合成有机产物的方法和材料的制作方法

专利名称：合成有机产物的方法和材料的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于生产有机产物的方法和材料。
2.背景信息诸如乳酸的有机产物具有许多重要的工业用途。例如，有机酸可用于合成塑料材料以及其它产品。为了满足对有机产物不断增长的需要，有待开发更有效且成本更实际的生产方法。一个这类方法涉及使用细菌。更具体地说，某些细菌在某些发酵条件下可产生大量的特定有机产物。然而，使用活细菌作为生产者受到随着有机产物在生长培养基中的积累细菌不能生长的限制。为了绕开该限制，在产物合成期间采用了各种产物纯化技术。另外，已经尝试了使用非细菌的微生物。事实上，在生产乳酸的尝试中已经遗传修饰了已知具有酸耐受性的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。具体地说，通过给细胞提供牛乳酸脱氢酶cDNA并破坏内源性丙酮酸脱羧酶基因(PDC1，PDC5，和PDC6)修饰了酿酒酵母细胞。尽管这些修饰的酿酒酵母细胞产生了一些乳酸，但是细胞生长受到抑制，因此细胞生长和乳酸生产均需要改进。
发明概述本发明一般涉及生产有机产物的方法和材料。具体地说，本发明提供了酵母细胞，培养酵母细胞的方法，制备酵母细胞的方法，核酸构建体，和产生各种有机产物的方法和材料。本发明基于这样的发现，即特定微生物(例如，细菌和真菌微生物)可遗传构建成在特定培养条件下具有生长能力，利用各种碳源用于生长以及产物生产，并产生用于商业目的的所需有机产物。例如，本文提供的酵母细胞在低pH和高温培养时可生长并产生有机产物。具有在例如，低pH和高温条件下迅速生长并高效产生有机产物的能力特别具有优势。具体地说，微生物耐受低pH的能力避免了需要在大规模生产过程中有困难且昂贵的维持中性pH环境。另外，从低pH培养基回收目的有机产物所需的方法和材料比从具有更中性pH的培养基中回收相同有机产物所需的方法和材料更实际且更有效。例如，某些有机酸产物随着pH下降到产物pKa值以下可能在溶液中沉淀出来，使得回收十分简单。另外，微生物耐受高温的能力避免了在生长和生产期间需要维持凉爽温度。很明显，减少对大规模生产过程中降低大容积罐温度的需要使得整个过程更有效且花费更低。而且，微生物同时耐受低pH和高温的能力提供了在大规模生产过程中防止被其它耐受性较小的微生物污染的方便方法。
重要的是应注意与产生用于商业目的的所需有机产物的能力相关的重要方面可以是产生所需有机产物的单位生产率(specific productivity)。例如，使用本文所述的方法和材料提供的高单位生产率可允许微生物当暴露在诸如低pH和高温的培养条件下时产生细胞维持所需的能量。该所需能量可在基本上厌氧的条件下通过发酵途径产生，而不是依赖于通过呼吸途径产生能量。当产生有机产物不需要呼吸途径时通过发酵途径获得能量特别具有优势，因为基本上所有的供给碳源可用于生产所需有机产物。
本发明也基于这样的发现，即可控制某些遗传构建的微生物对碳源的利用并主要定向产生生物量或者所需的有机产物。一般来说，本发明包含两种类型的培养方法。一种培养方法涉及依赖于微生物和所需结果，在促进生物量生产的特定培养条件下培养微生物，而另一培养方法涉及也依赖于微生物和所需结果，促进所需有机产物生产的一套不同的培养条件。很明显，在大规模生产过程中具有控制碳源利用的能力提供了比其它可能具有更大灵活性和更多控制的生产者。
另外，本发明基于这样的发现，即可对某些微生物进行遗传操作，以便大多数(如果不是全部的话)碳源被用于生产生物量或者所需的有机产物。具体地说，本发明提供了经过修饰以便从生物量或者所需有机产物的生产转移碳源利用的生物合成途径被失活的酵母细胞。失活该生物合成途径提供了可有效生长并产生所需产物的微生物。
一般来说，本发明的特征在于含有外源性核酸分子的酵母细胞，其中外源性核酸分子编码在细胞内具有酶活性的多肽。该核酸可插入细胞基因组中。该酶活性导致有机产物的形成，在某些实施方案中，该有机产物从细胞中分泌出来。该细胞还具有crabtree-阴性表型且产生该有机产物。例如，该细胞可来自Kluyveromyces，Pichia，Hansenula，Candida，Trichosporon，或Yamadazyma属。该有机产物可以是，例如，发酵产物，丙酮酸盐衍生的产物，有机酸，或诸如乳酸盐(lactate)的羧酸盐。在一个实施方案中，该多肽可具有乳酸脱氢酶活性。例如，外源性核酸可编码细菌乳酸脱氢酶或诸如K.lactis真菌乳酸脱氢酶的真菌乳酸脱氢酶。
在另一实施方案中，细胞含有4个外源性核酸分子，4个外源性核酸分子各编码一个不同的多肽。例如，4个外源性核酸分子中的第一个可编码具有乳酸脱氢酶活性的第一多肽，第二核酸分子可编码具有CoA-转移酶活性的第二多肽，第三核酸分子可编码具有乳酰-CoA脱水酶活性的第三多肽，且第四核酸分子可编码具有丙烯酰基-CoA水合酶活性的第四多肽。这种细胞可产生丙烯酸盐作为羧酸盐产物。作为选择，4个外源性核酸分子中的第一个可编码具有2-脱氢-3-脱氧-D-戊酸醛缩酶活性的第一多肽，第二核酸分子可编码具有木糖酸(xylonate)脱水酶活性的第二多肽，第三核酸分子可编码具有木糖酸内酯酶(xylonolactonase)活性的第三多肽，且第四核酸分子可编码具有D-木糖脱氢酶活性的第四多肽。这种细胞可产生诸如D-木糖的糖类作为有机产物。
在另一实施方案中，细胞含有6个外源性核酸分子，6个外源性核酸分子各编码一个不同的多肽。例如，6个外源性核酸分子中的第一个可编码具有2，5-二氧戊酸(2，5-dioxovalerate)脱氢酶活性的第一多肽，第二核酸分子可编码具有5-脱氢-4-脱氧-D-葡糖二酸脱氢酶活性的第二多肽，第三核酸分子可编码具有葡糖二酸(glucarate)脱水酶活性的第三多肽，第四核酸分子可编码具有乙醛脱氢酶活性的第四多肽，第五核酸分子可编码具有葡糖醛酸内酯还原酶活性的第五多肽，第六核酸分子可编码具有L-古洛糖酸内酯氧化酶活性的第六多肽。这种细胞可产生诸如L-抗坏血酸盐的维生素作为有机产物。
该有机产物可含有3个以上碳原子，例如可以是氨基酸。
在另一实施方案中，该细胞能分解代谢诸如核糖，阿拉伯糖，木糖和来苏糖的戊糖碳。
在另一实施方案中，该细胞具有降低的丙酮酸脱羧酶活性或降低的乙醇脱氢酶活性。例如，该细胞可缺乏所有的丙酮酸脱羧酶活性。丙酮酸脱羧酶活性降低可以是由于遗传基因座破坏，其中该基因座正常情况下具有编码丙酮酸脱羧酶的核酸序列。作为选择，该细胞可含有相应于内源性核酸序列的诸如核酶的反义分子，其中该反义分子降低了丙酮酸脱羧酶的活性。细胞也可含有充当杀伤质粒的其它外源性核酸分子。
在另一实施方案中，外源性核酸编码的多肽的酶活性导致以NADH消耗方式形成有机产物。
在另一实施方案中，当在生产有机产物的最佳条件下培养细胞时，每消耗100克葡萄糖细胞产生至少大约60克的有机产物。
在另一方面，本发明的特征在于含有外源性核酸分子的细胞，例如，酵母细胞，其中外源性核酸分子编码促进戊糖碳被细胞分解代谢的多肽。该多肽可以是，例如，木糖还原酶，木糖醇脱氢酶，或木酮糖激酶，且该戊糖碳可以是，例如，核糖，阿拉伯糖，木糖，和来苏糖。该细胞还可分解代谢己糖碳且如果需要，可同时分解代谢己糖碳和戊糖碳。己糖碳可以是，例如，阿洛糖，阿卓糖，葡萄糖，甘露糖，古洛糖，iodose，果糖，半乳糖和塔罗糖。
在另一方面，本发明的特征在于含有外源性核酸分子的酵母细胞，其中外源性核酸分子编码促进乙酰-CoA在细胞质中积累的多肽。
多肽可以是具有柠檬酸裂合酶活性的多肽，或可以是促进乙酰-CoA穿透过线粒体膜的线粒体膜多肽。细胞可具有降低的丙酮酸脱羧酶活性或降低的乙醇脱氢酶活性。另外，酵母细胞可缺乏乙醇生产，且在缺乏乙醇和乙酸盐的培养条件下可具有比缺乏乙醇产生的相应酵母细胞观察到的生长率更高的生长率。
在另一方面，本发明的特征在于具有线粒体多肽活性降低的酵母细胞，其中该细胞具有crabtree-阴性表型。该细胞可以是来自，例如，Kluyveromyces，Pichia，Hansenulo，Candicla，Trichosporon，或Yamadazyma属。细胞可完全缺乏该活性。细胞可含有破坏的基因座，其中该基因座正常情况下包含编码线粒体多肽的核酸序列。该线粒体多肽可以是三羧酸循环酶。另外，细胞可积累三羧酸循环产物。细胞可包括外源性核酸分子，其中该外源性核酸分子编码在细胞内具有酶活性的多肽，该酶活性导致形成一种有机产物，使得细胞可产生该有机产物。有机产物可以是，例如，柠檬酸盐，α-酮戊二酸盐，琥珀酸盐，延胡索酸盐，苹果酸盐，和草酰乙酸盐。多肽可以是参与乳酸盐或乙酸盐分解代谢的多肽。
在另一方面，本发明的特征在于一种生产有机产物的方法。该方法包括提供酵母细胞，其中该细胞包含编码在细胞内具有酶活性的多肽的外源性核酸分子，其中该酶活性导致形成该有机产物，且其中该细胞具有crabtree-阴性表型，并用培养基培养该细胞以便产生该有机产物。该酵母细胞可以是来自Kluyveromyces，Pichia，Hansenulo，Candicla，Trichosporon，或Yamadazyma属。该有机产物可以是发酵产物，丙酮酸盐衍生的产物，含有3个以上碳原子的有机产物，羧酸盐，糖类，氨基酸，维生素，或脂类产物。有机产物还可以是乳酸盐，甘油，丙烯酸盐，木糖，抗坏血酸盐，柠檬酸盐，异柠檬酸盐，α-酮戊二酸盐，琥珀酰-CoA，琥珀酸盐，延胡索酸盐，苹果酸盐，或草酰乙酸盐。在一些实施方案中，该有机产物由细胞分泌出来。该方法可导致细胞具有降低的丙酮酸脱羧酶活性或降低的乙醇脱氢酶活性。该酶活性可导致以NADH-消耗方式形成有机产物。
以这些方法制备的细胞当培养步骤最适于产生该有机产物时每消耗100克葡萄糖可产生至少大约60克有机产物。可以是液体的培养基可包含细胞呼吸抑制剂，例如，抗霉素A，氰化物，或叠氮化物。培养步骤可包括在需氧生长条件下生长细胞随后用细胞呼吸抑制剂接触所述细胞。
在另一实施方案中，培养步骤包括在厌氧培养条件下培养细胞。在另一可供选择的实施方案中，培养步骤包括在需氧生长条件下生长细胞随后在厌氧培养条件下培养细胞。培养步骤也可包括在高于大约35℃的温度下培养该细胞。
在一个实施方案中，培养基具有低于大约3.0的有机pH值，和/或低于大约3.0的无机pH值。在另一实施方案中，培养基含有戊糖碳，例如核糖，阿拉伯糖，木糖，或来苏糖。培养基也可包含具有例如，大约2.0和大约6.5之间的pH值的玉米纤维水解产物。
在另一方面，本发明的特征在于一种生产有机产物的方法，该方法包括a)提供含有编码促进细胞分解代谢戊糖碳的多肽的外源性核酸分子的酵母细胞，其中该细胞含有导致形成所述有机产物的酶活性，和b)用培养基培养细胞以便生产该有机产物。
在另一方面，本发明的特征在于一种生产有机产物的方法，该方法包括a)提供酵母细胞，其中该细胞包含编码促进细胞质积累乙酰-CoA的多肽的外源性核酸分子，且其中该细胞含有导致形成该有机产物的酶活性，和b)用培养基培养该细胞以便生产该有机产物。
在另一方面，本发明的特征在于一种生产有机产物的方法，该方法包括a)提供具有降低活性的线粒体酶的酵母细胞，其中该活性降低导致该有机产物的积累，和b)用培养基培养所述细胞以便生产所述的有机产物。
在另一方面，本发明的特征在于一种培养具有crabtree-阴性表型的酵母细胞的方法，该方法包括用培养基培养该细胞，其中该培养基具有低于大约3.0的有机pH值，和/或低于大约3.0的无机pH值。该培养步骤可包括在高于大约35℃的温度下培养细胞。培养基可包含细胞呼吸抑制剂。培养基也可包含戊糖碳。在另一实施方案中，培养基可包含玉米纤维水解产物。
在另一方面，本发明的特征在于一种培养具有crabtree-阴性表型的酵母细胞的方法，该方法包括用培养基培养该细胞，其中该培养基包含玉米纤维水解产物。
在另一方面，本发明的特征在于一种培养具有crabtree-阴性表型的酵母细胞的方法，该方法包括用培养基在高于大约35℃的温度下培养该细胞，该培养基具有低于大约3.0的无机pH值。
在另一方面，本发明的特征在于一种培养具有crabtree-阴性表型的酵母细胞的方法，该方法包括用培养基在高于大约35℃的温度下培养该细胞，该培养基包含戊糖碳。
在另一方面，本发明的特征在于一种培养具有crabtree-阴性表型的酵母细胞的方法，该方法包括用培养基在高于大约35℃的温度下培养该细胞，该培养基包含玉米纤维水解产物。
在另一方面，本发明的特征在于包含重组序列和选定序列的核酸构建体，该重组序列相应于具有crabtree-阴性表型的细胞的基因组序列，该基因组序列编码细胞表达的酶，该选定序列编码导致在细胞内形成有机产物的酶。选定序列可在重组序列内以便选定序列的每一端都是该重组序列侧翼。
在另一方面，本发明的特征在于制备该重组酵母细胞的方法，包括提供具有crabtree-阴性表型的酵母细胞，选择一个最终产物，鉴定需要加入细胞中以生产该最终产物的一个或多个外源性酶，鉴定其活性在所述细胞中下降以允许在所述细胞内生产所述最终产物的一个或多个内源性酶，将鉴定的一个或多个外源性酶添加到所提供的酵母细胞中，并降低所鉴定的一个或多个内源性酶在所提供的酵母细胞中的活性以便该细胞在培养条件下产生该最终产物。
在另一方面，本发明的特征在于一种玉米纤维水解产物，该水解产物具有大约2.0和大约6.5之间的pH值，该水解产物可含有葡萄糖，木糖，和阿拉伯糖。该水解产物可包含大约40克/L葡萄糖，大约40克/L木糖，和大约20克/L阿拉伯糖。作为选择，该水解产物可包含大约38.7克/L-葡萄糖，大约39.1克/L-木糖，大约20.7克/L-阿拉伯糖，和1.6克/L-糠醛。
在另一方面，本发明的特征在于一种制备有机产物的方法，包括a)在培养条件下培养微生物，其中该微生物具有降低的酶活性；该酶活性可以是丙酮酸脱羧酶，乙醇脱氢酶，乙醛脱氢酶，或乙酰-CoA合成酶活性；该微生物在没有乙醇和乙酸盐时表现出的生长率是对相应于不具有所述降低的酶活性的微生物所观察到的生长率的至少大约30％，和b)改变培养条件以促进该有机产物的生产。
在另一方面，本发明的特征在于一种制备有机产物的方法，包括a)在促进细胞呼吸的培养条件下培养微生物，其中该微生物具有降低的酶活性；该酶活性可以是丙酮酸脱羧酶，乙醇脱氢酶，乙醛脱氢酶，或乙酰-CoA合成酶活性；该微生物在没有乙醇和乙酸盐时表现出的生长率是对相应于不具有该降低的酶活性的微生物所观察到的生长率的至少大约30％，和b)改变培养条件以减少细胞呼吸，从而促进该有机产物的生产。
除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常的理解具有相同的意义。尽管在本发明的实践或试验中可使用相似于或相当于本文所述的方法和材料，但是下面也描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物，专利申请，专利，和其它参考文献以其整体引用以供参考。如有冲突，本说明书，包括定义将进行核对。另外，材料，方法和实施例都仅仅是说明性的，而不打算作为限制。本发明的其它特征和优势从下面的详细描述和从权利要求书将是显而易见的。


图1是描述pHES质粒的图示。
图2是描述pSEH质粒的图示。
图3是描述产生含有Lh-LDH或者Pa-LDH的pCRII质粒的图示。
图4是描述LDH/pCRII质粒的图示。
图5是描述产生含有Lh-LDH或者Pa-LDH的pHES质粒的图示。
图6a是描述产生丙酮酸脱羧酶(PDC)敲除片段的图示。
图6b是描述包含K.marxianus 1.7kbp PDC1的5.5kbp片段的图示。
图6c是描述缺失5.5kbp PDC同源区域的400bp并插入卡那霉素抗性基因的图示。
图6d是描述含有卡那霉素抗性基因和周围2.3kbp PDC1的4kb区域的图示。
图6e是描述7.5kbp K.thermotolerans PDC1和周围区域的图示。
图6f是描述从1.7kbp PDC1基因缺失750bp且插入卡那霉素抗性基因的图示。
图7是在低pH(pH 2.5)和高温(40℃)条件下培养的Kluyveromycesmarxianus的生长(光密度；OD)对时间(小时)的布点图。
图8是用葡萄糖，木糖，或阿拉伯糖在30℃下培养的K marxianus的生长(OD)对时间(小时)的布点图。
图9是用玉米纤维水解产物在30℃下培养的K marxianus的生长(OD)对时间(小时)的布点图。
图10是在30℃和所示pH下培养的K.marxianus的生长(OD)对时间(小时)的布点图。
图11是在40克乳酸存在时在30℃和所示pH下培养的K.marxianus的生长(OD)对时间(小时)的布点图。
图12显示了在需氧条件下在含有2％葡萄糖的无机培养基中培养时S.uvarum和K.marxianus的(A)生物量生产；(B)葡萄糖消耗；和(C)乙醇生产的3个布点图。
图13显示了在厌氧条件下在含有2％葡萄糖的无机培养基中培养时S.uvarum和K.marxianus的(A)生物量生产；(B)葡萄糖消耗；和(C)乙醇生产的3个布点图。
图14是PDCI启动子载体的质粒图谱。
图15是优选实施方案的详细描述本发明提供了涉及有机产物生产的方法和材料。具体地说，本发明提供了酵母细胞，培养酵母细胞的方法，制备酵母细胞的方法，核酸构建体，和生产各种有机产物的方法和材料。
本文提供的酵母细胞可用于生产有机产物。该有机产物可用于广泛的应用中。例如，本文所述的酵母细胞生产的有机产物可用作食品防腐剂或添加剂，药品，或化妆品，且可用于制备塑料以及其它产品。
为了本发明的目的，有机产物是含有碳原子的任意化合物。例如，有机产物是羧酸盐(例如，乳酸盐，丙烯酸盐，柠檬酸盐，异柠檬酸盐，α-酮戊二酸盐，琥珀酸盐，延胡索酸盐，苹果酸盐，草酰乙酸盐)，糖类(例如，D-木糖)，糖醇(例如，木糖醇，阿糖醇，核糖醇)，氨基酸(例如，甘氨酸，色氨酸，谷氨酸)，脂类，酯，维生素(例如，L-抗坏血酸盐)，多元醇(例如，甘油，1，3-丙二醇，赤藓醇)，醛，烯烃，炔烃，和内酯。因此，有机产物可含有1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多个碳原子。另外，有机产物可具有不超过大约1,000(例如，不超过大约900，800，700，600，500，400，300，200，或100)的分子量。例如，D-木糖(C5H10O5)是分子量为150的有机产物。另外，有机产物可以是发酵产物。本文使用的术语“发酵产物”是指由发酵过程产生的任何有机化合物。
一般来说，发酵过程涉及诸如糖类的有机化合物向诸如乙醇的化合物的厌氧酶促转化，产生腺苷三磷酸(ATP)形式的能量。因此，发酵与细胞呼吸的区别在于有机产物而不是分子氧用作电子受体。发酵产物的例子包括，但不限于乙酸盐，乙醇，丁酸盐，和乳酸盐。
有机产物也可以是丙酮酸盐衍生的产物。本文使用的术语“丙酮酸盐衍生的产物”是指在不超过15个酶促步骤内从丙酮酸盐合成的任何化合物。酶促步骤是由具有酶活性的多肽催化的任何化学反应或反应系列。本文使用的术语“具有酶活性的多肽”是指催化其它物质的化学反应而在反应完成时其本身不被破坏或改变的任何多肽。一般来说，酶多肽催化从一种或多种底物形成一种或多种产物。该多肽可具有任何类型的酶活性，包括，但不限于，与诸如乌头酸酶，异柠檬酸脱氢酶，酮戊二酸脱氢酶，琥珀酸硫激酶，琥珀酸脱氢酶，延胡索酸酶，苹果酸脱氢酶，柠檬酸合成酶，2，5-二氧戊酸脱氢酶，5-脱氢-4-脱氧-D-葡糖二酸脱氢酶，葡糖二酸脱水酶，乙醛脱氢酶，葡糖醛酸内酯还原酶，L-古洛糖酸内酯氧化酶，2-脱氢-3-脱氧-D-戊酸醛缩酶，木糖酸脱水酶，木糖酸内酯酶，D-木糖脱氢酶，乳酸脱氢酶，CoA-转移酶，乳酰基-CoA脱水酶，或丙烯酰-CoA水合酶的一种酶相关的酶活性。
