专利名称：人腺苷酸环化酶相关蛋白编码序列、其制备方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种新的人基因核苷酸序列。更具体地说，本发明涉及人腺苷酸环化酶相关蛋白的cDNA序列以及该序列编码的多肽。本发明还涉及所述多核苷酸序列和所述多肽的生产方法，以及这些多核苷酸和所述多肽的用途。
cAMP是信号通路中的众多传递者之一，在细胞信号传导中起重要作用。腺苷酸环化酶(Adenylate cyclase)是细胞中cAMP信号通路的催化单位。它结合在质膜上并跨越质膜十二次，是由大约1100个氨基酸残基组成的糖蛋白。该酶含有两个功能域一个N末端的催化功能结构域和一个C末端的调控结构域。有两个高度保守区域第一个位于催化结构域中，第二个在调节结构域中，后者含有一个保守的组氨酸，该组氨酸可被PTS系统的IIA酶磷酸化，从而激活整个环化酶。腺苷酸环化酶的作用是在Mg2+或Mn2+存在下的条件下催化ATP生成3’，5’-环腺苷酸(cAMP)。作为cAMP信号通路的胞内第二信使的cAMP，在细胞内的浓度(正常状况下≤10-6mol/L)应该被严格的控制，并且能够对细胞外信号产生快速的应答。例如当刺激型激素存在时，cAMP水平在1秒钟内增加5倍以上。细胞内另一种类型的酶即环核苷酸磷酸二酯酶(PDE)可快速的降解cAMP生成5’-腺苷酸(5-AMP)，使细胞内cAMP水平下降。
cAMP信号通路的最后一个化学反应是通过蛋白激酶A完成的。CAMP特异性的活化蛋白激酶A，活化的蛋白激酶A即可使特殊的蛋白磷酸化。依赖于cAMP的蛋白激酶A将ATP末端的磷酸转移到底物蛋白的丝氨酸或苏氨酸残基上。许多酶被蛋白激酶A磷酸化后，酶的活性提高；另一些酶被磷酸化后，酶活性降低。
每个蛋白激酶A由两部分组成两个催化亚基和两个调节亚基。不存在cAMP时，催化亚基和调节亚基形成一个钝化复合物。cAMP与调节亚基结合，改变了调节亚基的构象，使调节亚基和催化亚基解离，催化亚基释放。被释放的蛋白激酶A的催化亚基转为到细胞核中并磷酸化一种称为CREB的蛋白(binding protein of cAMP-responseelement，与cAMP应答元件结合的蛋白)的丝氨酸残基。被磷酸化的CREB作为基因调节蛋白识别靶基因上的基因调节序列CRE(cAMP-response element，cAMP应答元件)并与之结合调节靶基因的表达。通过靶基因表达产物把外界刺激转变为信号逐级传递，进而影响整个生物体的生理活动。
本发明的另一个目的是提供一种新的转运蛋白家族成员，该蛋白被命名为人hACL。
本发明的再一个目的是提供一种利用重组技术生产所述的人hACL的方法。
本发明还提供了hACL基因序列和多肽的应用。
在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，它包括编码具有人hACL蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸1040-1519位的核苷酸序列有至少90％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.1中从核苷酸1040-1519位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.2所示的序列。更佳地，该序列具有SEQ ID NO.1中从1040-1519位的核苷酸序列。
在本发明的另一方面，提供了一种分离的hACL蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO.2氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ IDNO.2序列的多肽。
在本发明的另一方面，提供了一种载体，它含有上述分离出的DNA。
在本发明的另一方面，提供了一种所述载体转化的宿主细胞。
在本发明的另一方面，提供了一种产生具有hACL蛋白活性的多肽的方法，该方法包括(a)将编码具有hACL蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成hACL蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸1040-1519位的核苷酸序列有至少90％的同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成hACL蛋白的重组细胞；(c)在适合表达hACL蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有hACL蛋白活性的多肽。
在本发明的一个具体实施方案中，本发明的分离的多核苷酸全长为2013个核苷酸，其详细序列见SEQ ID NO.1，其中开放读框位于1040-1519位核苷酸。
在本发明中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。
在本发明中，术语“hACL蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有hACL蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1中1040-1519位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.1序列的编码框1040-1519位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.1中1040-1519位核苷酸序列同源性低至约90％的简并序列也能编码出SEQID NO.2所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQ ID NO.1中从核苷酸1040-1519位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。还术语还包括与SEQ ID NO.1中从核苷酸1040-1519位的核苷酸序列的同源性至少90％的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与人hACL相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.1中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。
