检测和定量人p450分子种类的方法以及用于该方法的探针和试剂盒的制作方法

文档序号:573257阅读:496来源:国知局
专利名称:检测和定量人p450分子种类的方法以及用于该方法的探针和试剂盒的制作方法
技术领域
本发明涉及检测和定量人P450分子种类的方法以及用于该方法的探针和试剂盒。
在开发新药中,重要的是要了解人细胞色素P450的分子种类(下文简称“P450”)对施用新药的作用(表达水平的变化)。这是因为如果P450分子种类的表达水平的变化是未知的,则不可能预测与新药同时施用的药物或另一物质导致新药的功效和副作用增加或减少,或者预测同时施用的药物的功效和副作用增加或减少。因此,新药的安全性不能得到证实。
所以,在药物领域,如新药开发,一直希望得到涉及P450分子种类的信息,尤其是单独测定P450分子种类水平的技术以获得涉及各个P450分子种类的信息。单独测定分子种类的技术的开发将使下列行为成为可能,例如,容易地了解一种新药与另一种药的相互作用和该新药对特异病状中的机体的影响,以及获得关于新药的副作用的信息,由此确保其安全性。
聚合酶链式反应(PCR)是扩增核酸众所周知的方法。在PCR技术中,将RT-PCR(反转录-PCR)、竞争性RT-PCR等用于检测和定量痕量的mRNA,并显示它们的有效性。
近年来,使用PCR已经建立了实时的定量检测技术(TaqMan PCR,Genome Res.,6(10),986(1996),ABI PRISMTMSequence DetectionSystem,Applied Biosystem)。该技术采用特定的荧光-标记的探针(TaqMan探针)测定核酸量。更具体而言,该技术采用下列原理例如,将在5’末端具有报道染料和3’末端具有淬火染料的荧光-标记的探针与靶DNA退火,并将DNA进行正常PCR。随着延伸反应进行,从5’末端通过DNA聚合酶所拥有的5’-3’外切核酸酶活性水解探针。结果将5’末端的报道染料从3’末端的淬火染料分离,由此消除由两个染料之间的空间所产生的FRET(荧光共振能量转移,由于两个荧光染料的共振导致报道染料的能量水平降低,荧光强度减少)效应,并增加了已受到淬火染料控制的报道染料的荧光强度。靶核酸通过测定荧光强度的增加可以实时方式被选择地定量和检测。
该技术的优点在于其能在短时间内同时测试各种样品,这是由于与使用常规PCR的检测和定量技术不同,该技术不包括复杂步骤,如PCR后扩增产物的琼脂糖凝胶电泳和分析电泳图。
一般而言,当在临床测试中心等中进行临床测试时,必须在有限的时间内检查极大量的样品。所以,对开发有效测试技术存在相当的要求。实时定量检测技术是满足该需求有希望的候选对象。
本发明人将他们的注意力转向到使用PCR实时定量检测技术上,并设想如果检测技术可用于检测人P450分子种类,则使用相同的仪器在相同的PCR条件下可单独检测和定量该分子种类。
然而,如上所述,目前已知有大约30个P450分子种类参与了化学物质的代谢。尽管各个种类的mRNA序列是已知的,但是人们认为找到寡核苷酸(用作引物对)是困难的,所述寡核苷酸相互之间不重叠,并且能足够扩增这些分子种类作为靶基因以及与所述靶基因的特定部分杂交。困难的还有设想在引物对之间的特定区域中组成探针,该探针在相同PCR条件下与靶基因的杂交速度比其引物更快,并且只特异于一个分子种类。具体而言,虽然两个已知核苷酸序列的核酸之间杂交的容易度在一定程度上通过计算熔点(Tm)可估算出来,但是引物和基于估算而选择的探针的组合在DNA测定中没有必要带来好的结果。所以,针对全部现有已知P450分子种类的每一个,期望获得专家的许多尝试实验来筛选用于实时PCR检测的引物对和探针的组合,所述检测能够单独测定其基因。
本发明的另一目的是提供用于上述方法的探针和引物对。
为了实现上述目的,本发明人对P450分子种类反复进行了大量的实验和研究。结果是本发明人成功地找到了由引物对和探针组成的组,这些组特异于29个P450分子种类的特定基因,即引物对和探针的组能够单独地检测和定量编码分子种类的基因。基于此发现完成了本发明。
本发明提供了用于检测和定量P450分子种类的探针,各个探针包含与下列基因区域(1)-(29)中的一种可杂交的寡核苷酸。
(1)CYP1A1基因第616-641位的区域(2)CYP1A2基因第884-909位的区域(3)CYP1B1基因第1176-1203位的区域或第785-812位的区域(4)CYP2A6/7基因第195-218位的区域(5)CYP2A6基因第40-69位的区域(6)CYP2A7基因第889-913位的区域(7)CYP2B6基因第533-560位的区域或第1175-1202位的区域(8)CYP2C8基因第375-400位的区域或第863-894位的区域(9)CYP2C9基因第913-888位的区域或第863-890位的区域(10)CYP2C18基因第1420-1444位的区域(11)CYP2C19基因第913-887位的区域或第863-894位的区域(12)CYP2D6基因第748-775位的区域(13)CYP2E1基因第1096-1117位的区域(14)CYP2F1基因第608-635位的区域(15)CYP2J2基因第485-508位的区域(16)CYP3A3/4基因第876-905位的区域(17)CYP3A4基因第946-918位的区域(18)CYP3A5基因第850-822位的区域(19)CYP3A7基因第850-819位的区域(20)CYP4A11基因第666-691位的区域或第241-266位的区域(21)CYP4B1基因第997-1024位的区域(22)CYP4F2基因第1182-1205位的区域(23)CYP4F3基因第1188-1212位的区域(24)CYP4F8基因第1341-1370位的区域(25)CYP11B1基因第1209-1234位的区域(26)CYP11B2基因第1209-1239位的区域(27)CYP17基因第1230-1255位的区域(28)CYP19基因第437-465位的区域(29)CYP27基因第197-224位的区域更具体而言,本发明提供上述探针,其进一步包含报道染料和淬火染料,两者皆附着于寡核苷酸上;在上述探针中寡核苷酸具有20-40个的碱基长度;在上述探针中寡核苷酸包含在SEQ ID NO1至SEQ IDNO35中的一个所示的序列;在上述探针中寡核苷酸由在SEQ ID NO1至SEQ ID NO35中的一个所示的序列组成。
进一步,本发明提供检测和定量一种或多种P450分子种类的试剂盒,所述试剂盒包含至少一组正向引物和反向引物的引物对以及探针,各个引物和探针包含与以下(1)-(35)中所示的基因区域可杂交的寡核苷酸。
(1)引物对CYP1A1基因的第589-610位区域和第685-664位区域;探针该基因的第616-641位区域(2)引物对CYP1A2基因的第860-880位区域和第951-931位区域;探针该基因的第884-909位区域(3)引物对CYP1B1基因的第1155-1174位区域和第1228-1207位区域;探针该基因的第1176-1203位区域(4)引物对CYP2A6/7基因的第173-193位区域和第254-236位区域;探针该基因的第195-218位区域(5)引物对CYP2A6基因的第20-48位区域和第171-146位区域;探针该基因的第40-69位区域(6)引物对CYP2A7基因的第861-884位区域和第1000-978位区域;探针该基因的第889-913位区域(7)引物对CYP2B6基因的第513-531位区域和第587-564位区域;探针该基因的第533-560位区域(8)引物对CYP2C8基因的第352-372位区域和第425-407位区域;探针该基因的第375-400位区域(9)引物对CYP2C9基因的第659-682位区域和第937-915位区域;探针该基因的第913-888位区域
