专利名称：蔗糖合成酶的基因表达在植物组织中的修饰及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及到对植物体内的靶基因表达进行修饰，以在该植物体内获得所需的效果。
背景技术：
蔗糖合成酶(SuSy)在包括谷物和果类在内的所有植物积存组织(sink tissue)的蔗糖降解中均是一种关键的酶，并且在多种植物体内被广泛地研究。然而，该蛋白和基因近来才刚刚从棉花中进行了鉴定。全长的(2625bp)棉花蔗糖合成酶(SuSy)由Perez-Grau，L和Delmer，D于1996年5月在加州大学戴维斯分校进行了分离(获取号U73588)。同一cDNA在5’末端缺失595bp的一个2030bp片段由同一小组在1994年进行了分离并且被提供给了USDA/ARS的Prem Chourey以用于合作研究。但是，在当时没有证据涉及到该SuSy基因在棉花纤维/种子发育中的作用，尽管据推测(Amor et al.，1995)定位于纤维的部分SuSy可能同纤维素合成酶相结合以发挥碳同该酶之间的通道作用。
已有证据表明SuSy基因的表达不仅对于纤维素的合成很重要，而且对于纤维细胞的发生亦是如此(由此可以控制绒毛(fuzz))，并且提出了一种关于蔗糖在纤维、种皮和胚之间如何进行分配和竞争的模型(Ruan et al 1997 Plant Physiol.915，375-385；Ruan andChourey 1998 Plant Physiol.118，399-406)。更近一段时间以来，本发明者获得了进一步的证据，该证据所支持的假说认为在将蔗糖固定化于原始的纤维细胞的过程中SuSy发挥了重要作用(Ruan et al.，2000 Aust.J.Plant Physiol.27，795-800)。
因此，本领域缺乏提供一些方法和手段，这些方法和手段用于在植物体内，特别是在棉花内，通过在植物细胞内改变蔗糖合成酶而改变纤维发育和特性。本发明者证明，通过修饰SuSy基因表达，特别是通过在转基因棉花内修饰SuSy表达而对一种或者多种纤维特征以及/或者纤维含量进行改进是有可能的。
根据在后文的不同实施方案和权利要求中的描述，解决了这些和其它一些问题。
在本说明书全文内，除非上下文另外需要，词语“包括”应被理解为意指对所述的元件、整数或者步骤的涵盖或者对元件、整数或者步骤的群体的涵盖，但并非排除任何其它的元件、整数或者步骤或者件、整体或者步骤的群体。
发明概述本发明提供了一种方法，该方法用于改变产纤维植物的纤维发育或特性，在优选的情况下该植物为一种棉花作物，例如fribremax品种的棉花，特别是FibermaxTM品种的棉花，所述的方法包括的步骤有提供具有嵌合基因的所述植物的细胞，该嵌合基因包括以下一些经可操作连接的DNA片段一种植物可操作启动子，在优选的情况下为地三叶矮化病毒启动子；一个编码区域，该区域在转录时产生一种RNA，所述的RNA能够降低内源蔗糖合成酶基因的表达，在优选的情况下该内源蔗糖合成酶基因在纤维细胞中表达，优选的情况下该纤维细胞为纤维原始细胞，或者该RNA能够被翻译成为一种活性的蔗糖合成酶蛋白；以及在植物细胞中起作用的转录终止和聚腺苷酸化信号。
在该RNA能够被翻译成为一种活性的蔗糖合成酶蛋白的实施方案中，优选的编码区域包括一种核苷酸序列，该核苷酸序列选自(a)编码一种多肽的核苷酸序列，该多肽含有SEQ ID NO2的氨基酸序列；(b)一种核苷酸序列，该核苷酸序列含有SEQ ID NO1的核苷酸序列；(c)一种核苷酸序列，该序列同(a)或(b)的核苷酸序列具有至少70％的序列同一性；以及(d)一种核苷酸序列，该序列在严格的条件下同(a)或(b)的互补序列杂交；以及(e)从(a)到(d)的任何一项的核苷酸的片段，该片段编码一种活性蔗糖合成酶。
在该RNA能够降低内源蔗糖合成酶基因的表达的实施方案中，优选的编码区域含有一种核苷酸序列，该序列选自(a)一种核苷酸序列，该序列中有至少约19或者25个连续的核苷酸与编码含有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列或其互补序列具有至少70％的同一性该多肽；(b)一种核苷酸序列，该核苷酸序列中有至少约19或者25个连续的核苷酸与编码含有SEQ ID NO1的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列或其互补序列具有至少70％的同一性该多肽。更特别的情况下，该编码区域含有SEQ ID NO1中从约2208位到约2598位的核苷酸序列或其互补序列。该编码序列可能同时含有有义和反义核苷酸序列，这些序列能够形成一种双链RNA分子。
本发明的另一个目的为提供一个方法，该方法用于在产纤维植物中提高纤维产量，该方法包括的步骤有提供一种嵌合基因给所述植物的细胞，该嵌合基因含有以下一些经可操作连接的DNA片段(a)一种植物可操作启动子；(b)一个DNA区域，该区域能够被翻译成为一种活性蔗糖合成酶蛋白；以及(c)在所述的植物细胞中起作用的转录终止和聚腺苷酸化信号。
本发明还提供了一种方法，该方法用于在产纤维植物中改善纤维质量，该方法包括的步骤有提供一种嵌合基因给所述植物的细胞，该嵌合基因含有以下一些经可操作连接的DNA片段(a)一种植物可操作启动子；(b)一个DNA区域，该区域能够被翻译成为一种活性蔗糖合成酶蛋白；以及(c)在所述的植物细胞中起作用的转录终止和聚腺苷酸化信号。
在本发明的另一个实施方案中提供了一种方法，该方法用于在产纤维植物中提高种子大小，该方法包括的步骤有，提供一种嵌合基因给所述植物的细胞，该嵌合基因含有以下一些经可操作连接的DNA片段(a)一种种子特异性启动子；(b)一个DNA区域，该区域能够被翻译成为一种活性蔗糖合成酶蛋白；以及(c)在所述的植物细胞中起作用的转录终止和聚腺苷酸化信号。
本发明还涉及到一种产纤维植物，特别是棉花作物，该植物在其基因组中含有一种嵌合DNA，该嵌合DNA包括以下一些经可操作连接的DNA片段(a)一种植物可操作启动子；(b)一个编码区域，该区域在转录时产生一种RNA，所述的RNA能够降低内源蔗糖合成酶基因的表达，在优选的情况下该内源蔗糖合成酶基因于纤维细胞中表达，优选的情况下该纤维细胞为纤维原始细胞，或者该RNA能够被翻译成为一种活性的蔗糖合成酶蛋白；以及(c)在植物细胞中起作用的转录终止和聚腺苷酸化信号。
本发明的另一个目的在于提供一种产纤维植物，该植物含有本发明的一种嵌合DNA，其中所述的DNA经转录产生的RNA能够提高一种内源蔗糖合成酶基因的表达，在优选的情况下该内源蔗糖合成酶基因于纤维细胞中表达，优选的情况下该纤维细胞为纤维原始细胞，并且所述的纤维细胞同不含有所述的嵌合DNA的植物细胞中的纤维细胞相比较具有提高的蔗糖合成酶活性。
本发明的另一个目的在于提供一种产纤维植物，该植物含有本发明的一种嵌合DNA，其中所述的DNA经转录产生的RNA能够被翻译成为一种活性蔗糖合成酶蛋白，由此在该植物中使蔗糖合成酶的水平相对于不含所述的嵌合DNA的植物有所提高。在优选的情况下该活性蔗糖合成酶于纤维细胞中表达，更为优选的情况下该纤维细胞为纤维原始细胞，其中所述的纤维细胞在优选的情况下同不含有所述的嵌合DNA的植物中的纤维细胞相比较具有较高的蔗糖合成酶活性。
在本发明的另一个实施方案中，所提供的产纤维植物含有本发明的一种嵌合DNA，其中所述的编码区域含有一种核苷酸序列，该序列选自(a)编码一种多肽的核苷酸序列，该多肽含有SEQ ID NO2的氨基酸序列；(b)一种核苷酸序列，该核苷酸序列含有SEQ ID NO1的核苷酸序列；(c)一种核苷酸序列，该序列同(a)或(b)的核苷酸序列具有至少70％的序列同一性；以及(d)一种核苷酸序列，该序列在严格的条件下同(a)或(b)的核苷酸序列杂交；以及(e)从(a)到(d)的任何一项的核苷酸的片段，该片段编码一种活性蔗糖合成酶。
