专利名称：一种乙内酰脲酶系及其编码基因与生产菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种酶系及其编码基因与生产菌，特别是一种乙内酰脲酶系及其编码基因与生产菌。
乙内酰脲酶系在动物、植物和微生物中分布广泛，尤其以在微生物种群中分布较为广泛。乙内酰脲酶系的主要应用是进行各种氨基酸的酶法生产，不仅可用于各种天然氨基酸的酶法生产，还可用来生产D-型氨基酸以及各种D-或L-型的非天然氨基酸。
一种乙内酰脲酶系的编码基因，它具有下列序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同蛋白质的DNA序列。
一种乙内酰脲酶系，由下述3种蛋白质组成1)具有序列表中序列2的氨基酸序列的乙内酰脲消旋酶或将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有乙内酰脲消旋酶活性的由序列2衍生的蛋白质；2)具有序列表中序列3的氨基酸序列的乙内酰脲水解酶或将序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有乙内酰脲水解酶活性的由序列3衍生的蛋白质；3)具有序列表中序列4的氨基酸序列的N-氨甲酰氨基酸水解酶或将序列4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有N-氨甲酰氨基酸水解酶活性的由序列4衍生的蛋白质。
本发明的另一个目的是提供一种上述乙内酰脲酶系的高效生产菌。
本发明提供的上述乙内酰脲酶系的生产菌是节杆菌(Arthrobacter sp.)BT801CGMCC No0734及其功能相同的突变体或变异体。
节杆菌(Arthrobacter dp.)BT801已于2002年03月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，保藏编号为CGMCC No0734。
本发明的节杆菌从沈阳市浑河地区污泥中分离得到，为革兰氏染色阳性菌，不抗酸，不分解纤维素，接触酶阳性，于脱脂牛奶中加热至63℃15分钟不存活。菌体在生长过程中经历一个球状—杆状—球状的周期性变化。菌株在GYP或LB平板上生长良好，菌落为圆形且边缘整齐。在暗培养条件下菌落呈乳白色，在光照条件下转为乳黄至深黄色。
乙内酰脲酶系产生菌Arthrobacter BT801的染色体DNA，经Sau3A I部分酶切后分离30kb左右的片段，与经Hpa I和Pst I酶切的黏粒载体pKC505进行连接，将连接产物用包装蛋白包装，转染大肠杆菌DH5α，得到转化子。利用薄层层析的方法从转化子中筛选得到阳性克隆，通过亚克隆得到了序列表中序列1的乙内酰脲酶系的完整基因，该基因能利用自身的启动子在大肠杆菌中进行表达产生有活性的序列表中序列2、序列3、序列4的蛋白。
本发明的乙内酰脲酶系具有广泛的实际应用价值。光学活性氨基酸在医药和食品行业应用非常广泛，氨基酸的酶法生产是目前生产氨基酸的主要手段之一。乙内酰脲酶系能够将5-位单取代乙内酰脲类化合物特异水解为氨基酸。例如，L-色氨酸可作为氨基酸输液的成份和饲料添加剂，市场潜力很大，有关L-色氨酸酶法生产的报道很多，其中利用乙内酰脲酶系以5-吲哚甲基乙内酰脲为生产原料的路线颇受关注。尤其是利用本发明的酶系生产苯丙氨酸具有重要的经济实用意义。又如，L-苯丙氨酸是二肽甜味剂天冬甜精的主要原料，在这种甜味剂的生产成本中占相当比重，由5-苄基乙内酰脲酶法生产，方法新颖，前景乐观。此外一些难于发酵生产的脂肪族氨基酸如L-缬氨酸、L-丙氨酸和L-异亮氨酸等亦可望通过本发明的乙内酰脲酶系进行酶法生产。本发明的乙内酰脲酶具有L-和D-两种不同立体选择性，相应水解产物也可为L-或D-型的手性氨基酸，尤其对于一些不能直接通过发酵生产的D-型氨基酸和非蛋白质氨基酸，乙内酰脲酶更独具优势。
利用乙内酰脲酶酶法生产氨基酸的另一个优势还在于，酶促水解过程不仅仅是选择性水解外消旋底物中的一种异构体，而且能够利用乙内酰脲类化合物的消旋作用将其对映体不断转化为可被酶解的那种异构体，因此在理论上乙内酰脲酶酶法生产氨基酸的转化率可达100％，而且消旋作用与酶促水解可以在同一个体系中同时进行，使工艺大大简化。碱性条件可以催化乙内酰脲的消旋，但通常这种化学消旋是一个非常缓慢的过程。例如在室温和pH8.5的条件下，20h只有10％L-吲哚甲基乙内酰脲(L-IMH)转化为D-IMH。而乙内酰脲消旋酶可以在生理条件下高效率地催化乙内酰脲类化合物的消旋，在乙内酰脲酶酶法生产氨基酸中具有重要作用。此外，根据对地球原始环境的推测和分析，原始水圈的氨基酸可能多以对应的N-氨甲酰氨基酸或乙内酰脲类化合物的形式存在。乙内酰脲酶还被认为是在微生物三界系统形成之前就已经存在的一种将N-氨甲酰氨基酸或乙内酰脲转化为游离氨基酸的原始酶类，因此乙内酰脲酶及其产生菌是研究生命起源和进化的重要生物材料。
下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步说明。
图2为酶转化产物的红外光谱图。
图3为酶解产物的质谱图。
2、转化反应及转化产物的分离精制将5g DL-5-苄基乙内酰脲(可以按照水野正.JP.1985，60-11473和段々英则，水野正.JP.1985，60-11457的方法合成)和由上述步骤中100ml培养液得到的BT801菌体与含0.5mmol/L CoC12的PBS混合，于45℃保温搅拌反应24小时，待不溶的底物消失且用Ehrlish试剂检测中间产物显色反应微弱时停止转化反应。将反应混合物于10000r/min离心15min，上清液通过732阳离子交换树脂柱，用蒸馏水洗2次，再用0.2mmol/L NH4OH洗脱，收集紫外吸收强的组分，减压浓缩，调pH至5.48，加2倍乙醇，冷却使结晶。收集析出的结晶，再溶于水，用乙醇重结晶，得到约2g精制产物。
