由酵母生产抗坏血酸的制作方法

专利名称：由酵母生产抗坏血酸的制作方法
背景技术：
1.发明领域总体上，本发明涉及抗坏血酸生产领域。更具体地，它涉及从酵母，包括重组酵母中生产L-抗坏血酸的方法。
2.相关技术领域描述L-抗坏血酸(维生素C)是一种极强的水溶性抗氧化剂，对于人体所有器官的生长和维持均很重要。(Padh H.，1990，Biochem.Cell Biol.68，1166-1173)抗坏血酸的一个重要作用是参与胶原合成，胶原是结缔组织、肌肉、腱、骨骼、牙齿以及皮肤的重要细胞组分。血管、擦伤、断骨的修复同样需要胶原。抗坏血酸帮助调节血压，降低胆固醇水平，帮助移去沉淀在动脉管壁上的胆固醇。抗坏血酸还能协助叶酸的代谢，调节铁的吸收，L-酪氨酸和L-苯丙氨酸转变为去甲肾上腺素同样需要它。色氨酸转变为5-羟色胺同样需要足够量的抗坏血酸；5-羟色胺是负责睡眠，控制疼痛和身体健康的神经激素。
缺乏L-抗坏血酸会影响胶原的合成，从而引起关节疼、贫血、神经质和生长滞缓。其它后果包括免疫反应减弱以及更易受感染。最严重的抗坏血酸缺乏症是坏血病，症状为关节肿大、牙龈出血、皮下毛细管出血。如得不到治疗，坏血病能致死。
尽管抗坏血酸很容易被肠道吸收，但在摄取后的2-4个小时内就会被排到尿中，因此很难在体内储存。所有高等植物以及大多数高等动物的肝或肾均能合成抗坏血酸，但人、蝙蝠、一些鸟类以及许多鱼类却无法合成。因此人必须从均衡的日常饮食或额外补充剂中获取足够的抗坏血酸以维持良好的健康。
抗坏血酸的食物来源包括柑橘、马铃薯、辣椒、绿叶蔬菜、西红柿以及浆果。另外市场上还有片剂，丸剂，粉剂，薄片，糖浆等形式的抗坏血酸补充剂出售。
美国食品药物管理机构(FDA)允许将L-抗坏血酸用作营养补充剂和化学防腐剂，并将其列在FDA一般认为安全的物质名单中。L-抗坏血酸可作为香料的抗氧化剂用于软饮料中，可用于熏制或腌制的肉或含肉制品中，可用于面粉中以提高烘烤品质，在啤酒中可用作稳定剂，在脂肪或油料中作为抗氧化剂，以及加入众多的食品中以提供丰富的抗坏血酸。另外还可用于去污剂，护发产品，塑料制品，摄影和水处理中。
抗坏血酸的生物合成途径中的酶尚未完全确定。目前对植物和动物中生理合成途径的理解如

图1所示。
动物中，最初前体是D-葡萄糖，合成途径的最后一步由微粒体形式的L-古洛糖酸-1，4-内酯氧化酶催化完成。已有不同来源的此酶被分离和鉴定。大鼠中编码此酶的基因已被克隆并已测序。(Koshizaka T.等，1998，J.Biol.Chem.263，1619-1621)。
据报道在植物中有两条不连续的合成途径。一条途径中，D-葡萄糖经L-山梨糖酸(Loewus M.W.等，1990，Plant.Physiol.94，1492-1495)合成L-抗坏血酸。目前证据表明主要的生理途径是由D-葡萄糖经L-半乳糖和L-半乳糖酸-1，4-内酯到L-抗坏血酸。(Wheeler G.L.等1998，Nature，393，365-369)。最后两步分别由L-半乳糖脱氢酶和L-半乳糖酸-1，4-内酯脱氢酶催化。同样在这个途径中，最后一个酶也已分离得到并已被鉴定。甘蓝(Brassica oleracea)中编码此酶的基因已被克隆并已测序(stergaard J.等.1997，J.Biol.Chem.，272，30009-30016)。
用于饮食补给的抗坏血酸可以从天然资源中提取，也可以将Reichstein方法(美国专利2,265,121)稍作变动，以氧化L-山梨糖来化学合成。
仍需要以便捷方式生产抗坏血酸的方法。生产抗坏血酸有两个主要要求第一，合成必须对旋光异构体有选择性，因为只有L-对映体的抗坏血酸才具有生物活性；第二，合成最后一步要在非氧化环境中完成，因为抗坏血酸很容易被氧化。
一种可能的方法是用微生物生产L-抗坏血酸。微生物很容易以产业规模繁殖。尽管过去有报道用微生物或真菌生产L-抗坏血酸，但最近的证据表明，它们生产出的并不是L-抗坏血酸，而是其类似物。(Huh W.K.等，1998，Mol.Microbial.30，895-903)(Hancock R.D等，2000，FEMS Microbial.Let.186，245-250)(Dumbrava V.A等1987，BBA 926，331-338)。在酵母(假丝酵母属(Candida)和啤酒糖酵母属(Saccharomyces))中生产赤抗坏血酸(erythroascorbic acid)已有报道(Huh W.K.等，1994，Eur.J.Biochem，225，1073-1079)(Huh W.K.等，1998，Mol.Microbial.30，4，895-903)。在这些酵母中，已提出了生理途径从D-葡萄糖经D-阿拉伯糖和D-阿拉伯糖酸-1，4-内酯最后合成赤抗坏血酸(Kim S.T.等，1996，，1297，1-8)。白假丝酵母(Candida albicans)和啤酒糖酵母(S.cerevisiae)中的D-阿拉伯糖脱氢酶和D-阿拉伯糖酸-1，4-内酯氧化酶已被鉴定。有意思的是，在体外，L-半乳糖和L-半乳糖酸-1，4-内酯是这些活性的底物。
用L-半乳糖酸-1，4-内酯培养野生型假丝酵母细胞已实现体内生产L-抗坏血酸(国际专利申请号WO85/01745)。最近发现用L-半乳糖、L-半乳糖-1，4-内酯或L-古洛糖酸-1，4-内酯培养野生型啤酒糖酵母，能在胞内积累L-抗坏血酸(Hancock等，2000，FEMSMicrobiol.Lett.186，245-250)(Spickett C.M.等，2000，FreeRad.Bio.Med.28，183-192)。.
用L-半乳糖酸-1，4-内酯培养的野生型假丝酵母细胞能在培养基中积累L-抗坏血酸，表明这种酵母具有将胞内积累的L-抗坏血酸释放到胞外的生物机制；事实上，L-抗坏血酸是一个复杂分子并且符合科学逻辑的话，它在培养基中的积累不可能是简单的扩散过程，而应该是依赖于协助运输或主动运输。在高等真核(哺乳动物)细胞(Daruwala R.等，1999，FEBS Letters.460，480-484)中鉴定并表征的L-抗坏血酸转运蛋白支持这一结论。但在酵母属中并未发现此类转运蛋白。而且更奇怪的是生长在含L-古洛糖酸-1，4-内酯培养基中的假丝酵母细胞，能够在培养基中积累L-抗坏血酸，但从未发现存在抗坏血酸前体时培养的啤酒糖酵母细胞能在培养基中积累L-抗坏血酸。
大规模生产抗坏血酸的可取方法包括使用遗传工程改造的微生物(即重组微生物)。如今，用原核或真核微生物可以很容易且很成功地生产异源蛋白和异源代谢物。常用的原核微生物有大肠杆菌(Escherihia coli)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。常用的真核微生物有啤酒糖酵母和乳克鲁维氏酵母(Kluyveromyceslactis)。尽管这些宿主有很成功的应用，但使用转化微生物细胞生产L-抗坏血酸仅有一例。由于只有真核细胞才是L-抗坏血酸的天然制造者，因此仅有转化的原核微生物宿主在胞内积累L-抗坏血酸被描述就显得更奇怪了。据Lee等(Appl.Environment.Microbiol.，1999，65，4685-4687)报道，将啤酒糖酵母中编码D-阿拉伯糖酸-1，4-内酯氧化酶的基因克隆到大肠杆菌中，允许该菌在以L-半乳糖酸-1，4-内酯培养时产生L-抗坏血酸。但L-抗坏血酸积累只体现在胞内水平。
至今文献中没有实验数据来描述使用转化的真核微生物生产L-抗坏血酸。stergaard等将花椰菜的编码L-半乳糖酸-1，4-内酯脱氢酶的基因克隆到啤酒糖酵母中(J.Biol.Chem.，1997，272，30009-30016)。尽管在体外，作者检测到酵母提取物中有L-半乳糖酸-1，4-内酯脱氢酶的活性(细胞色素C方法，见stergaard等)，但在体内并未发现L-抗坏血酸产物。
Berry等，国际专利申请WO 99/64618讨论了植物中L-抗坏血酸生物合成途径的潜在用途；特别强调了将GDP-D-甘露糖转变成GDP-L-半乳糖的催化活性。但并没有对催化这一步的酶进行详细的特征描述。过表达得到的大肠杆菌同源物结果是没有活性的。
Smirnoff等，WO99/33995，讨论了使用L-半乳糖脱氢酶生产L-抗坏血酸。此酶是从豌豆芽中纯化得到，其N-末端序列已经确定。其全序列不清楚，而且至今没有报道。该L-半乳糖脱氢酶的部分序列与拟南芥(Arabidopsis thaliana)未确定的可能编码序列(登记号3549669)的5-22位氨基酸有72％同一性。
Roland等，美国专利4,595,659和4,916,068，讨论了用非重组Candida菌株将L-半乳糖酸底物转变成L-抗坏血酸。Roland等认为在其中负责的酶是L-半乳糖酸-1，4-内酯氧化酶。
Kumar，WO00/34502，讨论了酵母布蓝克氏假丝酵母(Candidablankii)和迪门纳隐球酵母(Cryptococcus dimennae)能够用2-酮-L-古洛糖酸作为唯一碳源生产L-抗坏血酸。Kumar专门排除从酵母中采用涉及L-半乳糖酸内酯氧化酶途径，或转化L-半乳糖酸前体的生产方法。
仍需要用便捷的发酵过程生产抗坏血酸的方法。
发明概述在一种实施方案中，本发明涉及生产抗坏血酸或其盐的方法，该方法包括(i)将克鲁维氏属酵母或接合糖酵母属酵母培养在至少含一种抗坏血酸前体的培养基中，由此产生抗坏血酸或其盐；以及(ii)分离抗坏血酸或其盐。
第二种实施方案中，本发明涉及生产抗坏血酸或其盐的方法，该方法包括(i)将重组酵母培养在含抗坏血酸前体的培养基中，由此产生抗坏血酸或其盐；以及(ii)分离抗坏血酸或其盐。优选，重组酵母在培养基中以远高于背景的水平积累抗坏血酸。同样优选，重组酵母从其前体生产抗坏血酸的产率高出35％。
在第三种实施方案中，本发明涉及稳定抗坏血酸或其盐的方法，这些抗坏血酸是加到培养基中的，或者是由酵母产生的，该方法包括在此种培养基中培养酵母。
另一个实施方案针对重组酵母，该重组酵母用至少一种蛋白的编码区功能性转化，而该蛋白的酶活性选自L-半乳糖脱氢酶(LGDH)、L-半乳糖酸-1，4-内酯脱氢酶(AGD)、D-阿拉伯糖脱氢酶(ARA)、D-阿拉伯糖酸-1，4内酯氧化酶(ALO)、L-古洛糖酸-1，4-内酯氧化酶(GLO)、和醛糖糖酸内酯酶(aldonolactonase)(AL)。优选地，用这些编码区经功能性转化得到的酵母具有至少(a)和(b)中的一种功能，(a)当在至少含一种抗坏血酸前体的培养基中培养时，能至少将约25％的抗坏血酸前体转化为抗坏血酸；(b)当酵母培养于含至少一种抗坏血酸前体的培养基中时，每升培养基至少能生产20毫克抗坏血酸。重组酵母优选为啤酒糖酵母，乳克鲁维氏酵母(K.lactis)，或拜氏接合糖酵母(Z.bailii)。
另一个实施方案针对用重组酵母生产，并分离抗坏血酸或其盐的方法，该酵母所生长的培养基至少含一种用以生产抗坏血酸及其盐的前体。优选地，使用的重组酵母至少能(a)能将至少25％的抗坏血酸前体转化为抗坏血酸或其盐；(b)每升培养基至少生产20毫克抗坏血酸。
本发明提供以便捷的发酵过程来生产抗坏血酸的方法。
附图详述图1分别显示目前对动、植物在生理条件下由D-葡萄糖合成L-抗坏血酸途径的理解。其中包括如下酶A，L-半乳糖酸-1，4-内酯脱氢酶(1.3.2.3)；B，L-半乳糖脱氢酶；C，糖磷酸酶(3.1.3.23，假设的)；D，水解酶(假设的)；；E，GDP-甘露糖-3，5-差向异构酶(5.1.3.18)；
F，甘露糖-1-磷酸鸟苷酰转移酶(2.7.7.22)；G，磷酸甘露糖变位酶(5.4.2.8)；H，甘露糖-6-磷酸异构酶(5.3.1.8)；I，葡萄糖-6-磷酸异构酶(5.3.1.9)；J，己糖激酶(2.7.1.1)；1，L-古洛糖酸-1，4-内酯氧化酶(1.1.3.8)；2，醛糖糖酸内酯酶(3.1.1.17)；2a，葡糖醛酸内酯还原酶(1.1.1.20)；3，D-葡糖醛酸还原酶(1.1.1.19)；3a，糖醛酸内酯酶(3.1.1.19)或自发进行；4，D-葡糖醛酸激酶(2.7.1.43)；5，葡糖醛酸-1-磷酸尿苷酰转移酶(2.7.7.44)；6，UDP-D-葡萄糖脱氢酶(1.1.1.22)；7，UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(2.7.7.9)；8，磷酸葡萄糖变位酶(5.4.2.2)；9，己糖激酶(2.7.1.1)。
但必须强调在本发明的范围中，生产L-抗坏血酸所用的酶并不限于生理途径中的酶。
图2显示在培养条件下抗坏血酸的稳定性。抗坏血酸加到矿物质培养基中(2％葡萄糖，0.67％YNB)，并在标准培养条件下培养7天。A图培养瓶中0时刻啤酒糖酵母GRF18U的起始OD660值为0.05，而B图培养瓶保持无菌。在标定时间取样并测定抗坏血酸的浓度。尽管当培养基中有活酵母时，抗坏血酸能稳定存在；但无菌培养基中抗坏血酸在7天内完全降解。这表明在含抗坏血酸的培养基中培养活酵母可作为稳定抗坏血酸的方法。
图3显示酵母将前体L-半乳糖酸-1，4-内酯或L-古洛糖酸-1，4-内酯转变成抗坏血酸的内在能力。未转化的酵母细胞(啤酒糖酵母GRF18U，W3031B和拜氏接合糖酵母ATCC 60483)在分别存在100mM L-半乳糖酸-1，4-内酯或L-古洛糖酸-1，4-内酯的矿物质培养基(2％葡萄糖，0.67％YNB)上生长72小时(起始OD660为0.05)；“-”表示未加前体。尽管在胞内有抗坏血酸积累，但在培养液中没有测到。
图4显示酵母将L-半乳糖转化成抗坏血酸的内在能力。未转化的啤酒糖酵母(GRF18U和W3031B)，拜氏接合糖酵母ATCC 60483和乳克鲁维氏酵母PM6-A在矿物质培养基(2％葡萄糖，0.67％YNB)上培养过夜，起始OD660为0.05。然后，加入250mg/l的L-半乳糖，在标准条件下继续培养24小时后测定抗坏血酸浓度。所有这些菌株在胞内积累抗坏血酸，但在培养液中除乳克鲁维氏酵母有少量积累外，其他菌株没有检测到。(乳克鲁维氏酵母的高背景估计是赤抗坏血酸的缘故，在自然条件下观察到此种酵母中的赤抗坏血酸浓度要高于啤酒糖酵母中的水平。
图5显示重组酵母将L-半乳糖酸-1，4-内酯转化为抗坏血酸。野生型啤酒糖酵母GRF18U(对照)，或分别用AGD和ALO编码区转化的两种啤酒糖酵母在含有50mM的L-半乳糖酸-1，4-内酯的矿物质培养基(2％葡萄糖，0.67％YNB)上培养72小时，起始OD660为0.05。尽管对照细胞在培养基中不积累抗坏血酸，但出人意料的是经AGD或ALO编码区转化的两种细胞在培养基中积累相当量的抗坏血酸(即远高于背景水平)。如不加L-半乳糖酸-1，4-内酯(“-”表示)，在培养基中测不到抗坏血酸。
图6显示重组酵母将L-半乳糖转化为抗坏血酸。在此用到以下几种啤酒糖酵母野生型啤酒糖酵母GRF18U(对照)，以及分别经以下一种或两种编码区转化的菌株LGDH、AGD、ALO、AGD和LGDH、ALO和LGDH、或ARA和ALO。菌株在矿物质培养基(2％葡萄糖，0.67％YNB)上培养过夜，起始OD660为0.05。然后，加入250mg/l的L-半乳糖，在标准条件下继续培养24小时后测定抗坏血酸浓度。对照细胞和仅用LGDH编码区转化的菌株在培养基中不积累抗坏血酸。用LGDH和AGD或LGDH和ALO编码区以及用ARA和ALO的编码区转化的菌株在培养基中积累相当量(远高于背景)的抗坏血酸。