本发明还提供了一种产纤维植物，该植物含有本发明的嵌合DNA，其中所述的嵌合DNA编码一种RNA，该RNA能够降低内源蔗糖合成酶基因的表达，由此而使所述的纤维细胞同并不含有所述的嵌合DNA的植物细胞的纤维细胞相比具有降低的蔗糖合成酶活性，在特别情况下其中该编码区域含有一种核苷酸序列，该核苷酸序列选自(a)一种核苷酸序列，该序列中有至少约19或者25个连续的核苷酸与编码含有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列或其互补序列具有至少70％的同一性该多肽；(b)一种核苷酸序列，该核苷酸序列中有至少约19或者25个连续的核苷酸与编码含有SEQ ID NO1的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列或其互补序列具有至少70％的同一性该多肽。更特别的情况下，该编码区域含有SEQ ID NO1中从约2208位到约2598位的核苷酸序列或其互补序列。该编码序列可能同时含有有义和反义核苷酸序列，这些序列能够形成一种双链RNA分子。
所提供的还有成纤维植物的种子，在优选的情况下为一种棉花作物的种子，该种子含有本发明的嵌合DNA或基因，所提供的还有从这些植物中分离的发育或特性有所改变的纤维。
本发明还涉及到一种编码蔗糖合成酶的核苷酸序列在改变纤维产量或纤维质量或者纤维特性中的用途。
附图简述
图1为一幅照相图，该图显示SuSy在纤维中的下调在转基因植物中导致了纤维延伸的减少。所示为野生型(WT)和带有反义SuSy基因构建体的转基因(SuSy/A)棉花的棉铃和种子的横切面。示出了三个发育阶段开花后的第0、2和6天。这些数据在转基因品系中显示出纤维的减少，特别是开花后(DAA)第2天或更晚的样品。
图2为免疫组织化学染色的照相图，所示为SuSy在野生型(WT)棉花(A)以及转基因品系291-147(B)和295-82(C)中的定位。在野生型(WT)植物的胚珠表面和胚珠上皮的发育纤维细胞中的黑色形成显现了SuSy蛋白。转基因品系表现出SuSy蛋白量的降低(减低的黑色形成)。在品系295-82中未检测出SuSy蛋白。这种降低的SuSy蛋白同转基因品系中纤维发育的缺乏正相关。
图3为来自野生型(WT)棉花和带有反义SuSy基因构建体的转基因品系294-147的棉铃(左)和种子(右)的照相图，该转基因品系在胚中具有降低的SuSy蛋白(上部的棉铃和种子)。来自转基因品系的种子无纤维，但在标记为III的种子的种子大小有很大的减少。
图4为野生型棉花作物(图左)以及两种转化棉花品系(图中和图右的植物)的照相图。这些数据显示该转基因对于植物的营养性生长没有可检测的表型影响。
图5为一种反义基因构建体(上部)和一种共抑制基因构建体(下部)的图示，该构建体被用于在植物体内抑制SuSy基因的表达。基因构建体成分如下nptII，用于转化子选择的新霉素磷酸转移酶标记基因；S1和S7分别为地三叶矮化病毒启动子1和7(见澳大利亚专利号No 689311)；S3和S5分别为地三叶矮化病毒基因终止子序列3和5(见澳大利亚专利号No 689311)；SuSy，一种蔗糖合成酶-编码cDNA(GenBank获取号U73588)从CTGGGAT到TGACTT的390bp核苷酸序列(即，终止子上游的211bp的编码区域加上176bp的3’-非翻译(UTR)区域；SEQ ID NO1的2208位到2598位的核苷酸)。箭头标示了这些片段相对于其在所来源的基因中的天然方向的定向。
图6为Southern印迹杂交的照相图拷贝，所示为野生型棉花作物和转基因棉花品系中的SuSy基因拷贝。这些DNA分离自T0代植物(A)以及来自于命名为14和4的初级转化品系的T1代植物的一个分离群(B)。箭头所示为具有无纤维或者纤维减少的表型的T0代的品系14、8和4(A)，以及具有无纤维或者纤维减少的表型的T1植物分离群中的品系14-1、14-2、14-3和4-3(B)。数字显示的是这些个体植物所来自的转基因棉花品系。
图7为野生型棉花(A)的胚珠上皮的扫描电子显微镜(SEM)特征的照相图以及示于图2B的品系294-147(B和C)的胚珠上皮的扫描电子显微镜(SEM)特征的照相图。同野生型植物相比较在转基因品系中许多纤维细胞呈萎陷状和/或皱缩状。尽管在转基因品系中出现了一些纤维细胞，但这些细胞同野生型胚珠相比在大小上小很多并且在数量上较为稀少(比较A和B)。该转基因品系的皱缩和/或萎陷表型在高倍放大下被清晰地展现(C)。
图8、9和10表示在来自三个T1代品系(品系147、43和101)以及品系82和野生型(WT)的10个分离个体的三日龄种子中SuSy活性(图8)和纤维长度的减少(图9)的改变的相关性。图10为SuSy活性和纤维长度之间的回归分析。
图8显示了同野生型植物相比较转基因品系的修饰的SuSy活性(横坐标)。植物品系示于x-轴上。误差柱为来自T1代品系的10个分离个体的三日龄的种子的测定的SEM。
图9的图示显示了同野生型植物相比较转基因品系的变化的纤维长度(纵坐标)。植物品系示于x-轴上。误差条柱为来自T1代品系的10个分离个体的三日龄的种子的分析SEM。
图10为图8的SuSy活性数据(x-轴)以及图9的纤维长度数据(纵坐标)之间的回归分析的图示。数据在所示范围显示了SuSy活性以及纤维长度的强相互关系(R2＝0.98)。
图11为显示了野生型棉花(A)和转基因品系147#2(B)的种子中的绒毛纤维长度的照相图，并且该图显示了转基因品系中的绒毛减少。数据显示SuSy基因表达的降低减少了绒毛。通过手工对种子进行去绒。卵形部分为成熟种子的合点端。来自转基因品系的种子同野生型种子相比在外观上褐色更重，这是因为同野生型种子相比覆盖下部的褐色种皮的绒毛纤维更短。
发明详述在第一方面，本发明提供了一种植物，该植物具有蔗糖合成酶(SuSy)的一种同工型的变化的表达，这导致了变化的纤维、果实或者种子产生能力。
在优选的情况下，该植物为一种转基因植物，该转基因植物具有某种SuSy同工型的表达不足或者过表达，该SuSy参与了果实/种子的产生。在一种优选的形式中，该植物在发育营养组织期间保持了SuSy的表达，从而使该植物的生长和发育未受不良影响。
当一种参与果实/种子产生的SuSy同工型的表达在植物中被降低时，优选地在种子中被降低，更优选在产生纤维的细胞中被降低，更优选在纤维原始细胞中被降低时，该植物具有了一种减低的纤维和/或种子产生。
当一种参与果实/种子产生的SuSy同工型的表达在植物中被增强(即SuSy过表达)时，优选地在种子中被增强，更优选在产生纤维的细胞中被增强，更优选在纤维原始细胞中被增强时，该植物具有了一种增强的纤维和/或种子产生。
导致参与果实/种子产生的SuSy同工型的表达不足的能力可被用于开发一些产生少量或者不产生种子但仍能够正常生长并且产生果实的植物。导致参与果实/种子产生的SuSy同工型的过表达的能力可被用于开发一些植物，这些植物产生较多量纤维或者较长的纤维或者具有改变的纤维结构，但这些植物仍能够正常生长和发育。该植物可以为任何一种在果实/种子产生中涉及到某种SuSy同工型的表达的植物。本发明适用于对广泛的园艺作物进行改进，例如葡萄、桃、梨和苹果。在更优选的情况下，该植物为一种棉花作物。
在一个优选的实施方案中，提供了一些植物，特别是棉花作物，这些植物含有一种嵌合基因，在优选的情况下该嵌合基因稳定地整合入这些植物的基因组中，该嵌合基因含有以下经可操作地连接的DNA片段a)一个植物可操作启动子b)一个编码区域，该区域在转录时产生一种RNA，该RNAi)能够降低一种内源蔗糖合成酶基因的表达，在优选的情况下该基因为一种在纤维原始细胞中表达的内源合成酶基因；或者ii)能够翻译为一种活性蔗糖合成酶蛋白；以及c)在植物细胞中起作用的转录终止和聚腺苷酸化信号。
