专利名称：聚合酶链反应与短片段dna测序相结合的诊断方法
技术领域：
本发明聚合酶链反应与短片段DNA测序相结合的诊断方法涉及一种生物检测方法，尤其适用于进行遗传病的产前诊断、致病病原体的检测、癌基因的检测和诊断、DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴以及法医物证、动、植物检疫、高科技生物医学等领域研究。
上述两个问题中，假阴性问题在长期的试验中已经有了比较多的经验和解决方法，一般只要按照各个条件依次审核，是可以得到最终可信的结果的。但出现假阳性错误，除了污染是一个主要因素外，PCR技术本身的缺陷也是一个重要原因。退火温度设计难以精确，引物的错配及一定程度的单核苷酸错误掺入，都可以导致假阳性结果的产生。而且，要找到其原因并纠正是非常耗时耗力的。所以一个成功的PCR检测方法要经过很长时间的摸索条件和实际验证，才能最终应用于临床，而且在实际操作过程中，对操作的规范要求较高，这也在一定程度上限制了其应用。
本发明的目的可通过下述技术方案实现一种聚合酶链反应与短片段DNA测序相结合的方法，以微量目的基因两端或两侧已知核苷酸序列设计一对引物，以待鉴定DNA作为模板进行扩增(PCR法)，特点是以PCR产物为模板再次扩增，选取相应检测对象DNA全序列中较保守且特异性较高的几十个甚至几个核苷酸进行短片段DNA测序。克服了现有PCR技术中常出现的假阴性、假阳性现象，提高了精确度。本发明采取PCR方法与短片段DNA测序相结合的方法。一方面保留了PCR方法高灵敏度、强特异性的特点，另一方面应用目前成熟的小片段DNA测序法，只需选取相应检测对象DNA全序列中较保守且特异性较高的几十个甚至几个核苷酸，即可判断PCR产物中是否存在该目的片段，确定阳性或阴性结果。对PCR的操作不再苛求。因为在测序中重新设计引物，以PCR产物为模板再次扩增，使得假阳性率大大降低，所以对PCR试验的条件可以降低要求，如退火温度、循环次数等不再要求得那么严格，大大减少了摸索时间和精力。由于间和精力。由于通过对相关基因的特异区域进行测序，可以确切地知道其具体序列，有利于对该基因进行分型鉴定，并可广泛地应用于各个领域。
在上述技术方案基础上，短片段DNA测序中引物设计是针对与疾病相关且基因序列已知的DNA而设计的。从而使本应用于疾病诊断、物种研究等多学科领域中。
在上述技术方案基础上，当测序引物是根据与高发的遗传病、有遗传倾向的疾病相关的已知基因序列设计的，本发明用于遗传病的诊断。一般情况下，遗传性疾病可以根据其临床症状、家系分析和生化、免疫等传统的检测手段被诊断出，但是对于隐性遗传性疾病中杂合子的诊断以及判断杂合子的后代是否罹患(产前诊断)，就要进行疾病基因的检测。对于高发的遗传病，如地中海贫血、镰刀状细胞贫血、凝血因子缺乏等，或有遗传倾向的疾病尤其是老年性疾病，如糖尿病、高血脂症、甚至肿瘤中的一部分，只要与疾病相关的基因序列已知，即可用本方法进行检测，迅速确定其突变位点或缺失的片段。
在上述技术方案基础上，根据外源入侵的致病基因设计引物或探针。对于外源入侵的基因，一旦阐明其部分核酸序列，就可以设计引物或探针，用PCR、RT-PCR或杂交方法来检测，其范围包括细菌、病毒、原虫及寄生虫、霉菌、立克次体、衣原体和支原体等一切微生物，这些PCR与短片段DNA结合诊断的特点是可以选择其基因中的保守区作通用检测，也可以选定差异较大的基因部位作分型检测。既可以做一病原体的专用检测，也可以将有关病毒、细菌中不同的品种作一次多元检测。而且可以得到确切的DNA序列进行分析，检测的灵敏度和特异性都远高于当前的免疫学方法，所需时间也已达到临床要求，这对于难于培养的病毒(乙肝)，细菌(如结核、厌氧菌)和原虫(如梅毒螺旋体)等来说尤为适用。
在上述技术方案基础上，通过设计针对癌基因、抗癌基因及抗转移基因的特异性引物进行PCR扩增及短片段测序，可以断定癌基因、抗癌基因及抗转移基因是否突变性，用于癌基因的检测和诊断。虽然对癌基因的研究大部分还属于基础阶段，但癌变是由基因变异所导致的这一基本事实已毋庸置疑，所以癌基因、抗癌基因及抗转移基因的研究，离开分子水平的诊断手段是无法进行的，临床上已可应用的例子有白血病残留细胞的定量(包括慢粒和急粒)，肺癌中P53及Rb等抗癌基因的失活，神经质瘤N-myc基因的激活和表达。通过设计针对这些基因的特异性引物进行PCR扩增及短片段测序，便可以断定癌基因、抗癌基因及抗转移基因是否产生突变，从而完成对肿瘤的基因诊断，尤其有优势的是对肿瘤的早期诊断。