重要的是应注意到具有特定酶活性的多肽可以是一种天然存在的或者非天然存在的多肽。天然存在的多肽是具有天然发现的氨基酸序列的任何多肽，包括野生型和多态性多肽。该天然存在的多肽可从任何物种获得，包括，但不限于哺乳动物，真菌，和细菌物种。非天然存在的多肽是具有在自然界中未发现的氨基酸序列的任何多肽。因此，非天然存在的多肽可以是天然存在的多肽的突变形式，或者构建的多肽。例如，具有柠檬酸合成酶活性的非天然存在的多肽可以是保留了至少一些柠檬酸合成酶活性的天然存在的具有柠檬酸合成酶活性的多肽的突变形式。多肽可通过，例如，序列添加，缺失，和/或取代进行突变。
有机产物如果需要超过15个酶促步骤从丙酮酸盐合成则该产物不是丙酮酸盐衍生的产物。丙酮酸盐衍生的产物的例子包括，但不限于，柠檬酸盐，α-酮戊二酸盐，琥珀酸盐，延胡索酸盐，苹果酸盐，草酰乙酸盐，2-脱氢-3-脱氧-D-木糖酸盐，D-木糖酸盐，D-木糖酸内酯，D-木糖，丙烯酸盐，乙酸盐，乙醇，丁酸盐，和乳酸盐。
为了本发明的目的，可以是“游离酸”或“盐”形式的羧酸盐产物将使用盐形式命名法称呼。例如，乳酸将称为乳酸盐。因此，在这种情况下，可预料到术语“乳酸盐”包括乳酸以及乳酸盐。
本文使用的术语“核酸”包含RNA和DNA，包括cDNA，基因组DNA，和合成(例如，化学合成的)DNA。核酸可以是双链或单链。如果是单链，核酸可以是有义链或反义链。另外，核酸可以是环型或线型。涉及核酸分子和特定细胞时本文使用的术语“外源性”或“异源性”是指不是来自于天然发现的该特定细胞的任何核酸分子。因此，所有非天然存在的核酸分子一旦被导入细胞则认为对该细胞是外源性的。重要的是应注意到非天然存在的核酸分子可含有天然发现的核酸序列或核酸序列的片段，只要该核酸分子作为整体在自然界中不存在。例如，在表达载体内含有基因组DNA序列的核酸分子被认为是非天然存在的核酸分子，因此，一旦导入细胞中则认为对细胞是外源性的，因为该核酸分子作为一个整体(基因组DNA加上载体DNA)在自然界中不存在。因此，作为整体在自然界中不存在的任何载体，自主复制的质粒，或病毒(例如，逆转录病毒，腺病毒，或疱疹病毒)都被认为是非天然存在的核酸分子。同理通过PCR或限制性核酸内切酶处理产生的基因组DNA片段以及cDNA也被认为是非天然存在的核酸分子，因为它们以自然界中未发现的分离分子存在。同理含有以自然界未发现的方式排列的启动子序列和多肽编码序列(例如，cDNA或基因组DNA)的任何核酸分子也认为是非天然存在的核酸分子。
术语“内源性”是指不是外源性的基因组材料。一般来说，内源性基因组材料在生物体，组织，或细胞内形成，且未通过重组技术插入或修饰。内源性基因组材料的范围内包含天然存在的变异。
重要的是还应注意到天然存在的核酸分子对于特定细胞可能是外源性的。例如，从人X的细胞分离的整个染色体一旦被导入人Y的细胞则相对于人Y的细胞可认为是外源性核酸分子。
本文使用的短语“遗传修饰的”是指其基因组通过例如，添加，取代或缺失遗传材料被修饰的生物体。添加或缺失遗传材料的方法是已知的且包括，但不限于，随机诱变，点突变，包括插入，缺失和取代，敲除技术，和使用重组技术用核酸序列转化生物体，包括稳定和瞬时转化子。酵母细胞也可天然或者由于遗传修饰而分解代谢淀粉，且甚至可通过加入例如，基于真菌的纤维素酶遗传修饰成分解代谢纤维素。
1.具有crabtree-阴性表型的酵母细胞本发明提供了具有crabtree-阴性表型的各种遗传修饰的酵母细胞。该重组酵母细胞可用于生产有机产物。例如，本发明提供了具有crabtree-阴性表型，且含有外源性核酸分子的酵母细胞，该核酸分子编码具有导致有机产物形成的酶活性的多肽。只要它们产生该有机产物则该酵母细胞在本发明的范围内。应注意产生的有机产物可从酵母细胞中分泌出来，这样排除了需要破碎细胞膜以回收该有机产物。一般来说，在生产产物的最佳条件下培养时本发明的酵母细胞产生该有机产物的产量是每消耗100克葡萄糖产生至少大约40克(例如，至少大约45，50，55，65，70，75，80，85，90，或95克)的有机产物。当测定特定酵母细胞的有机产物生产的产量时，可使用任何方法。例如，参见Kiers等，Yeast，14(5)459-469(1998)。还应注意到编码多肽的酶活性可导致以NADH-消耗方式形成有机产物。换句话说，该有机化合物的生产需要NADH作为能源。术语“NAD”是指在特定氧化-还原反应中充当电子和氢载体的辅因子，而术语“NADH”是指NAD的还原形式。其合成需要NADH的有机产物的例子包括，但不限于，乳酸盐，乙醇，乙酸盐，和丙烯酸盐。一般来说，本发明范围内的酵母细胞分解代谢诸如葡萄糖的己糖碳。然而，该酵母细胞也可分解代谢戊糖碳(例如，核糖，阿拉伯糖，木糖，和来苏糖)。换句话说，本发明范围内的酵母细胞可天然利用戊糖碳，或者可以改造成利用戊糖碳。例如，酵母细胞可接受一种编码木糖还原酶，木糖醇脱氢酶，和/或木酮糖激酶的外源性核酸分子以便可分解代谢木糖。酵母细胞也可天然或者由于遗传修饰而分解代谢淀粉，且甚至可通过加入，例如，基于真菌的纤维素酶而被遗传修饰成分解代谢纤维素。具有crabtree-阴性表型的酵母细胞是不表现出crabtree效应的任何酵母细胞。术语“crabtree-阴性”是指天然存在的和遗传修饰的生物体。简单地说，crabtree效应定义为在需氧条件下培养时由于存在高葡萄糖浓度(例如，50克葡萄糖/L)微生物的氧消耗被抑制。换句话说，具有crabtree-阳性表型的酵母细胞由于葡萄糖的存在而不论氧是否可得均可继续发酵，而具有crabtree-阴性表型的酵母细胞不表现出葡萄糖介导的氧消耗抑制。典型具有crabtree-阴性表型的酵母细胞的例子包括，但不限于，来自下列属的酵母细胞Kluyveromyces，Pichia，Hansenulo，Candida，Trichosporon，和Yamadaryrna。
如本文所述，本发明提供了能产生众多种类的不同有机产物的许多不同类型的重组酵母细胞。例如，酵母细胞可含有编码具有乳酸脱氢酶活性的多肽的外源性核酸分子以便生产乳酸盐。该多肽的例子包括，但不限于，牛乳酸脱氢酶，细菌乳酸脱氢酶，和真菌乳酸脱氢酶(例如，K.lactis或K.thermotolerans真菌乳酸脱氢酶)。另外，具有诸如乳酸脱氢酶活性的酶活性的多肽可以是天然存在的或非天然存在的。重要的是应注意到本文所述的酵母细胞可含有单拷贝或多拷贝(例如，大约5，10，20，35，50，75，100或150个拷贝)的特定外源性核酸分子。例如，酵母细胞可含有大约50个拷贝的外源性核酸分子X。重要的是还应注意到本文所述的酵母细胞可含有一个以上的特定外源性核酸分子。例如，酵母细胞可含有大约50个拷贝的外源性核酸分子X以及大约75个拷贝的外源性核酸分子Y。在这些情况下，每个不同的核酸分子可编码具有其自身独特酶活性的不同多肽。例如，酵母细胞可含有4个不同的外源性核酸分子以便生产丙烯酸盐。在该例子中，该酵母细胞可含有编码具有乳酸脱氢酶活性的多肽的第一外源性核酸分子，编码具有CoA-转移酶活性的多肽的第二外源性核酸分子，编码具有乳酰基-CoA脱水酶活性的多肽的第三外源性核酸分子，和编码具有丙烯酰基-CoA水合酶活性的多肽的第四外源性核酸分子。在另一例子中，酵母细胞可含有4个不同的外源性核酸分子以便产生D-木糖。具体地说，该酵母细胞可含有编码具有2-脱氢-3-脱氧-D-戊酸醛缩酶活性的多肽的第一外源性核酸分子，编码具有木糖酸脱水酶活性的多肽的第二外源性核酸分子，编码具有木糖酸内酯酶活性的多肽的第三外源性核酸分子，和编码具有D-木糖脱氢酶活性的多肽的第四外源性核酸分子。在另一例子中，酵母细胞可含有6个不同的外源性核酸分子以便产生维生素，即L-抗坏血酸盐。具体地说，该酵母细胞可含有编码具有2，5-二氧戊酸脱氢酶活性的多肽的第一外源性核酸分子，编码具有5-脱氢-4-脱氧-D-葡糖二酸脱氢酶活性的多肽的第二外源性核酸分子，编码具有葡糖二酸脱水酶活性的多肽的第三外源性核酸分子，编码具有乙醛脱氢酶活性的多肽的第四外源性核酸分子，编码具有葡糖醛酸内酯还原酶活性的多肽的第五外源性核酸分子，编码具有L-古洛糖酸内酯氧化酶活性的多肽的第六外源性核酸分子。
重要的是应注意到可使用酶多肽以便所需的有机产物是光学上纯的(例如，大约90，95，99％的纯度)。例如，具有(L)-乳酸脱氢酶活性的多肽可用于产生(L)-乳酸盐。
本发明范围内的酵母细胞也可具有降低的酶活性，例如丙酮酸脱羧酶和/或乙醇脱氢酶活性降低。对于细胞和特定的酶活性而言本文使用的术语“降低”是指酶活性的水平比在相同物种的可比酵母细胞中测量的水平更低。因此，缺乏丙酮酸脱羧酶活性的酵母细胞被认为具有降低的丙酮酸脱羧酶活性，因为大多数(如果不是全部的话)可比酵母细胞具有至少一些丙酮酸脱羧酶活性。该降低的酶活性可以是酶浓度更低，酶比活更小，或者其结合的结果。可使用许多不同的方法制备酶活性降低的酵母细胞。例如，酵母细胞可使用常规诱变或敲除技术改造成具有被破坏的酶编码基因座。参见，Methodsin Yeast Genetics(1997编辑)，Adams，Gottschling，Kaiser，和Stems，冷泉港出版社(1998)。作为选择，可使用反义技术降低酶活性。例如，酵母细胞可改造成含有编码防止酶制备的反义分子的cDNA。本文所用的术语“反义分子”包含含有相应于内源性多肽编码链的序列的任何核酸分子。反义分子也可具有侧翼序列(例如，调控序列)。因此，反义分子可以是核酶或反义寡核苷酸。核酶可具有任何常规结构，包括，但不限于，发夹，锤头，或斧头状结构，只要该分子裂解RNA。
酶活性降低的酵母细胞可使用任何方法鉴定。例如，使用常规方法可容易地鉴定丙酮酸脱羧酶活性降低的酵母细胞。参见，Ulhrich，Methods inEnzymology 18109-115(1970)。
2.具有crabtree-阳性或crabtree-阴性表型的酵母细胞本发明还提供了各种遗传改造的酵母细胞，该细胞不必具有crabtree-阴性表型，即该细胞可以是crabtree-阳性或crabtree-阴性。该重组酵母细胞可用于产生有机产物。例如，本发明提供了含有外源性核酸分子的酵母细胞，该核酸分子编码促进细胞戊糖碳(例如，核糖，阿拉伯糖，木糖，和来苏糖)分解代谢的多肽。具体地说，酵母细胞可具有编码木糖还原酶，木糖醇脱氢酶，和/或木酮糖激酶的外源性核酸分子使得木糖以更有效的方式被代谢。另外，能分解代谢戊糖碳的酵母细胞可还能依次或者同时分解代谢己糖碳(例如，阿洛糖，阿卓糖，葡萄糖，甘露糖，古洛糖，iodose，半乳糖，和塔罗糖)。例如，可修饰酵母细胞以便同时分解代谢木糖和葡萄糖。应注意分解代谢戊糖碳能力增强的酵母细胞可用于构建能从戊糖碳源产生有机产物的酵母细胞。这一特征特别具有优势，因为诸如木糖的戊糖碳一般比诸如葡萄糖的己糖碳更廉价。可被分解代谢的其它碳源包括，但不限于，蜜二糖，蔗糖，果糖，棉子糖，水苏糖，淀粉(例如，玉米淀粉和小麦淀粉)，和水解产物(例如，玉米纤维水解产物和其它纤维素水解产物)。
另外，本发明提供了含有外源性核酸分子的酵母细胞，该核酸分子编码促进乙酰-CoA在细胞质中积累的多肽。例如，酵母细胞可具有编码具有柠檬酸裂合酶活性的多肽的外源性核酸分子。作为选择，酵母细胞可具有编码促进乙酰-CoA穿透过线粒体膜的线粒体膜多肽的外源性核酸分子。应注意到缺乏乙醇生产能力的许多酵母细胞在缺乏乙醇和乙酸盐时不能生长。一般来说，当丙酮酸脱羧酶或者乙醇脱氢酶活性以某种方式缺乏时酵母细胞缺乏产生乙醇的能力。例如，缺乏丙酮酸脱羧酶活性的crabtree-阳性酵母(例如，Saccharomyces)在缺乏乙醇和乙酸盐时难以生长。
因此，为了改道利用丙酮酸盐产生其它有机产物(例如，乳酸盐和丙烯酸盐)，以减少乙醇生产的方式对该crabtree-阳性酵母的改造导致当没有乙醇和乙酸盐时生长特性较差，特别是由于当存在葡萄糖时crabtree-阳性酵母限制细胞呼吸。如本文所述，以非依赖于细胞质乙酸盐浓度和乙酰-CoA合成酶活性的一些方式可促进细胞质乙酰-CoA积累的酵母细胞在没有乙醇和乙酸盐时即使不能产生乙醇也可生长。应注意到具有在没有乙醇和乙酸盐时的生长能力但缺乏产生乙醇的能力的酵母细胞可改道利用丙酮酸盐产生非乙醇的有机产物。
任何类型的酵母可含有编码促进乙酰-CoA在细胞质中积累的多肽的外源性核酸分子。例如，具有crabtree-阴性或crabtree-阳性表型的酵母细胞可含有编码促进乙酰-CoA在细胞质中积累的多肽的外源性核酸分子。一般来说，通过(1)改造含有外源性核酸分子的细胞使其缺乏丙酮酸脱羧酶或乙醇脱氢酶活性，(2)测定细胞的生长特征，同时在存在滴定量的呼吸抑制剂(例如，抗霉素A，氰化物，或叠氮化物)时培养细胞，和(3)比较其生长特征与不含外源性核酸分子且也被改造成缺乏丙酮酸脱羧酶或乙醇脱氢酶活性的可比酵母细胞观察到的生长特征可鉴定该酵母细胞。通过该比较由于存在外源性核酸分子测定为具有更良好的生长特征的酵母细胞被认为是含有编码促进乙酰-CoA在细胞质中积累的多肽的外源性核酸分子。
含有编码促进乙酰-CoA在细胞质中积累的多肽的外源性核酸分子的酵母细胞也可具有降低的酶活性，例如降低的丙酮酸脱羧酶和/或乙醇脱氢酶活性。例如，，酵母细胞可缺乏产生乙醇的能力。一般来说，该酵母细胞在缺乏乙醇和乙酸盐的培养条件下的生长率比不含外源性核酸分子且也在相似条件(即缺乏乙醇和乙酸盐的培养条件)下培养的可比酵母细胞(即缺乏乙醇生产能力的酵母细胞)观察到的生长率更高(例如，高大约百分之5，10，20，35，50，75，100，150，200，或更高)。
本发明还提供了具有多肽活性降低的酵母细胞。该酵母细胞可具有crabtree-阳性或crabtree-阴性表型。例如，本发明范围内的酵母细胞具有活性降低的胞质膜多肽(例如，胞质膜转运蛋白)，细胞质多肽(例如，丙酮酸脱羧酶)，和/或线粒体多肽(例如，丙酮酸脱氢酶)。术语“胞质膜转运蛋白”是指帮助有机产物移动通过胞质膜的多肽。该多肽的例子包括，但不限于诸如酿酒酵母中的JEN1(Genbank登录号U241 55)的羧酸转运蛋白。术语“线粒体多肽”是指在线粒体内起作用的任何多肽，包括，但不限于，丙酮酸脱氢酶，参与乳酸盐或乙酰-CoA分解代谢的多肽(例如，细胞色素b2多肽)，和三羧酸循环酶。三羧酸循环酶包括乌头酸酶，异柠檬酸脱氢酶，酮戊二酸脱氢酶，琥珀酸硫激酶，琥珀酸脱氢酶，延胡索酸酶，苹果酸脱氢酶，和柠檬酸合成酶。如本文所述，酶活性降低的酵母细胞包括完全缺乏特定酶活性的酵母细胞。重要的是应注意本文使用的术语“降低的”对于酵母细胞和多肽活性是指比在相似条件下在相同种类的可比酵母细胞中测量的活性水平更低。因此，如果可比细胞具有至少一些转运活性则缺乏特定转运活性的酵母细胞认为是具有降低的转运活性。该降低的多肽活性可以是由于多肽浓度更低，多肽比活更低，或其结合。可使用各种方法中的任一种制备具有多肽活性降低的酵母细胞。例如，可使含有编码线粒体多肽的核酸序列的基因座失活，例如，通过常规诱变或敲除技术可使其失活。
应注意到线粒体酶活性降低的酵母细胞可积累三羧酸循环产物(例如，柠檬酸盐，异柠檬酸盐，α-酮戊二酸，琥珀酰-CoA，琥珀酸盐，延胡索酸盐，苹果酸盐，和草酰乙酸盐)。例如，延胡索酸酶活性降低的酵母细胞可积累延胡索酸盐。另外，酵母细胞可含有编码一种多肽的外源性核酸分子，该多肽具有导致形成一种有机产物的酶活性，以便该细胞可产生该有机产物。
重要的是应注意有些三羧酸循环产物不能穿透线粒体膜(例如，α-酮戊二酸，琥珀酰-CoA)。因此，特定三羧酸循环酶活性降低将导致某些三羧酸循环产物在线粒体腔内积累。在这种情况下，具有三羧酸循环酶活性降低的酵母细胞可改造成含有一个或多个不同的外源性核酸分子，每个核酸分子编码一个具有不同酶活性的多肽，使得所需三羧酸循环产物在细胞质内积累。例如，酮戊二酸脱氢酶活性降低将导致α-酮戊二酸积累，后者又将导致异柠檬酸盐积累。α-酮戊二酸不能穿透线粒体膜，而异柠檬酸盐可穿透线粒体膜。因此，异柠檬酸盐可在细胞质内积累。然而，也含有编码具有异柠檬酸脱氢酶活性的多肽的外源性核酸分子并在细胞质内表达该功能性多肽的酵母细胞可产生细胞质α-酮戊二酸。因此，降低特定三羧酸循环酶的活性同时提供编码在细胞质内具有功能的相同(或不同)三羧酸循环酶的外源性核酸分子可导致在细胞质内产生各种三羧酸循环产物(或三羧酸循环产物的衍生产物)。
另外，本发明提供了具有降低的酶活性且从生物量或所需有机产物的生产转移碳源利用的酵母细胞。例如，可破坏甘油或某些途径内的酶并利用培养基内的碳源主要生产生物量或所需有机产物。甘油途径酶的例子包括，但不限于，二羟丙酮磷酸还原酶。某些途径酶的例子包括，但不限于α-乙酰乳酸合成酶和α-乙酰乳酸脱羧酶。另外，可使用任何方法降低酶活性。
另外，本文提供的任一酵母细胞可含有充当杀伤质粒(killer plasmid)的外源性核酸分子。本文使用的术语“杀伤质粒”是指给一种酵母提供杀伤另一种酵母的能力的核酸分子。例如，含有杀伤质粒的来自Kluyveromyces属的酵母细胞可防止来自糖酵母属(Saccharomyces)的酵母生长。因此，具有杀伤质粒的酵母细胞可用于防止在大规模生产过程中出现的污染问题。另外，可给酵母细胞提供任何类型的杀伤质粒。例如，从K.thetis分离的杀伤质粒可提供给K.marxianus酵母细胞。使用常规方法可容易地鉴定含有杀伤质粒的酵母细胞。参见，例如，Gunge等，J.Bacteriol.145382-390(1981)；Gunge和Kitada，Eur.J.Epidemiol.，4409-414(1988)；和Wesolowski-Louvel等，Nonconventional yeasts in Biotechnology；Kluyveromyces lactis，Klaus Wolf，Springer Verlag编辑，柏林，第138-201页(1996)。
同样，本文提供的任一酵母细胞可含有编码具有修饰的ATP酶活性的多肽的外源性核酸分子使得该酵母细胞变得对低pH环境更有耐受性。例如，酵母细胞可接受一种ATP酶，当细胞外质子浓度高时它能有效维持低细胞质质子浓度。该多肽可按Mor somme等(EMBOJ.155513-5526(1996))所述构建。
重要的是应注意本文所述的任一重组酵母细胞可含有任意组合的所述遗传操作。例如，具有crabtree-阳性表型的酵母细胞可含有编码具有柠檬酸裂合酶活性的多肽的外源性核酸分子以及编码具有导致形成一种有机产物的酶活性的多肽的外源性核酸分子。
3合适的生物体各种生物体均适合于根据本发明的用途。除了诸如包括酿酒酵母(S.Cerevisiae)和S.uvarum的糖酵母种类，包括K.thermotolerans，K.Lactis，和K.marxianus的Kluyveromyces，Pichia，包括H.polymorpha的Hansenula，Candida，Trichosporon，包括Y.styptic.的Yamadazyma，或Torulaspora pretoriensis的crabtree阴性和crabtree阳性酵母微生物外，来自大批微生物种类的生物体也可用作乳酸生产的宿主。例如，可遗传修饰诸如Rhizopus oryzae，一种天然乳酸生产菌的生物体的酸耐受性，产量提高，和光学上纯的乳酸。也已知曲霉属(Aspergillus)种类生产诸如柠檬酸的各种有机酸且耐受低pH。遗传修饰曲霉属(Aspergillus)种类以生产乳酸的方法是可得到的。另外，诸如根霉菌属(Rhizopus)和曲霉属(Aspergillus)种类的真菌产生使其能将淀粉和其它糖类聚合物降解成单体糖类以用作碳源的酶。