(10)引物对CYP2C18基因的第1394-1414位区域和第1473-1451位区域;探针该基因的第1420-1444位区域(11)引物对CYP2C19基因的第858-880位区域和第943-921位区域;探针该基因的第913-887位区域(12)引物对CYP2D6基因的第720-740位区域和第912-891位区域;探针该基因的第748-775位区域(13)引物对CYP2E1基因的第1070-1088位区域和第1146-1123位区域;探针该基因的第1096-1117位区域(14)引物对CYP2F1基因的第585-606位区域和第744-723位区域;探针该基因的第608-635位区域(15)引物对CYP2J2基因的第460-482位区域和第592-571位区域;探针该基因的第485-508位区域(16)引物对CYP3A3/4基因的第850-872位区域和第1014-993位区域;探针该基因的第876-905位区域(17)引物对CYP3A4基因的第825-854位区域和第973-948位区域;探针该基因的第946-918位区域(18)引物对CYP3A5基因的第684-705位区域和第881-859位区域;探针该基因的第850-822位区域(19)引物对CYP3A7基因的第684-705位区域和第881-859位区域;探针该基因的第850-819位区域(20)引物对CYP4A11基因的第640-663位区域和第805-784位区域;探针该基因的第666-691位区域(21)引物对CYP4B1基因的第974-995位区域和第1081-1061位区域;探针该基因的第997-1024位区域(22)引物对CYP4F2基因的第1092-1113位区域和第1276-1256位区域;探针该基因的第1182-1205位区域(23)引物对CYP4F3基因的第1073-1094位区域和第1267-1246位区域;探针该基因的第1188-1212位区域(24)引物对CYP4F8基因的第1278-1299位区域和第1390-1371位区域;探针该基因的第1341-1370位区域
(25)引物对CYP11B1基因的第1158-1179位区域和第1415-1396位区域;探针该基因的第1209-1234位区域(26)引物对CYP11B2基因的第1167-1189位区域和第1429-1407位区域;探针该基因的第1209-1239位区域(27)引物对CYP17基因的第1200-1221位区域和第1294-1272位区域;探针该基因的第1230-1255位区域(28)引物对CYP19基因的第414-435位区域和第487-467位区域;探针该基因的第437-465位区域(29)引物对CYP27基因的第171-193位区域和第292-271位区域;探针该基因的第197-224位区域(30)引物对CYP1B1基因的第766-783位区域和第961-941位区域;探针该基因的第785-812位区域(31)引物对CYP2B6基因的第1146-1168位区域和第1228-1207位区域;探针该基因的第1175-1202位区域(32)引物对CYP2C8基因的第783-804位区域和第926-905位区域;探针该基因的第863-894位区域(33)引物对CYP2C9基因的第766-789位区域和第910-891位区域;探针该基因的第863-890位区域(34)引物对CYP2C19基因的第748-769位区域和第943-922位区域;探针该基因的第863-894位区域(35)引物对CYP4A1 1基因的第209-230位区域和第288-268位区域;探针该基因的第241-266位区域更具体而言,本发明提供上述试剂盒,其中探针进一步包含报道染料和淬火染料,两者皆附着于寡核苷酸上。
优选地,上述试剂盒中的引物对和探针的组选自下列(1)-(35)的组,即在组中引物和探针各包含以下所示的SEQ ID NO的序列。更优选地,组中的引物和探针各由以下所示的SEQ ID NO的序列组成。
(1)一组包含在SEQ ID NO36和37中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO1中所示序列的探针(2)一组包含在SEQ ID NO38和39中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO2中所示序列的探针(3)一组包含在SEQ ID NO40和41中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO3中所示序列的探针(4)一组包含在SEQ ID NO42和43中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO4中所示序列的探针(5)一组包含在SEQ ID NO44和45中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO5中所示序列的探针(6)一组包含在SEQ ID NO46和47中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO6中所示序列的探针(7)一组包含在SEQ ID NO48和49中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO7中所示序列的探针(8)一组包含在SEQ ID NO50和51中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO8中所示序列的探针(9)一组包含在SEQ ID NO52和53中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO9中所示序列的探针(10)一组包含在SEQ ID NO54和55中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO10中所示序列的探针(11)一组包含在SEQ ID NO56和57中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO11中所示序列的探针(12)一组包含在SEQ ID NO58和59中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO12中所示序列的探针(13)一组包含在SEQ ID NO60和61中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO13中所示序列的探针(14)一组包含在SEQ ID NO62和63中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO14中所示序列的探针(15)一组包含在SEQ ID NO64和65中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO15中所示序列的探针
