含有氨苄青霉素等药物的琼脂培养基上，在33℃以上该菌株能够生长的温度条件下培养6-24小时。从上述未添加药物的琼脂培养基上分离出与该条件下不能生育的菌株相对应的菌株，将其放在未添加药物的培养基上再次培养。此次培养后，从菌株中按常规方法分离出质粒。得到的质粒就是温度敏感性质粒。
获得在大肠杆菌K-12株以外的埃希氏杆菌属微生物的菌体中无法复制的质粒。
本发明涉及的、在大肠杆菌K-12株以外的埃希氏杆菌属微生物的菌体中无法复制的质粒，可以从上述(1)中所记载的方法获得的、在大肠杆菌K-12株中显示温度敏感性的质粒中选出。
其中，大肠杆菌K-12株以外的埃希氏杆菌属微生物就是任何K-12株体系以外的属于埃希氏杆菌属的微生物。比如，大肠杆菌W株、大肠杆菌B株、大肠杆菌C株、大肠杆菌15株等体系的属于大肠杆菌的微生物，其中优选大肠杆菌W株和B株。
具体而言，采用在大肠杆菌K-12株中显示温度敏感性的质粒，对大肠杆菌K-12株以外的埃希氏杆菌属微生物进行转化操作，得到转化体。将此转化体用含有药物的培养基培养时，如果在任何温度下该转化体体都无法生长，那么该温度敏感性质粒就是具有本发明特性的质粒。
染色体的基因整合由上述方法获得的、在大肠杆菌K-12株以外的埃希氏杆菌属微生物的菌体中任何温度下都无法复制的质粒(以下称本发明质粒)整合到染色体中。
首先，将基因在本发明质粒中克隆。该基因只要是与目标有用物质的制造有关，具有与大肠杆菌K-12株以外的埃希氏杆菌属微生物染色体的目标基因有相同序列者即可。有用物质就是该基因与其制造相关的所有有用物质。比如，有亮氨酸等氨基酸、异柠檬酸等有机酸、黄素腺嘌呤二核苷酸等核酸或核酸相关物质、果糖等糖类、磷脂或糖脂等脂类、生物素等维生素、胡萝卜素等色素、还有这些物质的衍生物、该基因编码的酶等蛋白质，等等。但也不仅限于这些物质。
基因的克隆可由大肠杆菌K-12株开始用常规方法进行[《分子克隆实验手册》，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)(以下简称MolecularCloning第二版)]。还可以用常规的方法人为地改变克隆后的基因的碱基序列(Molecular Cloning第二版)。而基因的克隆或是克隆后的基因改变，是以大肠杆菌K-12株为宿主、在32℃以下进行培养。
采用以上构建得到的重组质粒，对大肠杆菌K-12株以外的埃希氏杆菌属微生物进行转化，将该菌株用含有氨苄青霉素等药物的培养基培养而得到耐药性菌株，从而就可以得到含有目标基因的质粒整合到染色体中形成的染色体重组菌株。其中转化的方法可以采用电穿孔法或氯化钙法等常规的方法(Molecular Cloning第二版)。
也可以把质粒上克隆后的基因和大肠杆菌K-12株以外的埃希氏杆菌属微生物原染色体上具有的基因发生取代，从而获得菌株。
具体而言，采用本发明质粒转化后的菌株在不含氨苄青霉素等药物的培养基中培养。只要是该变形株可以生长的培养基，则可以用琼脂固体培养基培养，也可以用不含琼脂的液体培养基培养。
培养后的菌体用适量灭菌生理盐水稀释，涂抹在不含氨苄青霉素等药物的LB琼脂培养基上进行培养。发生生长的各菌落涂抹在含有氨苄青霉素等药物的琼脂培养基上，从原来的未添加药物的培养基上分离出与未发生生长的菌株相对应的菌株。从分离后的菌株中，可以选出本发明质粒上的基因与大肠杆菌K-12株以外的埃希氏杆菌属微生物染色体上原有基因通过同源重组发生取代后的菌株。
含有目标基因的质粒整合到染色体上得到的染色体重组株，或是质粒上经过了克隆的基因与大肠杆菌K-12株以外的埃希氏杆菌属微生物原染色体上具有的基因发生取代而得的菌株，以下称为本发明微生物。
用本发明微生物可以制造有用物质。
还有，上述方法中，如果质粒整合到染色体上的位置设计在目标基因的碱基序列中，那么在目标基因上整合新的序列就可以破坏该基因。用这种方法破坏基因，其优点是比通过变异使基因失活的方法准确率要高。