诸如大肠杆菌，Zymomonas mobilis和芽孢杆菌(bacillus)属种类的原核生物已经或者可被遗传修饰用于乳酸生产。被鉴定为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulas)的微生物也是乳酸的天然生产菌，它可被进一步经遗传修饰以提高低pH下的乳酸生产。另外，来自Archea科的嗜极端菌生物体可耐受极端的低pH和高温。对来自该科的选定种类的遗传修饰可提供乳酸生产菌。
4.遗传学方面可使用任何方法鉴定并获得编码具有酶活性的多肽的核酸分子。例如，标准核酸测序技术和根据遗传密码将核酸序列翻译成氨基酸序列的软件程序可用于确定特定核酸序列与已知酶多肽是否具有任何序列同源性。可使用诸如MEGALIGN(DNASTAR，Madison，WI，1997)的序列对比软件来比较各种序列。另外，使用常规分子克隆技术(例如，定点诱变)可突变编码已知酶多肽的核酸分子。可能的突变包括，但不限于，缺失，插入，和碱基取代，以及缺失，插入，和碱基取代的结合。另外，可使用核酸和氨基酸数据库(例如，GenBank)鉴定编码具有酶活性的多肽的核酸序列。简单地说，与具有酶活性的多肽具有一些同源性的任何氨基酸序列，或与编码具有酶活性的多肽的序列具有一些同源性的任何核酸序列都可用作检索词来检索GenBank。然后可分析鉴定的多肽以测定它们是否表现出酶活性。
使用常规分子克隆或包括PCR的化学核酸合成方法和技术可鉴定并获得编码具有酶活性的多肽的核酸分子。PCR是指与美国专利号4,683,195所述，和后来对其所述方法的改良方法以相似的方式扩增靶核酸的方法或技术。一般来说，使用目的区域末端或更远处的序列信息设计与待扩增的潜在模板的互补链在序列上相同或相似的寡核苷酸引物。使用PCR，可从RNA或DNA扩增核酸序列。例如，从总细胞RNA，总基因组DNA，和cDNA以及从噬菌体序列，质粒序列，病毒序列等通过PCR扩增可分离核酸序列。当使用RNA作为模板来源时，可使用逆转录酶合成互补DNA链。
另外，可使用核酸杂交技术来鉴定并获得编码具有酶活性的多肽的核酸分子。简单地说，可使用编码已知酶多肽的任何核酸分子，或其片断作为探针通过在中度至高度严格条件下杂交来鉴定相似的核酸分子。然后可分离，测序，并分析该相似的核酸分子以确定该编码肽是否具有酶活性。通过Southern或Northern分析可进行杂交以分别鉴定与探针杂交的DNA或RNA序列。探针可用诸如32P的放射性同位素，酶，洋地黄毒苷标记，或通过生物素标记法标记。待分析的DNA或RNA可在琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，转移到硝酸纤维素，尼龙，或其它合适薄膜上并使用本领域熟知的诸如Sambrook等(1989)，Molecular Cloning，第二版，冷泉港实验室，Plainview，NY的7.39-7.52章节所述的标准技术与探针杂交。一般来说，探针长度为至少大约20个核苷酸。例如，可使用相应于编码哺乳动物柠檬酸裂合酶的20个核苷酸序列的探针来鉴定编码具有柠檬酸裂合酶活性的真菌多肽的核酸分子。另外，可使用比20个核苷酸更长或更短的探针。
可使用任何方法将外源性核酸分子导入细胞。事实上，将核酸导入酵母细胞的许多方法是本领域的技术人员所熟知的。例如，原生质的转化，电穿孔，接合，和融合是将核酸导入酵母细胞的常规方法。参见，例如，Ito等，J.Bacterol.153163-168(1983)；Durrens等，Curr Genet.187-12(1990)；和Becker和Guarente，Methods in Enzymology 194182-187(1991)。
重要的是应注意本发明的酵母细胞中包含的外源性核酸分子可以任何方式在该细胞内维持。例如，外源性核酸分子可整合进细胞基因组中或以游离状态维持。换句话说，本发明的细胞可以是稳定或瞬时转化子。另外，本文所述的酵母细胞可含有单拷贝，或多拷贝(例如，大约5，10，20，35，50，75，100或150个拷贝)的上述特定外源性核酸分子。从外源性核酸分子表达氨基酸序列的方法是本领域的技术人员所熟知的。该方法包括，但不限于构建核酸使得调控元件启动编码多肽的核酸序列表达。一般来说，调控元件是在转录水平上调控其它DNA序列表达的DNA序列。因此，调控元件包括，但不限于，启动子，增强子等。另外，在酵母中从外源性核酸分子表达多肽的方法是本领域的技术人员熟知的。例如，能在Kluyveromyces中表达外源性多肽的核酸构建体是熟知的。参见，例如，美国专利号4,859,596和4,943,529。
如本文所述，本发明范围内的酵母细胞含有外源性核酸分子，例如，编码具有导致形成一种有机产物的酶活性的多肽的外源性核酸分子。鉴定含有外源性核酸的细胞的方法是本领域的技术人员所熟知的。该方法包括，但不限于，PCR和诸如Northern和Southern分析的核酸杂交技术。在某些情况下，可使用免疫组织化学和生物化学技术通过检测由特定核酸分子编码的酶多肽的表达来确定细胞是否含有特定核酸。例如，可使用对编码酶具有特异性的抗体鉴定特定酵母细胞是否含有该编码酶。另外，可使用生物化学技术通过检测由于酶多肽的表达而产生的有机产物来确定细胞是否含有编码酶多肽的特定核酸分子。
例如，将编码具有乳酸脱氢酶活性的多肽的外源性核酸分子导入正常情况下不表达该多肽的酵母细胞后检测乳酸盐可指示该酵母细胞不仅含有导入的外源性核酸分子，而且还从该导入的外源性核酸分子表达编码的酶多肽。检测特定酶活性或特定有机产物的存在的方法是本领域的技术人员所熟知的。例如，乳酸盐的存在可按在别处的描述测定。参见，Witte等，J.BasicMicrobiol.29707-716(1989)。
本发明还提供了含有重组序列和选定序列的核酸构建体。本文所用的术语“重组序列”是指相应于在细胞内发现的基因组序列的任何核酸序列。本文所述的重组序列可用于在产生敲除生物体期间指导重组事件。换句话说，重组序列可用于特异性破坏含有编码特定酶的核酸序列的基因座。
本文所用的术语“选定序列”包括任何核酸序列。一般来说，选定序列编码具有导致在细胞内形成有机产物的酶活性的多肽。因此，本发明的核酸构建体可用于在一个步骤中敲除内源性酶活性并加入外源性酶活性。在大多数情况下，选定序列在重组序列内使得选定序列的每一端侧翼是重组序列。
5.有机产物的生产和培养方法本发明提供了使用本文提供的任何酵母细胞或其它微生物细胞生产有机产物的方法。该方法包括提供酵母细胞和用培养基培养所提供的酵母细胞以便产生一种有机产物(例如，甘油，丙烯酸盐，木糖，抗坏血酸盐，乳酸盐，柠檬酸盐，异柠檬酸盐，α-酮戊二酸，琥珀酰-CoA，琥珀酸盐，延胡索酸盐，苹果酸盐，和草酰乙酸盐)。一般来说，培养基和/或培养条件可分类成两种类型中的一种促进细胞呼吸和/或生物量生产的培养基和/或培养条件和减少细胞呼吸的培养基和/或培养条件。一般来说，促进细胞呼吸的培养基和/或培养条件在如果需要迅速生长，或者如果生产的有机产物在没有细胞呼吸时不能产生的情况下使用。该有机产物可包括，但不限于三羧酸循环产物。另一方面，减少细胞呼吸的培养基和/或培养条件在如果不需要或者不希望迅速生长，或者如果生产的有机产物在没有细胞呼吸时可以产生的情况下使用。该有机产物包括，但不限于，乳酸盐，丙烯酸盐，和木糖。
本文使用的短语“促进细胞呼吸”或“促进生物量生产”当是指培养条件时，意思是维持该细胞培养条件以便培养基内的碳源主要通过氧化呼吸被代谢或者主要代谢为产生生物量。本文所用的术语“生物量”是指生物体的干重。本文所用的短语“主要代谢为产生生物量”意思是消耗每克碳源(以糖类形式)产生至少大约0.3克生物量(例如，至少大约0.4，0.45，0.5或0.6克生物量)。一般来说，每克碳源产生的生物量在大约0.3至大约0.6克之间。测定培养物中的生物量(细胞干重)含量的方法是已知的且包括，例如，Postma等，“酿酒酵母在限制葡萄糖的化学恒定培养中Crabtree效应的酶学分析”，Appl Environ.Microbiol.53，468-477(1989)；和Kliers等，“Kluyveromyces lactis CBS 2359在分批和化学恒定培养中乙醇发酵的调节”，Yeast，14，459-469(1998)所述的方法。测定消耗的碳源量的方法是已知的，且包括，例如HPLC方法。
应注意到碳源利用的效率依赖于碳源和生物体。因此，尽管可使用包含非糖类碳源的复合生长培养基，但是每克碳源产生的生物量仅仅是指消耗每克糖类碳源产生的生物量。
一般来说，含有细胞呼吸抑制剂的培养基(例如，抗霉素A，氰化物，和叠氮化物)可减少细胞呼吸，而缺乏该抑制剂可促进细胞呼吸。同样，厌氧培养条件可减少细胞呼吸，而需氧培养条件可促进细胞呼吸。需氧条件是氧被导入或者天然存在且用作呼吸途径底物的任何条件。一般来说，术语“需氧”是指在空气流速至少0.1VVM(空气体积/液体体积/分钟)(例如，大于0.2，0.3，0.4，0.5，1.0，1.5或2.0VVM)下维持培养基的培养条件。
如果使用非空气的气体，那么可根据气体的氧含量将名义上的VVM调节到与空气相当。另外，“需氧”可定义为具有相对于在大气压下空气饱和状态存在的含量的至少百分之2(例如，至少百分之5，10，20，30，40，50，60，75或80)的溶解氧含量的培养基。厌氧条件是其中故意或者天然使得呼吸途径基本上得不到氧，导致，例如产生诸如乙醇的还原产物的任何条件。一般来说，如果培养基具有不超过大约2.0％(例如，不超过大约1.5，1.0，或0.5％，或等于大约0％)的溶解氧(DO)含量的条件认为是厌氧条件。同样，具有不超过大约0.1(例如，不超过大约0.05，或等于大约0)的VVM(空气体积/液体体积/分钟)的条件认为是厌氧条件。一般来说，对于VVM，本文使用的术语“空气”是指大气中存在的空气。可影响细胞呼吸的其它培养条件包括，但不限于，pH，温度，和特定碳源(例如，葡萄糖)的存在。重要的是应注意在一种酵母内促进细胞呼吸的一些培养基和/或培养条件可减少另一种内的细胞呼吸。例如，培养基内存在葡萄糖在具有crabtree-阳性表型的酵母细胞中减少细胞呼吸而在具有crabtree-阴性表型的酵母细胞中对细胞呼吸具有很小或没有影响。
商业生产期间培养条件的定向控制可以是达到本文所述的所需有机产物的最佳水平的一个重要步骤。一般来说，本发明范围内的酵母细胞在促进细胞呼吸的培养条件下生长以产生有效的细胞密度。例如，酵母细胞可放入培养容器中，并供给充足的葡萄糖和氧。一般来说，在促进细胞呼吸的条件下，本文提供的微生物的倍增时间不超过大约10小时(例如，不超过大约8，5，或3小时)。一旦细胞达到有效密度，可将培养条件转换成减少细胞呼吸的条件以便产生不需要细胞呼吸的有机产物。例如，可将酵母细胞转移进培养容器中并供给充足的葡萄糖，但没有氧。在这种情况下，直接控制培养条件使其从需氧转换到厌氧可产生最佳水平的所需有机产物。另外，在有些情况下，细胞仅仅在促进细胞呼吸的条件下培养以便产生需要细胞呼吸的有机产物。应注意生产容器内的细胞量一般高于大约2g/L(例如高于大约4，6，或8g/L)。
培养期间，温度可高于大约35℃(例如，高于大约36，37，38，39，40，41，42，43，44，或45℃)。另外，培养基可以是液体的。培养基一般含有碳源。一般来说，碳源包括含糖类的原材料。一般来说，营养培养基还含有氮源。优选的氮源包括有机和无机含氮化合物的组合。在一种操作方式中，需要用培养基填充大型发酵容器，该培养基包含为生物量生产和目的产物生产足够的所有必需营养成分和所有糖类。该容器开始可在例如，通过提供需氧条件促进生物量生产的条件下运转，然后转换成以另一运转方式生产目的产物的厌氧条件，较小容器用于生物量生产，以高水平的营养成分和足够的糖类产生例如，大约100g/L生物量。
然后可将该容器的内容物转移进含有第二培养基的较大容器中，该培养基含有较少的营养成分，例如仅有葡萄糖作碳源或在水中的其它糖类碳源。该容器可在生产所需有机产物的厌氧条件下运转。由于营养水平降低和厌氧条件导致生物量生长降低。
在一个优选的实施方案中，营养培养基仅维持必需物质以简化目的产物的回收。相对于如果需要在厌氧条件下生长所需的培养基，使用需氧生长允许简化所用的培养基。许多本文所述的酵母可在需氧条件下，在仅由糖类，无机氮源，微量矿物质，和一些维生素组成的培养基中生长。由于发酵或其它过程有机产物加入培养基前，培养基一般具有在大约5.0和7.0之间的pH。然而，随着诸如有机酸的有机产物由微生物分泌进培养基中，培养基的pH倾向于降低。本文使用的术语“有机pH”是指由培养基中存在的诸如羧酸，例如乳酸的有机化合物产生的培养基的pH。本文所用的术语“无机pH”是指诸如HCl和H2SO4的无机化合物产生的pH。培养基可具有不超过大约3.0(例如，不超过大约2.9，2.8，2.7，2.6，2.5，2.4，2.3，2.2，2.1，2.0，1.9，1.8，1.7，1.6，或1.5)的有机pH值，或不超过大约3.0(例如，不超过大约2.9，2.8，2.7，2.6，2.5，2.4，2.3，2.2，2.1，2.0，1.9，1.8，1.7，1.6，或1.5)的无机pH值。培养过程中可使用任何碳源。例如，可使用含有戊糖碳(例如，核糖，阿拉伯糖，木糖，和来苏糖)的培养基。另外，可使用含有玉米纤维水解产物的培养基。玉米纤维水解产物可具有2.0和6.5之间的pH值。一般来说，玉米纤维水解产物含有葡萄糖，木糖，和阿拉伯糖。例如，玉米纤维水解产物可含有大约40克/L葡萄糖，大约40克/L木糖，和大约20克/L阿拉伯糖。对于大规模生产过程，可使用下面的方法。首先，用特定微生物接种含有合适培养基的大发酵罐(例如，50-，100-，200-，或更大加仑数的发酵罐)，其中该培养基含有例如，己糖和/或戊糖碳。接种后，可控制培养条件使得碳源主要用于生产生物量。例如，培养基可调节成具有大约7.0的pH值，大约35℃的温度，在整个发酵罐中产生需氧环境的溶氧量。应注意到所需的有机产物可在该生物量生产阶段期间产生。一旦达到足够的生物量，可将含有微生物的培养基转移进第二发酵罐。该第二发酵罐可以是任意大小。例如，第二发酵罐可以更大，更小，或与第一发酵罐具有相同大小。一般来说，第二发酵罐比第一发酵罐更大以便可向来自第一发酵罐的培养基中加入另外的培养基。此外，第二发酵罐内的培养基可与第一发酵罐使用的培养基相同或不同。例如，第一发酵罐可含有带木糖和阿拉伯糖的培养基，而第二发酵罐含有带葡萄糖的培养基。
一旦转移，可控制第二发酵罐中的培养条件使得碳源主要用于生产有机产物，其中“有机产物”包括丙酮酸盐衍生产物和二氧化碳(CO2)等，但不包括生物量(即，细胞干重)。本文使用的短语“主要生产‘选定的有机产物’”或“选定的丙酮酸盐衍生产物”当指培养条件时，意思是培养基内的碳源一般通过发酵过程(尽管不是必须的)被代谢，使得消耗每克碳源形成至少0.5克有机产物(例如，至少0.6，0.75或0.8克有机产物)。测定产生的有机产物和/或消耗的碳源的量的方法是已知的且包括，例如，HPLC。
如以前所述，碳源利用的效率可依赖于底物和生物体而变化。因此，尽管可使用包含非糖类碳源(例如，氨基酸)的复合生长培养基，但是每克碳源产生的有机产物或丙酮酸盐衍生产物的量仅仅是指消耗每克糖类碳源产生的有机产物或丙酮酸盐衍生产物的量。优选的是，在这一阶段，每克碳源产生不超过0.3克的生物量(例如，不超过0.2，0.1，或0.05克生物量)。例如，可将培养基调节成具有在整个发酵罐产生厌氧环境的溶氧含量，或含有细胞呼吸抑制剂。另外，可调节培养基使其维持特定的pH值(例如，酸性，中性，或碱性pH 10的值)。作为选择，可定期调节培养基的pH而不维持在任何特定的pH值。一般来说，当生产有机产物时，培养基的pH值维持在至少大约1.5(例如，至少大约2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，或7.0)以上。另外，随着微生物分解代谢所提供的碳源，发酵罐内的温度会升高。因此，可调节培养基使其维持特定的温度。作为选择，可定期调节培养基的温度而不维持在任何特定的温度。一般来说，当使用热敏感性微生物时维持在不超过大约35℃(例如，不超过大约34，33，32，31，或30℃)的温度，而当使用热不敏感性微生物时维持在不超过大约45℃(例如，不超过大约44，43，42，41，40，39，38，37，36，或35℃)的温度。应注意到在该有机产物生产期间可生产生物量。另外，第二发酵罐内的培养条件可一次或多次从促进产物生产的条件转换到促进生物量生产的条件，反之亦然。例如，第二发酵罐内的培养条件可在大多数时间是厌氧的，并有短暂的溶氧脉冲使其定期存在需氧条件。
在另一方法中，可修改厌氧培养条件以便通过，例如，加入末端电子受体来增加培养微生物的代谢能量。本文使用的术语“代谢能量”是指生物体从能源(例如碳源)产生的能量(以ATP形式)。在有些情况下，生物体从碳源代谢获得的代谢能量的量高于在不同条件下从相同碳源获得的能量。
活细胞是高度有序的且必需在其内部建立有序使其存活和生长。为了维持生物体内的有序，生物体内在任一瞬间会发生成千次不同的化学反应。例如，细胞需要能量用于诸如DNA，RNA和蛋白质聚合反应的生物合成反应和形成代谢产物。细胞也需要能量用于将底物携带进细胞，保持细胞内的代谢产物，维持合适的膨压和内部pH，以及用于运动。由于不能产生或者破坏了能量，细胞需要从环境中输入能量以维持有序。能量一般以电磁辐射或化学能量的形式从环境提供。从环境获得的能量通过两个常规生化机制之一底物水平磷酸化和电子传递被使用的细胞所驾驭。一般来说，在厌氧条件下，ATP(能量的“细胞货币”)通过底物水平磷酸化产生。在底物水平磷酸化中，能量从化学键释放且主要以ATP的形式储存。底物水平形成的一个例子是葡萄糖通过糖酵解转变成丙酮酸
然后丙酮酸可转变成乳酸
上述转化产生的净能量等于2个ATP。
丙酮酸可进一步进行三羧酸(TCA)循环并产生另外的能量和氢原子
葡萄糖呼吸的净反应
因此，通过底物水平磷酸化，葡萄糖完全呼吸成CO2将提供相当于4个ATP的净能量和24个氢原子。在“电子传递”中，构成“电子传递链”成员的化合物的氧化-还原潜力是平衡的使得各成员可被在前成员的还原形式所还原。因此，还原力以电子形式通过载体分子链流向诸如氧(O2)，硝酸盐(NO3)，和延胡索酸盐的末端电子受体。向培养基中加入诸如氧，硝酸盐或延胡索酸盐的末端电子受体可给微生物提供增加的代谢能量(例如，消耗相同量的碳源增加ATP生产)。
氧是最优选的末端电子受体。例如，如果使用氧作为末端电子受体，通过电子传递链可加工氢并给细胞提供额外的每个氢原子1.5个ATP和每个氧原子3个ATP。一般来说，通过测量耗氧量与消耗的葡萄糖量的比率可测定代谢能量的量。表1列出了生产期间加入氧时能量产量的预期最大和最小增加值(每摩尔葡萄糖的ATP摩尔数)与由于进入TCA循环(且随后进行呼吸)的丙酮酸盐损失而减少的产物产量的函数。假定P/O比率为3计算最大增加％，而假定P/O比率为0.5计算最小增加值％。表2显示了消耗每摩尔葡萄糖估计的最大耗氧量。加入氧可启动最小生长，这将消耗碳用于生物合成而留下少量的碳用于呼吸(且，因此利用氧)。
表1.


表2.