在本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的至少20％，较佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。
在本发明中，术语“hACL蛋白多肽”指具有hACL蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。该术语还包括具有与人hACL相同功能的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括hACL蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括同源序列、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨度条件下能与hACL DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗hACL多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含hACL多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括hACL多肽的可溶性片段。通常，该片段具有hACL多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
发明还提供hACL蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然hACL多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
本发明还包括hACL多肽编码序列的反义序列。这种反义序列可用于抑制细胞内hACL的表达。
本发明还包括一种可用作探针的核酸分子，该分子通常具有hACL多肽编码序列的8-100个，较佳地15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码hACL的核酸分子。
本发明还包括检测hACL核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于hACL多肽的编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为20-50个核苷酸。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。
另一方面，本发明还包括对hACL DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于hACL基因产物或片段。较佳地，指那些能与hACL基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制hACL蛋白的分子，也包括那些并不影响hACL蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的hACL基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab＇或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的hACL基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达hACL或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，2013；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，2013；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T CellHybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断hACL功能的抗体以及不影响hACL功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用hACL基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与hACL基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
本发明的人hACL核苷酸序列全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按已知方法制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。当然，通过先合成多个小片段，然后再进行连接而获得序列很长的片段。
在本发明中，hACL的cDNA核苷酸序列是如此获得的以人脑λgt11cDNA文库(Clontech公司)为模板，用两对寡核苷酸为引物A15＇-CTACCG AGTCCTCAGTGAACC-3‘为正向引物；寡核苷酸A25＇-CTG ACGGAGGTGC CTTCACTT-3’为反向引物，进行PCR。PCR条件为93℃4分钟，随之以93℃1分钟、68℃1分钟和72℃1分钟进行35个循环，最后72℃延伸5分钟。电泳检测PCR扩增产物，发现所得片段长度为六百个碱基左右。将上述的扩增产物与pGEM-T载体(Promega)连接，转化大肠杆菌JM103，用QIAprep Plasmid试剂盒(QIAGEN)提取质粒，用双链嵌套式缺失试剂盒(Pharmacia)对插入片段进行定向系列缺失，然后用PCR对缺失子进行快速鉴定及排序。用SequiTherm EXCELTMDNA测序试剂盒(Epicentre Technologies)对依次截短的缺失子进行测序，最后获得全长cDNA序列，共1700bp，详细序列见SEQ ID NO.1，其中开放读框位于1040-1519位核苷酸。根据得到的全长cDNA序列推导出hACL的氨基酸序列，共159个氨基酸残基，其氨基酸序列详见SEQ ID NO.2。