(16)一组包含在SEQ ID NO66和67中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO16中所示序列的探针(17)一组包含在SEQ ID NO68和69中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO17中所示序列的探针(18)一组包含在SEQ ID NO70和71中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO18中所示序列的探针(19)一组包含在SEQ ID NO72和73中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO19中所示序列的探针(20)一组包含在SEQ ID NO74和75中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO20中所示序列的探针(21)一组包含在SEQ ID NO76和77中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO21中所示序列的探针(22)一组包含在SEQ ID NO78和79中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO22中所示序列的探针(23)一组包含在SEQ ID NO80和81中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO23中所示序列的探针(24)一组包含在SEQ ID NO82和83中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO24中所示序列的探针(25)一组包含在SEQ ID NO84和85中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO25中所示序列的探针(26)一组包含在SEQ ID NO86和87中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO26中所示序列的探针(27)一组包含在SEQ ID NO88和89中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO27中所示序列的探针(28)一组包含在SEQ ID NO90和91中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO28中所示序列的探针(29)一组包含在SEQ ID NO92和93中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO29中所示序列的探针(30)一组包含在SEQ ID NO94和95中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO30中所示序列的探针
(31)一组包含在SEQ ID N096和97中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO31中所示序列的探针(32)一组包含在SEQ ID NO98和99中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO32中所示序列的探针(33)一组包含在SEQ ID NO100和101中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO33中所示序列的探针(34)一组包含在SEQ ID NO102和103中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO34中所示序列的探针(35)一组包含在SEQ ID NO104和105中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO35中所示序列的探针上述组用于检测和定量下列P450分子种类。
组(1)CYP1A1组(2)CYP1A2组(3)和(30)CYP1B1组(4)CYP2A6/7组(5)CYP2A6组(6)CYP2A7组(7)和(31)CYP2B6组(8)和(32)CYP2C8组(9)和(33)CYP2C9组(10)CYP2C18组(11)和(34)CYP2C19组(12)CYP2D6组(13)CYP2E1组(14)CYP2F1组(15)CYP2J2组(16)CYP3A3/4组(17)CYP3A4组(18)CYP3A5
组(19)CYP3A7组(20)和(35)CYP4A11组(21)CYP4B1组(22)CYP4F2组(23)CYP4F3组(24)CYP4F8组(25)CYP11B1组(26)CYP11B2组(27)CYP17组(28)CYP19组(29)CYP27本发明进一步提供了检测和定量一种或多种P450分子种类的方法,该方法包括下述的步骤(a)-(c),具体而言,在所述方法步骤(c)中,通过检测由激发光辐射所产生的荧光并测定荧光强度来检测和定量水解的一种或多种探针(a)制备含有一种或多种P450基因的样品;(b)使用本发明的试剂盒将该样品进行聚合酶链式反应(PCR,其可以是RT-PCR),所述试剂盒包括至少一个上述组的引物对和探针,以扩增样品中一种或多种编码P450分子种类的基因;以及(c)检测并测定在聚合酶链式反应过程中水解的一种或多种探针。
在此说明书中,氨基酸、肽、核苷酸序列、核酸等的缩写是在IUPAC-IUB通讯中对生物命名(IUPAC-IUB Communication onBiological Nomenclature,Eur.J.Biochem.,1389(1984))或“对含有核苷酸序列或氨基酸序列的说明书的准备指南”(日本专利局)(“Guideline for preparation of a specification containing nucleotidesequences or amino acid sequences”(JPO))所提供的那些,或本领域常用的那些。
本说明书中的术语“基因”包括双链DNA以及单链的有义或反义DNA组成的双链的DNA。该术语进一步包括参与这些基因表达的mRNA和与该mRNA互补的cDNA。术语“核苷酸”(“寡核苷酸”)包括RNA和DNA。
更优选的是根据实时检测技术,使用以报道染料和淬火染料标记的探针来实施本发明的方法。
实时检测技术能够容易和快速地以实时方式在相同的PCR或RT-PCR条件下对分子种类的基因进行单独定量,该技术的建立很有益于临床和药物领域。例如,该技术可容易地定量人样品中的P450mRNA表达,这在医药开发的动力学测试中是重要的,由此使得知晓P450分子种类当其与化学物质如药物接触时的活性成为可能。具体而言,在新药的开发中,要求研究者研究P450的代谢活性。通常,P450的代谢活性已通过单独检测各个P450分子的表达水平进行了研究,这是一种复杂、费工和费时的方法。相反,本发明提供在相同条件下对P450分子的表达水平容易和快速地进行定量的方法,这极其有用的,尤其是在新药开发中。
对分离组织或活检获得的组织中P450分子种类的mRNA表达的研究,本发明的方法也是有效的。因此,本发明方法的优点在于使用从少量组织中抽提出的总RNA,就能容易和快速地处理各种样品并获得所需的检测。
肝、肾等中由酶诱导或其他方法所导致的特定P450分子种类的表达水平的变化与血液(血液中的核细胞)中表达水平的变化存在着相关的可能性。然而,由于血液中表达水平低,需要大量的血用于测定。本发明的测定方法使用任意组的上述由本发明人设计的引物对和探针,使用少量的样品和普通设备就能容易和快速地检测和定量P450分子种类。所以,本发明的方法可检测和定量血液或相似样品中编码各个P450分子种类的基因,由此使得估算分子种类的表达水平称为可能。本发明的探针和引物对本发明的探针和引物对各包括与P450分子种类的特异区域可杂交的寡核苷酸。
如本文所用的术语“可杂交”表示在下列PCR(RT-PCR)条件下能与特异区域杂交48℃30分钟1个循环,95℃10分钟1个循环以及50个循环,各循环由95℃15秒和60℃1分钟组成。
一般而言,可杂交的寡核苷酸具有与特异区域的核苷酸互补的核苷酸序列。然而本领域已知,即使由例如约20个核苷酸组成的引物或探针与其模板链也可能有约1或2个错配,该引物或探针与其模板链杂交,并因此以PCR引物或检测探针起作用。因而,本发明的引物和探针包括那些含有少量错配的核苷酸序列。当然,错配数优选尽可能少。
本发明的探针和引物要求具有以下特征它们生成的扩增产物长度为约50-约400bp;各个组中的引物尽可能地靠近探针;各个序列中的G(鸟嘌呤)和C(胞嘧啶)的比例尽可能地靠近50%;它们一排中不含有4个或更多个G(鸟嘌呤)核苷酸。本发明探针要求的另一特征是它们具有Tm约为70℃。进一步,要求引物具有Tm约为60℃。
满足上述要求的各个引物或探针的寡核苷酸中的核苷酸数至少15,通常15-50,优选20-40。如果引物或探针中的核苷酸数远大于上述范围,则引物或探针难以与单链DNA杂交。另一方面,如果核苷酸数太少,则杂交的特异性降低。