3、转化产物的鉴定对该酶转化产物进行了薄层层析、熔点、元素分析、旋光等理化分析及紫外、红外和质谱等光谱学分析，结果如表1、
图1、图2及图3所示。
表1酶转化产物物理常数的测定结果转化产物 标准品薄层层析Rf0.65 0.65比旋光度[α]20D-34.2-34.5熔点℃ 235 237元素分析CHN 65.366.798.3165.456.668.48图1中，A为L-苯丙氨酸标准品(日本味之素公司产品)；B为转化产物；所用仪器为Shimadzu UV-2201，样品浓度为0.82mg/ml。图2中，曲线A为L-苯丙氨酸标准品(日本味之素公司产品)；曲线B为转化产物。图3中，A为L-苯丙氨酸标准品(日本味之素公司产品)；B为转化产物；轰击电子能量为70ev，加速电压为6KV。
从表1及图1-3中的结果可以看出BT801转化DL-5-苄基乙内酰脲所得产物确为L-苯丙氨酸。
序列表<160>4<210>1<211>4261<212>DNA<213>人工序列<400>1gatctacacc tattgggcag gattcaactg gccggcactc ggcgtgtatg tcgccgcgct60gctgttgtcc ctgctcacgc ccgatctcat gtttgtcaca ggtctcgttg catccggaat120tctgcattat ctagtgatga agttctgggt ctcgaagacg aatcccctgt cctcaagtac180cgaggacctg aacgcgaagt accttgttcc ggcagatgcg caggagcgcg ccccggaaac240cacaccaccg gctgtacagg agtaaacgat gcgaattcat atcatcaacc cgaacagctc300gtcggagttg accgaggcgg tagccgagac tgcacgaagc gttgtctcag ctggcaccgc360ggtcaccgca gtcaatccat cttcggggcc ggccgttatc gaaggcagct acgatgaggc420actggccacg taccaccttg tacaggaggt gatgcgtgcg gaacgggaag acaggccgga480cgcttacgta attgcctgtt tcggtgatcc aggcctgaat gcagtgaggg agctgacaga540gaagcctgtc gttggaatcg ccgaggctgc catccaactg tcatcgttta tcggcgcaac600tttctccata gtgagcacgc ttccacgcgt gcgaagccac ctccacgggc tcgttcgccg660cgcgggagca acaaaccgcc ttgcctcagt caaaacgccg gatctcggtg taatggcatt720ccatgaagac gccggcagcg cccaagccac cctcgaacag gccgctaaag aagccgtgca780agaagacggc gccgaagtcg ttgttcttgg atgcgccggc atggccggtc 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Arg Ile His Ile Ile Asn Pro Asn Ser Ser Ser Glu Leu Thr1 5 10 15Glu Ala Val Ala Glu Thr Ala Arg Ser Val Val Ser Ala Gly Thr20 25 30Ala Val Thr Ala Val Asn Pro Ser Ser Gly Pro Ala Val Ile Glu35 40 45Gly Ser Tyr Asp Glu Ala Leu Ala Thr Tyr His Leu Val Gln Glu50 55 60Val Met Arg Ala Glu Arg Glu Asp Arg Pro Asp Ala Tyr Val Ile65 70 75Ala Cys Phe Gly Asp Pro Gly Leu Asn Ala Val Arg Glu Leu Thr80 85 90Glu Lys Pro Val Val Gly Ile Ala Glu Ala Ala Ile Gln Leu Ser95 100 105Ser Phe Ile Gly Ala Thr Phe Ser Ile Val Ser Thr Leu Pro Arg110 115 120Val Arg Ser His Leu His Gly Leu Val Arg Arg Ala Gly Ala Thr125 130 135Asn Arg Leu Ala Ser Val Lys Thr Pro Asp Leu Gly Val Met Ala140 145 150Phe His Glu Asp Ala Gly Ser Ala Gln Ala Thr Leu Glu Gln Ala155 160 165Ala Lys Glu Ala Val Gln Glu Asp Gly Ala Glu Val