通过同源检索发现，本发明的hACL蛋白质序列中具有腺苷酸环化酶的典型序列及两个跨膜区域。腺苷酸环化酶的作用是在Mg2+或Mn2+存在下的条件下催化ATP生成3’，5’-环腺苷酸(cAMP)，并与环核苷酸磷酸二酯酶(PDE)一起调节细胞内的cAMP水平，进而影响整个生物体的生理活动。表达谱分析表明，本发明在脑中表达量最高，这暗示本发明的hACL可能参与大脑细胞信号传导，在人类大脑发育、记忆、学习、神经传导、维持正常精神和生理状态中起到重要作用。将本发明人hACL核酸(编码序列或反义序列)引入细胞，可以提高人hACL的表达水平或者抑制人hACL的过度表达。本发明的人hACL蛋白或其活性多肽片段也可以施用于病人，以治疗或减轻因人hACL缺失、无功能或异常而导致的有关病症。此外，还可以用基于本发明的核酸序列或抗体进行有关的诊断或预后判断。
2.PCR产物的测序将上述的扩增产物与pGEM-T载体(Promega)连接，转化大肠杆菌JM103，用QIAprep Plasmid试剂盒(QIAGEN)提取质粒，用双链嵌套式缺失试剂盒(Pharmacia)对插入片段进行定向系列缺失，然后用PCR对缺失子进行快速鉴定及排序。用SequiThermEXCELTMDNA测序试剂盒(Epicentre Technologies)对依次截短的缺失子进行测序，最后用电脑软件拼接顺序，获得全长cDNA序列，共1700bp，详细序列见SEQ ID NO.1，其中开放读框位于1040-1519位核苷酸。根据得到的全长cDNA序列推导出hACL的氨基酸序列，共159个氨基酸残基，其氨基酸序列详见SEQ ID NO.2。
实施例2结构分析用hACL的全长cDNA序列及其编码蛋白在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库及Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR数据库中用BLAST进行核酸和蛋白同源检索。结果发现hACL的蛋白质序列中具有腺苷酸环化酶(AC)的典型序列及两个跨膜区域。
腺苷酸环化酶的作用是在Mg2+或Mn2+存在下的条件下催化ATP生成3’，5’-环腺苷酸(cAMP)，并与环核苷酸磷酸二酯酶(PDE)一起调节细胞内的cAMP水平，进而影响整个生物体的生理活动，包括生物体的生长、发育、神经传导、激素和内分泌作用、学习与记忆、疾病、衰老与死亡等等。
腺苷酸环化酶的典型保守序列为E-Y-F-G-[SA](2)-L-W-x-L-Y-K和Y-R-N-x-W-[NS]-E-[LIVM]-R-T-L-H-F-x-G，其中[NS]表示所列2种氨基酸中任选一种，Xn表示n个任意氨基酸。本发明的hACL中符合腺苷酸环化酶保守序列的部分为SNAEQPFFKDLYGAVNAESTSPFLHCLREVIGEYSVHEFSLLGKTESQGIGLWIALVVFLS(SEQ ID NO 2中从第64-128位)。典型的腺苷酸环化酶有12个跨膜区域，本发明的hACL也有两个跨膜区GIGLWIALVVFLSFLIFSTSFYI(SEQ ID NO 2中从第45-67位)和GIGLWIALVVFLSFLIFSTSFYI(SEQ ID NO 2中从第116-138位)。因此，本发明可能具有腺苷酸环化酶的功能，通过对本发明的深入研究，一定能发现它与许多临床病例的关系，并最终为解决这些问题开拓新的思维与方法。
本发明的人hACL除了可作为腺苷酸环化酶家族一员用于进一步的功能研究，还可用于与其他蛋白一起产生融合蛋白，比如与免疫球蛋白一起产生融合蛋白。此外，本发明人hACL还可以与该家族的其他成员进行融合或交换片段，以产生新的蛋白。
针对本发明人hACL的抗体，用于筛选具有类似结构域的其他蛋白，或者用于亲和纯化相关蛋白。
例如，本发明人hACL核酸(编码序列或反义序列)可以被引入细胞，以提高人hACL的表达水平或者抑制人hACL的过度表达。本发明的人hACL蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治疗或减轻因人hACL缺失、无功能或异常而导致的有关病症。此外，还可以用基于本发明的核酸序列或抗体进行有关的诊断或预后判断。
实施例3表达谱分析从Clontech公司购得多种组织Northern印迹膜(MTN，16种组织)，以引物A1(5＇-CTACCG AGTCCTCAGT GAACC-3＇)和A2(5＇-CTG ACGGAGGTGC CTTCACTT-3＇)从人脑cDNA文库(Clontech)中扩增得到约六百个碱基对的片段，以此片段为探针，用α-32P-dATP(DuPont公司)对其进行随机引物标记，条件为37℃1小时，具体操作见MegaprimeDNA标记系统说明书(Amersham)。Northern杂交按用户手册操作。主要步骤如下(1)配制MTN杂交液(终浓度如下5XSSPE，10Xdenhardt′s，100μg/mlCTDNA，50％甲酰胺，2％SDS)，68℃预热杂交液，彻底溶解沉淀物。(2)烫膜，倒入少许烧开的0.05％SDS溶液于膜上，震荡、冷却后测信号。(3)将尼龙膜放在杂交管中，加入预杂交液，42℃预杂交12小时。(4)变性后探针加入杂交管中，42℃杂交24小时。(5)洗膜，42℃，用2XSSC，0.05％SDS溶液洗两次，每次20分钟。(6)用X光片进行放射自显影。
16种组织的Northern杂交结果显示，hACL在脑、胸腺、前列腺、胎盘、卵巢、小肠、外周血白细胞、胎盘、骨骼肌、肝和睾丸等种组织中均有表达，其中属脑中表达量最高。
实施例4hACL在大肠杆菌中的表达在该实施例中，用对应于编码hACL的cDNA序列的5＇和3＇端的PCR寡核苷酸引物进行扩增，获得hACL的cDNA作为插入片段。