培养本发明微生物的培养基，只要含有本发明微生物可以用于代谢的碳源、氮源、无机盐类等、可有效地培养本发明微生物，不管是天然培养基，还是合成培养基均可。
碳源，只要是本发明微生物可以用于代谢者即可，如葡萄糖、果糖、蔗糖、含有这些糖的糖蜜、淀粉或淀粉水解产物等碳水化合物、醋酸、丙酸等有机酸、乙醇、丙醇等醇类，等等。
氮源，可以用氨、氯化铵、硫酸铵、醋酸铵、磷酸铵等无机酸或有机酸的铵盐、其他含氮化合物、以及蛋白胨、肉提取物、酵母提取物、玉米浸渍液、酪蛋白水解物、大豆粕和大豆粕水解物、各种发酵菌体及其消化产物等。
无机盐，可以用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙等。
培养时，用振荡培养或深部通风搅拌培养等好氧条件下进行。
培养温度是15-40℃即可，培养时间一般为16小时～7天。培养中的pH值最好保持3.0～9.0。使用无机或有机酸、碱性溶液、尿素、碳酸钙、氨等来调节pH值。
还有，培养中必要时也可以在培养基中加入氨苄青霉素或四环素等抗生素。
通过上述培养，可以在培养液中积聚有用物质。
培养结束后，除去培养液中的菌体等沉淀物，同时使用离子交换处理法、浓缩法、盐析法等就可以从培养液中回收该有用物质。
有用物质为蛋白质时，可以用常规的蛋白质分离精制法对该蛋白质进行分离精制。比如，如果该蛋白质表现为溶解于细胞内的状态，那么培养结束后，通过离心分离回收细胞，用水系缓冲液悬浊，然后通过超声波粉碎机、法式压力机、Manton Gaulin匀浆器、Dyno磨等粉碎细胞，得到无细胞提取液。该无细胞提取液离心分离得到的上层清液，单独或合并使用以下各种常用的蛋白质分离精制法，即可得精制蛋白质。精制法有溶剂提取法、硫铵等盐析法、去盐法、有机溶剂沉淀法、二乙氨基乙基(DEAE)纤维素、使用DIAION HPA-75(三菱化成公司制造)等树脂的阴离子交换色谱法、用S-Sepharose FF(Pharmacia公司制造)等树脂的阳离子交换色谱法、使用丁基纤维素、苯基纤维素等树脂的疏水性色谱法、使用分子筛的凝胶过滤法、亲和色谱法、色谱聚焦法、等电点电泳等电泳法，等等。
另外，如果该蛋白质在细胞内形成不溶物而表达的情况，那么同样是对细胞进行回收、破碎、离心分离，该蛋白质不溶物作为沉淀组分而加以回收。回收的该蛋白质不溶物用蛋白质改性剂使其变为可溶。对该可溶性液体进行稀释或透析、降低该可溶液中蛋白质改性剂的浓度，从而使该蛋白质恢复到正常的立体结构。然后，通过与上述相同的分离精制法就可以得到该蛋白质的精制标准品。
本发明的实施例如下所述，但本发明并不仅限于实施例。
图2表示含有亮氨酸操纵子的pTS14-LEUR122的限制酶地图、以及各基因的配置图。
发明的最佳实施方案如下所述的实施例中的操作，只要未作特别申明，均按MolecularCloning第二版记载的方法实施。实施例1获得在大肠杆菌W株中无法保持的质粒对大肠杆菌的代表性质粒载体pMW119[日本基因公司制造]用体外培养进行变异处理。变异处理采用[G.O.Humphreys et al.，Mol.Gen.Genet.，145，101(1976)]记载的如下所示的羟胺方法进行。
首先，用超速离心法将配好的pMW119约10μg溶解到含有0.4mol/l盐酸羟胺的磷酸缓冲液[50mol/lNaH2PO4，1mmol/l EDTA2Na，pH6.0(NaOH)]中。在75℃下对该溶液加热40分钟。然后，加入乙醇使处理DNA沉淀，溶解到TE溶液[10mol/l三羟甲基甲烷，1mol/l EDTAZNa，pH8.0(HCl)]中。
用该DNA溶液对大肠杆菌K-12株DH5α(Bethesda ReseachLaboratories)进行转化处理。将该菌株在含有氨苄青霉素50mg/l的LB琼脂培养基[Bacto胰蛋白胨(Difco公司制造)1％、酵母提取物0.5％、NaCl 0.5％、琼脂2％]上30℃中培养，选出约1700株发生生长的菌株。