在上述技术方案基础上，针对肌红蛋白小卫星基因，β-珠蛋白基因、ApoB基因设计引物，根据多态性和重复次数的差异应用于鉴定DNA指纹、个体识别、亲子关系和物种研究。DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别及法医物证，作为公、检、法部分所瞩目的课题已经在某些国家取得法律认可。肌红蛋白小卫星基因，β-珠蛋白基因、ApoB基因等的多态性和重复次数的差异都被应用于鉴定，其灵敏度已达到一根头发、一个细胞、一个精子取得个体特征图谱，这一领域也已发展到骨髓或脏器移植配型及动物种系的研究中。
在上述技术方案基础上，针对烈性传染病病原体设计引物，用于检疫人员、动、植物是否携带烈性传染病病原体，以及食品、饲料等是否带沙门氏菌。动、植物检疫的灵敏、特异、快速诊断检测方法是我国进出口口岸的门卫，检查出入国门的人员、动、植物(种畜、种籽)等是否携带烈性传染病(艾滋、动物病毒、植物病毒等)病原体，食品、饲料等是否带沙门氏菌等均需要基因诊断手段，并将这些病菌拒之于国门之外，是提高我国综合国力的必要保证。
在上述技术方案基础上，本发明用于检查转基因动植物中植入基因的存在。在高科技生物医学领域中发挥了重要作用。
本发明的优越性在于操作简便、省时省力、灵敏度高、特异性强、对原始材料质量要求低。下面通过实施例详述。
下面以PyrosequencingTM为例，阐述短片段DNA测序的原理及步骤。
Pyrosequencing的基本原理是利用级联化学发光反应监测核酸链的延伸。检测到的发光程度与掺入的核苷酸数量成正比。通过分别检测四种核苷酸加入时的发光情况，就能知道待测位点的碱基顺序。具体步骤如下第一步DNA的聚合酶催化的链延伸反应，产生一个焦磷酸。
第二步，焦磷酸在Sulfurylase催化下，与APS反应生成ATP。
第三步ATP在荧光素酶(Luciferase)的作用下，发出荧光。第四步，检测所发荧光的强度，确定掺入核苷酸的数目。第五步，未反应的dNTP被Apyrse降解。二，本发明的用途PCR与短片段DNA测序相结合，可以应用于各个基因检测领域，相对于PCR检测，更加精确可靠。以α地中海贫血症的诊断为例，α地贫是由α珠蛋白基因不同范围的缺失及点突变所致，但以缺失型突变最为常见，其缺失的范围可从两个α-基因均缺失至一些小片段的缺失，均可在人群中检出，α-基因的另一突变即为单碱基置换，目前已发现的突变有18种以上，它包括错义突变，无意突变剪接部位突变及起始信号突变。因此，α地贫PCR诊断的主要任务就在于快速检出α珠蛋白基因的缺失片段或突变位点。仅仅运用PCR技术，是无法确切的指出是缺失还是突变，或缺失几个碱基还是突变了哪个位点。而应用本技术产品，则可对α地贫的基因型做出准确的判断。通过下列一对引物，PC015’TACTGTAGATACCCGTGTACAA3’PC025’ATCARGGAAACATAGTAAT3’扩增条件93℃(30”)；45℃(30”)；65℃，可以扩增出136bp的片段，直接进行测序即可得出结论，测序引物可以是上述引物，也可以在突变或缺失多发区域前后再设计一对引物，目的序列可缩短到几十个碱基对。这样，大大减少了PCR检测中的假阳性结果，使临床检验结果准确率接近100％。
本发明的优越性表现在下述几方面1，操作简便目前PCR技术可采用耐高温Taq DNA聚合酶，并且在有电脑控制的DNA扩增仪中进行，使操作大为简化，一次加入的酶即可满足反应全过程。DNA扩增仪能自动迅速升降温度，只需把反应所需的全部材料混匀，置入仪器内，反应便依所输入的程序进行。获得的PCR产物经过简单的纯化后即可直接进行测序分析，由于只需要对短至几十甚至几个核苷酸的序列测定，测序工作可以很快速地由全自动DNA测序仪或者手动测序法完成。
2，省时省力应用Taq DNA聚合酶时，单核苷酸掺入速率较高，75～80℃时，每个酶分子每秒钟可完成150个核苷酸的合成。PCR每一周期需数分钟，所以，一般常取用20～30个周期，使目的DNA达到百万倍扩增的反应只要数小时即可完成。PCR方法扩增的目的DNA片段可直接用作序列分析，既可采用手工测序法，即采用同位素标记法进行短片段序列测定；也可以应用最新的PyrosequencingTM测序法，在DNA聚合过程中根据掺入的dNTP和荧光强度对DNA序列进行实时监测，省略了双脱氧测序法中PCR扩增的一步，在短短几十分钟内就可对实验结果做出判断。同样，采取目前最为常用的DNA双脱氧终止法进行序列分析，因为只需扩增几十个碱基的寡核苷酸，第一步PCR扩增即可省略大量时间，并且只需采用几十厘米的短板进行凝胶电泳，所以在几个小时内可获得实验结果。因为得到的结果准确率高，省略了反复验证的时间，更是节省了大量的人力物力。