因此，为了提高细胞培养物中微生物的代谢能量，可向细胞培养物中加入氧作为末端电子受体。尽管从葡萄糖产生乳酸的最大摩尔产量是每摩尔葡萄糖产生2摩尔乳酸盐，且从葡萄糖产生的ATP摩尔产量是每摩尔葡萄糖产生2摩尔ATP，但是加入氧作为末端电子受体允许一些丙酮酸盐被引导进入柠檬酸循环(TCA)，其中它被转化成CO2和能量。因此，提供末端电子受体增加了微生物的代谢能量。
丙酮酸转向TCA循环将导致减少产生的其它丙酮酸盐衍生产物(例如乳酸)的量。例如，产量降低10％可导致微生物产生增多2.6倍的代谢能量，产量降低20％可导致微生物产生增多4.2-5倍的代谢能量，产量降低50％可导致微生物产生增多9倍的代谢能量。
可预期在方法的后期阶段，当存在高水平的诸如乳酸的代谢产物时，细胞可能需要更多代谢能量维持功能。
因此，需要使厌氧培养基内的微生物接触短暂脉冲的溶解氧。优选的是，短暂脉冲的溶解氧导致培养基具有的溶解氧浓度不超过0.5％，优选在大约百分之0.1和0.5之间。作为选择，通过加入诸如硝酸盐或延胡索酸盐的其它末端电子受体可增加厌氧发酵期间微生物的生长率或细胞维持。以刚好足以增加微生物的代谢能量而维持所需水平的生产率的水平加入氧。必须细心以避免过多的产量损失。该技术也可用于帮助消耗剩余糖类，从而进一步简化回收方法。
6.有机产物的纯化方法一旦生产出来，可使用任何方法分离目的产物。例如，可使用常规分离技术从培养液中去掉生物量，且可使用常规分离方法(例如，提取，蒸馏，和离子交换方法)从无微生物的培养液中获得该有机产物。参见，美国专利号4,275,234；美国专利号5,510,526；美国专利号5,831,122；美国专利号5,641,406；和国际专利申请号WO 93/00440。另外，可在其生产的同时分离该所需有机产物，或者可在产物的生产阶段结束后从培养液中分离它。重要的是应注意到可控制第二发酵罐内的培养条件以便改进分离方法。例如，可控制第二发酵罐内的pH和温度使得所需有机产物从溶液中沉淀出来，或者以更有利于分离的形式存在。具体地说，当培养液的pH低于有机酸的pKa值时，该有机酸的pH值可使溶液沉淀。例如，生产谷氨酸时的培养条件可以是pH低于2.19，它是谷氨酸的pKa值。因此，控制pH，温度，和培养基的含量可帮助有机产物分离。另外，可选择特定遗传修饰的酵母和/或可控制特定的培养条件使得培养液内的任何副产物不干扰所需有机产物的回收。
可预料到本文所述的方法和材料可适应和用于任何类型的培养方法，包括，但不限于，通常称为“连续发酵”和“分批发酵”方法的方法。另外，在一个生产过程中使用的微生物可被回收并在后来的生产过程中再利用。例如，微生物可多次再利用以产生所需的有机产物。另外，可使用任何碳源。例如，可使用阿洛糖，阿卓糖，葡萄糖，甘露糖，古洛糖，iodose，半乳糖，塔罗糖，蜜二糖，蔗糖，果糖，棉子糖，水苏糖，核糖，阿拉伯糖，木糖，来苏糖，诸如玉米淀粉和小麦淀粉的淀粉，和诸如玉米纤维水解产物和其它纤维素水解产物的水解产物作为碳源用于生物量或所需有机产物的生产。另外，可使用任何培养基。例如，可使用标准培养基(例如，酵母基本培养基和YP培养基(酵母提取物10g/L，蛋白胨肉汤20g/L))以及诸如玉米浸渍水溶液和玉米浆的培养基。本发明的重要优势在于优选的微生物，特别是在需氧条件下生长时，可利用基本培养基。厌氧生产一般不需要额外的营养成分，因此可使用各种分离技术中的任一种从相对清洁的发酵培养液中分离最终产物。液相-液相萃取是从发酵培养液分离有机酸的熟知技术，且导致较好的纯化。根据本发明，相信这种更简单，更廉价，能耗更少的系统也是有用的。
在一个实施方案中，本发明在驯养型(train-type)方法中使用具有crabtree-阴性表型的遗传修饰的酵母，该方法在达到临界细胞密度后且此时需要显著增加所需有机产物的单位生产率时诱导代谢途径的“转换”。诱导代谢途径转换的典型方法是将生物量从高度充气的容器转移到基本上厌氧的容器中，引起氧饥饿。应注意可使用常见糖类(例如，葡萄糖或木糖)作为生长期和生产期的碳源。使用具有crabtree-阴性表型的遗传修饰的酵母细胞对该实施方案的成功是关键性的。另外，所需有机产物的单位生产率也是成功的关键。本文所用的术语“单位生产率”反映了产生的产物量且表示为每小时每克生物量(干重)产生的有机产物的克数，即g/(g*小时)。一般来说，诸如乳酸盐和丙烯酸盐的有机产物的单位生产率高于大约0.1g/(g*小时)，例如，高于大约0.2g/(g*小时)，或高于大约0.5g/(g*小时)。通过提供本文所述的高单位生产率，在基本上厌氧的条件下通过发酵产物途径可获得细胞维持所需的能量，而不是依赖于充气通过呼吸途径产生高能量。
应注意基本上厌氧的容器以不超过大约0.1VVM的速率通气。在某些生产情况下，不使用通气。另外，在该实施方案中的产量(即，g有机产物/g消耗的碳源)一般高于大约70wt％，且在没有加入诸如乙醇和乙酸盐的碳源的条件下产生。在某些情况下，为了达到产生细胞维持所需能量需要的单位生产率，除了提供生产目的产物必需的酶外，增强从葡萄糖到丙酮酸盐的途径可能也是必须的。
在另一实施方案中，可设计驯养型方法以便只有高度充气的生长容器配备有灭菌能力。厌氧型生产容器一般在高于大约35℃(例如，高于大约36，37，38，39，40，41，42，43，44，或45℃)的温度下运转。很少有野生型酵母能够在产物生产期间随着pH下降在该温度下存活且与遗传修饰的酵母竞争，特别是因为它们没有可产生能量用于细胞维持的增强发酵途径，另外，该酵母可改造成含有能防止来自其它种类的酵母存活的本文所述的“杀伤质粒”。本发明还提供了培养酵母细胞的各种方法。例如，具有crabtree-阴性表型的酵母细胞可用具有不超过大约3.0的有机pH值，或含有玉米纤维水解产物的培养基培养。培养酵母细胞的其它方法包括，但不限于，在高于大约35℃的温度下用具有不超过大约3.0的无机pH值，或者含有戊糖碳或玉米纤维水解产物的培养基培养具有crabtree-阴性表型的酵母细胞。
另外，本发明提供了制备有机产物的方法。该方法包括在培养条件下生长一种微生物，并改变培养条件以促进有机产物的生产。在该方法中，微生物具有降低的丙酮酸脱羧酶，乙醇脱氢酶，乙醛脱氢酶，和/或乙酰-CoA合成酶活性，并表现出在没有乙醇和乙酸盐的条件下生长率为在没有降低丙酮酸脱羧酶，乙醇脱氢酶，乙醛脱氢酶，和/或乙酰-CoA合成酶活性的相应微生物中观察到的生长率的至少大约百分之30(例如，大约百分之35，40，50，75，100，150，200，或更大)。一般来说，促进细胞呼吸的培养条件在这样的情况下使用，即其中需要迅速生长，或其中待生产的有机产物在没有细胞呼吸时不能生产，而减少细胞呼吸的培养条件在这样的情况下使用，即其中不需要迅速生长，或者其中待生产的有机产物在没有细胞呼吸时能够生产。
在下面的实施例中将进一步描述本发明，该实施例不应限制权利要求书中所述的本发明的范围。
实施例实施例1-重组质粒pHES/pSEH用限制性酶HindIII消化Chien等(Proc.Natl Acad.Sci.，889578-9582(1991))所述的0.5ug质粒pGAD424。通过使用TBE缓冲液在0.8％的琼脂糖凝胶上凝胶电泳分离消化混合物。然后按Sambrook等，(出处同上)所述从凝胶中纯化5.9kbp的片断。设计具有多个限制性酶识别位点的92bp合成寡聚体的互补对。第一个命名为fwd HES寡聚体且具有如下序列5′-CCCAAGCTTGAATTCCCCGGGGGATCCCTGCAGGGTACCACGCGTAGATCTACTAGTGCGGCCGCCTCGAGTCTAGAGGGCCCAAGCTTGGG-3′(SEQ ID NO1)。第二个命名为camphes寡聚体并具有如下序列5′-CCAAGCTTGGGCCCTCTAGACTCGAGGCGGCCGCACTAGTAGATCTACGCGTGGTACCCTGCAGGGATCCCCCGGGGAATTCAAGCTTGGG-3′(SEQ ID NO2)。通过煮沸10分钟并逐渐冷却到室温使500nmoles的两个互补寡聚体互相退火。用HindIII消化该双链92bp DNA并与HindIII消化的5.9kbp pGAD424连接。使用该连接混合物按Sambrook等，(出处同上)所述通过电穿孔转化大肠杆菌DH10B(electromax细胞，LifeTechnologies，Rockville，MD)。将重组大肠杆菌涂布在Luria-Bertani肉汤平板上，使用100μg/mL的抗生素氨苄青霉素选择含有质粒的细胞。从氨苄青霉素抗性大肠杆菌克隆筛选质粒DNA以获得两个质粒pHES和pSEH(图1和2)。这两个质粒区别在于合成寡聚体相对于载体上乙醇脱氢酶-ADHI启动子的方向。
实施例2-从瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)和乳酸小球菌(Pediococcus acidilactici)PCR扩增编码乳酸脱氢酶的核酸使用PUREGENE基因组DNA分离试剂盒(Gentra systems，Minneapolis，MN)从瑞士乳杆菌(ATCC 10797)和乳酸小球菌(ATCC 25741)的过夜培养物分离基因组DNA。设计PCR引物从瑞士乳杆菌(1h-1dh寡聚体)和乳酸小球菌(pa-1dh寡聚体)基因组DNA分离编码乳酸脱氢酶的核酸。这些引物根据Genbank数据库中可得的乳酸脱氢酶基因序列设计，且具有如下序列5’1h-1dh，5’-CCGGGATCCATGGCAAGAGAGGAAAAACCTC-3’(SEQ ID NO3)；3’1h-1dh，5-CCAAGATCTTTATTGACGAACCTTAACGCCAG-3’(SEQ ID NO4)；5’pa-1dh5’-CCGGGATCCATGTCTAATATTCAAAATCATC AAAAAG-3’(SEQ IDNO5)；和3’pa-1dh，5’-CCAAGATCTTTATTTGTCTTGTTTTTCAGCAAG-3’(SEQ IDNO6)。使用可从Sci-ed软件(Durham，NC)获得的引物设计(Primer Designer)软件优化引物。1umole的基因组DNA与100nmoles的引物一起使用。Pfu DNA聚合酶(New England Biolabs)用于按Sambrook等，(出处同上)所述PCR扩增乳酸脱氢酶(LDH)核酸。
采用相似的策略从诸如芽孢杆菌属(Bacillus)种类，例如Bacillusmegaterium(ATCC 6458)或Rhizopus oryzae(ATCC 76275)的微生物，或者任何其它产生乳酸盐的生物(包括诸如真菌和细菌的微生物和诸如哺乳动物的多细胞生物)或者来自产生乳酸盐的生物的组织的基因组DNA分离编码L-乳酸脱氢酶的核酸。使用PUREGENE基因组DNA分离试剂盒(Gentra systems，Minneapolis，MN)从生长的生物培养物中分离基因组DNA。根据可从Genbank获得的来自这些物种的LDH基因序列设计合适的PCR引物分离编码乳酸脱氢酶的核酸。一般来说，1μmole的基因组DNA与100nmoles的合适引物一起使用。Pfu DNA聚合酶(New England Biolabs)或任何其它合适的DNA聚合酶用于使用例如按Sambrook等，(出处同上)所述的PCR技术从各基因组DNA扩增乳酸脱氢酶(LDH)核酸。
作为选择，编码乳酸脱氢酶的核酸可使用如下任一方法从Kluyveromyces thermotolerans(ATCC 52709)，Trichodenna reesci(ATCC13631)，Torulaspora pretoriensis(ATCC 36245)，或任何其它产生乳酸脱氢酶的生物中分离。
1)使用标准技术(Sambrook等，(出处同上))将来自一种这类生物的基因组cDNA文库克隆进诸如pUC19的标准大肠杆菌表达载体。用该文库转化大肠杆菌(1dh pfi)突变体菌株NZNI 11(Bunch等，(1997)，“编码大肠杆菌发酵乳酸脱氢酶的1dhA基因”，Microbiology，143187-95)且细胞在补充了酪蛋白氨基酸的M9培养基中在厌氧条件下生长。在这种条件下生长的任何大肠杆菌要么编码乳酸脱氢酶，要么是1dh或pf1的回复突变型。使用能区分(L)-LDH和(D)-LDH的乳酸特异性软琼脂覆盖(LASSO)的比色试验(Witte等，1989，Basic Microbiol.29707-716(1989))筛选LDH活性的阳性集落(在厌氧生长条件下形成的集落)。然后分离和测序来自怀疑表达1-乳酸脱氢酶的克隆的质粒DNA。
2)K.thermotolerans ATCC 52709，Treesei ATCC 13631和Torulasporapretoriensis ATCC 36245都是在厌氧条件下培养时产生L-乳酸的真核生物(Wine等(Basic Microbiol.29707-716(1989))，因此，根据该方法，这些菌株中至少一个在厌氧条件下生长以诱导乳酸脱氢酶活性。然后使用标准方法获得无细胞提取物并进行已知蛋白质纯化方法以分离乳酸脱氢酶。纯化乳酸脱氢酶的方法是已知的(Kelly等，(1978)，“细菌乳酸脱氢酶的亲和层析”，Biochem J.，171543-7)。蛋白质纯化后，将其部分裂解和测序以测定氨基酸序列。然后使用该氨基酸序列设计简并引物以便从基因组DNA分离编码乳酸脱氢酶的基因。
真核LDH，例如从K.Thermotolerans或Trichoderma reesei或Torulaspora pretoriensis分离的LDH比来自诸如芽孢杆菌属(Bacillus)或乳酸杆菌属(Lactobacillus)的细菌来源的LDH相比在酵母K.Marxianus中更好地起作用(对于其转录效率，翻译效率和/或蛋白质活性)。
3)使用可从Genbank获得的已知真核乳酸脱氢酶基因序列，设计简并引物从K.thermotolerans ATCC 52709，T.reesei ATCC 13631或Torulospora pretoriensis ATCC 36245的基因组DNA分离乳酸脱氢酶基因。使用LDH基因序列中保守的NAD+结合位点和丙酮酸盐结合位点设计简并引物。1μmole基因组DNA与100nmoles引物一起使用。Pfu DNA聚合酶(NewEngland Biolabs)或任何其它合适的DNA聚合酶用于按已知PCR方法，例如Sambrook等，(出处同上)所述的方法，扩增L-乳酸脱氢酶(LDH)核酸的片断。
实施例3-将瑞士乳杆菌(L.helveticus)和乳酸小球菌(P.acidilactici)的LDH基因克隆进pCRII载体使用从Invitrogen(CArlsbad，CA)获得的TA克隆试剂盒将PCR扩增的LDH DNA产物与pCRII载体(图3和4)连接。然后使用Sambrook等，(出处同上)所述的方法用该连接混合物转化大肠杆菌DH10B。该试剂盒提供的pCRII载体允许按照产品说明书快速克隆该PCR产物。含有来自瑞士乳杆菌和乳酸小球菌的LDH基因的pCRII载体在图4中描绘。
实施例4-在pHES载体中含有瑞士乳杆菌和乳酸小球菌LDH基因的重组质粒pLh 1dh-HES/pPa 1dh-HES含有瑞士乳杆菌和乳酸小球菌LDH基因的pCRII载体用合适的限制性核酸内切酶消化。pHES载体同样用相同的限制性核酸内切酶消化。然后将含有来自pCRII载体的LDH的1kbp插入片断使用T4 DNA连接酶按Sambrook等，(出处同上)所述连接进6.0kbp pHES载体中。使用该连接混合物转化大肠杆菌DH10B(electromax细胞，Life Technologies，Rockville，MD)，并选择氨苄青霉素抗性的重组克隆。分析从重组克隆分离的DNA以证实pLh1dh-HES和pPa 1dh-HES载体(图5)。这些载体含有在酵母乙醇脱氢酶启动子(ADH1)控制下的pHES载体中编码瑞士乳杆菌和乳酸小球菌LDH的基因。
实施例5-克隆芽孢杆菌属(Bacillus)种类，Rhizopus oryzae，K.Thermotolerans，Trichoderma reesei或Torulaspora pretoriensis LDH基因用于使用酵母属PDC1基因启动子的表达尽管可使用在Rhizopus oryzae，K thermotolerans，Trichodermareesei或Torulaspora pretoriensis中发现的乳酸脱氢酶启动子控制在K.marxianus中克隆的乳酸脱氢酶基因的表达，但是也可使用来自酿酒酵母的PDC1启动子控制该分离的乳酸脱氢酶基因的表达。酿酒酵母的糖酵解启动子已成功地用于表达Kluyveromyces菌株中的基因。(Gellissen和Hollenberg，(1997)，“基因表达研究中的酵母应用酿酒酵母，Hansenulapolymorpha和Kluyveromyces lactis的比较——综述”，Gene，19087-97)。
因此，来自酿酒酵母的PDC1启动子通过使用可在Genbank中获得的酿酒酵母基因组序列设计合适的寡聚体引物获得。通过PCR技术扩增PDC1基因序列和PDC1基因周围的1Kb区域。所得的4Kb DNA片断含有控制PDC1基因表达的启动子和终止子。在控制PDC1基因表达的启动子和终止子之间包含多个限制性酶位点使得可插入在PDC1启动子和终止子控制下的各种LDH基因。将4Kb DNA片断插入合适的载体中，例如以pUC 19为基础的酿酒酵母或大肠杆菌穿梭载体。然后在该启动子和终止子控制下的一个多克隆位点处将LDH基因导入载体中使得乳酸脱氢酶基因的表达受PDC1启动子和终止子控制(图14)。
作为选择，其它酵母属糖酵解启动子，例如控制酿酒酵母甘油醛-3磷酸脱氢酶或磷酸甘油酸激酶基因表达的启动子同样可用于表达K marxianus的克隆LDH基因。
实施例6-扩增同源DNA的线型片断用于丙酮酸脱羧酶的基因破坏设计含有与K.Marxianus丙酮酸脱羧酶(PDC)5’端相同的51bp和与pHES载体ADH1启动子5’端相同的30bp的82bp寡聚体引物(5’kmPDClKo)。5’kmPDClKo的序列如下5′-TAAACAGTACAATCGCAAAGAAAAGCTCCACACCCAAACCAAATAATTGCAATGCAACTTCTTTTCTTTTTTTTTCTTTTCT-3’(SEQ ID NO7)。从提取的Genbank序列获得酵母(K.Marxianus或Y.stipitis或H.polymorpha)PDC基因的序列。同样，设计含有与PDC基因3’端相同的54bp和与ADH1终止子3’端相同的22bp的反向79bp寡聚体(3’kmPDClKo)。3’kmPDClKo的序列如下5’-TTATAAAATCATTAAAATCCAAAATCGTAATTTATCTCTTTATCCTCTCCCTCTCTACATGCCGGTAGAGGTGTGGTCA-3’(SEQ ID NO8)。设计该引物从pLh-1dh-HES和pPa-1dh-HES质粒扩增线型DNA片断，其中该片断含有与ADH1启动子和终止子在一起的完整乳酸脱氢酶基因(图6)。该PCR扩增产物还含有与来自K.marxianus PDC1，Yamadazyma stipitis PDC1和PDC2，以及Hansenula polymorpha PDCI和PDC2之一的序列同源的末端。使用Pfu DNA聚合酶(New England Biolabs；Beverly，MA)进行扩增反应。100ng的pLh-1dh-HES或5pPa-1dh-HES与5单位的聚合酶和100nmoles的寡聚体一起用于反应。按Sambrook等，(出处同上)所述的方法进行反应。图6描绘了具有所述同源性的最终线型产物。
制备了另一构建体以提高获得K marxianus的pdc阴性菌株的可能性。为了制备这些构建体，使用PCR和基因组步查(genome walking)技术(Clonetech)分离包含Kmarxianus 1.7kbp PDC1基因的5.5kbp片断(图6b)。然后使用标准方法将该5.5kbp片断克隆进pCRII TA克隆载体(Invitrogen)中。通过限制性消化(Sambrook等，出处同上)从K.marxianus5.5kbp片断取出靠近1.7kbp PDCI编码区的中部的大约370bp的部分。取出的片断具有如下序列CCGGTTCTTTCTCTTACTCTTACAAGACCAAGAACATTGTCGAATTCCACTCCGACTACATCAAGGTCAGAAACGCCACTTTCCCAGGTGTCCAAATGAAGTTCGTCTTGCAAAAGTTGTTGACCAAGGTCAAGGATGCTGCTAAGGGTTACAAGCCAGTTCCAGTTCCTCACGCTCCAAGAGACAACAAGCCAGTTGCTGACTCTACTCCATTGAAGCAAGAATGGGTCTGGACTCAAGTCGGTAAGTTCCTACAAGAAGGTGATGTTGTTCTAACTGAAACCGGTACCTCCGCTTTCGGTATCAACCAAACCCACTTCCCAAATGACACCTACGGTATCTCCCAAGTCTTGTGGGGTTCCATTGGTTTCA(序列ID No.10)。
然后使用标准限制性技术(参见Sambrook等)从pPIC9K载体(Invitrogen)分离卡那霉素抗性基因及其启动子，并克隆进5.5kbp中取出了上述鉴定片断的位点中。插入pPIC9K(Invitrogen)卡那霉素抗性基因及其启动子使得插入区的序列如下GTACAACTTGAGCAAGTTGTCGATCAGCTCCTCAAATTGGTCCTCTGTAACGGATGACTCAACTTGCACATTAACTTGAAGCTCAGTCGATTGAGTGAACTTGATCAGGTTGTGCAGCTGGTCAGCAGCATAGGGAAACACGGCTTTTCCTACCAAACTCAAGGAATTATCAAACTCTGCAACACTTGCGTATGCAGGTAGCAAGGGAAATGTCATACTTGAAGTCGGACAGTGAGTGTAGTCTTGAGAAATTCTGAAGCCGTATTTTTATTATCAGTGAGTCAGTCATCAGGAGATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGACCTGCAGGGGGGGGGGGGGCGCTGAGGTCTGCCTCGTGAAGAAGGTGTTGCTGACTCATACCAGGCCTGAATCGCCCCATCATCCAGCCAGAAAGTGAGGGAGCCACGGTTGATGAGAGCTTTGTTGTAGGTGGACCAGTTGGTGATTTTGAACTTTTGCTTTGCCACGGAACGGTCTGCGTTGTCGGGAAGATGCGTGATCTGATCCTTCAACTCAGCAAAAGTTCGATTTATTCAACAAAGCCGCCGTCCCGTCAAGTCAGCGTAATGC
TCTGCCAGTGTTACAACCAATTAACCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTTTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGATGATATATTTTTATCTTGTGCAATGTAACATCAGAGATTTTGAGACACAACGTGGCTTTCCCCCCCCCCCCTGCAGGTCGGCATCACCGGCGCCACAGGTGCGGTTGCTGGCGCCTATATCGCCGACATCACCGATGGGGAAGATCGGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTGGCAGGCCCCGTGGCCGGGGGACTGTTGGGCGCCATCTCCTTGCATG(序列ID No.9).