由ii)所定义的编码区域的一个特别优选的实施方案为含有一种核苷酸序列的编码区域，该核苷酸序列编码一种蛋白质，该蛋白质含有SEQ ID NO2的氨基酸，特定情况下该核苷酸序列为SEQ ID NO1的核苷酸序列，或者该核苷酸序列为能够翻译为一种功能性的蔗糖合成酶的核苷酸序列的片段。编码蔗糖合成酶活性的编码区域可来自于其它植物种类或者其它物种(如本申请其它部分所示)，例如，来自于马铃薯(cDNA可获自Genbank文库，获取号M18745)。
由i)所定义的编码区域的一个特别优选的实施方案为含有编码一种多肽的核苷酸序列的互补序列(“反义”)，该多肽由SEQ ID NO1的核苷酸序列的2208位到2598位核苷酸所编码，在特定的情况下该编码区域含有SEQ ID NO1的核苷酸序列的2208位到2598位核苷酸。
本文所使用的术语“编码区域”应取意为能够被转录为一种生物活性RNA的DNA序列，无论所述的DNA序列是否编码一种氨基酸序列均可。在本文中，生物活性RNA包括能够在靶细胞中诱导某种生物效应的RNA，例如能够引发转录后基因沉默的反义或者有义RNA，或一种核酶等等。
生物活性RNA还包括能够翻译为一种多肽或者蛋白的RNA。
经过阅读这些优选的实施方案，本领域的技术人员将立即认识到所提及的编码区域的功能性等价物可被用于类似的作用。
能够被转录为可降低某种内源蔗糖合成酶基因的表达的RNA的编码区域的功能等价物包括，例如，同上述的核苷酸序列相比较短的反义片段。
该反义核苷酸序列的长度可介于约10个核苷酸(nt)或19nt直至等长于(在核苷酸数量上将)该靶核酸(即，全长蔗糖合成酶基因)。在优选的情况下，该反义核苷酸序列的全长至少为10nt，优选15nt或者19nt，更优选至少约50nt，更优选至少约100nt，更优选至少为约150nt，更优选200nt，尤优选500nt。不同于该靶核酸的总长度，该反义核苷酸序列的总长度预计没有上限。但是，由于实践的原因(例如嵌合基因的稳定性)，预期该反义核苷酸序列的长度不应超过5000nt，并且在优选的情况下应不超过2500nt。反义核酸的长度方便地限制于约1000nt。
可以理解，反义核苷酸序列的全长越长，总反义核苷酸序列同靶蔗糖合成酶基因中相应的互补序列之间的序列同一致所需的严格性将变得越低。
在优选的情况下，该总反义核苷酸序列应同相应的靶序列的互补序列具有至少75％的同一性，在特定的情况下具有至少约80％的同一性，更为特定的情况下具有至少约85％的同一性，更为特定的情况下具有约90％的同一性，尤为特定的情况下具有约95％的同一性，更特定的情况下具有约100％的同一性，更甚的情况下与该靶核酸的相应部分的互补序列相同。但是，优选的情况下该反义核苷酸序列总是包括与该靶核酸的相应部分的互补序列具有100％序列同一性的约10个连续核苷酸的序列，特定的情况下约19或20nt，更为特定的情况下约50nt，更特定的情况下约100nt，尤为特定的情况下150nt。在优选的情况下，为计算该序列的同一性并且设计相应的反义序列，空位的数量应被降至最低，特别是对于较短的反义序列。
特别优选的是同SEQ ID NO1的核苷酸序列的相应部分的互补序列具有至少约75％的同一性的反义核苷酸序列，在优选的情况下该同一性至少为约80％；在特定的情况下该同一性至少为约85％；尤为特定的情况下该同一性为至少约90％，尤其是该同一性为至少约95％。
出于本发明的目的，以百分比进行表示的两种相关的核苷酸和氨基酸序列的“序列同一性”指的是在两个经最优比对的序列中具有相同残基的位点数(×100)除以被比较的位点数。空位是指，比对中的一个位点，该位点上的残基存在于一个序列但并不存在于另一个序列中，该空位被视作为非相同残基的位点。两序列之间的比对通过Needleman与Wunsch算法进行(Needleman与Wunsch，1970)。计算机辅助的序列比对可以使用标准软件程序方便地进行，例如GAP，该程序是Wisconsin软件10.1版(Genetics Computer Group，Madison，Wisconsin，USA)的一部分，使用缺省的评分矩阵，其中一个空位的产生扣除50，一个空位的延伸扣除3。
毋庸多言，这些有义片段也可被用于降低一种内源蔗糖合成酶基因的表达，并且与针对反义分子描述的相同的关于长度和序列同源性的实施方案加以必要的变动也适用于这些有义分子。
特别适用于降低一种内源蔗糖合成酶基因的表达的DNA区域在转录时产生包括有义和反义序列的所谓双链RNA分子，如WO99/53050中所述(在此全文引为参考)，在优选的情况下该DNA区域处于一种植物可操作启动子的控制之下。在这一特定的情况下，一种嵌合基因可由此而被引入一种植物细胞，该植物细胞含有一种植物可操作启动子，该启动子同一个DNA区域可操作地连接，使得该DNA区域含有编码区域的一部分，该部分含有来自编码蔗糖合成酶蛋白的核酸的编码区域的至少10或者19个连续的核苷酸，该蔗糖合成酶蛋白的例子如，但不限于，一种具有SEQ ID NO1(所谓的有义部分)的氨基酸序列，该DNA区域还含有一个DNA序列，该序列至少含有该有义部分的至少10或者19个核苷酸的互补DNA序列，但也可能同该有义部分完全互补(所谓的反义部分)。该嵌合基因可含有额外的区域，例如在植物中起作用的转录终止和聚腺苷酸化信号。在转录时可产生一个RNA，该RNA可在该有义和反义区域的互补部分之间形成一种双链RNA茎干。在有义和反义核苷酸序列之间可以存在一个间隔区域。该嵌合基因可进一步含有一种内含子序列，在优选的情况下该内含子序列位于间隔区域内。
能够经转录为能够翻译成为一种活性蔗糖合成酶的RNA的编码区域的功能等价物包括源自蔗糖合成酶基因的突变体或者等位形式，特别是源自在纤维原始细胞中活跃表达的蔗糖合成酶基因的突变体或者等位形式。
产生突变体，例如产生蔗糖合成酶基因突变体，特别是产生编码SEQ ID NO2的蛋白的蔗糖合成酶基因的突变体，更特别是产生含有SEQ ID NO1的核苷酸序列的蔗糖合成酶基因的突变体的方法，即这样的一种位点特异性诱变方法在本领域中众所周知，同样为人所熟知的还有对由该突变体序列所编码的活性蔗糖合成酶基因进行鉴定的分析方法。
编码蔗糖合成酶的核苷酸序列的等位变体可通过严格条件下的文库杂交进行鉴定，例如不同品种或植物品系的cDNA或者基因组文库，特别是棉花品种和植物品系。同编码SEQ ID NO2的氨基酸序列的核苷酸序列或者SEQ ID NO1的核苷酸序列或它们的一个足够大的片段(在优选的情况下约25个连续的核苷酸，特定情况下至少约50个连续的核苷酸，更为特定的情况下至少约100个连续的核苷酸)在严格条件下杂交，并且编码一种具有蔗糖合成酶活性的功能性蛋白的核苷酸序列是上述的优选的编码区域的功能性等价物。这样的核苷酸也可使用例如多聚酶链反应扩增来加以鉴定和分离，该多聚酶链反应扩增使用一对适当的寡核苷酸，这些寡核苷酸具有SEQ ID NO1的至少约25个连续的核苷酸，在特定情况下具有至少约50个连续的核苷酸，更为特定的情况下具有至少约100个连续的核苷酸。
本文所使用的“严格的杂交条件”意指杂交一般在探针和靶序列之间具有至少95％的序列同源性，在优选的情况下具有至少97％的序列同源性的情况下才发生。严格杂交条件的例子为在一种含有50％的甲酰胺，5×SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH7.6)，5×Denhardt’s溶液，10％的硫酸葡聚糖以及20μg/ml的变性剪切载体DNA的溶液中孵育过夜，随后在0.1×SSC中于约65℃下洗涤该杂交支持物，所述的载体DNA的例子如鲑鱼精子DNA。其它杂交和洗涤条件是公知的并且在Sambrook等人的Molecular CloningA LaboratoryManual，第二版，Cold Spring Harbor，MY(1989)中有所例示，具体见11章。