将这些选择菌株复制到不含氨苄青霉素的LB琼脂培养基，在42℃培养。发生生长的菌落再次复制到含有氨苄青霉素的LB琼脂培养基，在42℃培养，从原来的平板上选出22株不能生长的菌株。
采用从这些选择菌株提取出的质粒，通过电穿孔法[William J.Dower et al.，Nucleic Acids Research，16，6127(1988)]对大肠杆菌W株(ATCC-11105)和大肠杆菌B株(ATCC-11303)进行转化处理。此时转换变异效率为7×108细胞/μg pBR322。
W株和B株这两株中，对氨苄青霉素显示耐受性的转换变异株获得频率为pMW119的107分之一以下的2种质粒分别为pMTS11910、pMTS11914。用pMTS11910、pMTS11914对大肠杆菌DH5α进行转化。该转化株大肠杆菌DH5α/pMTS11910和大肠杆菌DH5α/pMTS11914按照布达佩斯条约于平成11年9月30日分别以FERM BP-6904、FERM BP-6905保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(原工业技术院生命工学工业技术研究所日本国茨城县筑波市东1丁目1番3号)。实施例2构建含有亮氨酸操纵子的温度敏感性质粒采用大肠杆菌L-亮氨酸产生菌(FERM BP-4704)(特开平8-70879)的leu操纵子作为进行染色体基因整合的基因。用斋藤等人的方法[H.Saito and K.Miura，Biochem.Biophys.Acta，72，619(1963)]提取FERM BP-4704株的染色体DNA，再用限制酶Sau3AI将该染色体DNA部分分解。另外，用限制酶BamHI分解pMW218[日本基因(株)]，再进行碱性磷酸酯酶处理。处理后的各DNA溶液混合后，用T4 DNA连接酶进行连接反应。
采用该连接处理后的DNA，对大肠杆菌L-亮氨酸必需株CV437[M.G.Davis and J.M.Calvo，J.Bacteriol.，129，1078(1977)]通过电穿孔法进行转化。结果得到66株具有卡那霉素耐受性和L-亮氨酸非必需性的菌株。其中，将菌株在不含L-亮氨酸的M9最少培养基上培养，选出可以生长的菌株，就得到了L-亮氨酸非必需性菌株。
由该菌株中任选12株，提取质粒DNA。用该质粒DNA，对L-亮氨酸必需株CV524[M.G.Davis and J.M.Calvo，J.Bacteriol.，129，1078(1977)]通过电穿孔法进行转化，L-亮氨酸非必需株的质粒为pLEUR12。因为CV437缺少leu A，而CV524缺少leu D，所以推断往pLEUR12中至少整合了含有leu A和leu D的leu操纵子。再进一步绘制出pLEUR12的整合DNA片段的限制酶地图，结果发现和已经确定碱基序列的大肠杆菌K-12株leu ABCD基因[T.Ura et al.，Nucleic Acids Research，20，3305(1992)]的限制酶地图一致。
推断的pLEUR12的结构如

图1所示。
将克隆后的leu操纵子按以下操作步骤整合pMTS11914。
首先，用限制酶EcoRI、XbaI切断pLEUR12，对该切断DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳，由凝胶中提取出含有leu操纵子的约9Kb的片段。
另外，用限制酶EcoRI、XbaI切断pMTS11914，再用碱性磷酸酯酶处理。处理后的DNA溶液混合后，用T4 DNA连接酶进行连接反应。用该连接处理后的DNA，对大肠杆菌L-亮氨酸必需株C600[Brenner S.，and J.R.Beckwith，J.Mol.Biol.，13，629(1965)]通过电穿孔法进行转化。结果得到约500株具有氨苄青霉素耐受性的菌株。由该氨苄青霉素耐受性菌株中，按上述方法选出L-亮氨酸非要求性菌株，再将选出的菌株在42℃进行培养，选出具有氨苄青霉素敏感性的菌株。由选出的菌株中提取出质粒，检查该质粒的限制酶切断方式，将整合了目标leu操纵子的质粒作为pTS14-LEUR122(图2)。实施例3将pTS14-LEUR122整合入大肠杆菌W株染色体中采用pTS14-LEU R122，对大肠杆菌W 113-3株[ATCC-11105，J，Bacteriol.，60，17(1950)]通过电穿孔法进行转化。对转化而得的氨苄青霉素耐受性菌株，用生物测定法检查其是否具有L-亮氨酸生产能力。