所得的构建体含有被大约5kbp的pdc区包围的G418抗性基因，如图6c所示。制备了一个相似的DNA构建体，它含有在pCRII载体中被2.3kbp的K.marxianus PDC1包围的内部G418基因，如图6d所示。
实施例7 使用线型DNA片断破坏内源性PDC编码序列并同时插入一个LDH编码序列使用实施例5所述的通过PCR产生的线型DNA片断转化K.Marxianus，Yamadazyma stipitis，或Hansenula polymorpha。用于转化的方法如Wesolowski-Louvel等所述(NONCONVENTIONAL YEASTS IN BIOTECHNOLOGYKLUYVEROMYCES LACTIS，编辑Klaus Wolf，Springer Verlag，柏林，第138-201页(1996))。简单地说，离心5mL的过夜培养物并用电穿孔缓冲液(10nMTris-HCI，270nM蔗糖，1nM MgCl2，pH 7.5)洗涤。然后将洗涤的细胞在30℃下在培养缓冲液(5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨肉汤，10g/L葡萄糖，25nM DTT，20nM HEPES，pH 8.0)中培养30分钟。在该阶段结束时，再次洗涤细胞并重悬于400uL培养缓冲液中。向这些细胞中加入DNA(200ng)，并在0.4cm比色杯中使用Bio-Rad基因脉冲仪以1800伏特，1000Cl，和25μF脉冲细胞。
将细胞涂布在常规YPD(10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨肉汤，20g/L葡萄糖，15％琼脂平板)上，允许菌落再生72小时以上。带有菌落的各平板复制涂布在新鲜的YPD平板上并培养48小时。然后菌落用6.5％软琼脂(0.5％琼脂在300mM Tris-HCl，187mM谷氨酸，pH 8.3中)覆盖。向覆盖的平板中加入染色混合物(3.2mL的1％琼脂，1.6mL的120mM Tris，75mM谷氨酸，pH 8.3，0.4mL的2mg/mL吩嗪硫酸甲酯，7单位的谷氨酸丙酮酸转氨酶，和7单位的L(+)-猪肌肉乳酸脱氢酶)。
具有高L(+)的酵母菌株在10-120分钟内形成蓝色菌环。该方法类似于Subden等(Canadian J.Microbiol.，28883-886(1982))建议的方法，且由Witte等(J.Basic Microbial.29707-716(1989))修改。选择该菌落，通过PCR分析试验从该菌落分离的DNA并测序以检测破坏的丙酮酸脱羧酶基因。
在另一实施方案中，将上文实施例6中所述且在图6c和6d中描绘的克隆用两个限制性酶消化(参见，Sambrook等；出处同上)以产生大约3微克的含有同源性PDC区的DNA片断，该PDC区包含插入卡那霉素抗性基因的中间序列。使用诸如电穿孔的已知技术用该片断转化K marxianus以破坏K.marxianus的pdc。
一般来说，按如下方法进行电穿孔a)以20mL的体积在YPAD中生长微生物的培养物过夜(-15h)；b)从该培养物中转移500uL到微量离心管中，以离心@4L4mm，弃去上清；c)用1mL冷EB(EB＝电穿孔缓冲液10mM Tris-HCl，pH 7.5；270mM蔗糖；1mM MgCl2)洗涤沉淀；d)重悬于1mL IB(IB＝培养缓冲液YPD；25mM DTT；20mM HEPES，pH8.0)中；e)在Eppendorf Thermomixer中30℃下以800rpm摇动30分钟；f)离心，用EB洗涤一次，重悬于400uL EB中；g)加入3微克DNA片断(在10mM Tris-Cl，pH 8.5的水中)，在冰上培养30分钟；h)转移到0.4cm的电穿孔杯中。Bio-Rad基因脉冲仪设置1000V，1000Cl，50TF。脉冲后恒定时间-20毫秒；i)转移到3mL Morton Closure管中，在30℃下不摇动培养1小时。加入400uL液体YPAD培养基(YPAD10g酵母提取物；20g蛋白胨；20g葡萄糖；100mg腺嘌呤偏硫酸盐(AdenineHemisulphate)。体积＝1L。不调节pH)，在Eppendorf Thermomixer中30℃下以800rpm摇动1小时。加入400uL液体YPAD并恢复46小时；j)在微量离心管中4K离心4分钟，弃去上清，重悬于400uL 1M山梨糖醇中；k)涂布到200ug/ml G418选择性平板上；和1)在30℃下培养3到5天。
菌落首先通过第二次接种(patching)到300ug/ml G418上进行筛选。通过标准基因组制备法(Sambrook)从二级酵母斑分离基因组DNA。然后通过PCR筛选它们的下列特征1)使用合适的引物和条件(Sambrook)筛选卡那霉素片断的存在和2)使用合适的引物和PCR条件筛选不存在破坏的pdc区。
然后生长选择标记阳性且pdc破坏区阴性的菌落并通过HPLC进行生理学分析。来自这些菌株的基因组DNA通过southern杂交分析进一步进行分析。
实施例8-细胞的生长特征1.低pH/高温按照Kiers等(Yeast，14(5)459-469(1998))所述将K marxianus的过夜培养物接种进50mL的酵母基本培养基中。葡萄糖(100g/L)用作碳源。过夜培养物在40℃下维持，并接种进也在40℃维持的培养基中。接种物的加入将培养物的pH从5.5改变成2.5。实验期间，pH维持在2.5。通过YSI-膜测量葡萄糖浓度，并使用分光光度计测量光密度(OD)。
葡萄糖在72小时内被利用，表明在该时间期间在低pH和高温培养条件下存在代谢活性(图7)。另外，在48到72小时的时间期间生物量略有减少，表明细胞分解代谢超过了合成代谢(图7)。
2.戊糖碳源按照Kiers等(Yeast，14(5)459-469(1998))所述将K marxianus的过夜培养物接种进3个含有酵母基本培养基的50mL培养瓶中。3个培养瓶分别含有不同的碳源。第一瓶含有10％的葡萄糖，第二瓶含有10％的D-木糖，第三瓶含有10％的L-阿拉伯糖。培养瓶在30℃下培养，定期进行OD测量。
40小时后，用葡萄糖或木糖培养的酵母的生物量产量相似，而用阿拉伯糖培养的酵母的生物量产量较低(图8)。比较用葡萄糖培养的酵母生长与用木糖或阿拉伯糖培养的酵母生长显示存在一段起始生长滞后时间。用阿拉伯糖培养的酵母表现出几个小时的滞后时间，而用木糖培养的酵母的滞后时间更显著(图8)。该滞后时间的存在表明酵母细胞需要时间适应木糖和阿拉伯糖碳源。据推测，需要该时间诱导正常情况下不表达的多肽的合成。
3.低pH的玉米纤维水解产物按照Kiers等(Yeast，14(5)459-469(1998))所述将K.marxianus的过夜培养物接种进含有酵母基本培养基的培养瓶中。每瓶含有30％的玉米纤维水解产物作为碳源。简单地说，玉米纤维水解产物通过将玉米纤维与1.2％的硫酸在145℃下反应25分钟来制备。反应期间，半纤维素裂解成单体产物阿拉伯糖，木糖和葡萄糖。由于在反应期间温度高，一些阿拉伯糖和木糖降解成糠醛，而一些葡萄糖降解成羟甲基糠醛。HPLC分析该水解产物显示存在38.7克/L葡萄糖，39.1克/L木糖，20.7克/L阿拉伯糖，和1.6克/L糠醛。另外，该水解产物的pH为1.51。培养酵母前，将玉米纤维水解产物的pH调到3.0。培养实验期间，定期进行OD测量。
当用玉米纤维水解产物培养时酵母细胞能产生生物量(图9)。
4.各种pH条件将K.marxianus的过夜培养物接种进4个含有50mL酵母YPD培养基(10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨肉汤，20g/L葡萄糖)的培养瓶中。各培养瓶具有使用HCl调节的不同pH。培养实验期间，温度维持在30℃，定期进行OD测量。观察每瓶内的生长(图10)。
5.各种pH条件/乳酸将K.marxianus的过夜培养物接种进4个含有50mL酵母YPD培养基(10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨肉汤，20g/L葡萄糖)以及40g/L乳酸的培养瓶中。加入乳酸导致pH为2.8。因此，使用NaOH将3瓶内的pH调到所示的pH。培养实验期间，温度维持在30℃，并定期进行OD测量。观察每瓶内的生长(图11)。
实施例9-能产生丙烯酰-CoA的重组细胞用Clostridium propionicum基因组DNA文库转化不能利用丙烯酸盐作碳源的生物体(例如，大肠杆菌)。使用pHES质粒产生C.propionicum基因组文库，从而表达C.propionicum基因组的10kbp片段。将转化的大肠杆菌涂布在以丙烯酸作为唯一碳源的选择培养基上。只有具备同化丙烯酸盐能力的那些细胞才会生长。丙烯酸盐正常情况下通过其酶介导的转变成为乳酸盐而被同化。接着，乳酸盐可转变成丙酮酸盐且通过三羧酸循环被细胞利用。
一旦选择转化的大肠杆菌，从基因组文库分离DNA质粒，并测序插入的片段。一旦测序，扫描该片段的开放阅读框以测定涉及乳酸盐和丙烯酸盐之间转化的酶(例如，乳酰-CoA脱氢酶和CoA转移酶)的编码序列。
将含有这些酶的编码序列的分离克隆导入实施例6所述的酵母细胞中，该酵母细胞含有乳酸脱氢酶且缺乏丙酮酸盐脱羧酶活性。使用G418(300g/L)对含有导入的核酸的重组酵母细胞进行选择。一旦分离，重组酵母细胞在葡萄糖上需氧生长，然后转换成厌氧条件。随后收集培养液并使用Danner等(从生物量经生物技术生产丙烯酸，见Applied Biochemistry andBiotechnology，Vol.70-72(1998))所述的标准HPLC方法测定丙烯酸盐。
实施例10-能产生抗坏血酸盐的重组细胞构建表达载体以便表达下列多肽2，5-二氧戊酸脱氢酶，5-脱氢-4-脱氧-D-葡糖二酸脱水酶，葡糖二酸脱水酶，乙醛脱水酶，葡糖醛酸内酯还原酶，和L-古洛糖酸内酯氧化酶。编码这些多肽的核酸序列可从各种微生物分离。一旦构建后，可将表达载体通过电穿孔转化进酵母细胞。一旦转化，可分析酵母细胞以测定它们是否产生L-抗坏血酸盐。
实施例11-能产生D-木糖的重组细胞构建表达载体以便表达下列多肽2-脱氢-3-脱氧-D-戊酸醛缩酶，木糖酸脱水酶，木糖酸内酯酶(xylonotactonase)，和D-木糖脱氢酶。编码这些多肽的核酸序列可从假单胞菌属(Pseudomonas)种类分离。一旦构建后，可将表达载体通过电穿孔转化进酵母细胞。一旦转化，可分析酵母细胞以测定它们是否产生D-木糖或其它戊糖碳化合物。
实施例12-能产生柠檬酸盐的重组细胞根据酿酒酵母乌头酸酶(ACO1，Genbank登录号M33 13t)的核酸序列设计PCR引物。这些引物用于从Kluyveromyces，Yamadazyma，或Hansenula种类克隆编码乌头酸酶的核酸。一旦测序，按实施例5所述制备线型构建体，并用于破坏酵母细胞内编码乌头酸酶的核酸。使用的选择标记是抗生素G418，代替实施例5中所述的乳酸盐生产。提供抗生素G418抗性的核酸是新霉素/卡那霉素基因。该基因从pPIC9K载体(InVitrogen)获得，并插入pHES载体中。酵母细胞用PCR产生的线型片段转化，该片段构建成具有与上述ACO1同源的末端。该线型片段设计成编码G418抗性基因。只有在编码乌头酸酶的核酸的位置具有整合的线型片段的细胞才具有对该抗生素的抗性。使用PCR分析这些细胞的合适整合。通过该方法获得的酵母细胞具有部分有功能的TCA循环，因此可过度生产柠檬酸盐。
柠檬酸盐穿过线粒体膜运输并进入培养液中。另外，这些酵母细胞可接受编码诸如ATP-柠檬酸裂合酶的一种酶的外源性核酸分子以便它们可催化积累的柠檬酸盐转化成草酰乙酸盐(见实施例13)。
实施例13-能在细胞溶胶中表达柠檬酸裂合酶的重组细胞用pHES质粒转化crabtree阳性酵母细胞，该质粒含有编码具有ATP-柠檬酸裂合酶活性的多肽的核酸序列。该核酸从大肠杆菌，Krebsiellapneumoniae(Genbank登录号X79817)，或其它公开的来源分离。一旦转化，分析酵母细胞以测定它们是否利用糖类产生大量脂类积累。另外，按Holdsworth等(J.Gen.Microbiol.，1342907-2915(1998))所述分析酵母细胞以测定它们是否表现出ATP-柠檬酸裂合酶活性。具有ATP-柠檬酸裂合酶活性的酵母细胞能在需氧条件下提供细胞溶胶乙酸盐，其途经不是乙醛通过乙醛脱氢酶转化成乙酸盐。另外，当该酵母缺乏丙酮酸脱羧酶或乙醛脱氢酶活性时，它们应能够提供乙酸盐用于通过三羧酸循环的生物合成。
实施例14-不能利用乳酸盐作碳源的重组细胞构建酵母细胞使得相似于酿酒酵母JENI多肽的羧酸转运蛋白的活性降低。该酵母细胞运输乳酸盐的能力将降低，且因此利用乳酸盐的效率较低。通过破坏含有该多肽的编码序列的基因座可降低酵母细胞内羧酸转运蛋白的活性。首先，使用根据JEN1的可得序列(Genbank登录号U24 155)设计的简并引物从宿主细胞分离JEN1多肽的同源物。一旦该核酸从宿主细胞中分离，可测序该核酸。使用实施例11所述的方法对该多肽的编码序列进行破坏。产生编码JEN1序列同源区以及完整G418抗性基因的线型片段。将该线型片段整合进JEN1基因组序列引起该活性的破坏。缺乏羧酸转运蛋白活性的细胞以其不能运输羧酸，且因此在乳酸盐中培养时不能生长来鉴定。
另外，可修饰细胞使得酿酒酵母细胞色素b2多肽的功能等价物的活性降低。细胞色素b2多肽使得酿酒酵母细胞能够在线粒体内代谢乳酸盐。首先，从酵母属细胞色素b2序列(Genbank登录号Z46729)设计简并引物。一旦分离，测序该克隆。使用Methods in Yeast Genetics(编辑Alison等，冷泉港出版社(1997))中所述的方法对细胞色素b2的酵母宿主同源物进行破坏。该重组酵母细胞将不能利用乳酸盐作为碳源。
实施例15-乳酸盐的大规模生产产生并分离了多个PDC活性降低的K.marxianus细胞的变异体。各变异体改造成含有不同拷贝数的编码具有LDH活性的多肽的外源性核酸分子。LDH多肽来自多种不同的来源。该变异体细胞在40℃下具有不同的乳酸特异性生存率。
各变异体在气流为1.5VVM且溶解氧含量为30％的需氧条件下在容器中生长到细胞密度为大约60g/L的干重。一旦该密度足够，关掉气流，且容器内的条件转换成厌氧条件。不加入碱。
可发现厌氧阶段期间具有最高单位生产率的变异体与具有较低单位生产率的变异体相比不仅产生乳酸更快，而且在更低的pH下达到更高的浓度。
生产阶段期间对葡萄糖的产物产率可超过90％。选择确定的变异体且除了气流降低到0.1VVM而不是完全关闭外对其使用相同的培养方法。在该条件下，容器内的最终pH可能更低，且乳酸盐浓度可能比没有气流的条件下更高。产物对葡萄糖的产率可能减少，但可维持在大约90％。但是用0.5VVM的气流重复试验时，产物对葡萄糖的产率可下降到不超过80％。
实施例16-使用一系列分批发酵大规模生产乳酸盐缺乏PDC活性且具有LDH活性的K.Marxianus培养物用作一系列分批发酵中的接种物。各发酵在逐渐变大的容器中进行，每个容器在使用前立即灭菌。另外，各容器供给1.5VYM的气流且充分搅拌以维持超过10％的溶解氧含量。最终容器具有6,000L的容积。容器也在45℃的温度下维持以增强遗传修饰的K.marxianus细胞相对于野生型酵母和其它微生物的存活率。用标准培养基装满各容器用于最佳生长。
将具有细胞密度为100克细胞(干重)/L的最终容器的内容物转移进具有300,000L容积的最近蒸气灭菌的生产容器中。任选的是，加入从前面生产过程过滤获得的其它细胞。生产容器中的细胞密度是6克细胞(干重)/L。加入葡萄糖达到80g/L的水平。容器内的条件是温度为42℃的厌氧条件，维持25小时的时间。直到接近该过程结束时单位生产率大于0.5克乳酸盐/(克生物量*小时)，此时生产率开始下降。一旦生产率开始下降，取出细胞并保存以便再利用。最终乳酸盐浓度可为75g/L，pH为2.8。取出生物量后，通过蒸发将溶液浓缩到50％乳酸盐的浓度。游离酸(大约为总乳酸盐的86％)通过液体萃取法萃取进有机溶剂中并在更高温度下萃取回水中。含乳酸盐的萃取残液可纯化并再循环作为生长容器中的缓冲液，或者用例如，硫酸酸化并纯化。
实施例17crabtree阴性(K.marxianus)和crabtree阳性(S.uvarum)生物的需氧生产比较crabtree阴性(K.marxianus)和crabtree阳性(S.uvarum)生物分别在需氧和厌氧分批发酵罐中生长。分批培养在30℃下在工作容积为1.5L的实验室发酵罐中进行。通过自动加入2mol/L的氢氧化钾(KOH)将PH维持在5.0±0.1。发酵罐用空气(需氧培养)或氮气(厌氧培养)以0.8L/分钟的流速通气并以800rpm搅拌。溶氧浓度用氧电极(Ingold，34 100 3002型)连续监测。在需氧培养中，溶氧浓度维持在60％以上。以合适的间隔取出10mL样品用于测定干重和代谢产物浓度。向厌氧培养物中加入Tween-80和麦角固醇以提供脂肪酸合成所需的化合物。
在指数生长期间，以合适的间隔测定酵母培养物的干重和OD660，以及上清中的葡萄糖和乙醇浓度。特异性乙醇生产率(q乙醇mmol/g*h)通过如下公式使用线型回归分析计算q乙醇＝(dE/dCx)*μmax其中dE/dt(培养物中乙醇浓度增加的速率；mmol/l*h)和dCx/dt(生物量浓度增加的速率；g/l*h)使用乙醇浓度和生物量浓度对时间μmax(h-1)的绘图的微分法计算。在葡萄糖中的最大比增殖速度从Cx对时间的绘图的指数部分估计。为了计算特异性葡萄糖消耗率(q葡萄糖，mmol/g*h)，用dG(每小时消耗的葡萄糖量)代替dE。
在需氧分批培养中，Kluyveromyces和酵母属菌株表现出对葡萄糖的最大比增殖速度(specific growth rate)分别为0.4h-1和0.28h-1。高葡萄糖浓度和所得的酵母属培养物的高比增殖速度导致高速率的需氧乙醇发酵(表3，图1)。由于剧烈的乙醇发酵，酵母属菌株中葡萄糖的比消耗速率比Kluyveromyces菌株高大约2倍。从能量学的观点出发，乙醇发酵是细胞产生ATP的一种低效途经。对葡萄糖的生物量产量Kluyveromyces为0.38g/g，而Saccharomyces uvarum为0.14g/g。对于crabtree-阴性表型的Kluyveromyces菌株对葡萄糖的乙醇产率为零，而crabtree-阳性表型的Saccharomyces培养物为1.83mmol/mmol。
表3在含2％(wt/vol)葡萄糖的无机培养基中Saccharomyces uvarum和Kluyveromyces marxianus的分批培养物中指数生长期间的最大比增殖速度，乙醇生产和葡萄糖比消耗速率(q，mmol(g生物量)-1h-1)，生物量产率(g/g)，产物产率(mmol/mmol)，和碳回收率(表示为％；仅计算了厌氧培养物)。

在厌氧分批培养中，两个菌株的比增殖速度和生物量产量与在需氧条件下的所见相比极低(表3，图I和2)。对于Kluyveromyces和酵母属菌株，生物量产量分别为0.07和0.09g/g。两个菌株在厌氧条件下的乙醇发酵特异性速率同等较好。使用CO2生产数据证实了这一点。
一般来说，该实施例证实生物量的需氧生产比厌氧快得多，在需氧条件下crabtree阴性生物的生物量产量更高(因为，在crabtree阳性生物中，使用葡萄糖发生了一些乙醇发酵)。该实施例还证实了在厌氧条件下crabtree阳性和阴性生物都以相同的速率产生发酵产物(在本例中为乙醇)。因此，需氧生长阶段提供高生物量产量，且随后的厌氧发酵阶段引导代谢能量进入产物形成(而不是更多的生长)。总的来说，生产与生长分开的方法提供了更大的处理灵活性和对全过程产量的更好控制。
实施例18在天然制备L-乳酸的宿主菌株中提高乳酸盐产量扩增同源性DNA的线型片断用于丙酮酸脱羧酶的基因破坏酵母Kluyveromyces thermotolerans(K.thermotolerans)是L-乳酸的天然生产菌(Kurtzman和Fell，(1998)，“酵母，分类学研究”，第240-241页，Elsevier Science B.V.；Amsterdam，The Netherlands)。K.thermotolerans具有天然存在的允许产生L-乳酸的乳酸脱氢酶(1dh)基因。在厌氧条件下产生的乳酸量是大约4％g/g利用的葡萄糖，而剩余的葡萄糖基本上转化成乙醇(42.5％g/g消耗的葡萄糖)，甘油(3％g/g消耗的葡萄糖)和乙酸盐(0.3％g/g消耗的葡萄糖)。
表4.在YPDA培养基(丰富培养基)中起始为100g/l葡萄糖时使用K.Thermotolerans进行厌氧发酵的结果

使用通过比较来自K.marxianus和K.lactis的PDC1基因序列产生的序列构建的共有引物从K.thermotolerans分离PDC1的600bp区域。然后测序(Sanger)该PDCI片断，并用于使用PCR和基因组步查技术(Clonetech)分离包围K.thermotolerans pdcl的7.5kbp片断(图6e)。然后将该7.5kbp的片断克隆进pCRII TA克隆载体(Invitrogen)。从K.thermotolerans的7.5kbp片断去掉PDCI编码区接近中部的大约730bp的部分。通过限制性消化(Sambrook)去掉的K thermotolerans pdcl的部分含有如下序列TTACCACTGTCTTCGGTCTGCCAGGTGACTTCAATCTGCGTCTGTTGGACGAGATCTACGAGGTCGAGGGTATGAGATGGGCCGGTAACTGTAACGAGTTGAACGCTTCTTACGCTGCCGACGCTTACGCCAGAATCAAGGGTATGTCCTGTTTGATCACCACCTTCGGTGTCGGTGAGTTGTCCGCTTTGAACGGTATCGCCGGTTCTTACGCTGAGCACGTCGGTGTCTTGCACATTGTCGGTGTCCCATCCGTCTCCGCCCAGGCCAAGCAGCTATTGTTGCACCACACCTTGGGTAACGGTGACTTCACTGTCTTCCACAGAATGTCCGCCAACATCTCTGAGACCACTGCTATGATCACTGATCTAGCTACCGCCCCATCTGAGATCGACAGATGTATCAGAACCACCTACATTAGACAGAGACCTGTCTACTTGGGTTTGCCATCTAACTTCGTTGACCAGATGGTCCCAGCCTCTCTATTGGACACCCCAATTGACTTGGCCTTGAAGCCAAACGACCAGCAGGCTGAGGAGGAGGTCATCTCTACTTTGTTGGAGATGATCAAGGACGCTAAGAACCCAGTCATCTTGGCTGACGCTTGCGCTTCCAGACACGATGTCAAGGCTGAGACCAAGAAGTTGATTGACATCACTCAGTTCCCATCTTTCGTTACCCCAATGGGTAAGGGTTCCATTGACOAGAAGCACCCAAGATTCGGTGGTGTCTACGTCGGTACCTTGT(序列ID No.11)。然后通过限制性消化(Sambrook)从pPTC9K载体(Invitrogen)分离包含其启动子的编码卡那霉素抗性的基因，并克隆进7.5kbp上去掉730bp片断的位置。来自pPIC9K(Invitrogen)的卡那霉素抗性基因及其启动子的序列如下GTACAACTTGAGCAAGTTGTCGATCAGCTCCTCAAATTGGTCCTCTGTAACGGATGACTCAACTTGCACATTAACTTGAAGCTCAGTCGATTGAGTGAACTTGATCAGGTTGTGCAGCTGGTCAGCAGCATAGGGAAACACGGCTTTTCCTACCAAACTCAAGGAATTATCAAACTCTGCAACACTTGCGTATGCAGGTAGCAAGGGAAATGTCATACTTGAAGTCGGACAGTGAGTGTAGTCTTGAG