图7显示在高密度培养条件下重组酵母转变L-半乳糖为抗坏血酸。将三种啤酒糖酵母GRF18U野生型(对照)，用ALO编码区转化的菌株，或用LGDH和ALO编码区转化的菌株分别在矿物质培养基(2％葡萄糖，0.67％YNB)上培养，起始OD660为0.05。在起始时间点，将细胞浓缩10倍，加入250mg/l的L-半乳糖，在标准条件下培养6天。在各个标定时间取样，并测定培养液中的抗坏血酸浓度。对照细胞的培养基中不积累抗坏血酸，而单用ALO编码区转化的菌株以及用ALO和LGDH编码区转化的菌株在培养基中都积累相当量(远高于背景)的抗坏血酸。
图8显示重组酵母转化L-半乳糖为抗坏血酸。在此用到以下几种拜氏接合糖酵母野生型拜氏接合糖酵母ATCC 36947(对照)；用空载体(pZ3)转化的拜氏接合糖酵母；用LGDH编码区转化的拜氏接合糖酵母；用ALO编码区转化的拜氏接合糖酵母；或用ALO和LGDH两种编码区转化的拜氏接合糖酵母。各菌株分别在矿物质培养基(2％葡萄糖，0.67％YNB)上培养过夜，起始OD660为0.05，并加入合适的选择性抗生素(G418用于pZ3，潮霉素用于pAG26TPI，或两种都加)。然后，加入250mg/l的L-半乳糖，在标准条件下继续培养24小时后测定抗坏血酸浓度。在用L-半乳糖培养时，对照细胞在培养基中积累少量的抗坏血酸。用空载体转化的或用含LGDH编码区的载体转化的细胞在培养基中不积累抗坏血酸。用ALO编码区转化的以及用LGDH和ALO两种编码区转化的细胞在培养基中积累相当量(远高于背景)的抗坏血酸。用于筛选质粒的抗生素以及其抗性的表达会干扰培养基中抗坏血酸的积累和测定。这与本数据相符，因为培养基中没有潮霉素且不表达潮霉素抗性的ALO表达细胞比带有潮霉素抗性的ALO表达细胞在有潮霉素的培养基中积累更多的抗坏血酸。
图9显示重组啤酒糖酵母GRF18U将L-古洛糖酸和L-古洛糖酸-1，4-内酯转化为抗坏血酸。GRF18U分别用以下质粒转化空质粒(pL，对照)；pL-RGLO；质粒pL和pH-AL；或质粒pL-RGLO(RGLO是从褐家鼠(R.norvegicus)中分离得到的GLO)和pH-AL。重组酵母在基本培养基(2％葡萄糖，0.67％YNB)上培养过夜，起始OD660为0.05。然后，加入66mM的L-古洛糖酸或L-古洛糖酸-1，4-内酯，48小时后收获细胞，并测定胞内抗坏血酸浓度。在上清液中未测到抗坏血酸(数据没有显示)。当用L-古洛糖酸作为底物时，AL编码区转化的细胞积累的抗坏血酸水平远高于背景。用L-古洛糖酸-1，4-内酯作底物，RGLO转化的细胞其抗坏血酸积累量仅为对照(例如GRF18U/pL)的三倍。
图10显示在重组拜氏接合糖酵母培养物中L-古洛糖酸-1，4-内酯(例如，gul)到抗坏血酸的胞内转化。拜氏接合糖酵母ATCC36947和拜氏接合糖酵母ATCC 60483用空的拜氏接合糖酵母表达载体pZ3或用pZ3-RGLO(RGLO为从褐家鼠中分离得到的GLO)转化。酵母在含G418的矿物质培养基(2％葡萄糖，0.67％YNB)中培养过夜，起始OD660为0.05。然后，加入100mM的L-古洛糖酸-1，4-内酯，在标准条件下继续培养48小时后测定抗坏血酸浓度。两种表达RGLO的拜氏接合糖酵母菌株在L-古洛糖酸-1，4-内酯存在下产生相当高的胞内抗坏血酸水平。
说明性实施方案的详述在一个实施方案中，本发明涉及生产抗坏血酸或其盐的方法，该方法包括(i)将克鲁维氏酵母属或接合糖酵母属酵母培养在至少含一种抗坏血酸前体的培养基上，用以生成抗坏血酸或其盐，以及(ii)分离抗坏血酸或其盐。此方法基于这样的科学事实，即野生型克鲁维氏酵母属或接合糖酵母属在含有抗坏血酸前体的培养基中培养时能制造抗坏血酸。拜氏接合糖酵母或乳克鲁维氏酵母是优选的酵母。进一步优选的酵母是拜氏接合糖酵母ATCC 60483，拜氏接合糖酵母ATCC 36947或乳克鲁维氏酵母PM6-7A。
所用酵母培养基可以是本领域公知的任何适合于本目的的培养基。本领域的培养技术和培养基已属众所周知。典型地，但不限于，在合适的容器中采用液体发酵方式进行培养。典型的酵母发酵容器的实例包括摇瓶或生物反应器。
培养基包括酵母生长所必需的成分以及一或多种生产抗坏血酸的前体。酵母生长所需成分和生产抗坏血酸所用前体可以相同，也可不同。
培养基中包括碳源，比如葡萄糖或其他碳水化合物(如蔗糖、果糖、阿拉伯糖、乳糖、半乳糖、麦芽糖、棉子糖、乙醇、甲醇、甘油、或植物的水解物，及其他)。典型地，培养基还包括无机或有机的氮源，另外还可以包括氨基酸、嘌呤、嘧啶、玉米浆、酵母提取物、蛋白水解物、水溶性维生素如B复合维生素、或无机盐如钙、镁、钠、钾、铁、镍、钴、铜、锰、镆、或锌等的氯化物，氢氯化物，磷酸盐、硫酸盐。本领域普通技术人员用于酵母培养或发酵的其他已知成份，也可包括在内。培养基可用缓冲条件，也可不用。
培养基还包括抗坏血酸的前体。前体可以是任何能够在酵母中直接或通过中间步骤被转化成抗坏血酸的化合物。抗坏血酸前体可以选自单糖、寡糖、多聚糖、C1-C6醇、C2-C6多元醇、包括氨基酸和脂肪酸在内的有机酸、和C5-C6内酯。这些糖和有机酸可包括被磷酸化和/或被UDP或GDP修饰的形式。优选地，抗坏血酸前体可选自海藻糖、木糖、木酮糖、棉子糖、乙醇、麦芽糖、甘油、果糖、阿拉伯糖、D-葡萄糖-6-磷酸、D-葡萄糖-1-磷酸、UDP-D-葡萄糖、UDP-葡萄糖醛酸、D-葡萄糖醛酸-1-磷酸、D-葡萄糖醛酸、D-葡萄糖醛酸内酯、L-古洛糖酸、D-果糖-6-磷酸、D-甘露糖-6-磷酸D-甘露糖-1-磷酸、GDP-D-甘露糖、GDP-L-半乳糖、L-半乳糖-1-磷酸、内酯、蔗糖、淀粉、纤维素、柠檬酸盐、甲醇、甲醛、甲酸、甲胺、丙氨酸、油酸、L-半乳糖酸-1，4-内酯、D-葡萄糖、L-古洛糖酸-1，4-内酯、L-半乳糖、L-古洛糖酸、及其他。更优选，抗坏血酸前体可选自L-半乳糖酸-1，4-内酯、D-葡萄糖、L-古洛糖酸-1，4-内酯、L-半乳糖、L-古洛糖酸。两种或更多的前体可同时使用。此外，在某些实施方案中抗坏血酸前体可用作培养酵母的碳源。在发酵过程中酵母经过一步或多步将抗坏血酸前体转变为L-抗坏血酸。野生型克鲁维氏酵母属或接合糖酵母属酵母能在胞内积累其合成的L-抗坏血酸。优选的培养基包括葡萄糖、YNB(酵母氮源)以及L-古洛糖酸、L-半乳糖酸-1，4-内酯、L-古洛糖酸-1，4-内酯或L-半乳糖中的至少一种。
当培养了足够长时间，胞内或培养基中或二者中均有合适的L-抗坏血酸浓度后，进行L-抗坏血酸分离。此处抗坏血酸的“分离”是指将抗坏血酸同酵母或培养基的至少一种非抗坏血酸成分分离，以到达更高纯度的状态。优选，分离的抗坏血酸纯度至少达到约95％，更优选至少达到纯度99％。
为从酵母中分离L-抗坏血酸，在将酵母从培养基中分离出后，第一步一般是用化学或酶法处理，以及如用玻璃珠、超声波、冻融循环等其他已知技术处理裂解酵母。L-抗坏血酸可以从膜、蛋白、核酸、或其它酵母裂解组分中用适当的方法进行提纯，这些方法有离心、过滤、微量过滤、超滤、纳米过滤(nanofiltration)、液-液萃取、结晶、用核酸酶或蛋白酶进行酶法处理、层析以及其它方法。
从培养基中提取积累的L-抗坏血酸过程包括从培养基中纯化抗坏血酸。纯化可通过已知的技术，如应用离子交换树脂、活性碳、微过滤、超滤、纳米过滤、液-液萃取、结晶或层析以及其它方法。
从酵母和培养基中均可以提取L-抗坏血酸。
培养过程中，如果酵母在培养基中积累L-抗坏血酸，优选，L抗坏血酸的浓度可得到稳定或被提高。更优选，活酵母的存在稳定培养基中的L-抗坏血酸。
在第二个实施方案中，本发明涉及生产抗坏血酸的方法，该方法包括(i)在含有至少一种抗坏血酸前体的培养基中培养重组酵母，由此形成抗坏血酸，以及(ii)分离抗坏血酸。
重组酵母是含原本不属于酵母的核酸序列或拥有酵母内源核酸序列的额外拷贝的酵母，其中用人为的方法将核酸序列导入到酵母或其祖先细胞中。重组DNA技术已为人们公知，如在Sambrook等著的Molecular CloningA Laborotory Manual，Cold Spring HarbourLaboratory Press中提供了本领域许多相关技术的详细信息，在此将对它作一些讨论。在这一实施方案中，同源和/或异源基因的编码区来自含有该基因的生物。这种生物可以是细菌、原核生物、真核生物、微生物、真菌、植物或动物。
含有该编码区的遗传物质可以用任何已知技术从特定生物的细胞中提取。然后，用适当的方法分离得到该编码区。在一种已知的技术中，采用如下方法分离编码区首先制备基因组文库，或cDNA文库；然后在文库中确定出该编码序列，如用标记的核苷酸探针筛选文库，该探针经选择与或预计与编码区同源，至少部分同源，然后确定该编码区的表达是否导致含该编码区的文库微生物有可检测的表型；或者可用PCR扩增目的片段。还可用其它一些方法分离编码区。
重组酵母可以是任何已知种或属的酵母。在“The Yeasts”Vol.1 of Biology of Yeasts，Ch.2，A.H.Rose和J.S.Harrison，Eds.Academic Press，London，1987中对酵母有详述。比如，酵母属可以是糖酵母属(Saccharomyces)，接合糖酵母属(Zygosaccharomyses)，假丝酵母属(Candida)，汉逊氏酵母属(Hansenula)，克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)，德巴利氏酵母属(Debaromyces)，拿逊氏酵母属(Nadsonia)，油脂酵母属(Lipomyces)，球拟酵母属(Torulopsis)，克勒克氏酵母属(Kloeckera)，毕赤氏酵母属(Pichia)，裂殖糖酵母属(Schizosaccharomyces)，三角酵母属(Trigonopsis)，酒香酵母属(Brettanomyces)，隐球酵母属(Cryptococcus)，丝孢酵母属(Trichosporon)，短柄霉属(Aureobasidium)，Phaffia，红酵母属(Rhodotorula)，Yarrowia，许旺氏酵母属(Schwanniomyces)等。优选糖酵母属，接合糖酵母属，克鲁维氏酵母属。更优选啤酒糖酵母，拜氏接合糖酵母，乳克鲁维氏酵母。进一步优选啤酒糖酵母菌株GRF18U或W3031B，拜氏接合糖酵母ATCC 60483，ATCC 36947或乳克鲁维氏酵母PM6-7A。
优选本发明的重组酵母不能从2-酮-L-古洛糖酸生产L-抗坏血酸。
优选所用重组酵母含至少一种酶的编码区，这样功能性转化的重组酵母能以一或多个步骤转化抗坏血酸前体为抗坏血酸。
用于培养重组酵母的培养基可以是本领域任何已知的适用于本目的的培养基。培养技术和培养基在本领域已为人们公知。典型地，但不限于，在合适的容器中采用液体发酵方式进行培养。一般酵母发酵所用的容器实例摇瓶或生物反应器。
培养基包括酵母生长所必需的所有成分以及一种或多种生产抗坏血酸的前体。酵母生长所需成分和生产抗坏血酸所用前体可以相同，也可不同。适合的酵母生长所需的成分和抗坏血酸前体如上所述。在发酵过程中，重组酵母吸收抗坏血酸的前体，经一个或多个步骤将它转化为抗坏血酸。重组酵母产生的L-抗坏血酸可以在酵母胞内积累；也可以远高于背景水平的的量在培养基中积累。
当培养了足够长时间，胞内或培养基中或二者中均有合适的L-抗坏血酸浓度后，进行L-抗坏血酸提取，如上所述。从酵母以及培养基中均可以提取L-抗坏血酸。如上面解释的，培养过程中如果酵母在培养基中积累L-抗坏血酸，优选L抗坏血酸的浓度可得到稳定或被提高。更优选活酵母的存在可以稳定培养基中的L-抗坏血酸。
在本发明的优选实施方案中，导入重组酵母的编码区至少编码下例酶之一L-半乳糖脱氢酶(LGDH)、L-半乳糖酸-1，4-内酯脱氢酶(AGD)、D-阿拉伯糖脱氢酶(ARA)、D-阿拉伯糖酸-1，4-内酯氧化酶(ALO)、L-古洛糖酸-1，4-内酯氧化酶(GLO)、醛糖糖酸内酯酶(AL)。在一个更优选的实施方案中，从拟南芥，啤酒糖酵母，褐家鼠或运动发酵单孢菌(Zymomonas mobilis)中分离出以下酶编码区L-半乳糖脱氢酶(LGDH)、L-半乳糖酸-1，4-内酯脱氢酶(AGD)、D-阿拉伯糖脱氢酶(ARA)、D-阿拉伯糖酸-1，4-内酯氧化酶(ALO)、L-古洛糖酸-1，4-内酯氧化酶(GLO)、醛糖糖酸内酯酶(AL)。需要指出的是，此处用来指核酸的“分离”是指编码区的最终来源，而非直接来源。也即，“分离”指如果编码区所表达的蛋白与从生物体的细胞内纯化的相应蛋白基本相同，则该编码区分离自该生物体。在更优选的实施方案中，从拟蓝芥中分离LGDH和AGD的编码区，从啤酒糖酵母中分离ALO和ARA的编码区，从褐家鼠中分离GLO，从运动发酵单孢菌中分离AL。
另一个实施方案针对制备抗坏血酸或其盐的方法。这种方法包括在含至少一种抗坏血酸前体的培养基中培养重组酵母，这样来形成抗坏血酸或其盐，然后从培养基中提取抗坏血酸或其盐。重组酵母至少能够(a)将至少25％的抗坏血酸前体转化为抗坏血酸或其盐或者(b)每升培养基产生20毫克抗坏血酸。
在特定的实施方案中培养酵母生产抗坏血酸的培养基中重组酵母能够转化至少25％的抗坏血酸。更优选重组酵母能将培养基中至少约35％的抗坏血酸前体转变成抗坏血酸。最优选地能将至少约40％的前体转变成抗坏血酸。
优选地，培养基中抗坏血酸积累的最终浓度至少能达到每升培养基20毫克，更优选终浓度至少可达每升40毫克，最优选终浓度至少可达每升70毫克。
优选重组酵母至少用一种蛋白的编码区转化而来，这种蛋白的酶活性选自L-半乳糖脱氢酶(LGDH)、L-半乳糖酸-1，4-内酯脱氢酶(AGD)、D-阿拉伯糖脱氢酶(ARA)、D-阿拉伯糖酸-1，4-内酯氧化酶(ALO)、L-古洛糖酸-1，4-内酯氧化酶(GLO)、醛糖糖酸内酯酶(AL)。
在特定的实施方案中，可用第2种酶而非第1种酶的编码区来转化酵母，第二种酶可以选自LGDH、AGD、ARA、ALO、GLO和AL。
这样，在优选实施方案中，用ALO酶的编码区功能性转化酵母。在另一实施方案中，用LGDH酶的编码区功能性转化酵母。还有一种实施方案，使用AGD酶的编码区功能性转化酵母。此外还分别用GLO、AL、ARA编码区功能性转化酵母。
在优选的实施方案中，先用具D-阿拉伯糖酸-1，4-内酯氧化酶(ALO)活性的编码区功能性转化酵母，再进一步用具L-半乳糖脱氢酶(LGDH)活性的编码区功能性转化酵母。
在另一优选实施方案中，用具ALO酶活性的蛋白的编码区和ARA酶活性蛋白的编码区转化酵母。
另一优选实施方案中，用具AGD酶活性的蛋白的编码区和具ARA酶活性的蛋白的编码区转化酵母。在特定的实施方案中，具AGD活性的蛋白可以包括一个信号肽，而其他方案中不包括此信号肽。
另一优选实施方案中，用具AGD酶活性的蛋白的编码区和具LGDH酶活性的蛋白的编码区转化酵母。在特定的实施方案中，具AGD活性的蛋白可以包括一个信号肽，其他实施方案中不包括此信号肽。
另一优选实施方案中，用具GLO酶活性的蛋白的编码区和具AL酶活性的蛋白的编码区转化酵母。
在一更优选的实施方案中，重组酵母包括另外至少一种酶的编码区，该酶涉及将碳源转化为L-半乳糖。此酶优选选自己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、甘露糖-6-磷酸异构酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸鸟苷酰转移酶、鸟苷二磷酸-甘露糖-3，5-差向异构酶、鸟苷二磷酸-L-半乳糖水解酶和L-半乳糖磷酸磷酸酶。