具体而言，就是在如前所述的L-亮氨酸必需株CV524浓度约为1×107cells/ml、含M9最少琼脂培养基(葡萄糖5g/l，Na2HPO46g/l，KH2PO43g/l，NaCl 0.5g/l，NH4Cl 1g/l，MgSO41mol/l，CaCl20.1mol/l，DL-蛋氨酸20mg/l，琼脂2％)上，涂抹获得的氨苄青霉素耐受性菌株，37℃中培养12小时。
在具有L-亮氨酸生产能力的菌株的周围，CV524菌株生长并形成白色混浊的环形(以下称为晕圈)。分离出晕圈形成比平均大小要大的菌株，在含有氨苄青霉素的LB琼脂培养基上42℃培养。从该菌株中选出具有氨苄青霉素耐受性的菌株，这就是染色体上整合了pTS14-LEUR122的菌株。将该菌株的其中一个命名为大肠杆菌WLA-131株。
通过Southern杂交确定了pTS14-LEUR122经同源重组整合入了大肠杆菌WLA-131株染色体上。
大肠杆菌WLA-131株按照布达佩斯条约于平成11年9月30日作为FERM BP-6902保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(原工业技术院生命工学工业技术研究所日本国茨城县筑波市东1丁目1番3号)。实施例4采用染色体整合株获得取代株大肠杆菌WLA-131株接种到5ml LB培养基，33℃振荡培养24小时。得到的培养液100μL再接种到5mlLB培养基，33℃振荡培养24小时。
该培养液适度稀释后涂抹到LB琼脂培养基上。
发生生长的菌落复制到含有和不含有氨苄青霉素的LB琼脂培养基，选出氨苄青霉素敏感性菌株。用如实施例3所述的生物测定法检验该氨苄青霉素敏感性菌株的L-亮氨酸生产能力，形成晕圈的菌株的其中之一命名为大肠杆菌WL-1133株。
大肠杆菌WL-1133株按照布达佩斯条约于平成11年9月30日以FERMBP-6903保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(原工业技术院生命工学工业技术研究所日本国茨城县筑波市东1丁目1番3号)。
为确定大肠杆菌WL-1133株染色体上的基因已按预定目标重组，采用Southerin杂交方法进行了解析。pLEUR12进行HindIII和BamHI消化，获得含有leu ABCD的4.4Kb片段。该片段用异羟基毛地黄毒苷元修饰，用作探针。从大肠杆菌W113-3株、大肠杆菌WLA-131株、大肠杆菌WL-1133株中提取染色体DNA，该染色体DNA用SacII、KpnI分解，进行琼脂糖凝胶电泳。
电泳后，分离出来的DNA转移到硝酸纤维素薄膜，和探针杂交，接着进行了显色操作。亲株大肠杆菌WLA-113-3株和大肠杆菌WL-1133株中只检测出含有leu ABCD的约17Kb片段。而大肠杆菌W131株中检测出11Kb和约19Kb这两个片段。
用于染色体整合的pTS14-LEUR122在其多克隆位点具有一个KpnI位点。因此，如果象预先设定的那样将质粒上的亮氨酸操纵子经同源重组整合到了染色体上，就应该可以检测出19Kb和11Kb这两个片段。由以上可知，对大肠杆菌WLA-131株来说，pTS14-LEUR122整合到了其染色体上的leu操纵子上；对大肠杆菌WL-1133株来说，整合的质粒由于再次同源重组而脱落了。