PCR反应中使用的5＇寡核苷酸引物序列为5＇-A CTTGGATCC ATGGAGCCTGT TGAGCCAC-3＇该引物含有BamHI限制性内切酶的酶切位点，接之是hACL编码序列氨基端的部分核苷酸序列；3＇端引物序列为5’-CGCAAAGCTTCAGACT GAGTTCCTTA GCA-3’该引物含有HindIII限制性内切酶的酶切位点，一个翻译终止子和hACL的编码序列的部分核苷酸序列。
引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于细菌表达载体pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr)、一个细菌复制起点(ori)、一个IPTG-可调启动子/操纵子(P/O)、一个核糖体结合位点(RBS)、一个6-组氨酸标记物(6-His)以及限制性内切酶克隆位点。
用BamHI和HindIII消化pQE-9载体以及插入片段，随后将插入片段连接到pQE-9载体并保持开放读框在细菌RBS起始。随后用连接混合物转化购自Qiagen，商品名为M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷贝的质粒pREP4，其表达lacI阻遏物并携带卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培养皿上筛选转化子，抽提质粒，并测序验证hACL的cDNA片段已正确插入了载体。
在补加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的阳性转化子克隆。过夜(O/N)培养物以1∶100-1∶250的稀释率稀释，接种到大体积培养基中，培养细胞生长至600光密度(OD600)达0.4-0.6时，加入IPTG(“异丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至终浓度为1mM。通过使lacI阻遏物失活，IPTG诱导启动P/O导致基因表达水平提高。继续培养细胞3-4小时，随后离心(6000×g，20分钟)。超声裂解包涵体，收集细胞并将细胞沉淀溶于6M的盐酸胍中。澄清后，通过在能使含6-His标记物蛋白紧密结合的条件下，用镍-螯合柱层析从溶液中纯化溶解的hACL。用6M盐酸胍(pH5.0)从柱中洗脱hACL。可用几种方法从盐酸胍中变性沉淀蛋白。或者，使用透析步骤除去盐酸胍，或者从镍-螯合柱中分离出纯化蛋白。纯化后的蛋白质被结合到第二个柱中，该柱中具有递减的线性盐酸胍梯度。在结合到该柱时蛋白质变性，随后用盐酸胍(pH5.0)洗脱。最后，将可溶的蛋白质用PBS进行透析，然后将蛋白质保存在终浓度为10％(w/v)甘油的贮存液中。
此外，用常规方法对表达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO.2的序列一致。
实施例5hACL在真核细胞(CHO细胞株)中的表达在该实施例中，用对应于编码hACL的cDNA序列的5＇和3＇端的PCR寡核苷酸引物进行扩增，获得hACL cDNA作为插入片段。
PCR反应中使用的5’寡核苷酸引物序列为5＇-A CTTAAGCTT ATGGAGCCTGT TGAGCCAC-3＇该引物含有HindIII限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是hACL编码序列的氨基端部分核苷酸序列；3’端引物序列为5’-CGCAGGATCCCAGACT GAGTTCCTTA GCA-3’该引物含有BamHI限制性内切酶的酶切位点、一个翻译终止子和hACL的部分核苷酸序列。
引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于CHO细胞表达载体pcDNA3(Invitrogen公司)上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr和Neor)、一个噬菌体复制起点(f1 ori)、一个病毒复制起点(SV40 ori)、一个T7启动子、一个病毒启动子(P-CMV)、一个Sp6启动子、一个SV40启动子、一个SV40加尾信号和相应的polyA顺序、一个BGH加尾信号和相应的polyA顺序。
用BamHI和HindIII消化pcDNA3载体以及插入片段，随后将插入片段连接到pcDNA3载体。随后用连接混合物转化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培养皿上筛选转化子，在补加Amp(100μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的克隆。抽提质粒，并测序验证hACL的cDNA片段已正确插入了载体。
质粒转染CHO细胞是采用脂转染法，用Lipofectin试剂盒(GiBco Life)进行的。转染48小时后，经2-3周的持续G418加压筛选，收集细胞及细胞上清测定表达肽转运蛋白活力。去G418，连续传代培养；对混合克隆细胞极限稀释，选择具有较高蛋白活性的细胞亚克隆。按常规方法大量培养上述阳性亚克隆。48小时后，开始收集细胞及上清。以含0.05％Triton的50mM Tris·HCl(pH7.6)溶液为平衡液及洗脱液，用经预平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mM Tris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mM Tris·HCl(pH8.0)溶液为洗脱液进行梯度洗脱，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)为透析液对表达蛋白溶液进行透析。最后冻干保存。
此外，用常规方法对表达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO.2的序列一致。
实施例6制备抗体将实施例4和5中获得的重组蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体如下。重组蛋白用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化。用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund’s佐剂乳化的同样抗原对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀人hACL基因翻译产物的能力加以评估。