引物和探针的核苷酸的特定例子如下描述。依赖于分子种类,使用SEQ ID NO1-35(探针)和SEQ ID NO36-105(引物)中所示的序列。
优选地,用作本发明探针和引物的寡核苷酸由在这些SEQ ID NO中的一个所示的核苷酸序列所组成。但是,它们并不限于这些寡核苷酸,并且可能具有少量的错配,只要它们主要包含这些核苷酸序列中的一个。
P450分子种类的mRNA序列是已知的,并且以下列登记编号登记在GenBank中。
(1)CYP1A1基因NM_000499(2)CYP1A2基因AF182274(3)CYP1B1基因NM_000104(4)CYP2A6/7基因AF182275/NM_000764(5)CYP2A6基因AF182275(6)CYP2A7基因NM_000764(7)CYP2B6基因AF182277(8)CYP2C8基因NM_000770(9)CYP2C9基因M61857(10)CYP2C18基因M61856(11)CYP2C19基因NM_000769(12)CYP2D6基因NM_000106(13)CYP2E1基因AF182276(14)CYP2F1基因NM_000774(15)CYP2J2基因NM_000775(16)CYP3A3/4基因NM_000776/AF182273(17)CYP3A4基因AF182273
(18)CYP3A5基因NM_000777(19)CYP3A7基因NM_000765(20)CYP4A11基因NM_000778(21)CYP4B1基因NM_000779(22)CYP4F2基因NM_001082(23)CYP4F3基因NM_000896(24)CYP4F8基因NM_007253(25)CYP11B1基因NM_000497(26)CYP11B2基因NM_000498(27)CYP17基因NM_000102(28)CYP19基因NM_000103(29)CYP27基因M62401在本说明书中,分子种类的特异区域以登记在上述登记编号下的基因序列所指明。
用作本发明探针和引物的寡核苷酸可以常规方式采用全自动合成仪如DNA合成仪(Perkin-Elmer)等方便地合成。将所得的寡核苷酸可使用市售的滤芯等按需进行纯化。实时定量和检测通过PCR使用本发明的引物对和探针的实时检测P450分子种类的方法下文详细描述。
本发明的实时检测探针包括附着在一端如5′端的报道染料和附着在另一端如3′端的淬火染料。报道染料发射荧光,例如在用激发光辐射后,当淬火染料极其接近报道染料时,其作用于报道染料上以抑制荧光发射。报道染料的例子包括6-羧基荧光素(FAM)、四氯-6-羧基荧光素(TET)、2,7-二甲氧基-4,5-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、六氯-6-羧基荧光素(HEX)等。淬火染料的例子包括6-羧基四甲基若丹明(TAMRA)等。
通过将报道染料和淬火染料附着于具有特异序列的寡核苷酸可制备本发明的探针。例如,FAM分子可以磷酸酯的形式附着于探针5′端的磷酸基团上,通常采用若干个亚甲基链作为接头。进一步,TAMRA分子可通过下列结构单位以酰胺键附着于3′端。 对于本发明方法来说采用一种或多种本发明的引物对和探针是必须的。另外,根据已知的PCR(例如,Science,230,1350(1985))或RT-PCR(Genome Res.,6(10),986(1996))尤其是实时检测技术(例如TaqMan PCR,ABI PRISMTM 7700 SEQUENCE DETECTIONSYSTEM,Applied Biosystems,Verl,June 1996)可实施该方法。
本发明的方法尤其可用于检测靶P450分子种类的mRNA或cDNA,以确定P450分子种类的表达水平。在这种情况下,表达特异分子种类的组织被切除,以常规方式抽提总RNA。然后,以常规方式合成与该RNA互补的cDNA,接着通过PCR使用一种或多种本发明的引物对和探针进行扩增。或者,在以常规方式抽提总RNA后,使用一种或多种本发明的引物和探针,可将该RNA直接进行RT-PCR。
PCR和RT-PCR基本上根据已知技术进行。PCR或RT-PCR条件可根据已知技术选择,并与其中所使用的那些条件相似。具体而言,可优选使用下文给出的实施例中所示的条件。
根据常规技术基本上也可进行检测,例如通过用氩激光辐射PCR混合物并使用CCD照相机检测发射的荧光。
本发明发方法可容易和快速地测定和检测P450分子种类的各自基因。检测和定量P450分子种类的试剂盒本发明还提供实施上述方法的试剂盒。该试剂盒包括一组或多组上述的引物和探针。该试剂盒可进一步含有已知的用作质控的核酸以及测定该核酸的引物对和探针。
本发明的方法可单独检测和定量P450分子种类。此外,本发明的方法能快速和准确地定量P450分子种类。因此,本发明方法的应用使得有效获得新药与另一种药在人体中的相互作用和不相容性的基本数据成为可能。
使用两个极其接近的荧光染料,根据一个染料(报道染料)的荧光波长的波长区域与另一个染料(淬火染料)的激发光波长相互重叠时所产生的FRET,进行定量测定。在其中引发FRET的两个染料附着于末端上的探针(TaqMan探针)与衍生自特定P450分子种类并由PCR扩增的cDNA杂交。PCR延伸反应在此状态开始,TaqMan探针被TaqDNA聚合酶的5’-3’内切核酸酶活性水解,从而释放出报道染料并且增加两个染料间的物理距离。结果增加了已被FRET抑制的报道染料的荧光强度。由于荧光强度增加与PCR扩增产物量的增加成正比,因而,通过测定各个PCR循环后荧光强度的增加可实现目的cDNA的定量。
在此测试中,FAM作为报道染料附着于探针的5’端,而TAMRA作为淬火染料附着于3’端。根据文献(Genome Res.,6(10),986(1996))所描述的技术实施这些染料的附着以及TaqMan探针的制备。
使用全自动DNA/RNA合成仪(ABI)、dNTP底物和指定的试剂合成用作引物和探针的寡核苷酸。
作为样品RNA,下列RNA被分离、纯化和以总RNA的形式使用来自肺的CYP4B1和CYP2F1;来自小肠的CYP1B1;来自胎儿肝脏库的CYP3A7;来自前列腺的CYP4F8;来自胎盘的CYP19和来自肾上腺的CYP11B1、CYP11B2和CYP17。作为其他分子种类的样品RNA,使用从成人肝脏库中纯化的总RNA。所有这些总RNA购自Clontech Laboratories,Inc.。
将总RNA用不含核糖核酸酶的水稀释至20μg/ml,然后用具有浓度50μg/ml的酵母tRNA(GIBCO)5倍连续稀释。各溶液5μl用于测定中。
使用TaqMan一步RT-PCR Master Mix试剂盒(PE AppliedBiosystems)和ABI PRISMTM7700序列检测体系(PE AppliedBiosystems)在50μl/管的体系中进行RT-PCR,该试剂盒包含300nM正向引物、900nM反向引物以及200nM TaqMan探针。
PCR条件如下48℃30分钟1个循环,95℃10分钟1个循环,以及50个循环,各个循环由95℃15秒以及60℃1分钟所组成。各个循环后测定荧光强度。
表1表示在上述测试中所用的靶分子种类以及引物对和探针。表2代表测试结果(校准曲线)。
表1

表2

在表2中,采用从100000pg总RNA/50μl反应混合物中连续5倍稀释的RNA溶液制作的校准曲线显示CYP3A4在浓度低至1.28pg总RNA/50μl反应混合物下是可定量的;当定量极限是1.28pg-4000pg总RNA时,其他分子种类的校准曲线的相关系数是0.99或更高。然而,CYP4A11的校准曲线的相关系数是0.96。测试实施例2设计的引物-探针组的P450分子种类特异性的确认(1)测试方法为了证实本发明方法可特异地区别P450分子种类,如下进行了该测试。以如测试实施例1中相同的方式采用本发明方法对肾上腺、肝脏、胎儿肝脏、小肠、肾脏、肺、脑、前列腺、睾丸、子宫和胎盘的组织中P450分子种类的表达进行测试。将获得的结果与文献报道中的结果进行比较。
以GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)作为内控标准,测试重复三次。
组织的总RNA库购自Clontech Laboratories,Inc.。
对于用于制作校准曲线的组织,总RNA的浓度是20000pg总RNA/50μl反应混合物,而对于其他组织则为100000pg总RNA/501反应混合物。
表3和表4表示结果。表还显示总RNA来源的特性(收集数、年龄、性别、种族和死亡原因)。表中,“ND”表示低于定量极限。
表3

表3(续前页)

表4

表4(续前页)

将表中所示结果与下列文献1-5所报道的现有技术得到的那些结果进行比较后发现基本上相关。进一步,用现有技术不能检测的分子种类可用本发明方法检测。由本发明方法获得的结果展示了相互之间不重叠的组织-特异的表达模式。因此,这证实本发明方法能够单独定量P450分子种类。
文献1Drug Metabolism and Disposition 27,840-809(1999)文献2Exp.Toxic.Pathol.,51,412-417(1999)文献3Biochemical Pharmacology,52,379-383(1996)文献4Biochemical Pharmacology,57,1407-1413(1999)文献5Pharmacology & Therapeutics,84,429-445(1999)工业实用性本发明提供在相同PCR条件下以实时方式容易和快速地单独检测和定量人P450分子种类的方法,以及提供用于本方法的探针和引物。本发明方法在临床和医学领域是有用的。
序列表<110>株式会社大塚制药工场(Otsuka Pharmaceutical Factory Inc.)<120>检测和定量人P450分子种类的方法以及用于该方法的探针和试剂盒(A method for detecting human P450 molecular species and a prove and a kit therefor)<130>SCT022595-09<150>2000-164214<151>2000-06-01<160>105<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>26<212>DNA<213>人P450 CYP1A1基因<400>1cgctatgacc acaaccacca agaact 26<210>2<211>26<212>DNA<213>人P450 CYP1A2基因<400>2ctagagccag cggcaacctc atccca 26<210>3<211>28<212>DNA<213>人P450 CYP1B1基因<400>3cagctttgtg cctgtcacta ttcctcat 28<210>4<211>24<212>DNA<213>人P450 CYP2A6/7基因<400>4tggccccgtg ttcaccattc actt 24<210>5<211>30<212>DNA<213>人P450 CYP2A6基因<400>5tgcctgactg tgatggtctt gatgtctgtt 30<210>6<211>25<212>DNA<213>人P450 CYP2A7基因<400>6aacctcttca ttgcaggcac cgaga25<210>7<211>28<212>DNA<213>人P450 CYP2B6基因<400>7tcatctgctc catcgtcttt ggaaaacg 28<210>8<211>26<212>DNA<213>人P450 CYP2C8基因<400>8tttctccctc acaaccttgc ggaatt 26<210>9<211>26<212>DNA<213>人P450 CYP2C9基因<400>9ttgtgcttgt cgtctctgtc ccagct 26<210>10<211>25<212>DNA<213>人P450 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23<210>87<211>23<212>DNA<213>人P450 CYP11B2基因<400>87ttagtgtctc caccaggaag tgc 23<210>88<211>22<212>DNA<213>人P450 CYP17基因<400>88tcacaatgag aaggagtggc ac 22<210>89<211>23<212>DNA<213>人P450 CYP17基因<400>89agcttactga cggtgagatg agc 23<210>90<211>22<212>DNA<213>人P450 CYP19基因<400>90agagctctgg aaaacaactc ga 22<210>91<211>21<212>DNA<213>人P450 CYP19基因<400>91ctgtgaccat acgaacaagg c21<210>92<211>23<212>DNA<213>人P450 CYP27基因<400>92agaggagatt ccacgtctag gac 23<210>93<211>22<212>DNA<213>人P450 CYP27基因<400>93acatccacat tggaccgtac tt 22<210>94<211>18<212>DNA<213>人P450 CYP1B1基因<400>94accgttttcc gcgaattc18<210>95<211>21<212>DNA<213>人P450 CYP1B1基因<400>95gtacgttctc caaatccagc c21<210>96<211>23<212>DNA<213>人P450 CYP2B6基因<400>96ccccaaggac acagaagtat ttc 23<210>97<211>22<212>DNA<213>人P450 CYP2B6基因<400>97gattgaaggc gtctggtttt tc 22<210>98<211>22<212>DNA<213>人P450 CYP2C8基因<400>98ggactttatc gattgcttcc tg 22<210>99<211>22<212>DNA<213>人P450 CYP2C8基因<400>99ccatatctca gagtggtgct tg 22<210>100<211>24<212>DNA<213>人P450 CYP2C9基因<400>100gacatgaaca accctcagga cttt 24<210>101<211>20<212>DNA<213>人P450 CYP2C9基因<400>101tgcttgtcgt ctctgtccca 20<210>102<211>22<212>DNA<213>人P450 CYP2C19基因<400>102gaacaccaag aatcgatgga ca 22<210>103<211>22<212>DNA<213>人P450 CYP2C19基因<400>103tcagcaggag aaggagagca ta 22<210>104<211>22<212>DNA<213>人P450 CYP4A11基因<400>104aggagctaca acggattcag aa 22<210>105<211>21<212>DNA<213>人P450 CYP4A11基因<400>105acgaactttg cctccccata g2权利要求