3，灵敏度高PCR产物的生成是以指数方式增加的，所以欲扩增pg量级的起始物到μg水平或放大真核细胞单拷贝基因，通过PCR方法都是不难完成的。PCR方法可用单、双倍体细胞、一根头发、甚至单一精子进行DNA定型。而荧光素测序法可准确的监测DNA扩增时结合的核苷酸，增加了该方法的灵敏度。
4，特异性强作为引物的寡核苷酸与模板结合的正确性是决定反应产物是否特异的关键。Taq DNA聚合酶耐高温的性质使反应中引物与模板退火的步骤可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的目的片段也能保持很高的正确程度。同时，测序过程中选取的引物并非PCR时所用的引物，而是根据相应PCR产物序列中的高度保守区域重新设计的。因此，实际相当于进行了二次PCR扩增，大大提高了产物的特异性。但相对于巢式PCR或double-PCR，又缩短了时间，降低了成本。而测序结果更是验证目的基因的特异性扩增。
5，对原始材料质量要求低由于PCR技术有较高的灵敏度和特异性，故仅含微量(pg，ng)的目的DNA的粗制品或者总RNA，就可以用做反应起始材料来获取目的产物。部分降解的DNA材料也可以通过PCR多次反应周期，最终得到所需的全长DNA片段。
权利要求
1，一种聚合酶链反应与短片段DNA测序相结合的方法，以微量目的基因两端或两侧已知核苷酸序列设计一对引物，以待鉴定DNA作为模板进行扩增(PCR法)，特征在于以PCR产物为模板再次扩增，选取相应检测对象DNA全序列中较保守且特异性较高的几十个甚至几个核苷酸进行短片段DNA测序。
2，根据权利要求1所述的聚合酶链反应与短片段DNA测序相结合的方法，特征在于短片段DNA测序中引物设计是根据与疾病相关且基因序列已知的DNA而设计的。
3，根据权利要求1、2所述的聚合酶链反应与短片段DNA测序相结合的方法，特征在于测序引物是根据与高发的遗传病、有遗传倾向的疾病相关的已知基因序列设计的。
4，根据权利要求1、2所述的聚合酶链反应与短片段DNA测序相结合的方法，特征在于根据外源入侵的致病基因设计引物或探针。
5，根据权利要求4所述的聚合酶链反应与短片段DNA测序相结合的方法，特征在于可选择其基因中的保守区作通用检测。
6，根据权利要求4所述的聚合酶链反应与短片段DNA测序相结合的方法，特征在于可选定差异较大的基因部位作分型检测。
7，根据权利要求1、2所述的聚合酶链反应与短片段DNA测序相结合的方法的用途，特征在于通过设计针对癌基因、抗癌基因及抗转移基因的特异性引物进行PCR扩增及短片段测序，可以断定癌基因、抗癌基因及抗转移基因的突变性。
8，根据权利要求1、2所述的聚合酶链反应与短片段DNA测序相结合的方法的用途，特征在于针对肌红蛋白小卫星基因，β-珠蛋白基因、ApoB基因设计引物，根据多态性和重复次数的差异应用于鉴定DNA指纹、个体识别、亲子关系和物种研究。
9，根据权利要求1、2所述的聚合酶链反应与短片段DNA测序相结合的方法的用途，特征在于针对烈性传染病病原体设计引物，用于检疫人员、动、植物是否携带烈性传染病病原体，以及食品、饲料等是否带沙门氏菌。
10，根据权利要求1、2所述的聚合酶链反应与短片段DNA测序相结合的方法的用途，特征在于用于检查转基因动植物中植入基因的存在。
全文摘要
本发明聚合酶链反应与短片段DNA测序相结合的诊断方法涉及一种生物检测方法，尤其适用于进行遗传病的产前诊断、致病病原体的检测、癌基因的检测和诊断、DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴以及法医物证、动、植物检疫、高科技生物医学等领域研究。本发明以微量目的基因两端或两侧已知核苷酸序列设计一对引物，以待鉴定DNA作为模板进行扩增(PCR法)，特点是以PCR产物为模板再次扩增，选取相应检测对象DNA全序列中较保守且特异性较高的几十个甚至几个核苷酸进行短片段DNA测序。操作简便、省时省力、灵敏度高、特异性强、对原始材料质量要求低。
文档编号C12Q1/68GK1394964SQ02111130
公开日2003年2月5日 申请日期2002年3月21日 优先权日2002年3月21日
发明者张涛, 李宾, 彭永济, 钱静, 任一萍 申请人:上海晶泰生物技术有限公司