在一更优选的实施方案中，重组酵母包括另外至少一种酶的编码区，该酶涉及将碳源转化为L-古洛糖酸。此酶优选选自己糖激酶、磷酸葡萄糖变位酶、尿苷二磷酸-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶、尿苷二磷酸-D-葡萄糖脱氢酶、葡糖醛酸-1-磷酸尿苷酰转移酶、D-葡糖醛酸激酶、D-葡糖醛酸还原酶。
在另一优选方案中，重组酵母可包括另外至少一种酶的编码区，该酶涉及将碳源转化为L-古洛糖酸-1，4-内酯。此酶选自己糖激酶、磷酸葡萄糖变位酶、尿苷二磷酸-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶、尿苷二磷酸-D-葡萄糖脱氢酶、葡糖醛酸-1-磷酸尿苷酰转移酶、D-葡糖醛酸激酶、糖醛酸内酯酶(uronolactonase)D-葡糖醛酸还原酶和葡萄糖醛酸还原酶。
在另一更优选的实施方案中，LGDH酶或具LGDH酶活性的蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO11至少有70％的相似性，更优选有80％，更优化可达90％；AGD酶或具AGD酶活性的蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO1或SEQ ID NO3至少有70％的相似性，更优选有80％，更优选可达90％；ARA酶或具ARA酶活性的蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO20至少有70％的相似性，更优选有80％，更优选可达90％；ALO酶或具ALO酶活性的蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO5或SEQ ID NO7至少有70％的相似性，更优选有80％，更优选可达90％；GLO酶或具GLO酶活性的蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO9至少有70％的相似性，更优选有80％，更优选可达90％；AL酶或具AL酶活性的蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO29至少有70％的相似性，更优选有80％，更优选可达90％；其中相似性由程序CLUSTAL进行比对确定。
在另一更优选的实施方案中，LGDH酶或具LGDH酶活性的蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO11至少有70％的一致性，更优选有80％，更优选可达90％；AGD酶或具AGD酶活性的蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO1或SEQ ID NO3至少有70％的一致性，更优选有80％，更优选可达90％；ARA酶或具ARA酶活性的蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO20至少有70％的一致性，更优选有80％，更优选可达90％；ALO酶或具ALO酶活性的蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO5或SEQ ID NO7至少有70％的一致性，更优选有80％，更优选可达90％；GLO酶或具GLO酶活性的蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO9至少有70％的一致性，更优选有80％，更优选可达90％；AL酶或具AL酶活性的蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO29至少有70％的一致性，更优选有80％，更优选可达90％；其中一致性由程序CLUSTAL进行序列比对而确定。
在另一更优选的实施方案中，LGDH酶或具LGDH酶活性的蛋白的编码序列与SEQ ID NO12至少有70％的一致性，更优选有80％，更优选可达90％；AGD酶或具AGD酶活性的蛋白的编码序列与SEQ ID NO2的序列或SEQ ID NO4的56～1858位核苷酸至少有70％的一致性，更优选有80％，更优选可达90％；ARA酶或具ARA酶活性的蛋白的编码序列与SEQ ID NO21的285～1319位核苷酸至少有70％的一致性，更优选有80％，更优选可达90％；ALO酶或具ALO酶活性的蛋白的序编码列与SEQ ID NO6的序列或SEQ ID NO8的4～1584位核苷酸至少有70％的一致性，更优选有80％，更优选可达90％；GLO酶或具GLO酶活性的蛋白的编码序列与SEQ IDNO10的24～1346位至少有70％的一致性，更优选有80％，更优选可达90％；AL酶或具AL酶活性的蛋白的编码序列与SEQ ID NO30至少有70％的一致性，更优选有80％，更优选可达90％；其中一致性由程序CLUSTAL进行序列比对而确定。
本发明还涉及多肽，编码这些多肽的核酸在标准条件下可以与某种寡聚核苷酸探针杂交，而该探针在相同条件下与下列核酸序列杂交SEQ ID NO12、SEQ ID NO2、SEQ ID NO4的56～1858位核苷酸、SEQ ID NO21的285～1319位核苷酸、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8的4～1584位核苷酸、SEQ ID NO10的24～1346位、SEQ ID NO30以及它们的互补链或亚序列。(J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatus，1989，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，2ndedition，Cold Spring Harbour，NewYork)。寡聚核苷酸探针可以由编码序列本身或其亚序列组成。杂交表明被探针检测的序列和下列核酸中存在类似序列SEQ ID NO12、SEQ ID NO2、SEQ ID NO4的56～1858位、SEQ ID NO21的285～1319位、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8的4～1584位、SEQID NO10的24～1346位、SEQ ID NO30以及它们的亚序列。
这样，在另一个优选的实施方案中，重组酵母用选自下列的编码区进行功能性转化一个编码区，它能与SEQ ID NO12所列多核苷酸的互补序列杂交，且编码具LGDH酶活性的蛋白；一个编码区，能与SEQ ID NO2所列多核苷酸的或SEQ ID NO4的核苷酸56-1858区互补序列杂交，且编码具AGD酶活性的蛋白；一个编码区，能与SEQID NO21的核苷酸285-1319区互补序列杂交，且编码具ARA酶活性的蛋白；一个编码区，能与SEQ ID NO6或SEQ ID NO8的4-1548区的互补序列杂交，且编码具ALO酶活性的蛋白；一个编码区，能与SEQ ID NO10的24-1346区的互补序列杂交，且编码具GLO酶活性的蛋白；一个编码区，能与SEQ ID NO30的互补序列杂交，且编码具AL酶活性的蛋白；且其中编码区在严紧杂交条件下与多聚核苷酸的互补链杂交。严紧杂交条件可以是中等或高度严紧性。中等严紧条件下，比如，42℃，在5X SSPE，0.3％SDS，200μg/ml剪碎且变性的鲑精DNA，和35％甲酰胺中预杂交和杂交，按标准的Southern印迹程序进行。高度严紧条件下，比如42℃，在5×SSPE，0.3％SDS，200μg/ml剪碎且变性的鲑精DNA，和50％甲酰胺中预杂交和杂交，按标准的Southern印迹程序进行。
可用下列核苷酸序列从其他可用于根据本领域已知的方法生产抗坏血酸的不同种属中鉴定和克隆编码同源蛋白的DNA，这些核苷酸序列有SEQ ID NO12、SEQ ID NO2、SEQ ID NO4的核苷酸56～1858位、SEQ ID NO21的核苷酸285～1319位、SEQ ID NO6、SEQ IDNO8的核苷酸4～1584位、SEQ ID NO10的核苷酸24～1346位、SEQ ID NO30以及它们的亚序列。因此，可以从其它生物的基因组文库或cDNA文库中筛选与SEQ ID NO12、SEQ ID NO2、SEQ IDNO4的核苷酸56～1858位、SEQ ID NO21的核苷酸285～1319位、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8的核苷酸4～1584位、SEQ IDNO10的核苷酸24～1346位、SEQ ID NO30以及它们的亚序列杂交的DNA。
来源于其他生物的基因组DNA或其他DNA可用琼脂糖或聚丙烯酰胺电泳或其他技术进行分离。将文库DNA或分离得到的DNA转移并固定到尼龙膜或其他合适的载体上。为了确定与SEQ ID NO12、SEQID NO2、SEQ ID NO4的核苷酸56～1858位、SEQ ID NO21的核苷酸285～1319位、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8的核苷酸4～1584位、SEQ ID NO10的核苷酸24～1346位、SEQ ID NO30以及它们的亚序列同源的克隆或DNA，采用能与上述序列之一杂交的探针和固定的DNA进行杂交。杂交后，洗涤载体。比如在Southern印迹中，当探针与固定的DNA杂交后，用0.2X SSC，0.1％SDS在40℃下洗三次，每次洗30分钟，进一步优选温度不要超过45℃、更优选不超过50℃、更优选不超过55℃、更优选不超过60℃，尤其不要超过65℃。在这些条件下与探针杂交的分子可用本领域已知的方法检测。然后这些分子可用于克隆和转化，以确定是否具有想要的酶活性，还可分析这些分子与SEQ ID NO12、SEQ ID NO2、SEQ ID NO4的核苷酸56～1858位、SEQ ID NO21的核苷酸285～1319位、SEQ IDNO6、SEQ ID NO8的核苷酸4～1584位、SEQ ID NO10的核苷酸24～1346位、SEQ ID NO30以及它们的亚序列的一致性。
在另一个优选的实施方案中，用一种编码区功能性转化酵母。这些编码区的产物选自具有LGDH活性和SEQ ID NO11编码酶的免疫属性的蛋白；具有AGD活性和SEQ ID NO1或SEQ ID NO3编码酶的免疫属性的蛋白；具有ARA活性和SEQ ID NO20编码酶的免疫属性的蛋白；具有ALO活性和SEQ ID NO5或SEQ ID NO7编码酶的免疫属性的蛋白；具有GLO活性和SEQ ID NO9编码酶的免疫属性的蛋白；具有AL活性和SEQ ID NO29编码酶的免疫属性的蛋白。
这样，本发明还涉及具如下特征的多肽，(1)，有LGDH、AGD、ARA、ALO、GLO或AL的活性；且(2)，有下列多肽的完全或部分免疫化学特征，这些多肽有(a)如下氨基酸序列SEQ ID NO11，SEQID NO1，SEQ ID NO3，SEQ ID NO20，SEQ ID NO5，SEQ IDNO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO29，且(b)有与以上相似的酶活性。如果多肽具备某特定SEQ ID的酶的免疫特征就意味着含针对此SEQ ID号的天然多肽的抗原的抗血清能与其他具相似酶活性，但氨基酸序列不同的蛋白的抗原以同样的方式发生反应，如用具体的免疫化学方法得到沉淀全融合(total fusion of precipitates)，相同的沉淀形态，和/或同样的电泳泳动率。免疫化学一致性的进一步解释在以下书中有描述Axelsen，Bock和Krφll，InN.H.Axelsen，J.Krll and B.Weeks，editor，A Manual ofQuantitative Immunoelectrophoresis，Blackwell ScientificPublications，1973，Chapter 10 N.H.Axelsen，。
部分免疫化学一致性意味着含抗天然酶(有特定SEQ ID，如具有SEQ ID NO11，SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，SEQ ID NO20，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO29氨基酸序列的酶)抗原的抗体的抗血清能与其他具相似酶活性，但氨基酸序列不同的蛋白抗原以部分类似的方式发生反应，如用具体的免疫化学方法得到沉淀部分融合，沉淀形态部分相同，和/或电泳泳动率部分相同。部分免疫化学一致性的进一步解释在以下书中由Bock和Axelsen描述N.H.Axelsen，J.Krφll和B.Weeks，editor，AManual of Quantitative Immunoelectrophoresis，BlackwellScientific Publications，1973，Chapter 10。
免疫属性的检测可采用著名的Ouchterlony双免疫扩散方案进行免疫交叉反应确定。明确地，用免疫兔的办法得到本发明多肽的抗血清。(或免疫其它啮齿类动物，参照如下N.H.Axelsen，J.Krφlland B.Weeks，editor A Manual of QuantitativeImmunoelectrophoresis，Blackwell Scientific Publications，1973，Chapter 10 Harboe和Ingild所述步骤(更明确是在27-31页))。单克隆抗体的制备，比如，可以参考E.Harlow等的方法(E.Harlow和D.Lane，editors，1988，Antibodies，A LabortaryManual，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NewYork)。从抗血清中提纯免疫球蛋白，比如，可先用硫酸铵沉淀，接着用透析和离子交换层析(如DEAE-Sephadex)。同源多肽和具相同或部分相同免疫属性的多肽可以从任何属的微生物中得到，优选来自植物、动物或真菌。
在另一优选实施方案中，所用的酶是ARA，此酶包括醛-酮-还原酶(AKR)超家族的基序I和基序II，即分别为GXRXXDXAXXXXXEXXXG(SEQ ID NO13)和GXXN(SEQ ID NO26)，(Kim S.T.等1998，BBA，1429，29-39)。
优选地，目的酶的编码区整合到酵母中，从而在酵母中产生基本上有功能的目的酶，这样的酵母就称作被“功能性转化”。
编码区一旦分离得到，就可将它转化到本发明所用的酵母中，并在其中表达。最简单地说，这一过程包括，将编码区插入载体，并与载体上的启动子操作性连接，该启动子在目的生物(在本发明中为酵母)中有活性。任何载体形式(整合型、染色体型、附加体型)均有用。
任何一种在目的生物中有活性的启动子(同源的、异源的、组成型、可诱导型、可抑制型)均可用。插入通常包括用限制性内切酶在载体可能操作性连有启动子的目的位点“打开”载体，然后在打开位点处连入目的编码区。为了在目的生物中使用编码区，如有必要，可在插入载体之前对编码区作一些准备。这些准备包括改造编码区的密码子以便与目的生物中密码子的使用更加充分地相符；改变编码区那些会损害其转录和翻译或mRNA稳定性的序列；增加或删除信号肽编码序列(编码的信号肽用于将蛋白定位到特定的区域(比如，细胞器、细胞膜或细胞器膜、或胞外分泌))，还有其他本领域已知的可能的准备。