Val Val Leu170 175 180Gly Cys Ala Gly Met Ala Gly Leu Ala Arg Arg Leu Ser Glu Glu185 190 195Leu Gln Val Pro Val Ile Asp Pro Val Glu Ala Ala Cys Arg Val200 205 210Ala Glu Ser Leu Ser Ala Leu Gly Tyr Gly 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Arg185 190 195Gln Leu Lys Glu Ala Gly Arg Thr Asp Met Ala Ala Tyr Glu Ala200 205 210Ser Gln Pro Ala Phe Gln-Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala Leu215 220 225Ala Leu Gln Lys Glu Thr Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val230 235 240Ser Asn Pro Asp Gly Val Gln Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Ser245 250 255Gly Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile260 265 270Thr Ala Glu Asp Ala Ser Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Ile Ala275 280 285Pro Pro Val Arg Ser Ala Glu Met Asn Ala Arg Leu Trp Glu Gln290 295 300Leu Glu Lys Gly Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly305 310 315His Pro Lys Glu Asn Lys Glu Arg Gly Trp Asp Asn Val Trp Asp320 325 330Ala Ser Asn Gly Ala Leu Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met335 340 345Leu Thr Asn Gly Val Asn Arg Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu350 355 360Val Glu Val Met Cys Glu Asn Pro Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr365 370 375Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly Ser Asp Ala Asp Leu Val380 385 390Ile Val Asp Leu Glu Val Asp Asp Lys Val Asp Ala Ser Glu Phe395 400 405Arg Ser Leu Leu Lys His Ser Pro Phe Asp Gly Met Pro Val Thr410 415 420Gly Lys Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val Val Ala Glu425 430 435Asn Gly Lys Ile Leu Val Glu Pro Gly Phe Gly Gln Phe Val Thr440 445 450Cys Arg Glu Ser Gln Asp Pro Lys455 458<210>4<211>412<212>PRT<213>人工序列<400>4Met Thr Ser Leu Arg Ala Gln Ala Asp Arg Ile Glu Lys Asp Ile15 10 15Arg Asp Leu Ala Arg Phe Ser Ala Gly Gly Pro Gly Val Thr Arg20 25 30Leu Ser Tyr Thr Pro Glu His Ala Ala Ala Arg Asp Leu Ile Ile35 40 45Ala Ala Met Gln Gln Ala Gly Leu Asp Val Arg Glu Asp Gly Leu50 55 60Gly Asn Ile Thr Gly Arg Arg Glu Gly Ser Asp Pro Asp Leu Pro65 70 75Ala Ile Ala Val Gly Ser His Phe Asp Ser Val Arg Asn Gly Gly80 85 90Met Phe Asp Gly Thr Ala Gly Val Val Cys Ala Leu Glu Ala Ala95 100 105Arg Val Val Asn Glu Ser Glu Tyr Val Asn Arg His Pro Phe Glu110 115 120Phe Ile Ala Ile Val Glu Glu Glu Gly Ser Arg Phe Asn Ser Gly125 130 135Met Leu Gly Gly Arg Ala