以下为Genbank文库中的核苷酸序列的获取号，这些核苷酸序列为植物蔗糖合成酶基因、其部分或者同这些蔗糖合成酶基因具有序列相似性的核苷酸序列，这些序列可能被本文所描述的方法所使用BM094593(大豆)BM093753(大豆)BM093158(大豆)BM092695(大豆)BM092443(大豆)BM092322(大豆)BM085310(大豆)BM085020(大豆)AY059416(玉米)AF273253(甜菜)L39940(水稻)AJ316590(点形念珠藻)AJ316589(点形念珠藻)AJ316596(鱼腥藻)AJ316595(鱼腥藻)AJ316584(鱼腥藻)BM005654(番红花)BI973032(大豆)BI971794(大豆)AF367450(桃)BI945506(大豆)BI944973(大豆)AF420224(番木瓜)BI788449(大豆)Bo1788359(大豆)BI787127(大豆)BI787033(大豆)BI787000(大豆)BI786823(大豆)BI784933(大豆)BI784627(大豆)BI700214(大豆)BI699934(大豆)BI699923(大豆)BI699585(大豆)BI543240(Sugar beet)BI498340(大豆)BI471463(大豆)BI427241(大豆)BI427174(大豆)BI427022(大豆)BI426915(大豆)AF393809(芹)BI321173(大豆)BI320832(大豆)BI316894(大豆)BI316826(大豆)BI316405(大豆)BI315949(大豆)BI203222(番茄)BI176503(马铃薯)BG273882(Grapeberries)AY034958(拟南芥)AF378187(水稻)BG790580(大豆)BG790079(大豆)BG726150(大豆)BG654021(大豆)BG653916(大豆)BG653624(大豆)BG652711(大豆)BG652507(大豆)BG649914(大豆)BG649831(大豆)AJ309093(南欧海松)BG507656(大豆)BG405632(大豆)BG405474(大豆)BG405204(大豆)BG405017(大豆)BG363730(大豆)BG362638(大豆)BG359764(大豆)BG359452(大豆)BG359307(大豆)AJ311496(豌豆)BG239317(大豆)BG237287(大豆)BG157592(大豆)BG155900(大豆)BG047402(大豆)BG046717(大豆)BG046686(大豆)BG046043(大豆)BG043243(大豆)BG042159(大豆)BG041814(大豆)AB045710(梨)BF597682(大豆)BF597330(大豆)BF597258(大豆)BF595837(大豆)BF595646(大豆)BF425609(大豆)BF423725(大豆)BF324657(大豆)BF154308(马铃薯)BF154187(马铃薯)BF154037(马铃薯)BF153500(马铃薯)BF153341(马铃薯)BF153335(马铃薯)BF153307(马铃薯)BF097021(番茄)BF070782(大豆)BF070666(大豆)BF070277(大豆)BF070188(大豆)BF068815(大豆)BF071174(大豆)BF067110(大豆)BF009756(大豆)BE806119(大豆)BE805996(大豆)BE805178(大豆)BE800976(大豆)BE800941(大豆)BE800227(大豆)BE611805(大豆)BE611493(大豆)BE610447(大豆)BE610325(大豆)BE609887(大豆)BE609881(大豆)BE607382(水稻)BE607326(水稻)BE607323(水稻)BE556484(大豆)BE556306(大豆)BE555319(大豆)AJ001117(小麦)AJ292758(异形鱼腥藻)BE474178(大豆)BE440931(大豆)BE440323(大豆)BE347277(大豆)AF263384(甘蔗)BE330345(大豆)BE211050(大豆)BE209707(大豆)AW561929(棉花)BE040389(水稻)BE040121(水稻)BE039563(拟南芥)BE034387(Mesembryanthemum crystallinum)BE033387(Mesembryanthemum crystallinum)BE023957(大豆)BE023630(大豆)BE022760(大豆)BE021167(大豆)BE020760(大豆)BE020591(大豆)BE020550(大豆)AW990923(乳浆大戟)AW832022(大豆)AW760552(大豆)AW756812(大豆)AW756072(大豆)AW756065(大豆)AW734901(大豆)AW707163(大豆)AW706660(大豆)AW706520(大豆)AW706203(大豆)AW705595(大豆)AW704619(大豆)AB025778(蜜柑)AB021745(蜜柑)AW666333(大豆)AW666277(大豆)AW666250(大豆)AW620859(大豆)AW598476(大豆)AW598473(大豆)AW597690(大豆)AW597373(大豆)AW597332(大豆)AW596993(大豆)AW570615(大豆)AW570577(大豆)AW570566(大豆)AW570513(大豆)AW569822(大豆)AW568526(大豆)AW568333(大豆)AW509231(大豆)AW472408(大豆)AW459606(大豆)AW458318(大豆)X82504(C.rubrum)AW432731(大豆)AW432392(大豆)AW432192(大豆)AW397142(大豆)AW397071(大豆)AW309503(大豆)AW307502(大豆)AW307391(大豆)AW307001(大豆)AW306834(大豆)AB018561(西瓜)AB029401(蜜柑)AB022092(蜜柑)AB022091(蜜柑)AW279073(大豆)AW279053(大豆)AW278487(大豆)AJ388994(Medicago truncatula)AJ388888(Medicago truncatula)AW234887(大豆)AJ238219(小麦)AJ238218(小麦)AJ238217(Triticum speltoides)AW201670(大豆)AW185801(大豆)AW185627(大豆)AJ249624(小麦)AJ249623(小麦)AW164630(大豆)AW164393(大豆)AW133248(大豆)AW101578(大豆)AW100191(大豆)AW100069(大豆)AW099557(大豆)X96938(郁金香)X96939(郁金香)AW035186(番茄)AW033439(番茄)AW032339(番茄)AJ132002(Craterostigma plantagineum)AJ132001(Craterostigmaplantagineum)AJ132000(Craterostigma plantagineum)AJ131999(Craterostigma plantagineum)AI973811(大豆)AI973710(大豆)AI973540(大豆)AI967739(Lotus japonicus)AI965972(大豆)At960742(大豆)At960703(大豆)AI930917(大豆)AI900130(大豆)AI900087(大豆)Ai855470(大豆)AA080634(甘蔗)AA080610(甘蔗)AA269294(甘蔗)AA080580(甘蔗)At736370(大豆)AI731292(棉花)AI731115(棉花)AI729201(棉花)AI728436(棉花)AI727966(棉花)AI726092(棉花)U73588(棉花)U73587(棉花)AJ012080(豌豆)AJ131964(Medicago truncatula)AJ131943(Medicagotruncatula)AJ133726(Lotus