序列表<210>1<211>1700<212>DNA<213>Homo sapiens<220><221>CDS<222>(1040)..(1519)<223><400>1cggaagatgg tccgaatcaa ctggatagga ttgttaattt ccgaaggcac gagctcgcct 60ggcatccgca aatgtgaccc gcaatttaga gaggaagagg agcgcagacc ctacctgtcc120ggagtaacgg tcaggagaga ggtggggaag ggctgggccc ctctcggtgt cccgggttcc180cggcagaagt ctccaggact gaggcagtct gcagacacgg agtttccgtg ccagaggaga240gggtccacgc ggacaggcag ttccagctcc gggacatact ttattcagct gggtgctgaa300aaagaatctt ggaaattagg aaactgaatg aggcctcatt tcacactcag aatgtgggtt360gcaatagtca cttcctctgc tgctgggaaa gaaagaatta tactaccttt tgaattttgg420attaaggaga gaggtgttgg cttgtcaaac taccatgtat tcctcaagac atatttttgt480ggctttataa aattcaatat atatgtctaa attcaaaaat attttgttgc aatctggccc540ttggacaaac tgaggcccta gcaactgatg tttatggctt tccgtagaac ctttcagata600aaatttacac agcattttac tgcagctatt tcacacaaag cagaggattt tgccacaaaa660ctgaaagaaa aaagaaactg cattcttaaa tttttcataa atcaaaaggt ataaaaatat720ctacctaaac gataaaggag atgagaaacc ccacccatga tgggaagaaa gcctatttca780gttttgcctt tacttcaagt tcttttttcc atatctggaa tgcaatcaga attttaatct840tgccttgggt tcctcctgga tttggggaga agacaaaacc tgaaaatctc taatctgcat900gtgttcagct gcgtatcttc tggatacgga aggatcacac tgcacagagt gctggacttg960caggagcccc gcttctcaac ctccatcgct ttatgaatga attcaccaga aagaaaagga 1020agaatcaaca ctttcagag atg gag cct gtt gag cca cag tac caa cta gtc1072Met Glu Pro Val Glu Pro Gln Tyr Gln Leu Val1 5 10aat gct gaa tcg act tct ccc ttt cta cat tgc ctg aga gaa gtc att 1120Asn Ala Glu Ser Thr Ser Pro Phe Leu His Cys Leu Arg Glu Val Ile15 20 25ggg gaa tac tct gta cac gaa ttt tca ctg ttg ggg aaa aca gag agt 1168Gly Glu Tyr Ser Val His Glu Phe Ser Leu Leu Gly Lys Thr Glu Ser30 35 40caa ggg att gga ttg tgg att gca ttg gtg gtt ttc ctc agt ttc ctc 1216Gln Gly Ile Gly Leu Trp Ile Ala Leu Val Val Phe Leu Ser Phe Leu45 50 55atc ttc tcc aca agt ttc tac ata tcg aat gca gag cag ccc ttc ttc 1264Ile Phe Ser Thr Ser Phe Tyr Ile Ser Asn Ala Glu Gln Pro Phe Phe60 65 70 75aaa gac ctc tac gga gca gtc aat gct gaa tcg act tct ccc ttt cta 1312Lys Asp Leu Tyr Gly Ala Val Asn Ala Glu Ser Thr Ser Pro Phe Leu80 85 90cat tgc ctg aga gaa gtc att ggg gaa tac tct gta cac gaa ttt tca 1360His Cys Leu Arg Glu Val Ile Gly Glu Tyr Ser Val His Glu Phe Ser95 100 105ctg ttg ggg aaa aca gag agt caa ggg att gga ttg tgg att gca ttg 1408Leu Leu Gly Lys Thr Glu Ser Gln Gly Ile Gly Leu Trp Ile Ala Leu110 115 120gtg gtt ttc ctc agt ttc ctc atc ttc tcc aca agt ttc tac ata tcg 1456Val Val Phe Leu Ser Phe Leu Ile Phe Ser Thr Ser Phe Tyr Ile Ser125 130 135aat gca gag cag ccc ttc ttc aaa gga cct cct acg gaa gct gct aag 1504Asn Ala Glu Gln Pro Phe Phe Lys Gly