在本发明的一个实施方案中，L-半乳糖酸-1，4-内酯脱氢酶(AGD)包括一信号肽，编码此酶的编码区同样能编码此信号肽。在本发明的另一实施方案中，AGD酶不包括信号肽，同样，编码此酶的编码区不编码信号肽。特别地，SEQ ID NO1给出的AGD序列中包括一个1-100位氨基酸的信号肽，而在SEQ ID NO2给出的AGD序列中包括一个1-90位氨基酸的信号肽。如本领域技术人员所知，如果从目的酶的编码区中删去信号肽的编码序列，必须加入一个符合原阅读框(in-frame)的ATG起始密码子，用于正确起始目的酶的翻译。
无论对编码区是否进行修饰，当编码区插入到载体时，它与在酵母中有活性的启动子操作性连接。众所周知，启动子是一段能指导邻近编码区转录的DNA序列。如上所述，启动子可以是组成型，可诱导型或可抑制型。可诱导型或可抑制型启动子可通过在培养基中加入适当的诱导物或抑制物，或通过化学物理生长环境(比如温度、pH)的适当改变而被诱导或抑制，这由可诱导型或可抑制型启动子的特性确定。优选组成型启动子，是因为它不需要诱导物、抑制物或生长环境的改变。优选的组成型启动子是啤酒糖酵母的TPI(丙糖磷酸异构酶)启动子。
编码区与启动子有效相连的载体，可以是质粒、粘粒、酵母人工染色体以及其他本领域已知的适用于酵母属的载体。除了与启动子操作性连接的编码区外，载体还包括其他遗传元件。比如，如果载体不整合到酵母染色体中，则它可以包含复制起始点从而保证载体能顺利传到酵母后代细胞中。如需要将载体整合到酵母染色体中，则该载体可以包含与酵母基因组序列的同源序列，另外还可包括帮助整合的序列。为判断哪些酵母细胞已被转化，载体优选包括可选择或筛选标记，这些标记能赋予转化酵母区别于未转化酵母的不同表型。比如它能在含对非转化酵母致命的抗生素上存活；能代谢培养基中某种物质，而非转化酵母不行；或者还有其他表型。此外，载体还可包括其他遗传元件，如限制性酶切位点，及其他载体中的常有成分。
准备好载体，并且编码区操作性连接到启动子上以后，用载体转化酵母(即，将载体导入到酵母群体中至少一个细胞内)。酵母转化技术已经很成熟，包括电穿孔法、显微注射基因枪法、和LiAc/ssDNA/PEG法、以及其他。转化的酵母可用载体上携带的标记进行选择或筛选。必须指出，如上定义，在此“转化的酵母”与“重组酵母”意思本质相同。转化的酵母可以是用转化技术直接得到的细胞，或其后代。
如上所述，在特定的实施方案中，重组酵母用至少一种编码区完成功能性转化，这些编码区可以编码选自具有下列酶活性的蛋白LGDH、AGD、ARA、ALO、GLO、AL。
获得重组酵母以后，将它在培养基上培养。所用培养基如上所述。
优选的培养基包括葡萄糖、YNB以及L-半乳糖酸-1，4-内酯。可在此培养基上培养的优选的重组酵母包括啤酒糖酵母菌株(优选GRF18U)，它带有啤酒糖酵母的TPI启动子，该启动子与拟蓝芥的AGD编码区操作性连接；啤酒糖酵母菌株(优选GRF18U)，它带有啤酒糖酵母TPI启动子，该启动子与啤酒糖酵母的ALO编码区操作性连接的；其他可在此培养基上培养的优选重组酵母包括拜氏接合糖酵母菌株(优选地ATCC 36947)，它带有啤酒糖酵母TPI启动子，该启动子与啤酒糖酵母的ALO编码区操作性连接的；拜氏接合糖酵母菌株(优选地ATCC 36947)，它带有啤酒糖酵母TPI启动子，该启动子与啤酒糖酵母的AGD编码区操作性连接的。另一种优选的培养基包括葡萄糖、YNB以及L-古洛糖酸-1，4-内酯。能培养在此培养基上的一种特别优选的重组酵母是啤酒糖酵母菌株(优选GRF18U)，它携带啤酒糖酵母TPI启动子，该启动子与褐家鼠的RGLO编码区操作性连接。
另一种优选的培养基包括葡萄糖、YNB以及L-半乳糖。能培养在此培养基上的一种特别优选的重组酵母是啤酒糖酵母菌株(优选GRF18U)或拜氏接合糖酵母菌株(优选ATCC 36947)，其携带(i)与拟蓝芥的AGD编码区操作性连接的啤酒糖酵母TPI启动子，和(ii)与拟蓝芥LGDH编码区连接的TPI启动子。第二种特别优选的能在此培养基上生长的重组酵母是啤酒糖酵母菌株(优选GRF18U)或拜氏接合糖酵母菌株(优选ATCC 36947)，其包括(i)与啤酒糖酵母的ALO编码区连接的TPI启动子，和(ii)与拟蓝芥的LGDH编码区操作性连接的TPI启动子。第三种特别优选的能在此培养基上生长的重组酵母是啤酒糖酵母菌株(优选GRF18U)或拜氏接合糖酵母菌株(优选ATCC 36947)，其包括(i)与啤酒糖酵母的ALO编码区操作性连接的TPI启动子，和(ii)与啤酒糖酵母的ARA编码区操作性连接的TPI启动子。第四种特别优选的能在此培养基上生长的重组酵母是啤酒糖酵母菌株(优选GRF18U)或拜氏接合糖酵母菌株(优选地ATCC 36947)，其包括(i)与拟蓝芥的AGD编码区操作性连接的TPI启动子，和(ii)与啤酒糖酵母的ARA编码区操作性连接的TPI启动子。另一种能在此培养基上生长的优选重组酵母是啤酒糖酵母菌株(优选GRF18U)或拜氏接合糖酵母菌株(优选ATCC36947)，它携带啤酒糖酵母的TPI启动子，该启动子与啤酒糖酵母的ARA编码区操作性连接。还有一种能在此培养基上生长的优选重组酵母是啤酒糖酵母菌株(优选GRF18U)或拜氏接合糖酵母菌株(优选ATCC 36947)，它携带啤酒糖酵母的TPI启动子，该启动子与拟蓝芥的LGDH编码区操作性连接。
另一优选的培养基包括葡萄糖、YNB以及L-古洛糖酸。一种特别优选的能在此培养基上生长的重组酵母是啤酒糖酵母菌株(优选GRF18U)或拜氏接合糖酵母菌株(优选ATCC 36947)，它携带啤酒糖酵母的TPI启动子，该启动子与运动发酵单孢菌(Z.mobilis)的AL编码区操作性连接。另一种能在此培养基上生长的优选重组酵母是啤酒糖酵母菌株(优选GRF18U)或拜氏接合糖酵母菌株(优选ATCC 36947)，它携带(i)啤酒糖酵母的TPI启动子，该启动子与褐家鼠的RGLO编码区操作性连接，和(ii)与运动发酵单孢菌的AL编码区操作性连接的TPI启动子。
如上所述，对于非重组酵母而言，在发酵过程中，抗坏血酸前体经一步和多步被转变为抗坏血酸。
尽管培养在相同培养基中的非重组酵母细胞(如上所述)，在培养基中积累的抗坏血酸不超过背景水平；但奇怪地，一些所描述的特别优选的重组酵母能积累远高于背景水平的抗坏血酸。第一个例外涉及只用LGDH转化的酵母，它积累的抗坏血酸并不高于背景水平。第二个例外涉及用RGLO和/或AL转化的酵母，它积累的抗坏血酸并不高于背景水平。因此，在优选实施方案中，重组酵母能在培养基中积累高于背景水平的抗坏血酸。
从培养基中提取抗坏血酸如上所述。如以下的实施例中所述，抗坏血酸产率可以分别超过25％和35％。因此，在进一步优选的实施方案中，重组酵母转变抗坏血酸前体为抗坏血酸的产率超过前体的25％。术语“产率”指生产的抗坏血酸量(摩尔或重量/体积)除以消耗的前体量(摩尔或重量/体积)，然后再乘以100。
下列提供的定义是为了帮助本领域的技术人员理解本发明的详述。
术语“抗坏血酸积累高于背景水平”指抗坏血酸的积累量已高于所述检测方法的最低可检测水平。
“抗坏血酸”和“抗坏血酸盐”指维生素C，L-抗坏血酸和盐或其离子。
“抗坏血酸前体”指能被本发明的酵母，直接或经一或多个中间体转变成L-抗坏血酸或其盐的化合物。
“扩增”指用任何方法增加目标核酸分子的拷贝数，或增加酶的活性。
“碳源”指酵母在培养中用作碳来源来产生的新生物物质或进行细胞代谢的有机化合物。
“密码子”是确定特定氨基酸的三联核苷酸序列。
“DNA连接酶”指能共价连接两段双链DNA的酶。
“电穿孔法”指使用短暂高压直流电穿透宿主细胞，导致它们吸收染色体外DNA而将外源DNA导入到细胞中的方法。
“核酸内切酶”指在内部位点水解双链DNA的酶。
酶1.1.3.37，D-阿拉伯糖酸-1，4-内酯氧化酶，指催化D-阿拉伯糖酸-1，4-内酯+O2向D-赤抗坏血酸+H2O2，它积累的抗坏血酸并不高于背景水平的蛋白。由于此酶底物范围较广，它还可催化如下转变L-半乳糖酸-1，4-内酯+O2→L-抗坏血酸+H2O2。此酶常被误称为L-半乳糖酸-1，4-内酯氧化酶(酶1.1.3.24)(见Huh，W.K.等，1998，Mol.Microbiol)(Nishikimi，M.，等，1978，Arch.Biochem.Biophys.191，479-486)(Bleeg，H.S和Christensen，F.，1982，Eur.J.Biochem.127，391-96)。
酶1.3.2.3，L-半乳糖酸-1，4-内酯脱氢酶，指一种蛋白，它催化如下转变L-半乳糖酸-1，4-内酯+2高铁细胞色素(ferricytochrome C)→L-抗坏血酸+2亚铁细胞色素(ferrocytochrome C)。
酶1.1.3.8，L-古洛糖酸-1，4-内酯氧化酶，指一种蛋白，它可以催化L-古洛糖酸-1，4-内酯转化为L-木-己酮糖酸内酯(L-xylo-hexulonolactone)，后者能自发异构化为L-抗坏血酸。
其他涉及的酶，及其分类号如下所列己糖激酶 2.7.1.1葡萄糖-6-磷酸异构酶 5.3.1.9甘露糖-6-磷酸异构酶 5.3.1.8磷酸甘露糖变位酶 5.4.2.8D-甘露糖-1-磷酸-鸟苷酰转移酶 2.7.7.22鸟苷二磷酸-甘露糖-3，5-差向异构酶5.1.3.18糖磷酸酶 3.1.3.23L-半乳糖-脱氢酶 *)L-半乳糖酸-1，4-内酯脱氢酶 1.3.2.3甘露糖激酶 2.7.1.1磷酸葡萄糖变位酶 5.4.2.2尿苷三磷酸-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶 2.7.7.9尿苷二磷酸-D-葡萄糖脱氢酶1.1.1.22尿苷二磷酸-葡糖醛酸4-差向异构酶 5.1.3.6葡糖醛酸-1-磷酸尿苷酰转移酶 2.7.7.44
D-葡糖醛酸激酶2.7.1.43D-葡糖醛酸还原酶 1.1.1.19醛糖糖酸内酯酶(Aldonolactonase) 3.1.1.17L-古洛糖酸-1，4-内酯氧化酶1.1.3.8糖醛酸内酯酶(Uronolactonase) 3.1.1.19葡糖醛酸内酯还原酶活性1.1.1.20L-半乳糖酸-1，4内酯3-差向异构酶 *)半乳糖醛酸-1-磷酸尿苷酰转移酶 *)半乳糖醛酸激酶2.7.1.44已糖醛酸(D-半乳糖醛酸)还原酶 *)肌醇-1-磷酸合成酶 5.5.1.4肌醇-1-磷酸单磷酸酶 3.1.3.25肌醇加氧酶1.13.99.1D-半乳糖激酶 2.7.1.6尿苷三磷酸-己糖-1-磷酸尿苷酰转移酶2.7.7.10尿苷二磷酸-葡萄糖-4-差向异构酶5.1.3.2蔗糖(Suc)合成酶 2.4.1.13果糖激酶 2.7.1.4*)数据库中无法获得分类号。
术语“表达”指将基因转录为相应的mRNA，并将此mRNA翻译成相应的基因产物；即，肽，多肽，或蛋白。
“功能性连接”或“操作性连接”指以一定的方向和距离将启动子或启动子区与编码区或结构序列连接，从而前者能指导后者的转录。
“基因”指能够编码肽、多肽、蛋白或RNA分子的DNA，包括染色体DNA、质粒DNA、cDNA、合成的DNA、或其他DNA；以及编码序列附近的表达调节序列。
“基因组”涵盖细胞内染色体和质粒的统称。因此，本发明中的导入宿主细胞的编码DNA可以是整合在染色体上，也可定位于质粒上。
“异源DNA”指来自非受体细胞来源的DNA。
“同源DNA”指来自与受体细胞相同来源的DNA。
“杂交”指核酸通过碱基配对与其互补连结合的能力；两条核酸链的互补序列相互结合即发生了杂交。
“培养基”指酵母的化学环境，包括酵母或重组酵母生长的必需成分，以及产生抗坏血酸的一或多种前体。酵母生长所需成分与生产抗坏血酸的前体可以相同也可不同。
“开放阅读框(ORF)”指编码肽、多肽或蛋白的DNA或RNA区域。
“质粒”指环状，染色体外，可复制的DNA片段。
“聚合酶链式反应(PCR)”指产生多拷贝某种核酸序列的酶技术。通过DNA聚合酶在两个扩增引物间穿梭制备多拷贝DNA序列。扩增方法基于如下步骤的多次温度改变循环来变性，引物序列再退火，及在引物间延伸合成新DNA链。
术语“启动子”或“启动子区”指通常存在于编码区5’端上游的DNA序列，它通过为RNA聚合酶和/或确保在正确位点起始转录所必须的“其他因子”提供识别位点，控制转录进而控制编码区的表达。
“重组细胞”或“转化的细胞”指含有原本不属于该细胞的核酸序列，或含有内源核酸的额外拷贝。其中，用人为方法将核酸序列导入该细胞或其祖先细胞。
术语“重组载体”或“重组DNA或RNA构建物”指任何如质粒、粘粒、病毒、自主复制序列、噬菌体等线性或环状，单链或双链的DNA或RNA核苷酸序列等的媒介物；可以是任何来源的，能够整合到基因组中或自主复制；包括核苷酸分子，其中以操作性方式连入若干序列。这样的重组构建物或载体能够将5’端调节序列或启动子区域及所选基因产物的编码序列导入到细胞中，由此该编码序列可被转录成有功能的mRNA，进而可以或可以不翻译并表达。
“限制性酶”指能识别核酸双链中的特定序列，并切割双链的酶；另被称作限制性内切酶。切割通常发生在限制位点或其附近。
“选择性标记”指能赋予细胞因它的表达而获得可辨认性状的核酸序列。这种标记包括的性状有抗有毒化学物(如，氨苄青霉素，卡那霉素，G418，潮霉素)或弥补营养缺陷(比如，尿嘧啶、组氨酸、亮氨酸)。
“筛选标记”指因它的表达而获得视觉可辨性状的核酸序列。(如，颜色改变、发荧光)。
转录”指从DNA模板产生RNA拷贝的过程。
“转化”指如下过程将外源核酸序列(如，载体、质粒或重组核酸序列)导入细胞中，在细胞内该序列与染色体整合或能进行自主复制。发生转化的细胞或其后代被称作“转化的细胞”或“重组细胞”。如果外源序列携带目的蛋白的编码区，蛋白在转化酵母中得到表达，且表达蛋白基本上具有功能，那么这样的转化酵母实现了“功能性转化。”翻译”指从mRNA产生蛋白的过程。
术语“产率”指生产的抗坏血酸量(摩尔或重量/体积)除以消耗的前体量(摩尔或重量/体积)，然后再乘以100。
酶“单位”指酶的活性，表示每分钟，每毫克细胞总蛋白转变底物的微摩尔数。
“载体”指DNA或RNA分子(如，质粒、粘粒、噬菌体、酵母人工染色体或病毒及其他)，它能够携带核酸序列进入宿主细胞。载体或其部分能够插入到宿主基因组中。
缩写列表Asc L-抗坏血酸(维生素C)或其盐
AGDL-半乳糖酸-1，4-内酯脱氢酶AL 醛糖糖酸内酯酶ALOD-阿拉伯糖-1，4-内酯氧化酶ARAD-阿拉伯糖脱氢酶GalL-半乳糖酸-1，4-内酯GulL-古洛糖酸-1，4-半乳糖酸LGDH L-半乳糖脱氢酶GLOL-古洛糖酸-1，4-内酯氧化酶RGLO 褐家鼠L-古洛糖酸-1，4-内酯氧化酶TCA三氯乙酸TPI丙糖磷酸异构酶OD660660nm的光密度必需指出酶活性的缩写只代表相应的活性，并不代表特定的酶。
实施例下面的实施例用于示范本发明的优选实施方案。本领域的技术人员应当理解，在以下实施例中公开的技术代表发明人在本发明的实践中发现的行之有效的技术，因此可以考虑用这些技术构建实用的优选模式。但参考这些公开技术的技术人员应当理解，在特定的实施方案中，如在不脱离本发明的本质和范围前提下作诸多修改，仍可得到相同或相似的结果。