AAATTCTGAAGCCGTATTTTTATTATCAGTGAGTCAGTCATCAGGAGATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGACCTGCAGGGGGGGGGGGGGCGCTGAGGTCTGCCTCGTGAAGAAGGTGTTGCTGACTCATACCAGGCCTGAATCGCCCCATCATCCAGCCAGAAAGTGAGGGAGCCACGGTTGATGAGAGCTTTGTTGTAGGTGGACCAGTTGGTGATTTTGAACTTTTGCTTTGCCACGGAACGGTCTGCGTTGTCGGGAAGATGCGTGATCTGATCCTTCAACTCAGCAAAAGTTCGATTTATTCAACAAAGCCGCCGTCCCGTCAAGTCAGCGTAATGCTCTGCCAGTGTTACAACCAATTAACCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGATGATATATTTTTATCTTGTGCAATGTAACATCAGAGATTTTGAGACACAACGTGGCTTTCCCCCCCCCCCCTGCAGGTCGGCATCACCGGCGCCACAGGTGCGGTTGCTGGCGCCTATATCGCCGACATCACCGATGGGGAAGATCGGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGG-TGGCAGGCCCCGTGGCCGGGGGACTGTTGGGCGCCATCTCCTTGCATG(序列ID No.12)。所得的构建体包含被大约6.8kbp的PDC区域包围的卡那霉素抗性基因(G418)，如图6f所示。将图6f描绘的构建体用两个限制性酶(Sambrook)消化以产生大约3微克合同源性PDC区域和插入的卡那霉素抗性基因中间序列的DNA片断。使用诸如电穿孔的已知转化技术用该片断转化K.Thermotolerans以破坏K.thermotolerans的PDC。电穿孔方法如下a)以20mL的体积在YPAD中生长培养物过夜(-15h)；b)将500uL培养物转移进微量离心管中，离心@4K，4mm，弃去上清；c)用1mL冷EB(EB＝电穿孔缓冲液10mM Tris-HCl，pH 7.5；270mM蔗糖；1mM MgCl2)洗涤；d)重悬于1mL IB(IB＝培养缓冲液YPD；25mM DTT；20mM HEPES，pH8.0)中；e)在Eppendorf Thermomixer中30℃下以800rpm摇动30分钟；f)离心，用EB洗涤一次，重悬于400uL EB中；g)加入3微克DNA片断(在10mM Tris-Cl，pH 8.5的水中)，在冰上培养30分钟；h)转移到0.4cm的电穿孔杯中。Bio-Rad基因脉冲仪设置1000V，1000A，50TF。脉冲后恒定时间-20毫秒；i)转移到3mL Morton Closure管中，在30℃下不摇动培养1小时；j)加入400uL液体YPAD培养基(YPAD10g酵母提取物；20g蛋白胨；20g葡萄糖；100mg腺嘌呤偏硫酸盐(Adenine Hemisulphate)。体积＝1L。不调节pH)，在Eppendorf Thermomixer中30℃下以800rpm摇动1小时；k)加入400uL液体YPAD并恢复4-6小时；1)在微量离心管中离心@4K，4mm，弃去上清，重悬于400uL 1M山梨糖醇中并涂布到100ug/ml G418选择性平板上；和m)在30℃下培养3到5天。
菌落首先通过第二次接种(patching)到含有200ug/ml 0418的培养皿上进行筛选。使用标准基因组制备法(Sambrook)从二级酵母斑分离基因组DNA。然后通过PCR筛选分离的基因组的下列特征1)使用合适的引物和条件(Sambrook)筛选卡那霉素片断的存在；和2)使用合适的引物和PCR条件筛选不存在破坏的PDC区。然后生长选择标记阳性且PDC破坏区阴性的菌落用于进一步的研究，例如，来自这些菌株的基因组DNA通过southern杂交分析进行进一步分析。
实施例19酵母，真菌和细菌LDH基因的克隆从两种酵母，Kluyveromyces thermotolerans和Torulasporapretoriensis分离LDH-编码基因。这些种类已知生产乳酸(Witte等，1989，J Basic Microbiol.29707-716)。按照Sambrook等，出处同上提供的方法进行所有常规操作，除非另有说明。
Kluyveromyces thermotolerans LDH从美国典型培养物保藏中心(ATCC保藏号#52709)获得K.Thermotolerans并在标准条件下生长。使用Invitrogen的“Easy-DNA”试剂盒按照厂商的方案从这些细胞中纯化基因组DNA。通过逆向翻译保守区设计简并扩增引物，该保守区在对来自Rhizopus oryzae，人(Homo sapiens)，果蝇(Drosophila melanogaster)，拟南芥(Aribidopsis thaliana)，和瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)的L-LDH编码基因的序列对比中被鉴定。两个简并寡核苷酸已成功用于聚合酶链式反应(PCR)扩增。这些寡核苷酸是EJP4 GTBATYGGYTCHGGTAC(SEQ ID No.13)和EJP5 SWRTCDCCRTGYTCACC(SEQ ID No.14)。
PCR扩增反应使用Perkin Elmer缓冲液II(1.5mM MgCl2)和AmpliTaqGold聚合酶进行。各反应含有浓度为6ng/uL的K.Thermotolerans基因组DNA，浓度各为0.2mM的4种dNTPs，各为1uM的EJP4和EJP5引物。反应按照如下循环条件进行95℃10分钟的起始温育，接着是由95℃30秒，52℃40秒，72℃40秒组成的35个循环。使用常规方法凝胶纯化116个碱基对(bp)的微量产物片断，使用相同条件和本文公开的扩增条件再扩增，克隆，并测序。
所得的序列可翻译成与已知L-LDH编码基因表现出高度同源性的多肽。根据该序列设计两个非简并引物，EJP8和EJP9EJP8 GTACAGTTCTGGATACTGCTCG(SEQ ID No.15)和EJP9 ACAGGCATCGATGCTGTC(SEQ ID No.16)。
使用K.thermotolerans DNA通过将DNA的部分Sau3A消化产生的随机片断插入质粒Yep9T(ref)的BamH1位点构建基因组DNA文库。使用引物EJP8和EJP9结合载体臂中的引物通过PCR分离完整的K.Thermotolerans LDH-编码基因。这些载体引物是EJP10 CTACTTGGAGCCACTATCGAC(SEQ ID No.17)和EJP11 GTGATGTCGGCGATATAGG (SEQ ID No.18)。
在这些扩增反应中，除了延伸时间增加2分钟且退火温度增加到58℃外，条件与上述相同。克隆并测序扩增产物且根据与已知序列的同源性显示出含有K.thermotolerans LDH-编码基因的剩余部分。
最后，在PCR扩增反应中使用高保真聚合酶(Pfu)直接从K.thermotolerans基因组DNA再分离全长基因，使用的引物EJP12和EJP13为EJP12 GATCTCCTGCTAAGCTCTTGC(SEQ ID No.19)和EJP13 GCAGTTTTGGATATTCATGC (SEQ ID No.20)。
这些扩增反应按上述进行。这一独立产生的PCR产物的编码序列与AmpliTaq Gold产生的序列完全一致。K.thermotolerans LDH-编码基因的编码区的核酸序列在下面作为SEQ ID No.20提供。
该完整编码序列的翻译显示出与来自Schizosaccharomyces pombe(49.5％)，Bacillus megaterium(45.1％)，瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)(36.8％)，奶牛(35.3％)，和Rhizopus oryae(32.6％)等的L-LDH-编码基因有明显的序列相同性。
K.Thermotolerans乳酸脱氢酶的核苷酸序列(SEQ ID No.21)ATGTTCCAAG ATACAAAGTC TCAAGCAGTA AGAACTGATG CCAAAACAGTAAAAGTTGTG 60GTAGTGGGAG TGGGAAGTGT TGGGTCTGCC ACAGCGTATA CGTTGCTTCTCAGCGGCATC 120GTTTCCGAGA TTGTCCTTAT CGACGTGAAC AAAGACAAAG CAGAGGGTGAAAGCATGGAC 180TTAAACCACG CAGCACCTTC AAATACAAGG TCTCGAGCGG GTGATTATCCTGACTGCGCT 240GGCGCGGCCA TTGTTATTGT CACATGTGGG ATTAACCAAA AAAATGGACAAACAAGGATG 300GATCTTGCTG CAAAAAATGC CAACATTATG CTGGAAATCA TCCCCAATGTTGCCAAATAT 360GCTCCTGATA CCATCCTGCT TATTGCCACG AATCCTGTCG ATGTTTTGACCTATATTAGC 420TATAAGGCGT CAGGGTTTCC ACTAAGCAGA GTTATCGGCT CAGGTACAGTTCTGGATACT 480GCTCGTTTTA AATACATCCT CGGAGAGCAC TTCAAGATCT CATCGGACAGCATCGATGCC 540TGTGTAATTG GAGAACATGG TGATTCGGGT GTGCCTGTCT GGTCTCTTACCAACATCGAC 600GGCATGAAGC TCCGGGATTA CTGCGAAAAA GCCAACCACA TATTTGATCAGAATGCGTTC 660CATAGAATCT TTGAGCAAAC GCGAGACGCT GCTTACGATA TACTCAAGCGCAAAGGCTAT 720ACTTCATATG GAATCGCAGC GGGATTACTT CGCATAGTAA AGGCGATTTTAGAGGATACA 780GGATCCACAC TTACAGTTTC AACCGTTGGT GATTATTTTG GGGTTGAACAAATTGCTATA 840 AGCGTCCCTA CCAAACTCAA TAAAAGTGGG GCTCATCAAGTGGCTGAACT TTCACTCGAT 900GAGAAGGAAA TAGAATTGAT GGAAAAATCA GCTAGTCAGA TCAAATCAGTGATTGAGCAT 960CTGGAGATCAAT 972K.Thermotolerans乳酸脱氢酶的氨基酸序列(SEQ ID No.22)Met Phe Gln Asp Thr Lys Ser Gln Ala Val Arg Thr Asp Ala Lys Thr1 51015Val Lys Val Val Val Val Gly Val Gly Ser Val Gly Ser Ala Thr Ala20 25 30Tyr Thr Leu Leu Leu Ser Gly Ile Val Ser Glu Ile Val Leu Ile Asp3540 45Val Asn Lys Asp Lys Ala Glu Gly Glu Ser Met Asp Leu Asn His Ala50 55 60Ala Pro Ser Asn Thr Arg Ser Arg Ala Gly Asp Tyr Pro Asp Cys Ala65 70 75 80Gly Ala Ala Ile Val Ile Val Thr Cys Gly Ile Asn Gly Lys Asn Gly85 90 95Gln Thr Arg Met Asp Leu Ala Ala Lys Asn Ala Asn Ile Met Leu Glu100105 110Ile Ile Pro Asn Val Ala Lys Tyr Ala Pro Asp Thr Ile Leu Leu Ile115 120 125Ala Thr Ash Pro Val Asp Val Leu Thr Tyr Ile Ser Tyr Lys Ala Ser
130 135 140Gly Phe Pro Leu Ser Arg Val Ile Gly Ser Gly Thr Val Leu Asp Thr145 150 155 160Ala Arg Phe Lys Tyr Ile Leu Gly Glu His Phe Lys Ile Ser Ser Asp165 170 175Ser Ile Asp Ala cys Val Ile Gly Glu His Gly Asp Ser Gly Val Pro180 185 190Val trp Ser Leu Thr Asn Ile Asp Gly Met Lys Leu Arg Asp Tyr Cys195 200205Glu Lys Ala Asn His Ile Phe Asp Gln Asn Ala Phe His Arg Ile Phe210 215 220Glu Gln Thr Arg Asp Ala Ala Tyr Asp Ile Ile Lys Arg Lys Gly Thr225 230 235 240Thr Ser Tyr Gly Ile Ala Ala Gly Leu Leu Arg Ile Val Lys Ala Ile245 250 255Leu Glu Asp Thr Gly Ser Thr Leu Thr Val Ser Thr Val Gly Asp Tyr260 265 270Phe Gly Val Glu Gln Ile Ala Ile Ser Val Pro Thr Lys Leu Asn Lys275 280 285Ser Gly Ala His Gln Val Ala Glu Leu Ser Leu Asp Glu Lys Glu Ile290 295 300Glu Leu Met Glu Lys Ser Ala Ser Gln Ile Lys Ser Val Ile Glu His305 310 315 320Leu Glu Ile AsnTorulaspora pretoriensis LDHT.pretoriensis的L-LDH-编码基因以与K.thermotolerans基因相同的方式分离。该策略也是使用简并引物PCR扩增T.pretoriensis基因组DNA以分离该基因的一个片断并通过基于PCR的染色体步查分离该基因的剩余部分。T.pretoriensis从美国典型培养物保藏中心(ATCC保藏号.______)获得。使用Invitrogen的“Easy-DNA”试剂盒按照厂商的方案从这些细胞中纯化基因组DNA。简并引物根据上述的保守序列设计。两个简并寡核苷酸已成功用于聚合酶链式反应(PCR)扩增EJP1 GTYGGTGCHGGTGCHGTHGG(SEQ ID No.23)和EJP6 SWRTCDCCRTGYTCBCC (SEQ ID No.24)。
除了以20ng/uL的浓度使用T.pretoriensis基因组DNA外，热循环参数和反应条件如上所述。克隆并测序508bp的强产物DNA片断。所得的169个氨基酸翻译产物与已知L-LDH-编码基因表现出极好的同源性。
在已知序列的两个方向通过“步查”分离该基因的剩余部分。使用GenomeWalker试剂盒(Clontech#K1807-1)和Advantage Genomic PolymeraseMix(Clontech#8418-1)按照产品说明书完成该方法。除了该试剂盒中提供的衔接引物外使用4个基因特异性嵌套引物。基因特异性引物是EJP20 ATCCACAACAGCTTACACGTTATTGAG(SEQ ID No.25)EJP21 GTTTGGTTGCTGGAAGTGGTGTTGATAG(SEQ ID No.26)EJP22 AACATTGAATAGCTTGCTCAGGTTGTG(SEQ ID No.27)和EJP23 GATAATAAACGCGTTGACATTTCAGATG(SEQ ID No.28)。
克隆并测序该产物且根据与已知序列的同源性发现它含有来自T.pretoriensis的LDH-编码基因的剩余部分。该完整编码序列的翻译显示出与来自Schizosaccharomyces pombe(48.8％)，Bacillus megaterium(42％)，瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)(38.2％)，奶牛(34.9％)，和Rhizopus oryae(32.2％)等的L-LDH-编码基因有明显的序列相同性。T.pretoriensis LDH-编码基因的编码区的核酸序列在下面作为SEQ ID No.28提供，其中编码的LDH蛋白的推测氨基酸序列作为SEQ ID No.29被鉴定。
T.Pretoriensis乳酸脱氢酶的核苷酸序列(SEQ ID No.29)ATGCATAGAT GTGCTAAAGT GGCCATCGTC GGTGCCGGCC AAGTTGGATCCACAACAGCT 60TACACGTTAT TATTGAGTAG TTTGGTTGCT GAAGTGGTGT TGATAGATGTCGATAAAAGA 120AAGGTCGAAG GCCAATTTAT GGATCTGAAC CACGCGGCTC CTTTAACGAAGGAGTCACGA 180TTCAGTGCTG GGGACTATGA AAGTTGTGCT GATGCTGCGG TTGTAATCGTAACGGGCGGG 240GCTAATCAGA AACCTGGTCA AACTAGAATG GAGCTAGCCG AGAGGAACGTTAAAATCATG 300CAGGAAGTGA TCCCTAAGAT TGTGAAATAC GCCCCCAACG CAATTTTGCTGATTGCAACA 360AACCCTGTCG ATGTACTTAC CTATGCTAGT TTGAAAGCGT CGGGATTCCCAGCAAGCCGG 420GTTATTGGTT CTGGGACAGT TCTCGACTCT GCTCGTATAC AGCACAACCTGAGCAAGCTA 480TTCAATGTTT CATCTGAAAG TGTCAACGCG TTTATTATCG GGGAACATGGTGACTCAAGT 540GTGCCCGTCT GGTCGCTTGC TGAGATTGCC GGCATGAAAG TGGAGGATTACTGTAGGCAG 600TCCAAGAGAA AGTTTGACCC CAGCATTCTG ACCAAAATAT ATGAGGAGTCGCGTGACGCG 660GCAGCCTACA TCATAGAACG CAAAGGCTAT ACCAATTTCG GGATTGCAGCAGGTTTGGCT 720AGGATAGTGA GAGCTATTCT GAGAGATGAA GGTGCCCTAT TAACTGTGTCTACTGTAGGT 780GAGCACTTTG GCATGAAAGA TGTTTCATTG AGTGTTCCAA CTAGGGTAGACAGGAGCGGC 840GCTCACCATG TCGTCCACCT TCTGCTAAAC GACAAGGAGC TGGAGCAAATTAAAACATCT 900 GGAGCCAAGA TAAAGTCAGC CTGTGATGAA CTTGGCATT 939T.Pretoriensis乳酸脱氢酶的氨基酸序列(SEQ ID No.30)Met His Arg Cys Ala Lys Val Ala Ile Val Gly Ala Gly Gln Val Gly1 5 10 15Ser Thr Thr Ala Tyr Thr Leu Leu Leu Ser Ser Leu Val Ala Glu Val2025 30Val Leu Ile Asp Val Asp Lys Arg Lys Val Glu Gly Gln Phe Met Asp35 4045Leu Asn His Ala Ala Pro Leu Thr Lys Glu Ser Arg Phe Ser Ala Glu50 55 60Asp Tyr Glu Ser cys Ala Asp Ala Ala Val Val Ile Val Thr Gly Gly
65 7075 80Ala Asn Gln Lys Pro Gly Gln Thr Arg Met Glu Leu Ala Glu Arg Asn859095Val Lys Ile Met Gln Glu Val Ile Pro Lys Ile Val Lys Tyr Ala Pro100 105110Asn Ala Ile Leu Leu Ile Ala Thr Asn Pro Val Asp Val Leu Thr Tyr115 120 125Ala Ser Leu Lys Ala Ser Gly Phe Pro Ala Ser Arg Val Ile Gly Ser130 135 140Gly Thr Val Leu Asp Ser Ala Arg Ile Gln His Asn Leu Ser Lys Leu145 150 155 160Phe Asn Val Ser Ser Glu Ser Val Asn Ala Phe Ile Ile Gly Glu His165 170175Gly Asp Ser Ser Val Pro Val Trp Ser Leu Ala Glu Ile Ala Gly Met180 185 190Lys Val Glu Asp Tyr Cys Arg Gln Ser Lys Arg Lys Phe Asp Pro Ser195200 205Ile Leu Thr Lys Ile Tyr Glu Glu Ser Arg Asp Ala Ala Ala Tyr Ile210 215 220Ile Glu Arg Lys Gly Tyr Thr Asn Phe Gly Ile Ala Ala Gly Leu Ala225 230 235 240Arg Ile Val Arg Ala Ile Leu Arg Asp Glu Gly Ala Leu Leu Thr Val245 250 255Ser Thr Val Gly Glu His Phe Gly Met Lys Asp Val Ser Leu Ser Val260265 270Pro Thr Arg Val Asp Arg Ser Gly Ala His His Val Val Asp Leu Leu275 280 285Leu Asn Asp Lys Glu Leu Glu Gln Ile Lys Thr Ser Gly Ala Lys Ile290295 300
Lys Ser Ala Cys Asp Glu Leu Gly Ile305 310B.megaterium LDH编码LDH基因的B.megaterium DNA分离如下。B.megaterium从美国典型培养物保藏中心(ATCC保藏号#6458)获得并在标准条件下生长。使用Invitrogen的“Easy-DNA”试剂盒按照厂商的方案从这些细胞纯化基因组DNA。根据Genbank中可得的来自B.megaterium的L-LDH序列(Genbank登录号#M22305)设计引物。使用Perkin Elmer缓冲液II(1.5mM MgCl2)和AmpliTaq Gold聚合酶进行PCR扩增反应。各反应含有浓度为6ng/uL的B.megaterium基因组DNA，浓度各为0.2mM的4种dNTPs，浓度各为1uM的两种扩增引物BM1270和BM179，其中这些引物具有如下序列BM1270 CCTGAGTCCACGTCATTATTC(SEQ ID No.31)和BM179 TGAAGCTATTTATTCTTGTTAC(SEQ ID No.32)。
按照如下热循环条件进行反应95℃10分钟的起始温育，接着是由95℃30秒，50℃30秒，72℃60秒组成的35个循环。使用常规方法凝胶纯化1100个碱基对(bp)的强产物片断，克隆，并测序。所得的序列可翻译成与已知L-LDH-编码基因表现出极好同源性的多肽。
本文公开的B.megaterium LDH-编码基因的编码序列(SEQ ID No.32)与来自磷酸甘油酸激酶基因的启动子和来自GAL10基因的转录终止子(两者都来自酿酒酵母)可操作地连接。在制备该构建体时，制备如下寡核苷酸并用于从含有鉴定为SEQ ID No.29的序列的插入片断的质粒扩增编码序列。根据该序列设计两个寡核苷酸引物，即Bmeg5’和Bmeg3’，以便在该基因的编码序列末端导入限制性位点Bmeg5’GCTCTAGATGAAAACACAATTTACACC (SEQ ID No.33)和Bmeg3’ATGGATCCTTACACAAAAGCTCTGTCGC(SEQ ID No.34)。
使用上述浓度的dNTP和引物使用在厂商提供的缓冲液中的Pfu Turbo聚合酶(Stratagene)进行该扩增反应。通过在95℃下起始温育反应混合物3分钟，然后进行20个循环的95℃30秒，50℃30秒，72℃60秒，接着在72℃最后温育9分钟进行热循环。产物用限制性酶XbaI和BamHI消化，然后连接进质粒pNC101(NREL)的XbaI和BamHI位点。该连接导致PGK启动子和GAL10终止子可操作地连接(即，在酵母细胞中有转录活性地连接)到B.megaterium LDH编码序列上。一旦B.megaterium LDH可操作地连接到这些转录调控序列上，切下NotI-NotI片断并再克隆进能在Kluyveromyces种类中复制的载体(质粒pNC003，NREL)中。所得的质粒含有包含LDH的NotI-NotI片断以及来自K.lactis质粒pKD1的SphI位点之间的一个4,756bp的序列。
这些质粒在图17中显示。