1.检测和定量人细胞色素P450分子种类的探针,所述探针包含与下列基因区域(1)-(29)中的一种可杂交的寡核苷酸(1)CYP1A1基因第616-641位的区域(2)CYP1A2基因第884-909位的区域(3)CYP1B1基因第1176-1203位的区域或第785-812位的区域(4)CYP2A6/7基因第195-218位的区域(5)CYP2A6基因第40-69位的区域(6)CYP2A7基因第889-913位的区域(7)CYP2B6基因第533-560位的区域或第1175-1202位的区域(8)CYP2C8基因第375-400位的区域或第863-894位的区域(9)CYP2C9基因第913-888位的区域或第863-890位的区域(10)CYP2C18基因第1420-1444位的区域(11)CYP2C19基因第913-887位的区域或第863-894位的区域(12)CYP2D6基因第748-775位的区域(13)CYP2E1基因第1096-1117位的区域(14)CYP2F1基因第608-635位的区域(15)CYP2J2基因第485-508位的区域(16)CYP3A3/4基因第876-905位的区域(17)CYP3A4基因第946-918位的区域(18)CYP3A5基因第850-822位的区域(19)CYP3A7基因第850-819位的区域(20)CYP4A11基因第666-691位的区域或第241-266位的区域(21)CYP4B1基因第997-1024位的区域(22)CYP4F2基因第1182-1205位的区域(23)CYP4F3基因第1188-1212位的区域(24)CYP4F8基因第1341-1370位的区域(25)CYP11B1基因第1209-1234位的区域(26)CYP11B2基因第1209-1239位的区域(27)CYP17基因第1230-1255位的区域(28)CYP19基因第437-465位的区域(29)CYP27基因第197-224位的区域。
2.根据权利要求1所述的探针,其中所述寡核苷酸具有附着其上的报道染料和淬火染料。
3.根据权利要求1所述的探针,其中所述寡核苷酸具有20-40个碱基的长度。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的探针,其中所述寡核苷酸包括SEQ ID NO1-SEQ ID NO35中所示序列的一种。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的探针,其中所述寡核苷酸由SEQ ID NO1-SEQ ID NO35中所示序列的一种组成。
6.检测和定量一种或多种人细胞色素P450分子种类的试剂盒,其包含至少一组正向引物和反向引物的引物对和探针,所述引物和探针各包含与以下(1)-(35)中所示的基因区域可杂交的寡核苷酸(1)引物对CYP1A1基因的第589-610位区域和第685-664位区域;探针该基因的第616-641位区域(2)引物对CYP1A2基因的第860-880位区域和第951-931位区域;探针该基因的第884-909位区域(3)引物对CYP1B1基因的第1155-1174位区域和第1228-1207位区域;探针该基因的第1176-1203位区域(4)引物对CYP2A6/7基因的第173-193位区域和第254-236位区域;探针该基因的第195-218位区域(5)引物对CYP2A6基因的第20-48位区域和第171-146位区域;探针该基因的第40-69位区域(6)引物对CYP2A7基因的第861-884位区域和第1000-978位区域;探针该基因的第889-913位区域(7)引物对CYP2B6基因的第513-531位区域和第587-564位区域;探针该基因的第533-560位区域(8)引物对CYP2C8基因的第352-372位区域和第425-407位区域;探针该基因的第375-400位区域(9)引物对CYP2C9基因的第659-682位区域和第937-915位区域;探针该基因的第913-888位区域(10)引物对CYP2C18基因的第1394-1414位区域和第1473-1451位区域;探针该基因的第1420-1444位区域(11)引物对CYP2C19基因的第858-880位区域和第943-921位区域;探针该基因的第913-887位区域(12)引物对CYP2D6基因的第720-740位区域和第912-891位区域;探针该基因的第748-775位区域(13)引物对CYP2E1基因的第1070-1088位区域和第1146-1123位区域;探针该基因的第1096-1117位区域(14)引物对CYP2F1基因的第585-606位区域和第744-723位区域;探针该基因的第608-635位区域(15)引物对CYP2J2基因的第460-482位区域和第592-571位区域;探针该基因的第485-508位区域(16)引物对CYP3A3/4基因的第850-872位区域和第1014-993位区域;探针该基因的第876-905位区域(17)引物对CYP3A4基因的第825-854位区域和第973-948位区域;探针该基因的第946-918位区域(18)引物对CYP3A5基因的第684-705位区域和第881-859位区域;探针该基因的第850-822位区域(19)引物对CYP3A7基因的第684-705位区域和第881-859位区域;探针该基因的第850-819位区域(20)引物对CYP4A11基因的第640-663位区域和第805-784位区域;探针该基因的第666-691位区域(21)引物对CYP4B1基因的第974-995位区域和第1081-1061位区域;探针该基因的第997-1024位区域(22)引物对CYP4F2基因的第1092-1113位区域和第1276-1256位区域;探针该基因的第1182-1205位区域(23)引物对CYP4F3基因的第1073-1094位区域和第1267-1246位区域;探针该基因的第1188-1212位区域(24)引物对CYP4F8基因的第1278-1299位区域和第1390-1371位区域;探针该基因的第1341-1370位区域(25)引物对CYP11B1基因的第1158-1179位区域和第1415-1396位区域;探针该基因的第1209-1234位区域(26)引物对CYP11B2基因的第1167-1189位区域和第1429-1407位区域;探针该基因的第1209-1239位区域(27)引物对CYP17基因的第1200-1221位区域和第1294-1272位区域;探针该基因的第1230-1255位区域(28)引物对CYP19基因的第414-435位区域和第487-467位区域;探针该基因的第437-465位区域(29)引物对CYP27基因的第171-193位区域和第292-271位区域;探针该基因的第197-224位区域(30)引物对CYP1B1基因的第766-783位区域和第961-941位区域探针该基因的第785-812位区域(31)引物对CYP2B6基因的第1146-1168位区域和第1228-1207位区域;探针该基因的第1175-1202位区域(32)引物对CYP2C8基因的第783-804位区域和第926-905位区域;探针该基因的第863-894位区域(33)引物对CYP2C9基因的第766-789位区域和第910-891位区域;探针该基因的第863-890位区域(34)引物对CYP2C19基因的第748-769位区域和第943-922位区域;探针该基因的第863-894位区域(35)引物对CYP4A11基因的第209-230位区域和第288-268位区域;探针该基因的第241-266位区域。
7.根据权利要求6所述的试剂盒,其中所述探针进一步包含附着其上的报道染料和淬火染料。