材料和方法1.抗坏血酸的确定根据Sullivan等的方法(1955，Assoc.Off.Agr.Chem.，38，514-518)，用分光光度法检测抗坏血酸。将135μl样品与40μlH3PO4(85％)在试管中混匀。然后加入675μl，双吡啶基(-Bipyridyl)(0.5％)和135μl FeCl3(1％)。10分钟后，检测525nm处的吸收值。抗坏血酸鉴定采用HPLC(高效液相色谱)方法(TracerExtrasil Column C8，5μM，15×0.46cm，Teknokroma，S.Coop. C.Ltda#TR-016077；洗脱液5mM十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)，50mMKH2PO4溶于体积分数为95/5的水/乙腈溶液中；流速1ml/min，检测UV为254nm)，用纯L-抗坏血酸(Aldrich，A9，290-2)作标准。
2.蛋白浓度确定根据Lowery方法(Lowry O.H.等，1951，J.Biol.Chem.193，265-275)检测蛋白浓度。采用Bio-Rad DC蛋白检测试剂盒II(Cat.Nr.500-0112)，以BSA为标准。
3.特定基因序列的扩增使用PfuTurbo DNA聚合酶(Stratagene#600252)，在GeneAmpPCR系统9700(PE Appl.Biosystems，Inc)上扩增特异基因序列。采用如下标准条件400μM dNTP，0.5μM引物，0.5mM MgCl2(加缓冲液)，以及每100μl反应体系3.75U Pfu。
所用基因序列已在Genbank中公布，如下所列。
下列程序用于扩增AGD94℃ 5分钟94℃ 45秒53.5℃ 30秒 }33循环72℃ 1分钟40秒72℃ 7分钟4℃∞下列程序用于扩增AL94℃ 5分钟94℃ 45秒53.5℃ 30秒}33循环72℃ 1分钟40秒72℃ 7分钟4℃∞
下列程序用于扩增ALO94℃ 5分钟94℃ 45秒50℃ 30秒 }33循环72℃ 1分钟40秒72℃ 7分钟4℃ ∞下列程序用于扩增ARA94℃ 5分钟94℃ 45秒56℃ 30秒}33循环72℃ 1分钟40秒72℃ 7分钟4℃ ∞下列程序用于扩增LGDH94℃ 5分钟94℃ 45秒56℃ 30秒 }33循环72℃ 1分钟40秒72℃ 7分钟4℃∞下列程序用于扩增RGLO94℃ 30秒94℃ 5秒72℃ 4分钟 33循环72℃ 5分钟4℃ ∞
用于扩增AGD和LGDH的模板DNA50ng质粒cDNA文库pFL61拟南芥(ATCC#77500(Minet M.等，1992，Plant J.，2，417-422))。RGLO的模板0.5ng鼠肝脏marathon-ready cDNA文库(Clontech#7471-1)。AL的模板50ng运动发酵单孢菌(ATCC#10988)基因组DNA，按标准方法提取。ALO和ARA的DNA模板50ng啤酒糖酵母GRF18U的基因组DNA，按标准方法提取。采用NovagenInc.的完全平末端克隆试剂盒(#70191-4)，将PCR产物按平末端法克隆进pSTBlue质粒的EcoRV位点中。
所用的寡聚核苷酸扩增的基因SEQ ID NO14caagaaggcctaaatgttccgttacgctccSEQ ID NO15atgggcccttaagcagtggtggagactgggAGDSEQ ID NO16tgaggggtcagggtggtttgtttccaSEQ ID NO17tggaatcatggtccatgggtacaaaggg RGLOSEQ ID NO18tttcaccatatgtctactatccSEQ ID NO19aaggatcctagtcggacaactcALOSEQ ID NO22atgacgaaaatagagcttcgagcSEQ ID NO23ttagttctgatggattccacttgg LGDHSEQ ID NO24atgtcttcttcagtagcctcaaccSEQ ID NO25ttaatactttaaattgtccaagtttggtc ARASEQ ID NO27atgaccactggtcgtatgtctcgSEQ ID NO28ttaccagaaaataagacccaagca AL4.质粒构建如下是命名规则，比如如果pSTBlue-1所含AGD相对其多克隆位点(MCS)是有义方向，则为pSTB AGD-1。在另一例中，pSTBlue-1所含AGD相对其多克隆位点为反义方向，则为pSTB AGD-2，如此等等。
所有克隆目的均使用标准程序。(Sambrook J.等，MolecularCloningA Labortory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress)
构建表达质粒pYX质粒是一系列市场上有售的酵母表达载体(R&DSystems，Inc.)。
pAG26TPI用限制酶ApaI切割pAG26(Goldstein A.L.和McCuskerJ.H.，1999，Yeast 15，1541-1553)，并将其平末端化；再用限制酶AatII/PvuII从pYX022中切出表达盒(含有TPI启动子，多克隆位点和终止子)；将此表达盒平末端化，并克隆进上述pAG26中。
PZ3用限制酶DraIII切割pYX022，平末端化后，再用SpeI切割；用限制酶ClaI将ARS/CEN区从Ycplac33(Gietz R.D.和SuginoA.，1998，Gene 74，527-534)中切出，然后平末端化，再用限制酶SpeI切割并克隆到上述pYX022中。用KpnI限制酶切开上述得到的载体，并平末端化，然后连入G418抗性盒；此盒经由SphI/SacI酶切pFA6-KanMX4，并平末端化而得到。
5.酵母培养和检查所用酵母为啤酒糖酵母GRF18U，W3031B，拜氏接合糖酵母ATCC60483，拜氏接合糖酵母ATCC 36947，和乳克鲁维氏酵母PM6-7A(Wésolowski-Louvel，M.等，1992，Yeast 8，711-719)。GRF18U由农业研究机构保藏中心保藏，分类编号为NRRL Y-30320。在标准条件(振荡培养于30℃)下，所有菌株培养于摇瓶内的基本培养基(0.67％w/v YNB(Difco Laboratories，Detroit，MI#919-15)，2％w/v葡萄糖，分别相应加入合适的氨基酸或腺嘌呤或尿嘧啶至50mg/l)中。起始光密度OD660约0.05。
对于使用L-半乳糖培养，先将细胞培养过夜，然后加入250mgl-1的L-半乳糖，继续培养24小时。使用非L-半乳糖的底物培养，如没有不同说明，则在有50mM或100mM相应底物存在下，培养72小时。为检测胞内抗坏血酸，细胞作如下处理4℃，4000转/分离心5分钟，收集细胞；用冷蒸馏水将细胞洗一遍，用三倍于细胞沉淀体积的冷10％TCA重悬细胞，剧烈震荡，在冰上放20分钟，然后离心，使上清不含细胞碎片。
6.酵母转化按标准的LiAc/ss-DNA/PEG方法转化酵母细胞(Agateo，R.等，1998)。啤酒糖酵母GRF18U和各种转化酵母在NRRL保存。如下表列出了这些菌株和它们的NRRL编号。
这些菌株保存在农业研究机构保藏中心，1815 NorthUniversity Street，Peoria，Illinis 61604美国。该保藏机构符合微生物保藏国际认证布达佩斯条约关于用于专利程序及其管理目的的。一旦相关权利要求以美国专利发布，本酵母可在布达佩斯条约的条款下通过NRRL获取。可获得该保藏酵母不应理解为可以实施本发明并侵犯由任何政府根据其专利法赋予的权利。
实验结果1.抗坏血酸的稳定性为测定培养条件下抗坏血酸的稳定性，我们在我们的标准培养基(2％葡萄糖，0.67％YNB)中加入抗坏血酸，此溶液在摇瓶中30℃振荡培养。图2显示了相关结果。灭菌培养基中，抗坏血酸很快降解(见B组)，但如培养基中有活酵母时，抗坏血酸能稳定存在(见A组)。这表明在培养基中培养酵母可作为稳定抗坏血酸的一种方法。
因此，由于酵母所能产生的抗坏血酸因酵母的存在而得到稳定，使得本发明适合于生产抗坏血酸。
2.用非转化酵母生产抗坏血酸根据文献，野生型(wt)酵母具有D-阿拉伯糖酸-1，4-内酯氧化酶活性，且该酶底物专一性较宽(Huh W.K.等，1994，Eur.J.Biochem.225，1073-1079)。其酶活性可在体外证明。为检测底物或产物能否透过细胞膜，我们用L-半乳糖酸-1，4-内酯(植物合成抗坏血酸途径中的最后一个前体)或L-古洛糖酸-1，4-内酯(动物合成途径中的最后一个前体)培养三种不同的酵母(啤酒糖酵母GRF18U和W3031B以及拜氏接合糖酵母ATCC60483)。如图3所示，此两种物质均可以进入酵母细胞，并转化为抗坏血酸。培养液中不积累抗坏血酸(数据未显示)，但在全细胞提取物中能检测到相当量的抗坏血酸。
植物合成途径中的倒数第2的前体为L-半乳糖。图4显示用此底物培养酵母的结果。啤酒糖酵母，拜氏接合糖酵母和乳克鲁维氏酵母可从这些化合物产生抗坏血酸，并以相当量积累于胞内(图4)。
3.转化的酵母在培养基中生产并积累抗坏血酸我们克隆了如下酶活性的编码基因ALO、ARA、AGD、LGDH、RGLO、AL。如方法和材料中概括，将这些基因克隆到可用的表达载体中。简而言之，啤酒糖酵母中的一个天然的组成型强启动子TPI，起动目的基因的表达。用L-半乳糖酸-1，4-内酯培养经AGD或ALO转化的GRF18U，不但胞内积累抗坏血酸(数据未显示)，奇怪的是，而且在培养液中积累了相当量的抗坏血酸(图5)。用L-半乳糖培养上述转化酵母有同样结果(图6)。共转化LGDH或ARA能够显著增加相应菌株将L-半乳糖转变为抗坏血酸的能力(图6)。用L-半乳糖培养表达(a)ALO；(b)LGDH和ALO；或(c)ARA和ALO的重组GRF18U或W3031B能得到如上同样的结果(未显示)。图7显示高密度培养条件下，从L-半乳糖生成抗坏血酸的数据。相应的菌株在标准基本培养基上培养过夜。第二天，在无菌条件下离心，沉淀用1/10上清体积重悬，从而浓缩10倍。然后加入250mgl-1L-半乳糖，在标准条件下培养6天。6天后，用ALO和LGDH共转化的菌株积累的抗坏血酸超过每升培养基70毫克。胞内积累每升30毫克(数据未显示)。两者合计，相当于转化了约40％的L-半乳糖。
为检测其他酵母生产抗坏血酸的能力，用ALO和/或LGDH转化拜氏接合糖酵母ATCC 36947。用L-半乳糖在与上述啤酒糖酵母转化细胞一样的条件下培养拜氏接合糖酵母ATCC 36947转化细胞(图8)。与上述啤酒糖酵母实施例中一样，此例中同样有积累于培养液中抗坏血酸。用L-半乳糖培养野生型拜氏接合糖酵母，只积累少量抗坏血酸。用含有对抗生素G418或潮霉素抗性的质粒转化细胞以及在有相应抗生素条件下培养，似乎能破坏其内源产生抗坏血酸的能力。功能性表达ALO，或ALO和LGDH，导致抗坏血酸在培养液中有明显积累。分别用以上两种抗生素或只用G418抗生素培养ALO转化菌，前者积累的抗坏血酸低于后者，这表明潮霉素的存在或其抗性的表达明显干扰抗坏血酸的积累或检测。在上述两种抗生素存在的条件下培养如下两种转化酵母表达ALO和LGDH的酵母，和只表达ALO的酵母。前者在培养基中的抗坏血酸积累水平高于后者，这表明LGDH在拜氏接合糖酵母可功能性表达。
在有L-古洛糖酸-1，4-内酯的条件下培养用RGLO转化的啤酒糖醇母GRF18U，胞内积累抗坏血酸(图9)，但培养液中不积累(数据未显示)。如上所述，由于内源ALO的交叉反应，未转化细胞能转变一定量的L-古洛糖酸-1，4-内酯。一旦RGLO在此细胞中表达，抗坏血酸积累水平显著提高。如共表达AL则抗坏血酸积累水平较低。由于发生水解反应，在水环境中L-古洛糖酸-1，4-内酯与L-古洛糖酸处于平衡状态。平衡极大地倾向于自由酸一边，但达到平衡的速度极慢(以天计算)。用L-古洛糖酸-1，4-内酯培养的细胞能够吸收并将它转化为抗坏血酸。一旦功能性共表达AL、RGLO和ALO，这三种酶会在L-古洛糖酸-1，4-内酯与L-古洛糖酸的平衡反应中竞争底物。由于L-古洛糖酸不是ALO或RGLO的底物，从而更快达到L-古洛糖酸的平衡，从而内酯由ALO或RGLO转化成抗坏血酸的量减少。逆反应(L-古洛糖酸内酯化为古洛糖酸-1，4-内酯)在水环境中即使反应，如没有酶催化也很难进行。因此，不额外表达蛋白的啤酒糖酵母GRF18U或表达RGLO的GRF18U，在有L-古洛糖酸的培养条件下，无论在胞内(图9)还是胞外(数据未显示)均不积累抗坏血酸。一旦GRF18U表达AL，少量L-古洛糖酸被转化为L-古洛糖酸-1，4-内酯，后者可作为ALO或ALO和RGLO的底物。如此一来，在用酵母生产抗坏血酸中，AL酶成为除ALO和/或RGLO外的有用酶。
如用L-古洛糖酸-1，4-内酯培养经RGLO转化的拜氏接合糖酵母ATCC36947或ATCC60483，胞内(图10)积累抗坏血酸，但培养液中(数据未显示)不积累。因此从拜氏接合糖酵母中得到的数据与啤酒糖酵母中的数据相似。
下表概括了本发明报导的主要实施例。注意表下的“未测”指“未测定。”
尽管是在所谓的优选实施方案中给出本发明所用的组合物、方法以及酵母菌种，但显然，对于本领域的技术人员而言，在不背离本发明的理念、精神、和范围的前提下，可作一些变化。
参考文献此处特别引用下列参考以提供示范或其他补充。Agatep，R.，R.D.Kirkpatrick，D.L.Parchaliuk，R.A Woods，和R.D.Gietz，1998，用乙酸锂/单链载体DNA/聚乙二醇方法转化啤酒糖酵母.Technical Tips Online(http//tto.trends.com).Axelsen，Bock，和Krφll在N.H.Axelsen，J.Krφll，和B.Weeks，编辑，定量免疫电泳手册，Blackwell ScientificPublications，1973，第10章.Berry，A.，Running，J.，Severson，D.K.和Burlingame，R.P.，1999，用微生物和植物生产维生素C，国际专利申请，WO99/64618.Bleeg，H.S和Christensen，F.，1982，Bio，酵母中生产抗坏血酸，利用不同与哺乳动物L-古洛糖酸内酯氧化酶的性质纯化L-古洛糖酸内酯氧化酶，Eur.J.Biochem.127，391-96.Bock和Axelsen，在N.H.Axelsen，J.Krφll，和B.Weeks，编辑，定量免疫电泳手册，Blackwell Scientific Publications，1973，第11章.Daurwala，R.，song，J.，Koh，W.S.，Rumsey，S.C.和Levine，M.，1999，人钠依赖性维生素C运输子hSVCT1和hSVT2的克隆和功能解析.FEBS Lett.460，480-484.Dumbrava，V.A和Pall，M.L.，1987，在粗糙脉胞菌(Neurosporacrassa)中用cAMP控制核苷酸和赤抗坏血酸.Biochim BiophysActa.926，331-338.Gietz，R.D.和Sugino，A.，1988，用体外突变的缺乏六碱基酶切位点的突变基因构建新的酵母-大肠杆菌穿梭载体.Gene 74，527-534。Goldstein，A.L.和McCusker，J.H.，1999，啤酒糖酵母中导致基因断裂的三个新的显性抗药性盒.Yeast 15，1541-1553.Hancock，R.D.，Galpin，J.R.，和Viola，R.，2000用啤酒糖酵母合成L-抗坏血酸(维生素C).FEMS Micrtobiol.Lett.186，245-250.Harboe和Ingild，在N.H.Axelsen，J.Krφll，和B.Weeks，编辑，定量免疫电泳手册，Blackwell ScientificPublications，1973，第23章.Harlow，E.