Rhizopus oryzae LDH按如下方法从Rhizopus oryzae分离L-LDH。Rhizopus oryzae细胞从美国典型培养物保藏中心(ATCC保藏号#9363)获得且在标准条件下生长。使用Invitrogen的Easy-DNA试剂盒按照厂商的方案从这些细胞纯化基因组DNA。根据Genbank中可得的来自R.oryzae的L-LDH序列(Genbank登录号#AF226154)设计引物。使用Perkin Elmer缓冲液II(1.5mM MgCl2)和AmpliTaqGold聚合酶进行PCR扩增反应。各反应含有浓度为6ng/uL的R.oryzae基因组DNA，浓度各为0.2mM的4种dNTPs，各1uM的扩增引物Ra1-5’和Ra1-3’引物。该扩增引物具有如下序列Ra1-5’CTTTATTTTTCTTTACAATATAATTC(SEQ ID No.35)和Ra1-3’ACTAGCAGTGCAAAACATG (SEQ ID No.36)。
按照如下循环条件进行反应95℃10分钟的起始温育，接着是由95℃30秒，41℃30秒，72℃60秒组成的35个循环。使用常规方法凝胶纯化1100个碱基对(bp)的强产物片断，在TA载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)中克隆，并测序。所得的序列可翻译成与Genbank(登录号#AF226154)中已知Rhizopus oryzae L-LDH-编码基因序列表现出极好同源性的多肽。
本文公开的R.oryzae LDH-编码基因的编码序列与来自磷酸甘油酸激酶基因的启动子和来自GAL10基因的转录终止子(两者都来自酿酒酵母)可操作地连接。在制备该构建体时，制备如下寡核苷酸并用于从含有Rhizopus LDH插入片断的质粒扩增编码序列。根据该序列设计两个寡核苷酸引物，即Rapgk5和Papk3’，以便在该基因的编码序列末端导入限制性位点Rapgk5 GCTCTAGATGGTATTACACTCAAAGGTCG (SEQ ID No.37)和Papgk3 GCTCTAGATCAACAGCTACTTTTAGAAAAG (SEQ ID No.38)。
使用上述浓度的dNTP和引物使用在厂商提供的缓冲液中的Pfu Turbo聚合酶(Stratagene)进行该扩增反应。通过在95℃下起始温育反应混合物3分钟，然后进行20个循环的95℃30秒，53℃30秒，72℃60秒，接着在72℃最后温育9分钟进行热循环。产物用限制性酶XbaI消化，然后连接进质粒pNC101(NREL)的XbaI位点。
该连接导致PGK启动子和GAL10终止子可操作地连接(即，在酵母细胞中有转录活性地连接)到R.oryzae L-LDH编码序列上。一旦R.oryzae LDH可操作地连接到这些转录调控序列上，切下NotI-NotI片断并再克隆进能在Kluyveromyces种类中复制的载体(质粒pNC003，NREL)中。所得的质粒含有包含LDH的NotI-NotI片断以及来自K.lactis质粒pKD1的SphI位点之间的一个4,756bp的序列。
从K.Thermotolerns，R.oryzae或B.megaterium分离的编码LDH基因的G418抗性标记载体。
从Invitrogen(Carlsbad，CA)获得的G418抗生素选择标记经过修饰并与丙酮酸脱羧酶基因的启动子和GAL10基因的转录终止子(两者均来自酿酒酵母)可操作地连接。在制备该构建体时，制备如下寡核苷酸并用于从含有G418抗性基因插入片断的质粒扩增编码序列。根据该序列设计两个寡核苷酸引物，即G5’和G3’，以便在该基因的编码序列末端导入限制性位点。
G5’AAATCTAGATGAGCCATATTCAACGGGA (SEQ ID No.39)和G3’CCGGATCCTTAGAAAAACTCATCGAGCAT(SEQ ID No.40)。
这些寡核苷酸用于从pPIC9K载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)扩增G418基因。使用上述浓度的dNTP和引物使用在厂商提供的缓冲液中的PfuTurbo聚合酶(Stratagene)进行该扩增反应。通过在95℃下起始温育反应混合物3分钟，然后进行20个循环的95℃30秒，50℃30秒，72℃60秒，接着在72℃最后温育9分钟进行热循环。产物用限制性酶XbaI和BamHI消化，然后连接进质粒pNC104(NREL)的XbaI和BamHI位点。
与来自磷酸甘油酸激酶基因的启动子和来自GAL10基因的转录终止子(两者都来自酿酒酵母)可操作地连接的来自B.megaterium的LDH基因在G418基因Ga110终止子3’端的SphI位点导入该载体。这样基本上连接了G418选择标记基因与B.megaterium的LDH基因以产生质粒pCA5。限制性消化质粒pCA5以切除由G418选择标记基因和B.megaterium的LDH基因组成的4千碱基对(Kbp)片断。该4Kbp片断用于使用本文所述的化学和电穿孔方法转化K.Marxianus。
实施例20.用新的LDHs转化酵母本文公开的K.thermotolerans LDH-编码基因(SEQ ID No.20)的编码序列与来自磷酸甘油酸激酶基因的启动子和来自GAL10基因的转录终止子(两者都来自酿酒酵母)可操作地连接。在制备该构建体时，制备如下寡核苷酸并用于从含有该插入片断的质粒扩增编码序列EJP14 GCTCTAGAATTATGTTCCAAGATACAAAGTCTCAAG(SEQ ID No.41)和EJP15 CCGGAATTCATCCTCAATTGATCTCCAGATGCTC (SEQ ID.No.42)。
使用上述浓度的dNTP和引物使用在厂商提供的缓冲液中的Pfu Turbo聚合酶(Stratagene)进行该扩增反应。通过在95℃下起始温育反应混合物3分钟，然后进行20个循环的95℃30秒，60℃40秒，72℃60秒，接着在72℃最后温育9分钟进行热循环。产物用限制性酶XbaI和EcoRI消化，然后连接进质粒pNC101(SOURCE)的XbaI和EcoRI位点。该连接导致PGK启动子和GAL10终止子可操作地连接(即，在酵母细胞中有转录活性地连接)到K.thermotolerans LDH编码序列上。本文公开了含有所得融合的启动子，K.thermotolerans LDH编码序列和终止子的该质粒的NotI-NotI片断，鉴定为SEQ ID No.43GCGGCCGCGG ATCGCTCTTC CGCTATCGAT TAATTTTTTT TTCTTTCCTCTTTTTATTAA 60CCTTAATTTT TATTTTAGAT TCCTGACCTT CAACTCAAGA CGCACAGATATTATAACATC 120TGCACAATAG GCATTTGCAA GAATTACTCG TGAGTAAGGA AAGAGTGAGGAACTATCGCA 180TACCTGCATT TAAAGATGCC GATTTGGGCG CGAATCCTTT ATTTTGGCTTCACCCTCATA 240CTATTATCAG GGCCAGAAAA AGGAAGTGTT TCCCTCCTTC TTGAATTGATGTTACCCTCA 300TAAAGCACGT GGCCTCTTAT CGAGAAAGAA ATTACCGTCG CTCGTGATTTGTTTGCAAAA 360AGAACAAAAC TGAAAAAACC CAGACACGCT CGACTTCCTG TCTTCCTATTGATTGCAGCT 420
TCCAATTTCG TCACACAACA AGGTCCTAGC GACGGCTCAC AGGTTTTGTAACAAGCAATC 480GAAGGTTCTG GAATGGCGGG AAAGGGTTTA GATCCACATG CTATGATGCCCACTGTGATC 540TCCAGAGCAA AGTTCGTTCG ATCGTACTGT TACTCTCTCT CTTTCAAACAGAATTGTCCG 600AATCGTGTGA CAACAACAGC CTGTTCTCAC ACACTCTTTT CTTCTAACCAAGGGGGTGGT 660TTAGTTTAGT AGAACCTCGT GAAACTTACA TTTACATATA TATAAACTTGCATAAATTGG 720TCAATGCAAG AAATACATAT TTGGTCTTTT CTAATTCGTA GTTTTTCAAGTTCTTAGATG 780CTTTCTTTTT CTCTTTTTTA CAGATCATCA AGGAAGTAAT TATCTACTTTTTACAACAAA 840TCTAGAATTA TGTTCCAAGA TACAAAGTCT CAAGCAGTAA GAACTGATGCCAAAACAGTA 900 AAAGTTGTGG TAGTGGGAGT GGGAAGTGTT GGGTCTGCCACAGCGTATAC GTTGCTTCTC 960AGCGGCATCG TTTCCGAGAT TGTCCTTATC GACGTGAACA AAGACAAAGCAGAGGGTGAA 1020AGCATGGACT TAAACCACGC AGCACCTTCA AATACAAGGT CTCGAGCGGGTGATTATCCT 1080GACTGCGCTG GCGCGGCCAT TGTTATTGTC ACATGTGGGA TTAACCAAAAAAATGGACAA 1140ACAAGGATGG ATCTTGCTGC AAAAAATGCC AACATTATGC TGGAAATCATCCCCAATGTT 1200GCCAAATATG CTCCTGATAC CATCCTGCTT ATTGCCACGA ATCCTGTCGATGTTTTGACC 1260TATATTAGCT ATAAGGCGTC AGGGTTTCCA CTAAGCAGAG TTATCGGCTCAGGTACAGTT 1320CTGGATACTG CTCGTTTTAA ATACATCCTC GGAGAGCACT TCAAGATCTCATCGGACAGC 1380ATCGATGCCT GTGTAATTGG AGAACATGGT GATTCGGGTG TGCCTGTCTGGTCTCTTACC 1440AACATCGACG GCATGAAGCT CCGGGATTAC TGCGAAAAAG CCAACCACATATTTGATCAG 1500AATGCGTTCC ATAGAATCTT TGAGCAAACG CGAGACGCTG CTTACGATATCATCAAGCGC 1560AAAGGCTATA CTTCATATGG AATCGCAGCG GGATTACTTC GCATAGTAAAGGCGATTTTA 1620GAGGATACAG GATCCACACT TACAGTTTCA ACCGTTGGTG ATTATTTTGGGGTTGAACAA 1680ATTGCTATAA GCGTCCCTAC CAAACTCAAT AAAAGTGGGG CTCATCAAGTGGCTGAACTT 1740TCACTCGATG AGAAGGAAAT AGAATTGATG GAAAAATCAG CTAGTCAGATCAAATCAGTG 1800 ATTGAGCATC TGGAGATCAA TTGAGGATGA ATTCGGATCCGGTAGATACA TTGATGCTAT 1860CAATCCAGAG AACTGGAAAG ATTGTGTAGC CTTGAAAAAC GGTGAAACTTACGGGTCCAA 1920GATTGTCTAC AGATTTTCCT GATTTGCCAG CTTACTATCC TTCTTGAAAATATGCACTCT 1980ATATCTTTTA GTTCTTAATT GCAACACATA GATTTGCTGT ATAACGAATTTTATGCTATT 2040TTTTAAATTT GGAGTTCAGT GATAAAAGTG TCACAGCGAA TTTCCTCACATGTAGGGACC 2100GAATTGTTTA CAAGTTCTCT GTACCACCAT GGAGACATCA AAAATTGAAAATCTATGGAA 2160AGATATGGAC GGTAGCAACA AGAATATAGC ACGAGCCGCG GATTTATTTCGTTACGCATG 2220CGCGGCCGC2229一旦K.thermotolerans LDH可操作地连接到这些转录扩增序列上，切下该NotI-NotI片断并再克隆进能在Kluyveromyces种类中复制的载体(质粒pNC003，Invitrogen，Carlsbad，CA)中。所得的质粒含有包含LDH的NotI-NotI片断(SEQ ID No.43)以及来自K.lactis质粒pKD1的SphI位点之间的一个4,756bp的序列(Chen等，1986，Nucleic Acids Res.，144471-4481)。另外，pNC003携带酵母TEF启动子控制下的zeocin抗性基因(Hwang等，1993，EMBO J.122337-2348)。获得了两种方向的NotI-NotI片断并称为pNC102和pNC103。
这些质粒基本上按下面所述导入K.Marxianus和K.Lactis中。质粒pNC102和pNC103通过化学转化方法导入酵母细胞。不含LDH-编码基因的质粒pNC003导入酵母细胞作为对照。在含有200ug/mL zeocin的YPD平板上选择转化子并在30℃下生长2天。对于K.Marxianus的转化培养物，只获得了一个pNC003转化子和一个pNC103转化子。在K.Lactis的转化培养物中，获得了每个质粒的多个转化子。
然后分析转化子产生L-乳酸的能力。从转化平板上的菌落直接接种含20g/L葡萄糖和300ug/mL zeocin的YPD培养基的培养物(2mL)。在30℃下不摇动培养该培养物52小时。在该时期结束时，离心去掉细胞并使用YSI测定培养物上清的葡萄糖和L-乳酸。该测定的结果在下面表5中显示。含有K.thermotolerans LDH质粒的K.Marxianus和K.Lactis细胞两者都能产生明显水平的L-乳酸，而含空载体的对照细胞不产生可检测到的L-乳酸。因此，K.thermotolerans LDH清楚地能够在其它种类的酵母中起作用以引导碳进入乳酸生产。
表5宿主 质粒 转化子#葡萄糖g/l L-乳酸g/lK.lactis pNC003 1 10.00.01K.lactis pNC003 2 9.9 0.02K.lactis pNC102 1 10.12.4K.lactis pNC102 2 10.52.4K.lactis pNC102 3 10.02.5K.lactis pNC102 4 10.12.4K.lactis pNC102 5 10.62.4K.lactis pNC103 1 11.02.2K.lactis pNC103 2 10.02.4K.lactis pNC103 3 9.3 2.5
K.lactis pNC103411.0 2.4K.lactis pNC10359.92.5K.marxianus pNC00310.01 0.02K.marxianus pNC10310.00 1.3仅含YPD 19.0 0.02实施例21.在Kluvveromyces marxianus中从D-木糖生产乳酸为了证实非葡萄糖的糖类可用于生产乳酸，通过遗传改造从K.marxianus1(ATCC保藏号52486)衍生的Kluyveromyces marxianus菌株在250-mL挡板摇瓶中进行木糖发酵成乳酸。更具体地说，在该实施例中使用的3个菌株如下(i)NC39携带多拷贝的含有质粒pNC3上的Zeocin选择标记和如下所述在磷酸甘油酸激酶启动子控制下的Bacillus megaterium乳酸脱氢酶(LDH)的质粒pNC7的K.marxianus1；(ii)NC103携带多拷贝的含有质粒pNC003上的Zeocin选择标记和如上所述在磷酸甘油酸启动子控制下的Kluyveromyces thermotolerans LDH的质粒pNC103的K.marxianus1；和(iii)NC102携带多拷贝的含有pKD1载体上的Zeocin标记的质粒pNC102的K.marxianus1。后一菌株用作对照。培养基中存在Zeocin使质粒丢失最小化。
通过将单个菌落转移进含有3mL补充了300μg/mL Zeocin的确定成分完全培养基的10mL试管中制备接种物。在所有实验中使用的培养基含有(每升)6.7g Yeast-Nitrogen-Base(YNB；无氨基酸和硫酸铵)，3g尿素和0.3gZeocin。作为碳源和能源，加入20g/L D-葡萄糖或D-木糖。用氢氧化钾将起始pH调节到5.0。在摇床上以250rpm和30℃生长细胞过夜并随后转移进含有100mL上述YNB培养基的250mL挡板摇瓶中。细胞在pH 5.0和30℃下再次生长过夜，随后在-80℃贮存在15％(w/v)甘油的悬液中。这些贮存培养物用作下述实验的接种物。
用NC39和NC103在葡萄糖上生产乳酸菌株NC102，NC103和NC39的培养物在上述YNB培养基中的2％(w/v)葡萄糖中以250rpm和30℃生长到静止期。此后，沉淀细胞并以起始OD600为20转移进补充了2％(w/v)葡萄糖的YNB培养基中。细胞以100rpm和30℃培养以减少补充进培养物中的氧。以一定的时间间隔从培养物中取出液体样品以测量生长(使用OD600)，代谢产物和pH。使用固定在Waters 410Refractive Index检测器上的Aminex HPX-87H柱(用10mM H2SO4作移动相以0.5mL/分的流速在55℃下操作)通过HPLC进行代谢产物分析。当pH下降到3.5以下时，加入2g无菌CaCO3将pH增加到大约5.5。
将细胞转移进新鲜培养基24小时后，在所有试验菌株中葡萄糖完全耗尽。在菌株NC39和NC103中，分别产生了6.4g/L(32％产率)和3.8g/L(19％产率)的乳酸。在对照菌株NC102中没有检测到乳酸产生。菌株NC39和NC103还分别产生了2.3和2.9g/L乙醇；对照菌株NC102产生了5.8g/L乙醇。在所有培养物中没有检测到＞1.0g/L的其它典型发酵产物(丙酮酸盐，琥珀酸，甘油和乙酸盐)。
这些结果确定了表达异源性LDH(来自B.megaterium或者K.thermotolerans)的Kluyveromyces marxianus(crabtree-阴性酵母菌株)可用于从葡萄糖生产乳酸。
NC39和NC103在木糖上生产乳酸除了用D-木糖代替培养基中的葡萄糖外，使用基本上如上所述的培养和发酵条件证实使用木糖作碳源的乳酸生产。发酵72小时后在菌株NC39中从20g木糖产生4.8g乳酸的最大量(即，产率为0.23g/g)。在菌株NC103或对照菌株NC102中不产生乳酸。另外，没有检测到＞1.0g/L的其它发酵产物(例如，丙酮酸盐，乙酸盐，甘油，乙醇)。
这些结果确定了表达异源性LDH(来自B.megaterium或者K.thermotolerans)的Kluyveromyces marxianus(crabtree-阴性酵母菌株)可用于从木糖生产乳酸，尽管速率比用葡萄糖更慢。
这些结果也在图15中显示。
实施例22.在酵母中从戊糖糖类生产L-乳酸将Candida种类遗传改造成使用戊糖糖类生产乳酸。载体和其它构建体在图16中显示。
用于C.sonorensis的Zeocin抗性载体通过加入提供同源重组靶的C.sonorensis rDNA片断修饰含有在酿酒酵母TEF1启动子控制下的zeocin抗性标记的质粒pTEF1/Zeo(Invitrogen)。相应于C.sonorensis26 S rRNA(Genbank登录号U70185)的下列寡核苷酸引物TGGACT AGTAAA CCA ACA GGG ATT GCC TTA GT (SEQ ID No.44)和CTA GTC TAG AGA TCA TTA CGC CAG CAT CCT AGG(SEQ ID No.45)用于扩增C.Sonorensis基因组DNA以提供26S rDNA基因的PCR扩增片断。所得的PCR产物片断用限制性酶SpeI和XbaI消化并与用XbaI消化的pTEF/Zseo连接。所得的质粒pMI203在图16中显示。
用来自另一种念珠菌属(Candida)的基因启动子，即白色念珠菌(C.albicans)PGKI启动子代替pMI203中所含的TEF1启动子。根据可得的白色念珠菌PGK1序列(Genbank登录号U25180)设计下列寡核苷酸引物GCG ATC TCG AGG TCC TAG AAT ATG TAT ACT AAT TTG C(SEQ ID No.46)和ACT TGGCCA TGGTGA TAG TTA TTC TTC TGC AAT TGA (SEQ ID No.47)用于使用白色念珠菌基因组DNA作模板从白色念珠菌PGK1开放阅读框的上游区扩增700 bp片断。向引物中加入限制性位点XbaI和SpeI(上面的下划线)以利于该片断的克隆。扩增后，分离该片断并用限制性酶XhoI和NcoI消化，然后连接到用XhoI和NcoI消化的质粒pMI203上。所得的质粒pMI205在图16中显示。
C.Sonorensis基因的分离为了形成C.sonorensis的合适遗传工具，从该种类构建基因组文库。根据相关酵母基因的已知氨基酸和核苷酸序列从该文库分离目的基因。分离诸如PGK1和TDH1的强组成型表达基因的启动子和终止子并用于表达异源性基因。分离PDC基因，因为相应的酶进行与乳酸生产竞争的反应。因此需要从用于乳酸生产的菌株删除PDC基因。
使用Easy DNA试剂盒(Invitrogen)从YPD中生长过夜的细胞分离C.sonorensis(ATCC保藏号32109)的基因组DNA。用Sau3A部分消化DNA并通过蔗糖梯度离心(Sambrook等，1989，Molecular Cloning，第二版，纽约冷泉港实验室)进行大小分离，将大约22kb的DNA片断连接到BamHI消化的，磷酸酶处理的λDASHTM载体臂(Stratagene)上并使用GigapackII GoldPackaging Extract(Stratagene)将连接混合物包装进λ颗粒中。该λ颗粒用于感染大肠杆菌MRA P2。
使用Dynazyme EXT聚合酶(Finnzymes，Espoo，Finland)，序列特异性引物和如下的酿酒酵母，白色念珠菌或C.sonorensis的基因组DNA作模板通过PCR扩增制备用于从该文库分离C.sonorensis基因的探针·相应于酿酒酵母TDH1基因的寡核苷酸TGT CAT CAC TGC TCC ATC TT(SEQID No.48)和TTA AGC CTT GGC AAC ATA TT(SEQ ID No.49)用于从基因组酿酒酵母DNA扩增TDH基因的片断。
·相应于白色念珠菌PGK1基因的寡核苷酸GCG ATC TCG AGG TCC TAG AATATG TAT ACT AAT TTG C(SEQ ID No.50)和CGC GAA TTCCCA TGGTTAGTT TTT GTT GGA AAG AGC AAC(SEQ ID No.51)用于从基因组白色念珠菌DNA扩增PGK1基因的片断。
·相应于C.sonorensis 26S rRNA的寡核苷酸TGGACT AGTAAA CCA ACAGGG ATT GCC TTA GT(SEQ ID No.52)和CTA GTC TAG AGA TCA TTA CGCCAG CAT CCT AGG(SEQ ID No.53)用于从C.sonorensis基因组DNA扩增26S rDNA基因的片断。
·根据在酿酒酵母PDC1，Pichia stipitis PDC1和PDC2，和白色念珠菌PDC1和PDC3的不完全序列之间保守的部分丙酮酸脱羧酶氨基酸序列WAGNANELNA(SEQ ID No.56)和DFNTGSFSYS(SEQ ID No.57)设计寡核苷酸CCGGAA TTC GAT ATCTGG GCW GGK AAT GCC AAY GAR TTR AAT GC(SEQ ID No.54)和CGCGGA TTC AGG CCTCAG TAN GAR AAW GAA CCN GTRTTR AAR TC(SEQ ID No.55)。这些引物用于从C.sonorensis基因组DNA扩增PDC基因的片断。用这些引物的PCR反应产生了称为PDC1和PDC2的不同核苷酸序列的两个片断。
·根据真菌乙醇脱氢酶序列中发现的保守区设计寡核苷酸TCTGTTMCCTACRTAAGA(SEQ ID No.58)和GTYGGTGGTCACGAAGGTGC(SEQ IDNo.59)。这些引物用于从C.sonorensis基因组DNA扩增ADH基因的片断。用这些引物的PCR反应产生了称为ADH1，ADH2，和ADH3的不同核苷酸序列的3个片断。
用上述产生的PCR片断筛选该文库，使用随机引发标记试剂盒(Boehringer Mannheim)用32Pα-dCTP标记该产物。通过在含有50％甲酰胺，5x Denhardt’s，5x SSPE，0.1％SDS，100μg/mL鲱精DNA，1μg/mL polyADNA的溶液中42℃温育过夜进行与放射性探针的杂交。对于TDH1，PGK1，和PDC1探针，杂交后在室温下在2x SSC的溶液中洗涤滤膜5分钟并重复，接着在1x SSC-0.1％SDS的溶液中68℃洗涤两个30分钟。对于rDNA和PDC2探针的杂交后洗涤在室温下在2x SSC中进行两次5分钟，接着在68℃下在0.1x SSC-0.1％SDS中洗涤两个30分钟。