也就是说，曾整合在染色体上的pTS14-LEUR122的来自于pMT11914的区域从染色体上脱落了，大肠杆菌WL-1133株的染色体上有1拷贝的leu操纵子。实施例5氨基酸生产实验大肠杆菌W113-3株、大肠杆菌WLA-131株、大肠杆菌WL-1133株分别接种到250ml容量的烧瓶中的种培养基(葡萄糖2％、蛋白胨1％、酵母提取物1％、NaCl0.25％、pH7.0)20ml上，30℃中振荡培养16小时。得到的种培养液2.5ml分别接种到250ml容量烧瓶中的生产培养基(葡萄糖3％、硫酸胺1.6％、磷酸二氢钾0.1％、玉米浸渍液0.2％、DL-蛋氨酸150mg/l、磷酸镁4％、碳酸钙1％、pH7.0)25ml上，在30℃中振荡培养48小时。培养结束后的培养液中的L-亮氨酸的积聚量用高效液相色谱法定量。
结果如表1所示。
表1

工业实用性采用在大肠杆菌K-12株中可以自主复制、在大肠杆菌K-12株以外的大肠杆菌(大肠杆菌K-12株以外的埃希氏杆菌属微生物)中不能自主复制的质粒，就可以在大肠杆菌K-12株以外的埃希氏杆菌属微生物的染色体上的任意区域整合任意基因，或有目的地改变染色体上的任意基因。
权利要求
1.质粒，是在大肠杆菌K-12株中、10-30℃范围内能够自主复制、而在33℃以上在该菌体内不能自主复制或是该菌株细胞分裂时不能均匀分配、该条件下在该菌体内不能保持稳定的温度敏感性质粒，而且在大肠杆菌K-12株以外的埃希氏杆菌属微生物中、任何温度下在该菌体内都无法自主复制、或是该菌株细胞分裂时不均匀分配、该条件下在该菌体内不能保持稳定的质粒。
2.如权利要求1所记载的质粒，其中大肠杆菌K-12株以外的埃希氏杆菌属微生物为大肠杆菌W株和大肠杆菌B株。
3.如权利要求1和2所记载的质粒，其中质粒为含有与大肠杆菌的染色体可以同源重组的DNA片段的质粒。
4.如权利要求1～3中任何一项所记载的质粒，其中质粒为具有大肠杆菌DH5α/pMTS11910(FERM BP-6904)和大肠杆菌DH5α/pMTS11914(FERM BP-6905)的质粒。
5.在如权利要求1～3中任何一项所记载的质粒中整合任意基因而得到的基因整合用质粒。
6.基因整合方法，其特征在于将如权利要求1～5中任何一项所记载的质粒引入到大肠杆菌K-12株以外的埃希氏杆菌属微生物中。
7.如权利要求6所记载的基因整合方法，其中大肠杆菌K-12株以外的埃希氏杆菌属微生物为大肠杆菌W株或大肠杆菌B株。
8.如权利要求6或7所记载的基因整合方法，其中基因整合是通过将质粒整合到染色体中的方式进行的。
9.如权利要求6～8任一项所记载的基因整合方法，其中基因整合是质粒上的DNA片段通过同源重组与染色体上的DNA片段发生取代。
10.通过如权利要求6～9任一项所记载的方法获得的转化体。
11.如权利要求10所记载的转化体，其中转化体是选自大肠杆菌DH5α/pMTS11910(FERM BP-6904)、大肠杆菌DH5α/pMTS11914(FERMBP-6905)、大肠杆菌WLA-131(FERM BP-6902)、大肠杆菌WL-1133(FERMBP-6903)中的任何一种。
12.有用物质制造方法，其特征在于将如权利要求10和11所记载的转化体用培养基培养，在培养物中生成并积聚有用物质，从该培养物中提取有用物质。
13.如权利要求12所记载的有用物质制造方法，其中有用物质为氨基酸、有机酸、核酸、核酸相关物质、糖、脂类、维生素、色素和这些物质的衍生物中的任何一种。
14.如权利要求12所记载的有用物质制造方法，其中有用物质为蛋白质。
全文摘要
埃希氏杆菌属微生物作为各种有用物质的产生菌具有很高的应用价值。本发明的目的在于提供对此种微生物染色体上之特定基因进行有效人工重组的方法。构建在大肠杆菌K－12株中可以复制、同时在大肠杆菌K－12株以外的埃希氏杆菌属微生物中不能复制的质粒。向此质粒中整合目标基因，再将其引入至大肠杆菌K－12株以外的埃希氏杆菌属微生物中，就可以有效地选出目标基因被取代后的菌株。
文档编号C12N15/70GK1422335SQ01807613
公开日2003年6月4日 申请日期2001年4月6日 优先权日2000年4月6日
发明者高野纯一, 木野邦器, 古川令 申请人:协和发酵工业株式会社