8.根据权利要求7所述的试剂盒,其包含至少一组选自下列组(1)-(35)的引物对和探针(1)一组包含在SEQ ID NO36和37中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO1中所示序列的探针(2)一组包含在SEQ ID NO38和39中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO2中所示序列的探针(3)一组包含在SEQ ID NO40和41中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO3中所示序列的探针(4)一组包含在SEQ ID NO42和43中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO4中所示序列的探针(5)一组包含在SEQ ID NO44和45中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO5中所示序列的探针(6)一组包含在SEQ ID NO46和47中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO6中所示序列的探针(7)一组包含在SEQ ID NO48和49中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO7中所示序列的探针(8)一组包含在SEQ ID NO50和51中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO8中所示序列的探针(9)一组包含在SEQ ID NO52和53中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO9中所示序列的探针(10)一组包含在SEQ ID NO54和55中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO10中所示序列的探针(11)一组包含在SEQ ID NO56和57中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO11中所示序列的探针(12)一组包含在SEQ ID NO58和59中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO12中所示序列的探针(13)一组包含在SEQ ID NO60和61中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO13中所示序列的探针(14)一组包含在SEQ ID NO62和63中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO14中所示序列的探针(15)一组包含在SEQ ID NO64和65中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO15中所示序列的探针(16)一组包含在SEQ ID NO66和67中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO16中所示序列的探针(17)一组包含在SEQ ID NO68和69中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO17中所示序列的探针(18)一组包含在SEQ ID NO70和71中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO18中所示序列的探针(19)一组包含在SEQ ID NO72和73中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO19中所示序列的探针(20)一组包含在SEQ ID NO74和75中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO20中所示序列的探针(21)一组包含在SEQ ID NO76和77中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO21中所示序列的探针(22)一组包含在SEQ ID NO78和79中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO22中所示序列的探针(23)一组包含在SEQ ID NO80和81中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO23中所示序列的探针(24)一组包含在SEQ ID NO82和83中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO24中所示序列的探针(25)一组包含在SEQ ID NO84和85中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO25中所示序列的探针(26)一组包含在SEQ ID NO86和87中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO26中所示序列的探针(27)一组包含在SEQ ID NO88和89中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO27中所示序列的探针(28)一组包含在SEQ ID NO90和91中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO28中所示序列的探针(29)一组包含在SEQ ID NO92和93中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO29中所示序列的探针(30)一组包含在SEQ ID NO94和95中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO30中所示序列的探针(31)一组包含在SEQ ID NO96和97中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO31中所示序列的探针(32)一组包含在SEQ ID NO98和99中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO32中所示序列的探针(33)一组包含在SEQ ID NO100和101中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO33中所示序列的探针(34)一组包含在SEQ ID NO102和103中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO34中所示序列的探针(35)一组包含在SEQ ID NO104和105中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO35中所示序列的探针。
9.根据权利要求7所述的试剂盒,其包含至少一组选自下列(1)-(35)的引物对和探针(1)一组包含在SEQ ID NO36和37中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO1中所示序列的探针(2)一组包含在SEQ ID NO38和39中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO2中所示序列的探针(3)一组包含在SEQ ID NO40和41中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO3中所示序列的探针(4)一组包含在SEQ ID NO42和43中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO4中所示序列的探针(5)一组包含在SEQ ID NO44和45中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO5中所示序列的探针(6)一组包含在SEQ ID NO46和47中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO6中所示序列的探针(7)一组包含在SEQ ID