japonicus)Y16091(胡罗卜)Y16090(胡罗卜)AJ011319(番茄)AI496671(大豆)AI496540(大豆)At496532(大豆)AI495774(大豆)AI495135(大豆)AI495023(大豆)AI494833(大豆)AJ011534(番茄)Y15802(大麦)AI461126(大豆)AI460757(大豆)AI460629(大豆)AI444096(大豆)AI444083(大豆)AI444054(大豆)AI443620(大豆)AI443476(大豆)AI443231(大豆)AI442789(大豆)AI442411(大豆)AI441989(大豆)AI441004(大豆)AI437923(大豆)AI437907(大豆)Af437840(大豆)AJ010639(鱼腥藻.)AJ011535(番茄)D10266(绿豆)L03366(水稻)AF030231(大豆)M97551(蚕豆)AJ000153(小麦)AF079523(尖叶蕉)AF079851(豌豆)AJ001071(豌豆)AF049487(Medicago sativa)AF054446(Mesembryanthemum crystallinum)AA753339(水稻)AA752298(水稻)AA752293(水稻)AA753445(水稻)AA753437(水稻)AA753297(水稻)AA752123(水稻)AA751990(水稻)AA750692(水稻)AA750079(水稻)AA749692(水稻)AA749554(水稻)AA720478(Mesembryanthemum crystallinum)AA661050(Medicagotruncatula)AA661041(Medicago truncatula)AA660686(Medicagotruncatula)D88412(棉花)D10418(水稻)D21308(水稻)D29733(水稻)X81974(大佛肚竹)X92378(A.glutinosa)Z56278(V.faba)Z48640(V.faba)X98598(罂粟)T25261(玉米)T23326(玉米)T14713(玉米)T14662(玉米)T14661(玉米)X75332(D.carota)X02382(玉米)X02400(玉米)X70990(拟南芥)X60987(拟南芥)X69773(V.faba)X73477(马铃薯)Z11532(甘蔗)Z15028(水稻)X64770(水稻)X59046(水稻)X66728(大麦)X65871(大麦)X69931(大麦)A27685(水稻)W21612(玉米)U24088(马铃薯)U24087(马铃薯)X73221(大麦)L32898(玉米)F13913(拟南芥)F13912(拟南芥)U21129(马铃薯)M26672(小麦)M26671(小麦)L19762(番茄)M18745(马铃薯)L33244(玉米)L22296(玉米)Z17959(拟南芥)。这些序列被引为参考。
在第二个方面，本发明提供了一种方法，该方法在植物中改变了纤维、果实或种子的产生，该方法包括在该植物体内引发参与果实/种子产生的SuSy同工型的表达不足或者过表达。
在优选的情况下，该方法涉及到提供一种遗传构建体，该构建体转化至植物体内时靶向于该SuSy基因的3’-末端。“3’-末端”指的是一种含有或者不含有3’非编码序列的编码一种SuSy多肽的C-末端部分的序列或者该序列的互补链。该构建体可为一种共抑制的反义序列或者联合的有义/反义(反向重复)的SuSy构建体。
在第三个方面，本发明提供了一种通过本发明的第二个方面的方法所产生的植物体，该植物具有改变的产生纤维、果实或者种子的能力。
在第四个方面，本发明提供了一种遗传构建体，该构建体靶向于该SuSy基因的3’-末端，该构建体在植物体内的表达降低了参与果实/种子产生的SuSy同工型的表达。
这些方法所使用的嵌合基因的优选的实施方案，特别是编码区域如本说明书的其它部分所述。
在优选的情况下，该构建体选自于图5所示的构建体，两种构建体的几个部分的组合产生一种反向重复基因抑制构建体，该构建体具有或者不具有组织特异性启动子区域。
开发这些构建体的一个优选的方法是通过使用“pPLEX”技术，该方法涉及到在AU689311中描述的地三叶矮化病毒启动子以及终止子。
在第五个方面中，本发明提供了本发明的第四个方面的构建体在产生具有降低的产生纤维、果实或者种子的能力的植物中的用途。
本发明适用于以下的应用A)用SuSy增强或者改善纤维产量-SuSy可被用于通过在这些植物细胞中提高SuSy的表达或者活性而增强或者改善纤维的合成，例如，一种纤维特异性或者纤维增强型启动子(例如棉花扩展(expansion)启动子，或者具有SEQ IDNO1的核苷酸序列的SuSy基因的启动子，但不限于这些)或者某种组成型启动子(例如CaMV 35S)可被用于该SuSy基因在棉花细胞中的表达。
-棉花纤维产量可通过降低或者抑制棉绒毛纤维而加以改善。绒毛纤维特异性或者增强型启动子或者组成型启动子用以选择性地在棉花绒毛纤维细胞中减少蔗糖合成酶。表达的降低可通过基因沉默技术来实现(反义、共抑制、显性失活等等)。蔗糖合成酶基因的显性失活突变等位基因的获得可通过，例如，通过突变(蔗糖合成酶蛋白编码区域的磷酸化位点的插入、取代或者缺失)产生。
-棉花纤维产量可通过将绒毛(fuzz)纤维改进成为棉绒lint纤维而加以改善，例如，通过SuSy编码区域的或其功能等价物的表达，该表达通过纤维特异性或者纤维增强启动子，初生或者次生细胞壁启动子或者某种组成型启动子而进行。
B)用SuSy改善纤维质量-纤维长度是纤维质量的一个例子。通过纤维特异性或者纤维增强启动子，初生细胞壁启动子或者某种组成型启动子进行SuSy表达。
C)用SuSy改善纤维性质(例如，纤维强度、长度以及数目)-纤维强度是纤维性质的一个例子。纤维强度很大程度上受纤维细胞的次生细胞壁中的纤维素含量的影响。这可通过SuSy的表达而实现，该表达通过纤维特异性或者纤维增强启动子，次生细胞壁启动子或者某种组成型启动子而进行。
D)SuSy在种子中特异性过表达，用以提高蔗糖在种子中的利用，从而增加种子大小和贮藏产物含量。
E)在果实(例如棉花纤维、园艺果实)中的母体组织中过表达，用以增加碳水化合物或者纤维含量。
F)在种子中的抑制SuSy同时在果实/纤维中过表达，用以提高纤维/果实产量。
优选的植物可操作启动子包括纤维特异性和/或次生细胞壁特异性启动子，这些启动子可根据WO98/18949、WO98/00549或者US5932713的教导进行分离。
棉花的胚珠上皮中的蔗糖合成酶活性与纤维长度的相关关系还可允许蔗糖合成酶蛋白(或者抗体或识别相同目标的aptamer)或者蔗糖合成酶编码区域被应用作为棉花育种的诊断工具。这些可被用于识别棉花品系或者品种，包括野生来源，它们具有增强的蔗糖合成酶活性以及更强的形成较长纤维的能力，特别是在育种程序中同其它具有良好的纤维特性的棉花品系和/或品种进行杂交的情况下。源自于蔗糖合成酶编码区域的核酸可被用于测定胚珠上皮中蔗糖合成酶RNA的量。同样，蔗糖合成酶基因之间的多形性，包括单核苷酸多形性在内，可被用于鉴定具有优良的蔗糖合成酶等位基因的品系。