和Lane，D.，编辑，1988，抗体的实验手册，ColdSpring Harbor Press，Cold Spring Harbor，New York.Huh，W.K.，Lee，B.H.，kim，S.T.，Kim，.Y.R.，Rhie，G.E.，Baek，Y.W.，Hwang，C.S.Lee，S.J.和Kang，S.O.，1998，D-赤抗坏血酸是啤酒糖酵母中一个重要的抗氧化分子，Mol.Microb.30，895-903.Huh，W.K.，Kim，S.T.，Seok，Y.J.，Hah，Y.C.和Kang，S.O.，1994，Candida albicans ATCC 10231中的D-阿拉伯糖酸-1，4-内酯氧化酶的解析，Eur.j.Biochem.225，1073-1079.Johnstone和Thorpe，实用免疫化学，BlackwellScientific Publications，1982，27-31.Kim，S.T.，Huh，W.K.，Kim，J.Y.，Hwang，S.W.和Kang，S.O.，1996，D-阿拉伯糖脱氢酶与Candida albicans合成赤抗坏血酸，BBA 1297，1-8.Kim，S.T.，Huh，W.K.，Lee，B.H.和Kang，S.O.，1998，D-阿拉伯糖脱氢酶和其在啤酒糖酵母中的基因，BBA 1429，29-39.Koshizaka T.，Nishikimi M.，Ozawa T.和Yagi K.，1998，编码鼠肝中L-古洛糖酸-γ-内酯氧化酶，合成L-抗坏血酸的关键酶的DNA的提取和序列分析J.Biol.Chem.263，1619-1621.Kreger-van Rij，N.J.W.，1987，酵母，Biology of Yeasts，第一卷，第二章，A.H.Rose和J.S.Harrison，编辑.AcademicPress，London.Kumar，M.2000用酵母生产抗坏血酸，国际专利申请，WO00/34502.Lee，B.H.，Huh，W.K.，Kim，S.T.，Lee，J.S和Kang，S.O.，1999，通过在大肠杆菌中功能性表达啤酒糖酵母的D-阿拉伯糖酸-1，4-内酯氧化酶生产D-赤抗坏血酸和L-抗坏血酸，App.Env.Microb.65，4685-4687.Loewus M.W.等，1990，Plant.Physiol.94，1492-1495.Lowry，O.H.，Rosebrough，N.J.，Farr，A.L.和Randall，R.J.，1951，福林苯酚试剂检测蛋白，J.Biol.Chem.193，265-275.Minet，M.，Dufour，M.E.和Lacroute，F.，1992，用拟蓝芥cDNA对啤酒糖酵母的营养缺陷型突变体进行互补，Plant J.2，417-422.Nishikimi，M.，Noguchi，E.和Yagi，K.，1978，酵母中一个与动物抗坏血酸合成关键酶L-半乳糖酸内酯脱氢酶相似的酶的发生，Arch.Biochem.Biophys.191，479-486.stergaard，J.，Persiau，G.，Davery，M.W.，Bauw，G.和VanMontagu，M.，1997，植物中参与抗坏血酸合成的L-半乳糖酸内酯脱氢酶的cDNA的提取，J.Biol.Chem.272，30009-30016.Padh，H.，1990，抗坏血酸的细胞功能，Biochem CellBiol.68，1166-1173.Reichstein，T.，抗坏血酸(维生素C)的生产方法，美国专利2,265,12l.Roland，J.F.，Cayle，T.，Dinwoodie，R.C.和Mehnert，d.W.，1986，用L-半乳糖酸发酵生产左旋抗坏血酸，美国专利4,595,659.Roland，J.F.，Cayle，T.，Dinwoodie，R.C.和Mehnert，D.W.，1990，用L-半乳糖酸-1，4-氧化酶合成抗坏血酸，美国专利4,916,068.Roland，J.F.，Cayle，T.，Dinwoodie，R.C.和Mehnert，D.W.，1986，用L-半乳糖酸发酵生产抗坏血酸，国际专利申请WO85/01745.Spickett，C.M，Smiroff，N.和Pitt，A.R.2000，赤抗坏血酸在啤酒糖酵母中的合成，及抗氧化剂作用，Free Radic.Biol.Med.28，183-192.Sambrook，J.，Frisch，E.F.，和Maniatus T.，1989，分子克隆之实验手册，第二版，Cold Spring Harbor，New York.Smirnoff，n.和Wheeler，G.，1999，植物半乳糖脱氢酶，国际专利申请，WO99/33995.Sullivan，M.X.和Clarke，H.C.N.，1955，一种针对抗坏血酸的高度专一方法，Assoc.Off.Agr.Chem.38，514-518.Wach，A.，Brachat，A.，Pohlmann，R.，和Philippsen，P.，1994，导致啤酒糖酵母中经典的或基于PCR的基因断裂的新异质模块，Yeast 10，1793-1808.Wésolowski-louvel，M.，Prior，C.，D.和Fukuhara，H.，1992，涉及酵母中葡萄糖代谢的Rag突变体提取和遗传分析.Yeast8，711-719.Wheeler，G.L.，Jones，M.A.和Smirnoff，N.1998.高等植物中的维生素C合成途径，Nature 393，365-369.
序列表<110>BIOPOLO S.C.a.R.L.<120>由酵母生产抗坏血酸<130>WPP84333<140><141><150>US 09/630,983<151>2000-08-02<160>30<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>610<212>PRT<213>拟南芥<400>1Met Leu Arg Ser Leu Leu Leu Arg Arg Ser Val Gly His Ser Leu Gly1 5 10 15Thr Leu Ser Pro Ser Ser Ser Thr Ile Arg Ser Ser Phe Ser Pro His20 25 30Arg Thr Leu Cys Thr Thr Gly Gln Thr Leu Thr Pro Pro Pro Pro Pro35 40 45Pro Pro Arg Pro Pro Pro Pro Pro Pro Ala Thr Ala Ser Glu Ala Gln50 55 60Phe Arg Lys Tyr Ala Gly Tyr Ala Ala Leu Ala Ile Phe Ser Gly Val65 70 75 80Ala Thr Tyr Phe Ser Phe Pro Phe Pro Glu Asn Ala Lys His Lys Lys85 90 95Ala Gln Ile Phe Arg Tyr Ala Pro Leu Pro Glu Asp Leu His Thr Val100 105 110Ser Asn Trp Ser Gly Thr His Glu Val Gln Thr Arg Asn Phe Asn Gln115 120 125Pro Glu Asn Leu Ala Asp Leu Glu Ala Leu Val Lys Glu Ser His Glu130 135 140Lys Lys Leu Arg Ile Arg Pro Val Gly Ser Gly Leu Ser Pro Asn Gly145 150 155 160Ile Gly Leu Ser Arg Ser Gly Met Val Asn Leu Ala Leu Met Asp Lys165 170 175Val Leu Glu Val Asp Lys Glu Lys Lys 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Ala610<210>2<211>1833<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述拟南芥<400>2atgctccggt cacttcttct ccgacgctcc gtcggccatt ctctcggaac cctatctccg 60tcttcatcca ccatccgttc ctcattttcg cctcatcgta ctctctgcac caccggtcaa 120acattgacac caccaccgcc gccaccgcca cgtcctccac ctccgcctcc ggccaccgcc 180tcagaagctc aattccgtaa atacgccgga tacgcagcac tcgctatctt ctctggagtt 240gctacctatt tctcatttcc attccctgag aatgctaaac acaagaaggc tcaaatcttc 300cgttacgctc ctttacctga agatcttcac actgtctcta attggagtgg tactcatgag 360gtacagacta ggaactttaa tcaaccggag aatcttgctg atctcgaagc tcttgttaag 420gaatctcatg agaagaagtt aaggattcgt cccgttggat cgggtctctc gcctaatggg 480attggtttgt ctcgctctgg gatggtgaat ctggcgctta tggataaagt tctagaggtg 540gataaagaga agaagagagt tacggtgcag gctgggatta gggtccagca attggttgac 600gccattaaag actatggtct tactcttcag aactttgcct ccattagaga gcagcagatt 660ggtggtatta ttcaggttgg ggcacatggg acaggtgcta gattgcctcc tattgatgag 720caggtgatca gtatgaagct ggttactcct gcgaagggaa caattgaact ttcaagagag 780aaagatccgg agctctttca tctagctcga 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tcgagcctgt aaagaatctg acatggccaa gtggaatcca tcagaactaa 960<210>13<211>18<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述醛-酮还原酶超家族的基序I<220><221>变体<222>(2)<223>Xaa＝任何氨基酸<220><221>变体<222>(4)..(5)<223>Xaa＝任何氨基酸<220><221>变体<223>Xaa＝任何氨基酸<220><221>变体<223>Xaa＝任何氨基酸<220><221>变体<222>(15)..(17)<223>Xaa＝任何氨基酸<400>13Gly Xaa Arg Xaa Xaa Asp Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Xaa Xaa1 5 10 15Xaa Gly<210>14<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述来自拟南芥的L-半乳糖酸-1，4-内酯脱氢酶的正向PCR引物。caagaaggcctaaatgttcc gttacgctcc30<210>15<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述来自拟南芥的L-半乳糖酸-1，4-内酯脱氢酶的反向PCR引物。<400>15atgggccctt aagcagtggt ggagactggg 30<210>16<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述来自褐家鼠的L-古洛糖酸-1，4-内酯氧化酶的正向PCR引物。<400>16tgaggggtca gggtggtttg tttcca 26<210>17<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述来自褐家鼠的L-古洛糖酸-1，4-内酯氧化酶的反向PCR引物。<400>17tggaatcatg gtccatgggt acaaaggg28<210>18<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述来自啤酒糖酵母的D-阿拉伯糖酸-1，4-内酯氧化酶的正向PCR引物。<400>18tttcaccata tgtctactat cc 22<210>19<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述来自啤酒糖酵母的D-阿拉伯糖酸-1，4-内酯氧化酶的反向PCR引物。<400>19aaggatccta gtcggacaac tc22<210>20<211>344<212>PRT<213>啤酒糖酵母<400>20Met Ser Ser Ser Val Ala Ser Thr Glu Asn Ile Val Glu Asn Met Leu1 5 10 15His Pro Lys Thr Thr Glu Ile Tyr Phe Ser Leu Asn Asn Gly Val Arg20 25 30Ile Pro Ala Leu Gly Leu Gly Thr Ala Asn Pro His Glu Lys Leu Ala35 40 45Glu Thr Lys Gln Ala Val Lys Ala Ala Ile Lys Ala Gly Tyr Arg His50 55 60Ile Asp Thr Ala Trp Ala Tyr Glu Thr Glu Pro Phe Val Gly Glu Ala65 70 75 80Ile Lys Glu Leu Leu Glu Asp Gly Ser Ile Lys Arg Glu Asp Leu Phe85 90 95Ile Thr Thr Lys Val Trp Pro Val Leu Trp Asp Glu Val Asp Arg Ser100 105 110Leu Asn Glu Ser Leu Lys Ala Leu Gly Leu Glu Tyr Val Asp Leu Leu115 120 125Leu Gln His Trp Pro Leu Cys Phe Glu Lys Ile Lys Asp Pro Lys Gly130 135 140Ile Ser Gly Leu Val Lys Thr Pro Val Asp Asp Ser Gly Lys Thr Met145 150 155 160Tyr Ala Ala Asp Gly Asp Tyr Leu Glu Thr Tyr Lys Gln Leu Glu Lys165 170 175Ile Tyr Leu Asp Pro Asn Asp His Arg Val 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tattttctgg 960taa 96权利要求