NO48和49中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO7中所示序列的探针(8)一组包含在SEQ ID NO50和51中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO8中所示序列的探针(9)一组包含在SEQ ID NO52和53中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO9中所示序列的探针(10)一组包含在SEQ ID NO54和55中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO10中所示序列的探针(11)一组包含在SEQ ID NO56和57中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO11中所示序列的探针(12)一组包含在SEQ ID NO58和59中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO12中所示序列的探针(13)一组包含在SEQ ID NO60和61中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO13中所示序列的探针(14)一组包含在SEQ ID NO62和63中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO14中所示序列的探针(15)一组包含在SEQ ID NO64和65中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO15中所示序列的探针(16)一组包含在SEQ ID NO66和67中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO16中所示序列的探针(17)一组包含在SEQ ID NO68和69中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO17中所示序列的探针(18)一组包含在SEQ ID NO70和71中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO18中所示序列的探针(19)一组包含在SEQ ID NO72和73中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO19中所示序列的探针(20)一组包含在SEQ ID NO74和75中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO20中所示序列的探针(21)一组包含在SEQ ID NO76和77中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO21中所示序列的探针(22)一组包含在SEQ ID NO78和79中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO22中所示序列的探针(23)一组包含在SEQ ID NO80和81中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO23中所示序列的探针(24)一组包含在SEQ ID NO82和83中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO24中所示序列的探针(25)一组包含在SEQ ID NO84和85中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO25中所示序列的探针(26)一组包含在SEQ ID NO86和87中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO26中所示序列的探针(27)一组包含在SEQ ID NO88和89中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO27中所示序列的探针(28)一组包含在SEQ ID NO90和91中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO28中所示序列的探针(29)一组包含在SEQ ID NO92和93中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO29中所示序列的探针(30)一组包含在SEQ ID NO94和95中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO30中所示序列的探针(31)一组包含在SEQ ID NO96和97中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO31中所示序列的探针(32)一组包含在SEQ ID NO98和99中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO32中所示序列的探针(33)一组包含在SEQ ID NO100和101中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO33中所示序列的探针(34)一组包含在SEQ ID NO102和103中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO34中所示序列的探针(35)一组包含在SEQ ID NO104和105中所示序列的引物对和包含在SEQ ID NO35中所示序列的探针。
10.根据权利要求9所述的试剂盒,其中组(1)-(35)对于检测和定量下列P450分子种类是有用的组(1)CYP1A1组(2)CYP1A2组(3)和(30)CYP1B1组(4)CYP2A6/7组(5)CYP2A6组(6)CYP2A7组(7)和(31)CYP2B6组(8)和(32)CYP2C8组(9)和(33)CYP2C9组(10)CYP2C18组(11)和(34)CYP2C19组(12)CYP2D6组(13)CYP2E1组(14)CYP2F1组(15)CYP2J2组(16)CYP3A3/4组(17)CYP3A4组(18)CYP3A5组(19)CYP3A7组(20)和(35)CYP4A11组(21)CYP4B1组(22)CYP4F2组(23)CYP4F3组(24)CYP4F8组(25)CYP11B1组(26)CYP11B2组(27)CYP17组(28)CYP19组(29)CYP27。
11.检测和定量一种或多种人色素P450分子种类的方法,所述方法包含下列步骤(a)制备含有一种或多种人色素P450基因的样品;(b)使用根据权利要求6-10中任一项所述的试剂盒将该样品进行聚合酶链式反应,从而扩增样品中一种或多种编码人细胞色素P450分子种类的基因;以及(c)检测和测定在聚合酶链式反应过程中水解的一种或多种探针。
12.根据权利要求11所述的方法,其中通过检测和测定用激发光辐射所产生的荧光来检测和定量水解的一种或多种探针。
全文摘要
本发明提供用于检测和定量人细胞色素P450分子种类的试剂盒,其包含一种或多种寡核苷酸探针以及一种或多种特异引物对,各个所述寡核苷酸探针可与编码人细胞色素P450种类的特异区域例如CYP1A1基因的第616-641位的区域杂交;并提供了使用该试剂盒检测和定量一种或多种人细胞色素P450分子种类的方法。
文档编号C12N15/53GK1441845SQ01810426
公开日2003年9月10日 申请日期2001年5月30日 优先权日2000年6月1日
发明者西村益浩, 矢口宽, 内藤真策, 平冈功 申请人:株式会社大塚制药工场
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