本发明的方法和手段特别适用于在棉花作物(陆地棉和海岛棉)中的应用，特别是对于Coker312，Coker310，Coker5AcalaSJ-5，GSC25110，FiberMax 819，Siokra 1-3，T25，GSA75，Acala SJ2，Acala SJ4，Acala SJ5，Acala SJ-C1，Acala B1644，Acala B1654-26，Acala B1654-43，Acala B3991，Acala GC356，Acala GC510，AcalaGAM1，Acala C1，Acala Royale，Acala Maxxa，Acala Prema，AcalaB638，Acala B1810，Acala B2724，Acala B4894，Acala B5002，non Acala″picker″Siokra，″stripper″品种FC2017，Coker 315，STONEVILLE 506，STONEVILLE 825，DP50，DP61，DP90，DP77，DES119，McN235，HBX87，HBX191，HBX107，FC3027，CHEMBRED A1，CHEMBREDA2，CHEMBRED A3，CHEMBRED A4，CHEMBRED B1，CHEMBRED B2，CHEMBREDB3，CHEMBRED C1，CHEMBRED C2，CHEMBRED C3，CHEMBRED C4，PAYMASTER145，HS26，HS46，SICALA，PIMA S6以及ORO BLANCO PIMA。
本文中对现有技术的文件的描述并非承认这些文件形成了澳洲的相关领域的公知常识的一部分。
为使本发明可被更清晰地理解，优选的形式将参考以下实施例和附图而进行描述。
实践本发明的方式普通分子生物学除非另行指出，在本发明中使用的重组DNA技术为标准方法，这些方法为本领域的技术人员所熟知。这些技术通过来自于诸如J.Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning，John Wileyand Sons(1984)，J.Sambrook等人，Molecular CloningALaboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989)，T.A.Brown(编者)，Essential Molecular BiologyA Practical Approach，第1和第2卷，IRL Press(1991)，D.M.Glover和B.D.Hames(编者)，DNA CloningA PracticalApproach，1-4卷，1RL Press(1995和1996)，以及F.M.Ausubelet al.(编者)，Current Protocols in Molecular Biology，GreenePub Associates以及Wiley-1nterscience(1988，包括至今的所有更新)的文献进行了描述和解释并且在此引为参考。
通过Southern印迹对转基因的存在进行的分析根据Sambrook等人(1989)的描述而进行，SuSy蛋白在组织切片上的免疫定位根据Ruan和Chourey(1998)的描述而进行。
基因/DNA分离编码蛋白质的DNA可从cDNA文库获得，该文库来自于任何一种被认为表达基因mRNA并且以可检测水平进行表达的组织或者生物体。基因序列还可以获自基因组文库或者基因组DNA。
这些文库通过探针或分析工具进行筛选，该探针和分析工具经设计用以鉴定目的基因或者该基因所编码的蛋白。对于cDNA表达文库，适用的探针包括对该蛋白进行识别和特异性结合的单克隆或者多克隆抗体；长度为约20-80个碱基的寡核苷酸，该寡核苷酸编码来自相同或者不同的物种的cDNA的已知或者怀疑部分；以及/或者编码相同或杂交基因的互补或同源cDNA或其片段。用于筛选基因组DNA文库的适当探针包括，但不限于寡核苷酸；编码相同或杂交DNA，包括被表达的序列标记等的cDNA或其片段，以及/或者同源基因组DNA或者其片段。以选定的探针对cDNA或者基因组文库进行的筛选可根据Sambrook等人的文献中第10-12章的描述使用标准的方法进行。
一种替代性的分离编码基因的方法为多聚酶链反应(PCR)方法，如Sambrook等人的文献中第14部分的描述。该方法需要使用同该基因杂交的寡核苷酸探针。
被选作为探针的寡核苷酸序列应当有足够的长度和足够的确定性以将假阳性降至最低。实际的核苷酸序列通常基于该基因的保守或者高度同源性核苷酸序列或者区域。这些寡核苷酸可在一个或者多个位置上简并。在文库筛选自一个具有已知的密码子使用优先的物种的情况下，简并寡核苷酸的使用可能特别重要。该寡核苷酸必须经标记以使其同文库中的被筛选DNA杂交时可被检测出来。优选的标记方法为使用32P-标记的dATP通过多核苷酸激酶对该寡核苷酸进行放射性标记，该过程为本领域所熟知。然而，其它的方法也可被用于标记该寡核苷酸，包括生物素或者酶标记，但不限于这些。
具有所有的蛋白质编码序列的核酸通过对选定的cDNA或者基因组文库进行筛选而获得，并且，在必要的情况下，使用在Sambrook等人的文献的7.79部分中描述的传统引物延伸方法，从而对mRNA前体和加工中间体进行检测，这些mRNA可能并未被反转录成为cDNA。
用于获得目的基因的另一种替代性的方法为化学合成，该方法使用在Fingels等人的文献(Agnew Chem.Int.Ed.Engl.28716-734，1989)中所描述的方法。这些方法包括三酯法、亚磷酸酯法亚磷酰胺法、以及氢-磷酸酯法、PCR和其它自动引物方法以及基于固相支持物的寡核苷酸合成。如果已知完整的核酸序列或者已有该编码链的互补核苷酸序列，可以使用这些方法，或者，在已知靶氨基酸序列的情况下，可使用各个氨基酸残基的已知和优选的编码残基推断可能的核酸序列。
棉花转化根据在F.Murray等人文献(Molec.Breeding 5219-232)中的描述使用农杆菌介导的转化技术对棉花进行转化。被转化的植株在自然光照下于温室中生长，其所处的昼/夜温度约为30℃/22℃。
实施例1SuSy表达在棉花中的抑制为提供关于SuSy在纤维发育中的作用的证据，本发明者以共抑制和反义SuSy构建体对棉花进行了转化，该构建体靶向于SuSy的cDNA的3’末端并且由组成型地三叶矮化病毒启动子(图示见图5)驱动。通过Southern分析证实了该转基因在11个转基因品系中的存在(见图6)。其中两个反义品系(294-147，292-43)以及一个共抑制品系(295-82)显示出纤维和种子发育的明显减少，而其余的品系显示出不同程度的纤维生长的抑制。
对0-d的胚珠切片进行的免疫定位分析(图2)揭示，同野生型的纤维原始细胞相比，品系294-147中的SuSy蛋白被降低至低于野生型水平的20％并且在295-82中降至不可检测。进一步，同野生型胚珠相比较，在这两个品系中初始纤维的数量和大小降低了至少50％。实际上，在开花后(DAA)6天，这些转基因种子基本上无纤维(见图1)。对蔗糖合成酶活性进行生化测定。WT植株表现出22.5nmol/min/种子的SuSy活性，品系147表现出5.8nmol/min/种子的SuSy活性并且品系82表现检测不到的活性。这导致了胚珠上皮中正常纤维原始细胞的明显降低。从这些结果看出，很明显纤维发生的水平取决于胚珠上皮中的SuSy表达。
SuSy表达对于纤维初始化的作用通过对品系147的胚珠上皮的扫描电镜分析(见图7)进行了进一步的展示，该分析显示许多纤维细胞萎陷和皱缩(见图7B)。出现了一些纤维细胞，但是这些细胞在大小上远低于野生型胚珠，并且同野生型胚珠相比在数量上减少(图7A)。萎陷和皱缩的表型在高度放大下清晰可见(图7C)。
这些结果证明，SuSy的一些同工型在纤维发生和延伸中起到了关键性的作用。SuSy的某种同工型的抑制由此可被用于防止或者降低纤维的发生和延伸，而该同工型的过表达由此可被用于增强纤维发生和延伸。
尽管品系295-82和292-43中的全部棉铃在开花后10天发生成熟前脱落，品系294-147的一些棉铃保持到了成熟。在这些成熟的棉铃中，多数种子发育受阻、皱缩并且无纤维。但是，约15％的种子表现出30％的野生型纤维长度(以及纤维松散)以及野生型胚和种子大小，这最有可能由转基因的分离所导致。
这表明，仅仅SuSy的同工型在母体组织(种皮/纤维)中的抑制便可抑制纤维发育长度的70％，而SuSy在胚中的额外的抑制可完全阻止种子的发育。
SuSy的同工型特异性地在胚中的基因抑制提供了一种无种子的表型(在广泛的园艺作物之中，例如葡萄、桃、梨、苹果)。