1.生产抗坏血酸或其盐的方法，包括将克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces spp.)或接合糖酵母属(Zygosaccharomyces spp.)酵母培养在含至少一种抗坏血酸前体的培养基中，来产生抗坏血酸或其盐，并分离抗坏血酸或其盐。
2.权利要求1的方法，其中酵母为拜氏接合糖酵母或乳克鲁维氏酵母。
3.权利要求2的方法，其中酵母为拜氏接合糖酵母菌株ATCC60483，拜氏接合糖酵母菌株ATCC36947，或乳克鲁维氏酵母菌株PM6-7A。
4.权利要求1的方法，其中抗坏血酸的前体选自L-半乳糖；D-葡萄糖；L-半乳糖酸-1，4-内酯；L-古洛糖酸；和L-古洛糖酸-1，4-内酯。
5.权利要求1的方法，其中分离步骤包括裂解酵母。
6.权利要求5的方法，其中分离步骤还包括离心，过滤，微量过滤，超滤，纳米过滤(nanofiltration)，液-液萃取，结晶，用核酸酶或蛋白酶处理，或层析。
7.生产抗坏血酸的方法，包括a)获得能将抗坏血酸前体转化成抗坏血酸的重组酵母，b)在含抗坏血酸前体的培养基中培养重组酵母，由此产生抗坏血酸，和c)分离抗坏血酸。
8.权利要求7的方法，其中酵母属于如下属糖酵母属(Saccharomyces)，接合糖酵母属(Zygosaccharomyses)，假丝酵母属(Candida)，汉逊氏酵母属(Hansenula)，克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)，德巴利氏酵母属(Debaromyces)，拿逊氏酵母属(Nadsonia)，油脂酵母属(Lipomyces)，球拟酵母属(Torulopsis)，克勒克氏酵母属(Kloeckera)，毕赤氏酵母属(Pichia)，裂殖糖酵母属(Schizosaccharomyces)，三角酵母属(Trigonopsis)，酒香酵母属(Brettanomyces)，隐球酵母属(Cryptococcus)，丝孢酵母属(Trichosporon)，短柄霉属(Aureobasidium)，Phaffia，红酵母属(Rhodotorula)，Yarrowia或者许旺氏酵母属(Schwanniomyces)。
9.权利要求8的方法，其中酵母属于啤酒糖酵母，乳克鲁维氏酵母或拜氏接合糖酵母。
10.权利要求9的方法，其中酵母选自啤酒糖酵母菌株GRF18U；啤酒糖酵母菌株W3031B；乳克鲁维氏酵母菌株PM6-7A；拜氏接合糖酵母菌株ATCC60483；或拜氏接合糖酵母菌株ATCC36947。
11.权利要求7的方法，其中酵母用第一酶的编码区功能性转化，此酶选自L-半乳糖脱氢酶(LGDH)、L-半乳糖酸-1，4-内酯脱氢酶(AGD)、D-阿拉伯糖脱氢酶(ARA)、D-阿拉伯糖酸-1，4-内酯氧化酶(ALO)、L-古洛糖酸-1，4-内酯氧化酶(GLO)，和醛糖糖酸内酯酶(AL)。
12.权利要求11的方法，其中LGDH酶与SEQ ID NO11至少有约70％的相似性；AGD酶与SEQ ID NO1或SEQ ID NO3至少有约70％的相似性；ARA酶与SEQ ID NO20至少有约70％的相似性；ALO酶与SEQ ID NO5或SEQ ID NO7至少有约70％的相似性；GLO酶与SEQ ID NO9至少有约70％的相似性；且AL酶与SEQ IDNO29至少有约70％的相似性。
13.权利要求11的方法，其中LGDH酶与SEQ ID NO11至少有约70％的一致性；AGD酶与SEQ ID NO1或SEQ ID NO3至少有约70％的一致性；ARA酶与SEQ ID NO20至少有约70％的一致性；ALO酶与SEQ ID NO5或SEQ ID NO7至少有约70％的一致性；GLO酶与SEQ ID NO9至少有约70％的一致性；AL酶与SEQ ID NO29至少有约70％的一致性。
14.权利要求11的方法，其中LGDH酶的编码区与SEQ ID NO12至少约有70％的一致性；AGD酶的编码区与SEQ ID NO2或SEQ IDNO4的核苷酸56-1858位至少约有70％的一致性；ARA酶的编码区与SEQ ID NO21的核苷酸285-1319位至少约有70％的一致性；ALO酶的编码区与SEQ ID NO6或SEQ ID NO8的核苷酸4-1584位至少约有70％的一致性；GLO酶的编码区与SEQ ID NO10的核苷酸24-1346位至少约有70％的一致性；AL酶的编码区与SEQ IDNO30至少约有70％的一致性。
15.权利要求11的方法，其中用ALO酶的编码区功能性转化酵母。
16.权利要求11的方法，其中用LGDH酶的编码区功能性转化酵母。
17.权利要求11的方法，其中用AGD酶的编码区功能性转化酵母。
18.权利要求17的方法，其中AGD酶包含信号肽。
19.权利要求17的方法，其中AGD酶不包含信号肽。
20.权利要求11的方法，其中用GLO酶的编码区功能性转化酵母。
21.权利要求11的方法，其中用AL酶的编码区动能性转化酵母。
22.权利要求11的方法，其中用ARA酶的编码区功能性转化酵母。
23.权利要求22的方法，其中ARA酶包含氨基酸序列GXRXXDXAXXXXXEXXXG(SEQ ID NO13)和GXXN(SEQ ID NO26)。
24.权利要求11的方法，其中编码区与在酵母中有活性的启动子连接。
25.权利要求24的方法，其中启动子是啤酒糖酵母的丙糖磷酸异构酶(TPI)启动子。
26.权利要求11的方法，其中编码区分离自拟南芥，啤酒糖酵母，褐家鼠，或运动发酵单孢菌。
27.权利要求26的方法，其中LGDH酶的编码区分离自拟南芥，ALO酶的编码区分离自啤酒糖酵母，AGD酶的编码区分离自拟南芥，ARA酶的编码区分离自啤酒糖酵母，GLO酶的编码区分离自褐家鼠，并且AL酶的编码区分离自运动发酵单孢菌。
28.权利要求11的方法，其中用与第一酶不同的第二酶的编码区功能性转化酵母，第二酶选自LGDH、AGD、ARA、ALO、GLO和AL。
29.权利要求28的方法，其中第二酶的编码区与在酵母中有活性的启动子连接。
30.权利要求29的方法，其中启动子是啤酒糖酵母的丙糖磷酸异构酶(TPI)启动子。
31.权利要求11的方法，其中重组酵母还包含至少一种酶的编码区，此酶与将碳源转化为L-半乳糖、L-古洛糖酸-1，4-内酯、或L-古洛糖酸相关。
32.权利要求7的方法，其中用第一酶的编码区功能性转化酵母，该编码区选自LGDH酶的编码区，它能与SEQ ID NO12所列多核苷酸的互补链杂交；AGD酶的编码区，它能与SEQ ID NO2所列多核苷酸的互补链或SEQ ID NO4的核苷酸56-1858位的互补链杂交；ARA酶的编码区，它能与SEQ ID NO21的核苷酸285-1319位所列多核苷酸的互补链杂交；ALO酶的编码区，它能与SEQ ID NO6所列多核苷酸的互补链或SEQ ID NO8的核苷酸4-1584位的互补链杂交；GLO酶的编码区，它能与SEQ ID NO10的核苷酸24-1346位的互补链杂交；或AL酶的编码区，它能与SEQ ID NO30所列多核苷酸的互补链杂交；且其中编码区和多核苷酸的互补链在严紧条件下杂交。
33.权利要求7的方法，其中用第一酶的编码区功能性转化酵母，该酶选自LGDH酶，它具有SEQ ID 11的酶的免疫属性；AGD酶，它具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的酶的免疫属性；ARA酶，它具有SEQ ID NO20的酶的免疫属性；ALO酶，它具有SEQ IDNO5序列或SEQ ID NO7的酶的免疫属性；GLO酶，它具有SEQ IDNO9的酶的免疫属性；和AL酶，它具有SEQ ID NO29序列的酶的免疫属性。
34.权利要求7的方法，其中抗坏血酸前体选自单糖、寡糖、多糖、C1-C6醇、C2-C6多元醇、有机酸、和C5-C6内酯。
35.权利要求7的方法，其中抗坏血酸前体选自海藻糖、棉子糖、乙醇、木糖、木酮糖、麦芽糖、甘油、果糖、阿拉伯糖、D-葡萄糖-6-磷酸、D-葡萄糖-1-磷酸、尿苷二磷酸-D-葡萄糖、尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸、D-葡萄糖醛酸-1-磷酸、D-葡萄糖醛酸、D-葡萄糖醛酸内酯、L-古洛糖酸、D-果糖-6-磷酸、D-甘露糖-6-磷酸、D-甘露糖-1-磷酸、鸟苷二磷酸-D-甘露糖、鸟苷二磷酸-L-半乳糖、L-半乳糖-1-磷酸、乳糖、蔗糖、淀粉、纤维素、柠檬酸盐、甲醇、甲醛、甲酸、甲胺、丙氨酸、油酸、L-半乳糖酸-1，4-内酯、D-葡萄糖、L-古洛糖酸-1，4-内酯、L-半乳糖、和L-古洛糖酸。
36.权利要求7的方法，其中抗坏血酸前体选自L-半乳糖酸-1，4-内酯、D-葡萄糖、L-古洛糖酸-1，4-内酯、L-半乳糖、和L-古洛糖酸。
37.权利要求7的方法，其中抗坏血酸前体也是重组酵母的碳源。
38.权利要求7的方法，其中分离步骤包括裂解酵母。
39.权利要求38的方法，其中分离步骤进一步包括离心、过滤、微量过滤、超滤、纳米过滤、液-液萃取、结晶、用核酸酶或蛋白酶处理、以及层析。
40.权利要求7的方法，其中培养步骤包括在培养基中积累高于背景水平的抗坏血酸。
41.权利要求40的方法，其中分离步骤包括层析、活性炭、微量过滤、超滤、纳米过滤、液-液萃取、结晶。
42.权利要求7的方法，其中培养步骤包括培养基中积累抗坏血酸的最终浓度至少约20mg/l。
43.权利要求7的方法，其中培养步骤包括培养基中积累抗坏血酸的最终浓度至少约40mg/l。
44.权利要求7的方法，其中培养步骤包括培养基中积累抗坏血酸的最终浓度至少约70mg/l。
45.权利要求7的方法，其中重组酵母能至少将25％的前体转变为抗坏血酸。
46.权利要求7的方法，其中重组酵母能至少将35％的前体转变为抗坏血酸。
47.权利要求7的方法，其中重组酵母能至少将40％的前体转变为抗坏血酸。
48.稳定培养基中的抗坏血酸或其盐的方法，包括在含抗坏血酸或其盐的培养基中培养酵母。
49.权利要求48的方法，其中在培养基中加入抗坏血酸或其盐。
50.权利要求48的方法，其中培养基中的抗坏血酸由酵母产生，其中酵母通过转变至少一种抗坏血酸前体为抗坏血酸而产生抗坏血酸，且其中培养基中含有抗坏血酸前体。
51.啤酒糖酵母，其中该啤酒糖酵母用L-半乳糖脱氢酶(LGDH)编码区功能性转化。
52.啤酒糖酵母，其中该啤酒糖酵母用D-阿拉伯糖脱氢酶(ARA)编码区功能性转化。
53.啤酒糖酵母，其中该啤酒糖酵母用L-半乳糖酸-1，4-内酯脱氢酶(AGD)编码区功能性转化。
54.啤酒糖酵母，其中该啤酒糖酵母用D-阿拉伯糖酸-1，4-内酯氧化酶(ALO)编码区功能性转化。
55.啤酒糖酵母，其中该啤酒糖酵母用L-古洛糖酸-1，4-内酯氧化酶(GLO)编码区功能性转化。
56.啤酒糖酵母，其中该啤酒糖酵母用AGD的编码区和LGDH的编码区功能性转化。
57.啤酒糖酵母，其中该啤酒糖酵母用ALO的编码区和LGDH的编码区功能性转化。
58.啤酒糖酵母，其中该啤酒糖酵母用ALO的编码区和ARA的编码区功能性转化。
59.啤酒糖酵母，其中该啤酒糖酵母用AL编码区功能性转化。
60.啤酒糖酵母，其中该啤酒糖酵母用AL的编码区和GLO的编码区功能性转化。
61.拜氏接合糖酵母，其中该拜氏接合糖酵母用LGDH编码区功能性转化。
62.拜氏接合糖酵母，其中该拜氏接合糖酵母用ARA编码区功能性转化。
63.拜氏接合糖酵母，其中该拜氏接合糖酵母用AGD编码区功能性转化。
64.拜氏接合糖酵母，其中该拜氏接合糖酵母用ALO编码区功能性转化。
65.拜氏接合糖酵母，其中该拜氏接合糖酵母用GLO编码区功能性转化。
66.拜氏接合糖酵母，其中该拜氏接合糖酵母用AGD编码区和LGDH的编码区功能性转化。
67.拜氏接合糖酵母，其中该拜氏接合糖酵母用ALO和LGDH的编码区功能性转化。
68.拜氏接合糖酵母，其中该拜氏接合糖酵母用ALO和ARA的编码区功能性转化。
69.拜氏接合糖酵母，其中该拜氏接合糖酵母用AL编码区功能性转化。
70.拜氏接合糖酵母，其中该拜氏接合糖酵母用AL编码区和GLO的编码区功能性转化。
71.重组酵母，其中用至少一种蛋白的编码区功能性转化该酵母，这些蛋白具有的酶活性选自L-半乳糖脱氢酶(LGDH)、L-半乳糖酸-1，4-内酯脱氢酶(AGD)、D-阿拉伯糖脱氢酶(ARA)、D-阿拉伯糖酸-1，4-内酯氧化酶(ALO)、L-古洛糖酸-1，4-内酯氧化酶(GLO)、醛糖糖酸内酯酶(AL)；且其中当酵母在含至少一种抗坏血酸前体的培养基中生长时，能够将至少25％的前体转变为抗坏血酸。
72.权利要求71的重组酵母，其中该酵母能在培养基中产生至少约20mg/l的抗坏血酸。
73.权利要求71的重组酵母，其中该酵母能在培养基中产生至少约40mg/l的抗坏血酸。
74.权利要求71的重组酵母，其中该酵母能在培养基中产生至少约7Omg/l的抗坏血酸。
75.权利要求71的重组酵母，其中该酵母能将至少约35％的前体转变为抗坏血酸。
76.权利要求71的重组酵母，其中该酵母能将至少约40％的前体转变为抗坏血酸。
77.权利要求71的重组酵母，其中该酵母用编码具LGDH活性的蛋白的编码区功能性转化。
78.权利要求71的重组酵母，其中该酵母用编码具AGD活性的蛋白的编码区功能性转化。
79.权利要求71的重组酵母，其中该酵母用编码具ARA活性的蛋白的编码区功能性转化。
80.权利要求71的重组酵母，其中该酵母用编码具ALO活性的蛋白的编码区功能性转化。
81.权利要求71的重组酵母，其中该酵母用编码具GLO活性的蛋白的编码区功能性转化。
82.权利要求71的重组酵母，其中该酵母用编码具AL活性的蛋白的编码区功能性转化。
83.权利要求71的重组酵母，其中该酵母用编码具ALO活性的蛋白的编码区功能性转化，且进一步用编码具LGDH活性的蛋白的编码区功能性转化。
84.权利要求71的重组酵母，其中该酵母用具ALO活性的蛋白的编码区和具ARA活性的蛋白的编码区功能性转化。
85.权利要求71的重组酵母，其中该酵母用具GLO活性的蛋白的编码区和具AL活性的蛋白的编码区功能性转化。
86.权利要求71的重组酵母，其中该酵母用具AGD活性的蛋白的编码区和具LGDH活性的蛋白的编码区功能性转化。
87.权利要求71的重组酵母，其中该酵母属于选自如下的属糖酵母属、接合糖酵母属、假丝酵母属、汉逊氏酵母属、克鲁维氏酵母属、德巴利氏酵母属、拿逊氏酵母属、油脂酵母属、球拟酵母属、克勒克氏酵母属、毕赤氏酵母属、裂殖糖酵母属、三角酵母属、酒香酵母属、隐球酵母属、丝孢酵母属、短柄霉属(Aureobasidium)，Phaffia，红酵母属、Yarrowia、和许旺氏酵母属。
88.权利要求87的重组酵母，其中该酵母属于如下种啤酒糖酵母，乳克鲁维氏酵母，或拜氏接合糖酵母。
89.权利要求71的重组酵母，其中具LGDH活性的蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO11有至少约70％的相似性；具AGD活性的蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO1或SEQ ID NO3有至少约70％的相似性；具ARA活性的蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO20有至少约70％的相似性；具ALO活性的蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO5或SEQID NO7有至少约70％的相似性；具GLO活性的蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO9有至少约70％的相似性；具AL活性的蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO29有至少约70％的相似性。