按照厂商的说明书(Stratagene)分离和纯化阳性噬菌斑。使用常规方法(Sambrook等，出处同上)纯化噬菌体，对该方法的修改为除出DNAseI处理并使用PEG6000沉淀从裂解的宿主细胞释放的噬菌体颗粒，然后将该噬菌体颗粒溶于SM缓冲液中并用氯仿萃取，通过在Kontron TST41.14离心机中以25,000rpm离心2小时沉淀，并再次溶于SM缓冲液中。通过用蛋白酶K消化噬菌体颗粒接着苯酚提取和乙醇沉淀分离λDNA。
使用序列特异性引物部分测序C.sonorensis基因组DNA插入片断。将该核苷酸序列和从其推断的氨基酸序列与序列数据库进行比较，通过与已知基因或蛋白质的同源性鉴定由噬菌体插入片断全部或部分编码的基因。依赖于用于分离各克隆的探针，所获得的序列与真菌rDNA，磷酸甘油酸激酶，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，或丙酮酸脱羧酶具有显著的相似性。从而鉴定了C.sonorensis PGK1，PDC1和TDH1开放阅读框编码序列的起始和终止点。
MEL5基因选择用于选择C.sonorensis转化子为了建立对C.sonorensis转化子的阳性选择，从质粒pMEL5-39以2160bp的EcoRI-SpeI片断获得酿酒酵母MEL5基因(Naumov等，1990，MGG224119-128；Turakainen等，1994，Yeast101559-1568；Genbank登录号Z37511)并与用EcoRI和SpeI酶切消化的pBluescript II KS(-)(Stratagene)连接。MEL5基因中的EcoRI位点位于起始密码子ATG上游510bp处，SpeI位点位于MEL5终止密码子下游250bp处。所得的质粒命名为pMI233，且在图16中显示。
用引物GCG ATC TCG AGA AAG AAA CGA CCC ATC CAA GTG ATG(SEQ ID No.60)和TGGACT AGTACA TGC ATG CGG TGA GAA AGT AGA AAG CAA ACA TTG TAT ATAGTC TTT TCT ATT ATT AG(SEQ ID No.61)并使用上述分离的PGK1λ克隆的DNA作模板扩增1500bp的C.sonorensis PGK1启动子。3’引物(SEQ IDNo.61)可产生C.sonorensis PGK1启动子和酿酒酵母MEL5之间的融合，因为它相应于紧靠开放阅读框上游的PGK1启动子上存在的核苷酸和相应于MEL5开放阅读框5’端的核苷酸。所得的扩增片断用限制性酶SphI和XhoI消化并连接到用SphI和XhoI消化的质粒pMI233上。在该质粒中所得的构建体含有MEL5开放阅读框上游且可操作地连接到其上的C.sonorensisPGK1启动子，且鉴定为图16中所示的pMI234。
以相似的方式，使用上述分离的TDH1λ克隆的DNA作模板用引物GCG ATCTCG AGA AAA TGT TAT TAT AAC ACT ACA C(SEQ ID No.62)和TGGACT AGTACA TGC ATG CGG TGA GAA AGT AGA AAG CAA ACA TTT TGT TTG ATT TGT TTGTTT TGT TTT TGT TTG(SEQ ID No.63)扩增650bp的C.sonorensis TDH1启动子。3’引物(SEQ ID No.63)可产生C.sonorensis TDH1启动子和酿酒酵母MEL5之间的融合，因为它相应于紧靠开放阅读框上游的TDH1启动子上存在的核苷酸和相应于MEL5开放阅读框5’端的核苷酸。用SphI和XhoI酶切扩增片断并连接到用SphI和XhoI消化的质粒pMI233上。鉴定为图16中所示的pMI238的所得质粒含有MEL5开放阅读框上游且可操作地连接到其上的C.sonorensis TDH1启动子。
通过用SpeI和XhoI限制性酶消化可从载体序列释放MEL5表达序列盒，且按照Backer等(1999，Yeast151609-1618)的方法通过电穿孔将1μg的该线型DNA转化进C.sonorensis中。细胞在50mL的YPD中生长过夜，离心收获并重悬于0.1M LiAc/10mM DTT/10mM Tris-HCl溶液中及在室温下培养1小时后进行转化。离心收集细胞并用冷水和1M山梨醇洗涤并重悬于冷的1M山梨醇中。将DNA(1-3μg)加入40μL的细胞悬液中并将该混合物吸入0.2cm电穿孔杯中。Bio-Rad基因脉冲仪设置为1.5kY，25F，200Ω用于电穿孔。电脉冲后，将1mL冷的1M山梨醇加到细胞上。然后细胞在30℃不摇动培养1小时；作为选择，可加入2mL YPD且在30℃下继续培养2-3小时。将细胞涂布到合适的琼脂平板上用于再生。
在另一选择方案中，按照Gietz等(1992，Nucleic Acids Res.201425)的方案转化细胞。转化子在以40μg/mL的浓度补充了α-半乳糖苷酶的产色底物，即5-溴-4-氯-3-吲哚基-α-D-半乳糖吡喃糖苷(X-gal；ICNBiochemicals)的YPD琼脂平板(含有10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖和2％琼脂)上生长。平板在30℃下培养1-3天，然后转移到4℃。存在X-gal时，用有功能的MEL5表达序列盒转化的酵母菌落变蓝，而未转化的菌落为白色。在这些实验中获得的转化频率为2-20个转化子/μgDNA。通过将它们在新鲜指示剂平板上再划线培养来纯化蓝色菌落。
转化子还获得了在作为唯一碳源的蜜二糖上生长的能力。这表明蜜二糖通过分泌进培养基的MEL5-编码的α-半乳糖苷酶水解成葡萄糖和半乳糖。
在含有X-gal的培养基中筛选转化子的平行策略是在含有蜜二糖作为唯一碳源的培养基上选择它们。转化后，细胞涂布到含有0.67％Yeast Nitrogenbase(Difco)和2％蜜二糖的琼脂平板上，平板在30℃下培养5-10天。在这些条件下，未转化的细胞不能长出可见菌落，而MEL5转化子形成菌落。
含有C.sonorensis的MEL5标记的瑞士乳杆菌LDH表达盒和载体质粒pMI205用于产生含有作为选择标记的MEL5基因和用于使得能够在C.soronensis中产生乳酸的LDH基因的质粒。在所得的质粒中，用瑞士乳杆菌LDH基因取代pMI205中的zeocin抗性基因。
将含有LDH基因和CYC1终止子的pVR1的1329bp NcoI-BamHI片断连接到pMI205的3413bp NcoI-BamHI片断上，导致瑞士乳杆菌LDH基因在白色念珠菌PGK1启动子的控制下；所得的质粒称为pMI214且在图16中表示。在第二个步骤中，用C.sonorensis PGK1启动子取代白色念珠菌PGK1启动子。使用引物GCG ATC TCG AGA AAG.AAA CGA CCC ATC CAA GTG ATG(SEQ IDNo.64)和ACT TGGCCA TGGTAT ATA GTC TTT TCT ATT ATT AG(SEQ ID No.65)从上述分离的λ克隆通过扩增分离C.sonorensis PGK1启动子，用XhoI和NcoI消化该PCR产物并连接进用XhoI和NcoI消化的pMI214中。该质粒命名为pMI277且在图16中表示。
通过将pMI227的3377bp AvrII-NheI片断与SpeI-消化的pMI234连接将pMI227的LDH表达盒和pMI234的MEL5标记序列盒组合进同一载体中。所得的质粒命名为pMI246且在图16中表示。
通过将pMI227的3377bp AvrII-NheI片断与SpeI-消化的pMI238连接将pMI227的LDH表达盒和pMI238的MEL5标记序列盒组合进同一载体中。所得的质粒命名为pMI247且在图16中表示。
用于乳酸生产的C.sonorensis转化使用本领域中对于其它酵母种类形成的转化方法将编码LDH的载体导入C.sonorensis细胞中。转化前，质粒pMI246和pMI247通过用在rDNA序列内酶切的限制性酶BstBI消化被线型化，从而定向整合进rDNA基因座。作为选择，转化质粒用ApaI和BamHI消化，接着从琼脂糖凝胶纯化，从而从载体序列释放该标记和LDH序列盒并有利于随机整合进基因组。
通过醋酸锂方法(Gietz等，1992，Nucleic Acids Res.201425)或者通过上述电穿孔方法用pMI246或pMI247转化C.sonorensis且根据在补充了X-gal的YPD平板上形成的蓝色筛选并纯化转化子。
检测产生α-半乳糖苷酶的菌落的乳酸生产。转化子在YPD液体培养基中30℃下生长过夜，取出等分试样的培养基并使用L-乳酸测定试剂盒(Boehringer Mannheim)酶促分析乳酸的存在。在转化子培养物上清中检测到的乳酸比宿主菌株多至少10倍。
用BstBI酶切的pMI246转化C.sonorensis产生的转化子命名为246-1到246-9。用BstBI酶切的pMI247转化C.sonorensis产生的转化子命名为247-1到247-4。用ApaI-BamHI酶切的pMI246转化C.sonorensis产生的转化子命名为246-10到246-15。用ApaI-BamHI酶切的pMI 247转化C.sonorensis产生的转化子命名为247-5到247-10。
含有整合进基因组的瑞士乳杆菌LDH基因的C.sonorensis在丰富培养基中的L-乳酸生产C.sonorensis细胞和上述转化子(246-1，246-2，246-3，247-1，247-2，247-3和247-4)在YPD培养基中培养。预培养物在YPD培养基中生长到OD600为11-17，然后重悬于50mL的YPD中达到OD600为0.5用于培养实验。培养开始时，酵母细胞在以250rpm摇动的250mL锥形瓶中培养。培养4小时后，将酵母细胞移进100mL锥形瓶中并加入额外的葡萄糖(相应于20g/L的终浓度)并以40rpm摇动继续培养。培养期间取出样品，测量OD600，通过离心收获细胞并以HPLC分析生长培养基的乳酸和葡萄糖(使用BoehringerMannheim的L-乳酸UV法和葡萄糖/GOD-过碘酸盐方法)。
培养24小时后，转化子从葡萄糖产生2.4-3.3g/L乳酸(相当于11-63％的产率)，而对照菌株产生0.05g/L乳酸(0.1％的产率)。
本实施例证实了LDH在C.sonorensis细胞中的超表达增强了含葡萄糖的培养基中的L-乳酸生产。
含有整合进基因组中的瑞士乳杆菌LDH基因的C.sonorensis在基本葡萄糖培养基中生产L-乳酸C.sonorensis细胞和上述转化子(246-1，246-3，247-2)在YD培养基(补充了2％葡萄糖的无氨基酸的酵母氮源)中培养。预培养物在YD培养基中生长到OD600为10-13，离心收集细胞，用YD培养基洗涤一次，然后重悬于50mL的YD中达到OD600为0.4用于培养实验。酵母在100mL锥形瓶中以40rpm摇动培养(微需氧条件)。培养期间取出样品，测量OD600，通过离心收获细胞并以HPLC分析生长培养基的乳酸和葡萄糖。HPLC分析用Waters 510HPLC泵，Waters 717+自动取样器和Water System Interphase Module液相色谱法与折光率检测器(Waters 410示差折射计)和UV-检测器(Waters 2487双重λUV检测器)组合进行。使用的Aminex HPX-87H离子排阻柱(300mm×7.8mm，Bio-Rad)在35℃下用水中的5mM H2SO4平衡，样品用在水中的5mMH2SO4以0.6mL/分的流速洗脱。用Waters Millennium软件进行数据获取和控制。
培养70小时后，转化子从葡萄糖产生2.2-2.5g/L乳酸(相当于10-13％的产率)，而对照菌株不产生能检测到的乳酸。
本实施例证实了超表达异源性LDH基因的C.sonorensis细胞能从葡萄糖产生乳酸。
含有整合进基因组中的瑞士乳杆菌LDH基因的C.sonorensis细胞在厌氧条件下在基本葡萄糖培养基(minimal glucose media)中生产L-乳酸C.sonorensis细胞和上述转化子(246-1)在YD培养基(补充了2％葡萄糖的无氨基酸的酵母氮源)中在厌氧摇瓶中培养。预培养物在YD培养基中生长到OD600为22-24，离心收集细胞，用YD培养基洗涤一次，然后重悬于100mL的YD中达到OD600为0.75用于培养实验。在装备有以40rpm摇动的锁水器(waterlocks)的100mL锥形瓶中(厌氧条件)培养酵母。培养期间取出样品，测量OD600，通过离心收获细胞并以HPLC分析生长培养基的乳酸和葡萄糖。HPLC分析用Waters 510 HPLC泵，Waters 717+自动取样器和WaterSystem Interphase Module液相色谱法与折光率检测器(Waters 410示差折射计)和UV-检测器(Waters 2487双重λUV检测器)组合进行。使用的AminexHPX-87H离子排阻柱(300mm×7.8mm，Bio-Rad)在35℃下用水中的5mMH2SO4平衡，样品用在水中的5mM H2SO4以0.6mL/分的流速洗脱。用WatersMillennium软件进行数据获取和控制。
培养160小时后，菌株246-1从葡萄糖产生1.1g/L乳酸(相当于16％的产率)，而对照菌株产生0.03g/L乳酸(0.1％的产率)。
本实施例证实了超表达异源性LDH基因的C.sonorensis细胞能在厌氧条件下从葡萄糖产生乳酸。
含有整合进基因组中的瑞士乳杆菌LDH基因的C.sonorensis在基本木糖培养基中生产L-乳酸C.sonorensis细胞和上述转化子(246-1，246-3，247-2)在YX培养基(无氨基酸且补充了2％木糖的酵母氮源(base))中培养。预培养物在YPD培养基中生长到OD600为10-13，随后离心收集细胞，用YX培养基洗涤一次并重悬于50mL的YX培养基中达到OD600为0.75用于培养实验。酵母培养物在100mL锥形瓶中以40rpm摇动培养。培养期间取出样品，测量OD600，通过离心收获细胞并以HPLC分析生长培养基的乳酸和木糖。HPLC分析用Waters 510 HPLC泵，Waters 717+自动取样器和Water System InterphaseModule液相色谱法与折光率检测器(Waters 410示差折射计)和UV-检测器(Waters 2487双重λUV检测器)组合进行。Aminex HPX-87H离子排阻柱(300mm×7.8mm，Bio-Rad)在35℃下用水中的5mM H2SO4平衡，样品用在水中的5mM H2SO4以0.6mL/分的流速洗脱。用Waters Millennium软件进行数据获取和控制。以Boehringer Mannheim的L-乳酸UV法分析L-乳酸。
培养70小时后，转化子从木糖产生0.1g/L乳酸(相当于9-17％的产率)，而对照菌株产生0.003g/L乳酸(0.2％的产率)。
本实施例证实了超表达异源性乳酸脱氢酶编码基因的C.sonorensis能从木糖产生乳酸。
含有整合进基因组中的瑞士乳杆菌LDH基因的C.sonorensis在基本木糖培养基中生产L-乳酸C.sonorensis细胞和上述转化子(246-1，246-3，247-2)在YX培养基(无氨基酸且补充了2％木糖的酵母氮源)中培养。预培养物在YPD培养基中生长到OD600为12-18，随后离心收集细胞，用YX培养基洗涤一次并重悬于50mL的YX培养基中达到OD600为2.0用于培养实验。酵母培养物在100mL锥形瓶中以40rpm摇动(微需氧条件)培养。培养期间取出样品，测量OD600，通过离心收获细胞并以HPLC分析生长培养基的乳酸和木糖。HPLC分析用Waters 510 HPLC泵，Waters 717+自动取样器和Water System InterphaseModule液相色谱法与折光率检测器(Waters 410示差折射计)和UV-检测器(Waters 2487双重λUV检测器)组合进行。Aminex HPX-87H离子排阻柱(300mm×7.8mm，Bio-Rad)在35℃下用水中的5mM H2SO4平衡，样品用在水中的5mM H2SO4以0.6mL/分的流速洗脱。用Waters Millennium软件进行数据获取和控制。以Boehringer Mannheim的L-乳酸UV法分析L-乳酸。
培养165小时后，转化子从木糖产生0.2g/L乳酸(相当于5-6％的产率)，而对照菌株不产生可检测的乳酸。
本实施例证实了超表达异源性乳酸脱氢酶编码基因的C.sonorensis能从木糖产生乳酸。
含有整合进基因组中的瑞士乳杆菌LDH基因的C.sonorensis在基本阿拉伯糖培养基中生产L-乳酸C.sonorensis细胞和转化子(246-1，246-3，247-2)在YA培养基(无氨基酸且补充了2％L-阿拉伯糖的酵母氮源)中培养。预培养物在YPD培养基中生长到OD600为12-18，随后离心收集细胞，用YA培养基洗涤一次并重悬于50mL的YA培养基中达到OP600为2.0用于培养实验。酵母培养物在100mL锥形瓶中以40rpm摇动(微需氧条件)培养。培养期间取出样品，测量OD600，通过离心收获细胞并以HPLC分析生长培养基的乳酸和阿拉伯糖。HPLC分析用Waters 510 HPLC泵，Waters 717+自动取样器和Water System InterphaseModule液相色谱法与折光率检测器(Waters 410示差折射计)和UV-检测器(Waters 2487双重λUV检测器)组合进行。Aminex HPX-87H离子排阻柱(300mm×7.8mm，Bio-Rad)在35℃下用水中的5mM H2SO4平衡，样品用在水中的5mM H2SO4以0.6mL/分的流速洗脱。用Waters Millennium软件进行数据获取和控制。
培养165小时后，转化子从阿拉伯糖产生0.04-0.05g/L乳酸(相当于2-3％的产率)，而对照菌株产生0.007g/L乳酸(0.5％的产率)。
本实施例证实了超表达异源性乳酸脱氢酶编码基因的C.sonorensis能从阿拉伯糖产生乳酸。
含有整合进基因组中的瑞士乳杆菌LDH基因的C.sonorensis菌株在基本蜜二糖培养基中生产L-乳酸C.sonorensis细胞和上述转化子(246-1，246-10，247-2，247-5)在YM培养基(无氨基酸且补充了2％蜜二糖的酵母氮源)中培养。预培养物在YPD培养基中生长到OD600为18-25，离心收集细胞并用YM培养基洗涤一次并重悬于50mL的YM培养基中达到OD600为1.5用于培养实验。酵母在100mL锥形瓶中以40rpm摇动(微需氧条件)培养。培养期间取出样品，测量OD600，通过离心收获细胞并以HPLC分析生长培养基中的乳酸(以BoehringerMannheim的L-乳酸UV法)。
培养165小时后，转化子产生0.8-2.6g/L乳酸。
本实施例揭示了超表达异源性LDH基因的C.sonorensis细胞能从蜜二糖产生乳酸。
其它实施方案应理解尽管结合其详细描述已经描述了本发明，但是前面的描述的意图是举例说明性的而不是限制本发明的范围，该范围由所附的权利要求书的范围来限定。其它方面，优点，和修改均在下面权利要求书的范围内。
序列表<110>Rajgarhia，Vineet<120>合成有机产物的方法和材料<130>00-1237-A<140>09<141>2001-11-23<150>60/252，541<151>2000-11-22<160>65<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>92<212>DNA<213>人工序列-多克隆位点<400>1cccaagcttg aattccccgg gggatccctg cagggtacca cgcgtagatc tactagtgcg60gccgcctcga gtctagaggg cccaagcttg gg92<210>2<211>91<212>DNA<213>人工序列-多克隆位点<400>2ccaagcttgg gccctctaga ctcgaggcgg ccgcactagt agatctacgc gtggtaccct60gcagggatcc cccggggaat tcaagcttgg g91<210>3<211>31<212>DNA<213>Lactobacillus helveticus<400>3ccgggatcca tggcaagaga ggaaaaacct c31<210>4<211>32<212>DNA<213>Lactobacillus helveticus<400>4ccaagatctt tattgacgaa ccttaacgcc ag32<210>5<211>37<212>DNA<213>Pediococcus acidilactici<400>5ccgggatcca tgtctaatat tcaaaatcat caaaaag37<210>6<211>33<212>DNA<213>Pediococcus acidilactici<400>6ccaagatctt tatttgtctt gtttttcagc aag33<210>7<211>82<212>DNA<213>Kluyveromyces marxianus<400>7taaacagtac aatcgcaaag aaaagctcca cacccaaacc aaataattgc aatgcaactt60cttttctttt tttttctttt ct82<210>8<211>79<212>DNA<213>Kluyveromyces 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1.一种分离的核酸，它编码具有以Seq.ID No.22鉴定的氨基酸序列的酵母乳酸脱氢蛋白。
2.一种分离的核酸，它编码具有以Seq.ID No.30鉴定的氨基酸序列的酵母乳酸脱氢蛋白。
3.根据权利要求1的分离的核酸，它编码酵母乳酸脱氢蛋白且在高度严格条件下与以Seq.ID No.21鉴定的核酸探针杂交。
4.根据权利要求3的分离的核酸，其中在高度严格杂交条件下洗涤后检测杂交。
5.根据权利要求2的分离的核酸，它编码酵母乳酸脱氢蛋白且在高度严格条件下与以Seq.ID No.29鉴定的核酸探针杂交。
6.根据权利要求5的分离的核酸，其中在高度严格杂交条件下洗涤后检测杂交。
7.一种重组表达构建体，它含有具有根据权利要求1或2的编码酵母乳酸脱氢蛋白的核苷酸序列的核酸，其中该核酸在酵母细胞中表达。
8.根据权利要求7的重组表达构建体，还含有与编码酵母乳酸脱氢蛋白的核酸可操作地连接的酵母启动子。
9.根据权利要求7的重组表达构建体，还含有与编码酵母乳酸脱氢蛋白的核酸可操作地连接的酵母转录终止子元件。
10.根据权利要求7的重组表达构建体，还含有来自酵母2-micron环状质粒的酵母复制元件。
11.用权利要求7的重组表达构建体转化的酵母细胞，其中该转化细胞表达酵母乳酸脱氢蛋白。
12.根据权利要求11的酵母细胞，其中该酵母细胞是来自糖酵母属，Kluyveromyces，Hansenula，Candida，Trichosporon，Yamadazyma，Torulaspora或Pichia属的酵母。
13.根据权利要求11的酵母细胞，其中该酵母细胞表达crabtree-阴性表型。
14.根据权利要求11的酵母细胞，其中该酵母细胞是选自由C.sonorensis和K.Marxianus组成的组中的酵母种类。
15.根据权利要求11的酵母细胞，其中该酵母细胞产生的选自由丙酮酸脱羧酶，乙醇脱氢酶，和乙酰-CoA合成酶组成的组中的糖酵解酶的量减少。
16.一种生产乳酸的方法，包括在含有糖类的营养培养基中在至少50％的糖类被酵母细胞转化成乳酸的条件下发酵根据权利要求11的酵母细胞培养物的步骤。
17.权利要求16的方法，其中该酵母细胞在从大约35℃到大约55℃的温度下生长。
18.权利要求16的方法，其中该营养培养基具有不超过大约pH 5.0的pH。
19.权利要求16的方法，其中酵母在基本上厌氧的条件下生长。
20.权利要求16的方法，其中该酵母细胞是crabtree-阴性酵母细胞。
21.权利要求20的方法，其中该酵母细胞是K.marxianus或C.sonorensis。
22.权利要求16的方法，其中该酵母细胞产生的选自由丙酮酸脱羧酶，乙醇脱氢酶，和乙酰-CoA合成酶组成的组中的糖酵解酶的量减少。
23.权利要求16的方法，其中该糖类是葡萄糖，木糖，核糖，阿拉伯糖，甘露糖，半乳糖，果糖，麦芽糖或来苏糖。
全文摘要
本发明提供了用于生产乳酸盐的生物催化剂，它是含有重组表达载体的重组酵母细胞，该载体编码异源性乳酸脱氢酶基因。
文档编号C12N15/81GK1486366SQ01821843
公开日2004年3月31日 申请日期2001年11月23日 优先权日2000年11月22日
发明者文尼特·拉杰加希亚, 默加·潘蒂拉, 劳拉·劳霍南, 马加·伊尔曼, 卡里·科伊沃兰塔, 伊尔曼, 劳霍南, 文尼特 拉杰加希亚, 潘蒂拉, 科伊沃兰塔 申请人:加吉尔·道聚合物公司, 加吉尔 道聚合物公司