Pro Pro Thr Glu Ala Ala Lys140 145 150 155gaa ctc agt ctg tag ctctgcgtgg agccatgtgt aaacactgaa ctgagacctg 1559Glu Leu Ser Leuccacctccta ctacctaagg gcccattttc atctgatatc atcccccaga aacaaactca 1619tgatgacttc catgtttttt ttagattaga tacatggaga attttccttt cccttagaat 1679taaaatcctg cattctaaaa a 1700<210>2<211>159<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Met Glu Pro Val Glu Pro Gln Tyr Gln Leu Val Asn Ala Glu Ser Thr1 5 10 15Ser Pro Phe Leu His Cys Leu Arg Glu Val Ile Gly Glu Tyr Ser Val20 25 30His Glu Phe Ser Leu Leu Gly Lys Thr Glu Ser Gln Gly Ile Gly Leu35 40 45Trp Ile Ala Leu Val Val Phe Leu Ser Phe Leu Ile Phe Ser Thr Ser50 55 60Phe Tyr Ile Ser Asn Ala Glu Gln Pro Phe Phe Lys Asp Leu Tyr Gly65 70 75 80Ala Val Asn Ala Glu Ser Thr Ser Pro Phe Leu His Cys Leu Arg Glu85 90 95Val Ile Gly Glu Tyr Ser Val His Glu Phe Ser Leu Leu Gly Lys Thr100 105 110Glu Ser Gln Gly Ile Gly Leu Trp Ile Ala Leu Val Val Phe Leu Ser115 120 125Phe Leu Ile Phe Ser Thr Ser Phe Tyr Ile Ser Asn Ala Glu Gln Pro130 135 140Phe Phe Lys Gly Pro Pro Thr Glu Ala Ala Lys Glu Leu Ser Leu145 150 15权利要求
1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括编码具有人hACL蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸1040-1519位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.1中从核苷酸1040-1519位的核苷酸序列杂交。
2.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.2所示的序列。
3.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，该序列具有SEQ ID NO.1中核苷酸1040-1519位的序列。
4.一种分离的hACL蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.2氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如权利要求4所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID NO.2序列的多肽。
6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA。
7.一种用权利要求6所述载体转化的宿主细胞。
8.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，该细胞是大肠杆菌。
9.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，该细胞是真核细胞。
10.一种产生具有hACL蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，该方法包括(a)将编码具有hACL蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成hACL蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸1040-1519位的核苷酸序列有至少90％的同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成hACL蛋白的重组细胞；(c)在适合表达hACL蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有hACL蛋白活性的多肽。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，该序列为SEQ ID NO.1中从核苷酸1040-1519位。
12.一种能与权利要求4所述的hACL蛋白多肽特异性结合的抗体。
13.一种核苷酸分子，其特征在于，它是权利要求1所述DNA分子的反义序列。
14.一种探针分子，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA分子中约8-100个连续核苷酸。
全文摘要
本发明涉及基因工程领域,具体地,本发明涉及一种新的人基因核苷酸序列。更具体地说,本发明涉及人腺苷酸环化酶相关蛋白(hACL)的cDNA序列以及该序列编码的多肽。本发明还涉及所述多核苷酸序列和所述多肽的生产方法,以及这些多核苷酸和所述多肽的用途。
文档编号C12N15/63GK1374405SQ02111410
公开日2002年10月16日 申请日期2002年4月18日 优先权日2002年4月18日
发明者余龙, 唐丽莎 申请人:复旦大学