90.权利要求71的重组酵母，其中具LGDH活性的蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO11有至少约70％的一致性；具AGD活性的蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO1或SEQ ID NO3有至少约70％的一致性；具ARA活性的蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO20有至少约70％的一致性；具ALO活性的蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO5或SEQID NO7有至少约70％的一致性；具GLO活性的蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO9有至少约70％的一致性；且具AL活性的蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO29有至少约70％的一致性。
91.权利要求71的重组酵母，其中具LGDH活性的蛋白的核酸编码区与SEQ ID NO12有至少约70％的一致性；具AGD活性的蛋白的核酸编码区与SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的核苷酸56-1858位有至少约70％的一致性；具ARA活性的蛋白的核酸编码区与SEQ IDNO21的核苷酸285-1319位有至少约70％的一致性；具ALO活性的蛋白的核酸编码区与SEQ ID NO6或SEQ ID NO8的核苷酸4-1584位有至少约70％的一致性；具GLO活性的蛋白的核酸编码区与SEQID NO10的24-1346位有至少约70％的一致性；具AL活性的蛋白的核酸编码区与SEQ ID NO30有至少约70％的一致性。
92.权利要求71的重组酵母，其中编码区选自具LGDH活性的蛋白的编码区，该编码区能与SEQ ID NO12所列多核苷酸的互补链杂交；具AGD活性的蛋白的编码区，该编码区能与SEQ ID NO2所列多核苷酸的互补链或SEQ ID NO4的核苷酸56-1858位的互补链杂交；具ARA活性的蛋白的编码区，该编码区能与SEQ ID NO21的核苷酸285-1319位所列多核苷酸的互补链杂交；具ALO活性的蛋白的编码区，该编码区能与SEQ ID NO6所列多核苷酸的互补链或SEQID NO8的核苷酸4-1584位的互补链杂交；具GLO活性的蛋白的编码区，该编码区能与SEQ ID NO10的核苷酸24-1346位所列多核苷酸的互补链杂交；具AL活性的蛋白的编码区，该编码区能与SEQ IDNO30的所列多核苷酸的互补链杂交；且其中编码区与多核苷酸的互补链在严紧条件下杂交。
93.权利要求71的重组酵母，其中蛋白选自具有LGDH活性和SEQ ID 11酶的免疫属性的酶；具有AGD活性和SEQ ID NO1或SEQID NO3酶的免疫属性的酶；具有ARA活性和SEQ ID NO20酶的免疫属性的酶；具有ALO活性和SEQ ID NO5或SEQ ID NO7酶的免疫属性的酶；具有GLO活性和SEQ ID NO9酶的免疫属性的酶；具有AL活性和SEQ ID NO29酶的免疫属性的酶。
94.权利要求71的重组酵母，其中酵母用具有ARA酶活性的蛋白的编码区功能性转化，且其中该蛋白的氨基酸序列中含包括氨基酸序列GXRXXDXAXXXXXEXXXG(SEQ ID NO13)和GXXN(SEQ IDNO26)。
95.权利要求71的重组酵母，其中编码区域与在酵母中有活性的启动子功能性连接。
96.权利要求95的重组酵母，其中启动子是啤酒糖酵母的丙糖磷酸异构酶(TPI)启动子。
97.权利要求71的重组酵母，其中酵母用至少一种蛋白的编码区功能性转化，这种蛋白的酶活性与将碳源转变为L-半乳糖、L-古洛糖酸-1，4-内酯、或L-古洛糖酸有关。
98.生产抗坏血酸或其盐的方法，包括在含至少一种抗坏血酸前体的培养基中培养重组酵母由此获得抗坏血酸或其盐，该酵母能至少将25％的前体转变为抗坏血酸或其盐；和提取抗坏血酸或其盐。
99.权利要求98的方法，其中抗坏血酸前体选自单糖、寡糖、多糖、C1-C6醇、C2-C6多元醇、有机酸、和C5-C6内酯。
100.权利要求98的方法，其中抗坏血酸前体选自海藻糖、棉子糖、乙醇、木糖、木酮糖、麦芽糖、甘油、果糖、阿拉伯糖、D-葡萄糖-6-磷酸、D-葡萄糖-1-磷酸、尿苷二磷酸-D-葡萄糖、尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸、D-葡萄糖醛酸-1-磷酸、D-葡萄糖醛酸、D-葡萄糖醛酸内酯、L-古洛糖酸、D-果糖-6-磷酸、D-甘露糖-6-磷酸、D-甘露糖-1-磷酸、鸟苷二磷酸-D-甘露糖、鸟苷二磷酸-L-半乳糖、L-半乳糖-1-磷酸、乳糖、蔗糖、淀粉、纤维素、柠檬酸盐、甲醇、甲醛、甲酸、甲胺、丙氨酸、油酸、L-半乳糖酸-1，4-内酯、D-葡萄糖、L-古洛糖酸-1，4-内酯、L-半乳糖、和L-古洛糖酸。
101.权利要求98的方法，其中抗坏血酸前体选自L-古洛糖酸、L-半乳糖酸-1，4-内酯、D-葡萄糖、L-古洛糖酸-1，4-内酯、和L-半乳糖。
102.权利要求98的方法，其中分离步骤包括裂解酵母。
103.权利要求102的方法，其中分离步骤进一步包括离心、过滤、微量过滤、超滤、纳米过滤、液-液萃取、结晶、用核酸酶或蛋白酶处理、以及层析。
104.权利要求98的方法，其中培养步骤包括在培养基中以高于背景的水平积累抗坏血酸。
105.权利要求104的方法，其中分离步骤包括层析、活性炭、微量过滤、超滤、纳米过滤、液-液萃取、结晶。
106.权利要求98的方法，其中培养步骤包括在培养基中以最终浓度至少约20mg/l积累抗坏血酸。
107.权利要求98的方法，其中培养步骤包括在培养基中以最终浓度至少约40mg/l积累抗坏血酸。
108.权利要求98的方法，其中培养步骤包括在培养基中以最终浓度至少约70mg/l积累抗坏血酸。
109.权利要求98的方法，其中重组酵母能转变至少35％的前体为抗坏血酸。
110.权利要求98的方法，其中重组酵母能转变至少40％的前体为抗坏血酸。
111.权利要求98的方法，其中酵母属于选自如下的属糖酵母属、接合糖酵母属、假丝酵母属、汉逊氏酵母属、克鲁维氏酵母属、德巴利氏酵母属、拿逊氏酵母属、油脂酵母属、球拟酵母属、克勒克氏酵母属、毕赤氏酵母属、裂殖糖酵母属、三角酵母属、酒香酵母属、隐球酵母属、丝孢酵母属、短柄霉属、Phaffia、红酵母属、Yarrowia、和许旺氏酵母属。
112.权利要求111的方法，其中酵母属于如下啤酒糖酵母，乳克鲁维氏酵母，或拜氏接合糖酵母种。
113.权利要求98的方法，其中用至少一种蛋白的编码区功能性转化该酵母，这些蛋白具有的酶活性选自L-半乳糖脱氢酶(LGDH)、L-半乳糖酸-1，4-内酯脱氢酶(AGD)、D-阿拉伯糖脱氢酶(ARA)、D-阿拉伯糖酸-1，4-内酯氧化酶(ALO)、L-古洛糖酸-1，4-内酯氧化酶(GLO)、和醛糖糖酸内酯酶(AL)。
114.权利要求113的方法，其中酵母用具有ALO活性的蛋白编码区功能性转化且进一步用具LGDH活性的蛋白编码区功能性转化。
115.权利要求113的方法，其中酵母用两种蛋白的编码区功能性转化，它们分别具有ALO和ARA活性。
116.权利要求113的方法，其中酵母用两种蛋白的编码区功能性转化，它们分别具有GLO和AL活性。
117.权利要求113的方法，其中酵母用具有AGD活性的蛋白编码区功能性转化且进一步用具LGDH活性的蛋白编码区功能性转化。
118.权利要求113的方法，其中有AGD活性的蛋白包含信号肽。
119.权利要求113的方法，其中有AGD活性的蛋白不包含信号肽。
120.权利要求113的方法，其中具LGDH活性的蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO11有至少约70％的相似性；具AGD活性的蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO1或SEQ ID NO3有至少约70％的相似性；具ARA活性的蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO20有至少约70％的相似性；具ALO活性的蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO5或SEQ IDNO7有至少约70％的相似性；具GLO活性的蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO9有至少约70％的相似性；具AL活性的蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO29有至少约70％的相似性。
121.权利要求113的方法，其中具LGDH活性的蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO11有至少约70％的一致性；具AGD活性的蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO1或SEQ ID NO3有至少约70％的一致性；具ARA活性的蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO20有至少约70％的一致性；具ALO活性的蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO5或SEQ IDNO7有至少约70％的一致性；具GLO活性的蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO9有至少约70％的一致性；具AL活性的蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO29有至少约70％的一致性。
122.权利要求113的方法，其中具LGDH活性的蛋白的核酸编码区与SEQ ID NO12有至少约70％的一致性；具AGD活性的蛋白的核酸编码区与SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的核苷酸56-1858有至少约70％的一致性；具ARA活性的蛋白的核酸编码区与SEQ ID NO21的285-1319有至少约70％的一致性；具ALO活性的蛋白的核酸编码区与SEQ ID NO6或SEQ ID NO8的4-1584有至少约70％的一致性；具GLO活性的蛋白的核酸编码区与SEQ ID NO10的24-1346有至少约70％的一致性；具AL活性的蛋白的核酸编码区与SEQ IDNO30有至少约70％的一致性。
123.权利要求113的方法，其中编码区选自具LGDH活性的蛋白的编码区，其能与SEQ ID NO12所列多核苷酸的互补链杂交；具AGD活性的蛋白的编码区，其能与SEQ ID NO2寡聚核苷酸的互补链或SEQ ID NO4的核苷酸56-1858位的互补链杂交；具ARA活性的蛋白的编码区，其能与SEQ ID NO21的核苷酸285-1319位的互补链杂交；具ALO活性的蛋白的编码区，其能与SEQ ID NO6所列多核苷酸的互补链或SEQ ID NO8的核苷酸4-1584位的互补链杂交；具GLO活性的蛋白的编码区，其能与SEQ ID NO10的核苷酸24-1346位的互补链杂交；具AL活性的蛋白的编码区，其能与SEQ ID NO30所列多核苷酸互补链杂交；且其中编码区与多核苷酸的互补链在严紧条件下杂交。
124.权利要求113的方法，其中蛋白选自具有LGDH活性和SEQ ID 11酶的免疫属性的酶；具有AGD活性和SEQ ID NO1或SEQID NO3酶的免疫属性的酶；具有ARA活性和SEQ ID NO20酶的免疫属性序列的酶；具有ALO活性和SEQ ID NO5或SEQ ID NO7酶的免疫属性的酶；具有GLO活性和SEQ ID NO9酶的免疫属性的酶；具有AL活性和SEQ ID NO29酶的免疫属性的酶。
125.权利要求113的方法，其中酵母用具有ARA酶活性的蛋白的编码区功能性转化，且其中该蛋白的氨基酸序列中含包括如下氨基酸序列GXRXXDXAXXXXXEXXXG(SEQ ID NO13)和GXXN(SEQ IDNO26)。
126.权利要求113的方法，其中编码区与在酵母中有活性的启动子功能性连接。
127.权利要求126的方法，其中启动子是啤酒糖酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)启动子。
128.权利要求113的方法，其中酵母用至少一种蛋白的编码区进一步功能性转化，这种蛋白的酶活性与将碳源转变为L-半乳糖、L-古洛糖酸-1，4-内酯、或L-古洛糖酸有关。
129.生产抗坏血酸的方法，包括在含有抗坏血酸前体的培养基中培养克鲁维氏酵母或接合糖酵母属酵母，由此形成抗坏血酸，和分离抗坏血酸。
130.重组酵母，其中用至少一种蛋白的编码区功能性转化该酵母，这些蛋白具有的酶活性选自L-半乳糖脱氢酶(LGDH)、L-半乳糖酸-1，4-内酯脱氢酶(AGD)、D-阿拉伯糖脱氢酶(ARA)、D-阿拉伯糖酸-1，4-内酯氧化酶(ALO)、L-古洛糖酸-1，4-内酯氧化酶(GLO)、和醛糖糖酸内酯酶(AL)；且其中当酵母在含至少一种抗坏血酸前体的培养基中生长时，每升培养基至少能够产生约20毫克抗坏血酸。
131.生产抗坏血酸及其盐的方法，包括在含至少一种抗坏血酸前体的培养基中培养能将抗坏血酸前体转化为抗坏血酸或其盐的重组酵母，由此获得抗坏血酸或其盐，该酵母能产生至少约20mg抗坏血酸/L培养基；和分离抗坏血酸或其盐。
全文摘要
在此公开从酵母中生产抗坏血酸的方法。在一种实施方案中，酵母为接合糖酵母属或者克鲁维氏酵母属，其培养于含有抗坏血酸前体的培养基中。第二种实施方案中，将重组酵母培养在含抗坏血酸前体的培养基内。优选地，重组酵母用酶的编码区转化而得到，该酶选自L－半乳糖脱氢酶(LGDH)、L－半乳糖酸－1，4－内酯脱氢酶(AGD)、D－阿拉伯糖脱氢酶(ARA)、D－阿拉伯糖酸－1，4内酯氧化酶(ALO)、L－古洛糖酸－1，4－内酯氧化酶(GLO)、和醛糖糖酸内酯酶(AL)。优选的抗坏血酸前体是D－葡萄糖、L－半乳糖、L－半乳糖酸－1，4－内酯、L－古洛糖酸－1，4－内酯、或L－古洛糖酸。在另一优选的实施方案中，培养基中积累的抗坏血酸量远高于背景水平。优选，这种酵母至少能将约25％的抗坏血酸前体转变成L－抗坏血酸。
文档编号C12N15/53GK1484708SQ01814790
公开日2004年3月24日 申请日期2001年8月2日 优先权日2000年8月2日
发明者D·泊罗, M·萨尔, D 泊罗 申请人:比奥波罗有限合伙公司