品系292-43和295-82为雄性不育(无花粉)，并且种子生成可通过以野生型花粉进行授粉而回复。这表明SuSy在棉花的雄性不育中起了作用。
SuSy在雄性花部分中的基因抑制被发现导致了不育。在不同品系开花前二天针对发育的花药的蔗糖合成酶活性、花粉的鲜重和花粉的活力进行了检测。活力分析通过以2，3，5-氯化三苯基四唑(TTC)进行染色而进行。结果总结于表1。
表1.SuSy在花药中的抑制通过花粉形成的抑制而导致了雄性不育。
SuSy活性在花药中降低约33％导致了总花粉重量约70％的减少，这在很大程度上是由于花粉量的降低所致。在剩余的30％中，仅仅半数花粉具有活力。当SuSy降低60％时不再形成花粉。因此，花粉发育非常敏感于SuSy活性的变化。由此可通过在花药中对SuSy进行抑制和过表达来影响(抑制或者促进)花粉的形成。
SuSy活性在转基因棉花作物的母体种皮组织中的抑制还导致了同野生型植物相比SuSy抑制转基因植物中绒毛长度的降低(见图9)。绒毛纤维长度从成熟种子的合点端量起，并且通过轻微地拉伸种子绒毛、手工去绒并且测定从种皮上皮到顶部的长度来进行该测量。在转基因品系中可见到的褐色是由于这些转基因品系中的绒毛短于野生型所致，该野生型中褐色的种皮被相对较长的绒毛完好地覆盖。同样还检测了SuSy活性。结果总结如下-野生型植株具有2.2mm的绒毛长度(并且SuSy活性测量值设为100％)-转基因品系147#2具有1.4mm的绒毛长度(SuSy活性测量值为WT的36％)。
通过从本文所述的SuSy表达和纤维含量和/或质量之间检测到的常规性关联，可以认为SuSy基因的过表达应对于植物中纤维、果实和种子产生具有潜在的有利效果。
实施例2.具有抑制的SuSy活性的棉花品系82、147和43的子代分析。
为证实棉花中SuSy抑制转基因的存在和纤维发生的降低之间的相关关系，对T1代进行了进一步的分析。将来自于6个T0代的约24个T1种子进行播种。对所有的发芽幼苗通过PCR针对该转基因的存在与否进行筛选(nptII；S7启动子和SuSy抑制转基因)。分别对来自于6个品系的6个PCR阳性和一个PCR阴性分离个体进行分子生物化学和细胞水平的分析。对品系82进行营养性繁殖以作为参照点。在T0代的不同品系中的无纤维表型(图6A中箭头所示)分别在品系147和43中的3个和2个分离个体中被保留下来(图6B中的箭头)。其余的个体表现出不同程度的纤维/种子抑制。营养性保持(vegetatively-kept)品系82继续产生无纤维种子。这些结果表明所描述的无纤维/或种子抑制表型在实际上是由SuSy转基因的存在所导致。
在品系147、43和101的T1代分离植株中的种子上皮蔗糖合成酶活性程度和纤维长度之间可发现强烈的正相关(见图8、9和10)。当以包括野生型品系在内的不同品系的不同植株的纤维长度对蔗糖合成酶活性作图时，可产生一个线性回归(Y＝2.634X-50；R2＝0.98)。该相关关系直至野生型水平的线性性质表明，蔗糖合成酶活性超过野生型水平的过表达将导致纤维长度大于野生型植株的纤维长度。
类似的强相关关系还存在于SuSy活性的降低和成熟棉花纤维长度及干重之间。在品系43的T1代的分离个体#1、#2和#3中，种皮上皮中的SuSy活性分别降低至野生型水平的28.8％、42.5％和53.9％。每棉铃的棉绒(lint)纤维干重分别为11.1％、51.6％和70.9％。
棉花纤维中的纤维素含量也密切地相关于SuSy的表达水平。通过以特异性结合于纤维素的荧光染料Calcofluor white对棉花纤维在第25天(体内纤维素合成的高峰)进行标记而分析了纤维素含量。用于显示纤维素含量的被标记纤维的荧光强度在SuSy抑制的转基因品系中同野生型的荧光相比较明显降低。荧光降低的程度相关于SuSy活性的抑制程度。
实施例3.蔗糖合成酶在棉花作物中的过表达。
将一种马铃薯的蔗糖合成酶cDNA的编码序列(Genbank获取号M18745)可操作地连接于一种地三叶矮化病毒启动子(S7；WO9606932)以及一种在植物体内起作用的3’转录终止信号和聚腺苷酸化信号。这种嵌合基因被可操作地连接于一种选择标记基因并且被引入一种T-DNA载体。使用上述的农杆菌介导的转化技术对棉花作物进行转化。对转基因棉花品系进行鉴定并且分析蔗糖合成酶活性、纤维长度、绒毛纤维长度、纤维素含量以及棉绒干重。在SuSy活性和纤维长度、纤维素含量以及棉绒干重的提高之间发现了某种正相关关系。
实施例的总结单细胞的棉花纤维发生于开花时的胚珠上皮，在约16天内延伸至2.5～3.0cm并且随后合成大量的纤维素。因此，棉花纤维为一种研究高等植物中的细胞分化、延伸和纤维素合成的极佳系统，具有改善纤维产量和质量的重要工业意义。
为提供关于SuSy在纤维和种子发育中的作用的确定证据，本发明者以共抑制和反义SuSy构建体对棉花进行了转化，这些构建体靶向于该种子的SuSy cDNA的3’末端并由地三叶矮化病毒启动子驱动。通过Southern分析证实了该转基因存在于9个转基因品系。这其中，一个反义品系(294-147)以及一个共抑制品系(295-82)在纤维和种子的发育上表现出强烈的降低，而其它的品系表现出纤维生长的不同程度的抑制。对0-d的胚珠切片进行的免疫定位分析揭示，同野生型纤维原始细胞相比，在品系294-147中SuSy蛋白被降至野生型水平的约20％并且在品系295-82中降至检测不到的水平。进一步，在这两个品系中原始纤维的数量和大小同野生型胚珠相比降低了至少50％。实际上，在开花后(DAA)2天这些转基因种子基本上是无纤维的。这同处于该阶段的野生型植物的纤维覆盖的种子表现型形成了对比。在品系295-82中所有的棉铃在10DAA时发生成熟前脱落，而品系294-147的一些棉铃被保持至成熟。在这些成熟棉铃中，多数种子发育受阻、皱缩并且无纤维。但是，这些种子约有15％表现出30％的野生型纤维长度以及野生型胚和种子大小，这最有可能是因为该转基因的分离所致。这些结果表明，(a)SuSy在纤维初始化和延伸中发挥了关键性作用，(b)SuSy在母体组织(种皮/纤维)中的抑制独自便可抑制纤维的发育，而SuSy在胚中的额外抑制可完全遏制种子发育。SuSy抑制对于纤维长度的降低的影响已经由这些转基因棉花的后代分析所证实。进一步，在SuSy活性和纤维长度的提高之间发现具有线性相关关系。这种相关关系的线性特征表明，在野生型棉花中，蔗糖合成酶的水平是限制性的。
蔗糖合成酶的过表达至少在产纤维植物的母体胚珠组织中提高了纤维长度。
本领域的技术人员应会认同，根据具体的实施方案所示，在不脱离本发明的精神或者范围的情况下可按广泛的描述进行大量的变动和/或修改。这些实施方案因此在各方面均被视为示例性的而非限制性的。
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序列表序列表<110>联邦科学及工业研究组织<120>蔗糖合成酶的基因表达在植物组织中的修饰及其用途<130>500159/MRO<150>PR1975<151>2000-12-08<150>US60/251852<151>2000-12-08<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2625<212>DNA<213>陆地棉(Gossypium hirsutum)<220><221>misc_特征<222>(1240)..(1240)<223>N是任意核苷酸<220><221>外显子<222>(1)..(2418)<223><400>1atg gct gag cgt gct ctc act cgc gtc cac agt ctc cgt gag cgt ttg48Met ala Glu Arg Ala Leu Thr Arg Val His Ser Leu Arg Glu Arg Leu1 5 10 15gat gag acc ctt ctt gct cac agg aac gag att ttg gcc ttg ctc tca96Asp Glu Thr Leu Leu Ala His Arg Asn Glu Ile Leu Ala Leu Leu Ser20 25 30agg atc gag ggc aaa gga aaa gga att ctg caa cac cat caa att att144Arg Ile Glu Gly Lys Gly Lys Gly Ile Leu Gln His His Gln Ile Ile