Leu Ala Gly Leu Val Thr Asp Glu Asp140 145 150Leu Asp Lys Leu Lys Asp Glu Asp Gly Ile Ser Val Arg Asp Ala155 160 165Ala Thr Glu Phe Gly Leu Gln Pro Gly Asn Leu Gln Thr Ser Val170 175 180Arg Ser Arg Leu Asp Leu Arg Ala Phe Ile Glu Pro His Ile Glu185 190 195Gln Gly Pro Val Leu Glu Gln Glu Gly Ile Glu Ile Gly Val Val200 205 210Thr Ser Ile Val Gly Ile Arg Thr Leu Arg Val Ala Val Leu Gly215 220 225Arg Ser Asp His Ala Gly Thr Thr Pro Met His Leu Arg Gln Asp230 235 240Ala Leu Ile Pro Ser Ala Leu Met Val Arg Glu Val Asn Arg Leu245 250 255Val Asn Glu Leu Gly Asp Glu Thr Val Ala Thr Val Gly His Leu260 265 270Thr Val Ala Pro Gly Gly Ile Asn Gln Val Pro Gly Glu Val Asn
275 280 285Phe Thr Leu Asp Leu Arg Ser Pro His Glu Glu Ser Leu Lys Gln290 295 300Ile Val Lys Gln Ile Thr Val Met Ile Gln Glu Val Ala Ser Gln305 310 315Ala Glu Val Thr Ala Asn Val Glu Glu Phe Phe Ser Leu Asp Pro320 325 330Val Pro Leu Ala Pro Ser Val Val Asp Ala Val Arg Gln Ala Ala335 340 345Ser Asn Leu Arg Phe Ser His Arg Asp Met Pro Ser Gly Ala Gly350 355 360His Asp Ser Met Phe Ile Ser Gln Val Thr Asp Val Gly Met Val365 370 375Phe Val Pro Ser Arg Asp Gly Arg Ser His Val Pro Glu Glu Trp380 385 390Ser Asp Phe Asp Asp Leu Arg Lys Gly Thr Asp Val Val Leu Gly395 400 405Val Met Thr Ala Leu Asp Lys410 41权利要求
1.一种乙内酰脲酶系的编码基因，它具有下列序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同蛋白质的DNA序列。
2.根据权利要求1所述的基因，其特征在于所述乙内酰脲酶系的编码基因是序列1的DNA序列。
3.一种乙内酰脲酶系，由下述3种蛋白质组成1)具有序列表中序列2的氨基酸序列的乙内酰脲消旋酶或将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有乙内酰脲消旋酶活性的由序列2衍生的蛋白质；2)具有序列表中序列3的氨基酸序列的乙内酰脲水解酶或将序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有乙内酰脲水解酶活性的由序列3衍生的蛋白质；3)具有序列表中序列4的氨基酸序列的N-氨甲酰氨基酸水解酶或将序列4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有N-氨甲酰氨基酸水解酶活性的由序列4衍生的蛋白质。
4.根据权利要求3所述的乙内酰脲酶系，其特征在于所述乙内酰脲酶系由具有序列表中序列2的氨基酸序列的乙内酰脲消旋酶、具有序列表中序列3的氨基酸序列的乙内酰脲水解酶和具有序列表中序列4的氨基酸序列的N-氨甲酰氨基酸水解酶组成。
5.节杆菌(Arthrobacter sp.)BT801 CGMCC No0734及其功能相同的突变体或变异体。
全文摘要
本发明公开了一种乙内酰脲酶系及其编码基因与生产菌。本发明的目的是提供一种转化效率较高的乙内酰脲酶系及其编码基因。本发明乙内酰脲酶系的编码基因，具有下列序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同蛋白质的DNA序列。本发明的乙内酰脲酶系，由下述3种蛋白质组成1)具有乙内酰脲消旋酶活性的序列2蛋白质；2)具有乙内酰脲水解酶活性的序列3蛋白质；3)具有N－氨甲酰氨基酸水解酶活性的序列4蛋白质。本发明提供的上述乙内酰脲酶系的生产菌是节杆菌(Arthrobacter sp.)BT801CGMCC №0734。本发明的乙内酰脲酶系具有生产氨基酸等广泛的实际应用价值。
文档编号C12N15/61GK1458276SQ02116788
公开日2003年11月26日 申请日期2002年5月13日 优先权日2002年5月13日
发明者张惟材 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所