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1.一种用于改变产纤维植物的纤维发育或者特性的方法，该方法包括以下步骤a)提供一种嵌合基因给所述植物的细胞，该嵌合基因含有以下经可操作地连接的DNA片段(i)一种植物可操作启动子；(ii)一个上文所定义的编码区域，该编码区域经转录产生一种RNA，所述的RNA能够降低一种内源蔗糖合成酶基因的表达或者能够被翻译为一种活性蔗糖合成酶蛋白；以及(iii)在所述的植物细胞中起作用的转录终止和聚腺苷酸化信号。
2.权利要求1的方法，其中该内源蔗糖合成酶基因为一种在纤维细胞中表达的基因。
3.权利要求2的方法，其中该纤维细胞为纤维原始细胞。
4.权利要求1到3中任意一项的方法，其中所述的RNA能够被翻译为一种活性的蔗糖合成酶蛋白。
5.权利要求4的方法，其中所述的编码区域含有一种选自下组的核苷酸序列a)一种编码含有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，或者所述编码一种活性蔗糖合成酶的核苷酸序列的一个片段；b)SEQ ID NO1的核苷酸序列或者所述编码一种活性蔗糖合成酶的核苷酸序列的一个片段；c)一种与a)或者b)具有至少70％的序列同一性的核苷酸序列；d)一种在严格的条件下与a)或者b)或其互补序列或其编码一种活性蔗糖合成酶的一部分杂交的核苷酸序列。
6.权利要求1到3中任意一项的方法，其中所述的编码区域经转录产生能够降低一种内源蔗糖合成酶基因表达的RNA。
7.权利要求6的方法，其中所述的编码区域含有一种选自下组的核苷酸序列a)一种核苷酸序列，该序列含有与编码含有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列具有至少70％序列同一性的序列的至少约19个连续的核苷酸；b)一种核苷酸序列，该序列含有与SEQ ID NO1的核苷酸序列具有至少70％序列同一性的序列的至少约25个连续的核苷酸；c)a)或者b)的互补序列。
8.权利要求7的方法，其中a)中的核苷酸序列含有与编码含有SEQ I D NO2的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列具有至少70％序列同一性的序列的至少约25个连续的核苷酸。
9.权利要求6到8中任意一项的方法，其中所述的编码区域含有SEQ ID NO1中从约2208位核苷酸到约2598位核苷酸的核苷酸序列或其互补序列。
10.权利要求6到9中任意一项的方法，其中所述的编码区域同时含有能够形成双链RNA分子的有义和反义核苷酸序列。
11.权利要求1到10中任意一项的方法，其中所述的启动子为一种地三叶矮化病毒启动子。
12.权利要求1到11中任意一项的方法，其中所述的产纤维植物为一种棉花作物。
13.权利要求12的方法，其中所述的棉花作物为FibermaxTM品种。
14.一种用于在产纤维植物中提高纤维产量的方法，该方法包括以下步骤a)提供一种嵌合基因给所述植物的细胞，该嵌合基因含有以下经可操作地连接的DNA片段(i)一种植物可操作启动子(ii)一个能够被翻译为一种活性蔗糖合成酶蛋白的DNA区域；以及(iii)在所述的植物细胞中起作用的转录终止和聚腺苷酸化信号。
15.一种用于在产纤维植物中提高纤维质量的方法，该方法包括以下步骤a)提供一种嵌合基因给所述植物的细胞，该嵌合基因含有以下经可操作地连接的DNA片段(i)一种植物可操作启动子(ii)一个能够被翻译为一种活性蔗糖合成酶蛋白的DNA区域；(iii)在所述的植物细胞中起作用的转录终止和聚腺苷酸化信号。
16.一种用于在产纤维植物中增加种子大小的方法，该方法包括以下步骤a)提供一种嵌合基因给所述植物的细胞，该嵌合基因含有以下经可操作地连接的DNA片段(i)一种种子特异性启动子(ii)一个能够被翻译为一种活性蔗糖合成酶蛋白的DNA区域；以及(iii)在所述的植物细胞中起作用的转录终止和聚腺苷酸化信号。
17.一种产纤维植物，该植物在其基因组中含有一种嵌合DNA，该DNA含有以下经可操作地连接的DNA片段i)一种植物可操作启动子ii)一个编码区域，该编码区域经转录产生一种RNA，所述的RNA能够降低一种内源蔗糖合成酶基因的表达或者能够被翻译为一种活性蔗糖合成酶蛋白；以及iii)在所述的植物细胞中起作用的转录终止和聚腺苷酸化信号。
18.权利要求17的产纤维植物，其中所述的编码区域经转录产生能够降低一种内源蔗糖合成酶基因表达的RNA。
19.权利要求18的产纤维植物，其中该纤维细胞为纤维原始细胞。
20.权利要求17的产纤维植物，其中所述的RNA能够被翻译为一种活性蔗糖合成酶蛋白。
21.权利要求20的产纤维植物，其中该活性蔗糖合成酶蛋白在纤维细胞中表达，并且其中所述的纤维细胞与不含有所述的嵌合DNA的植物细胞的纤维细胞相比具有提高的蔗糖合成酶活性。
22.权利要求21的产纤维植物，其中该纤维细胞为纤维原始细胞。
23.权利要求17到22中任意一项的产纤维植物，其中所述的编码区域含有一种选自下组的核苷酸序列a)一种编码含有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，或者所述编码一种活性蔗糖合成酶的核苷酸序列的一个片段；b)SEQ ID NO1的核苷酸序列或者所述编码一种活性蔗糖合成酶的核苷酸序列的一个片段；c)一种与a)或者b)具有至少70％的序列同一性的核苷酸序列；以及d)一种在严格的条件下与a)或者b)或其互补序列或其编码一种活性蔗糖合成酶的一部分杂交的核苷酸序列。
24.权利要求23的产纤维植物，其中所述的编码区域含有一种选自下组的核苷酸序列a)一种核苷酸序列，该序列含有与编码含有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列具有至少70％序列同一性的序列的至少约19个连续的核苷酸；b)一种核苷酸序列，该序列含有与SEQ ID NO1的核苷酸序列具有至少70％序列同一性的序列的至少约25个连续的核苷酸；c)a)或者b)的互补序列。
25.权利要求24的产纤维植物，其中a)中的核苷酸序列含有与编码含有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列具有至少70％序列同一性的序列的至少约25个连续的核苷酸。
26.权利要求17到25中任意一项的产纤维植物，其中所述的编码区域含有SEQ ID NO1中从约2208位核苷酸到约2598位核苷酸的核苷酸序列或其互补序列。
27.权利要求17到26中任意一项的产纤维植物，其中所述的植物为一种棉花作物。
28.权利要求17到27中任意一项的植物的种子
29.分离自权利要求17到27中任意一项的植物或者权利要求28的种子的纤维，其中所述的纤维与来自于不含有嵌合DNA的植物的纤维相比具有改变的发育或者改变的特性。
30.通过实施权利要求1到15中任意一项的方法而获得的植物。
全文摘要
提供了一些方法和手段以用于在产纤维植物中，例如在棉花中，通过调整该植物中的蔗糖合成酶活性和/或表达来调节纤维质量。这些方法和手段还可被用于获得具有无籽果实的植物或者雄性不育植物。
文档编号C12N15/54GK1479569SQ01820254
公开日2004年3月3日 申请日期2001年12月7日 优先权日2000年12月8日
发明者D·维林, R·福尔班克, Y·－L·阮, D 维林, ト , 嗫 申请人:联邦科学及工业研究组织