专利名称：H型非病毒载体以及包含其的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明属于基因治疗领域，具体地说，本发明涉及非病毒载体及编码其的融合基因，所述非病毒载体将能够在体内表达对细胞具有杀伤作用的蛋白质的表达型重组体靶向性地导入被HIV/SIV感染的CD4+细胞，以使该表达型重组体在该细胞内表达蛋白，从而杀伤清除所述被感染的细胞；该非病毒载体同时在细胞外中和游离的HIV/SIV；本发明还涉及包含所述非病毒载体和所述表达型重组体的药物组合物，并涉及特定的表达型重组体及用于构建所述表达型重组体的特定目的基因。
背景技术：
目前，艾滋病的最常用的治疗方法为鸡尾酒疗法，该方法最大的缺陷是毒副作用大，虽然可以降低患者血中的病毒滴度，但不能根治艾滋病。
基因治疗逐渐成为艾滋病治疗方法中非常有前景的一种手段。基因治疗通过将外源DNA导入人体的特定细胞以产生治疗效果，达到治疗疾病的目的。目前主要有两大类方法可以有效地介导外源DNA转入人体细胞，一类是病毒载体介导的方法；另一类是非病毒载体介导的方法。病毒载体存在一些目前的技术多无法克服的缺点，如滴度低、逆转录病毒载体存在致瘤的可能性、病毒载体感染的靶细胞必须为可分裂细胞、病毒引起的免疫排斥反应导致治疗失效以及靶细胞的死亡等。而近年来发展起来的非病毒载体有以下优点简便、安全、无毒，可以将目的基因特异性地导入靶组织或细胞，达到治疗目的。
对属于非病毒载体的受体介导的基因转移方法，近年来有所报道。受体介导的基因转移可以通过外源DNA与受体的相应配体结合形成复合物来实现。该类复合物中的配体可与特定细胞表面的相应受体结合，通过受体介导的内吞作用，将外源DNA转导入特定细胞，提高基因转移的靶向性和转移效率。
靶向性治疗技术又称为“生物导弹”技术，正越来越引起人们的关注。第一代生物导弹的设计思路是将单克隆抗体与药物、核素或毒素蛋白融合在一起用于临床治疗，其主要问题是靶向性差；第二代生物导弹的设计思路是将不同的功能区段拼接所构建的融合蛋白作为“分子导向”型导弹，如人工构建IL2-PE40融合蛋白用于治疗某些自身免疫性疾病，其主要问题是人工构件的融合蛋白由于其中的PE40对人体而言是异源蛋白，在人体应用会有较强的免疫原性，无法真正在临床上推广；第三代生物导弹主要设计思路是利用治疗基因(或基因片段)与多聚阳离子分子形成DNA-蛋白脂复合物，利用此复合物中蛋白质上的特异性配体作为分子识别蛋白，将整个复合物特异性地导向到靶细胞实现其靶向性设计。经常用于结合DNA的多聚阳离子分子为多聚赖氨酸(Polylysine)，但大部分的多聚赖氨酸都是人工合成的，在基因治疗临床应用中成本极高(在美国，固相合成的28氨基酸，1克约为40-50万美元，在中国约为150-160万人民币)，以至于即使临床试验成功也几乎无法在临床推广应用。为了降低成本，并尽可能减少外源物质引起免疫原性的可能，需要有更廉价易得且无免疫原性的结合DNA的多聚阳离子物质。
为了克服以上缺点，本发明的发明者应用来自于人体基因表达产物的蛋白质片段，复合与包裹带有毒素基因的重组体DNA，以使毒素基因仅在拟将之杀灭的细胞内表达，从而杀灭该细胞。这样，一方面通过用基因代替蛋白，避免了作为人体异源蛋白的毒素蛋白在人体内运行过程中因免疫原性所导致的抗体产生及其继后的中和失效的发生；另一方面也避免了毒素蛋白对正常细胞的杀伤作用，即毒副作用。同时由于用于复合与包裹重组体DNA的蛋白质片段是来自于人体的基因的表达产物，从而避免了使用昂贵的多聚赖氨酸，使其实施成为可能。
发明内容
因此，在第一方面，本发明提供非病毒载体，所述非病毒载体是包含受体多肽与富含阳性氨基酸的多肽的靶向性融合蛋白。
在另一方面，本发明提供包含所述非病毒载体以及表达型重组体的药物组合物，其用于靶向性艾滋病基因治疗，所述表达型重组体包含表达对细胞具有杀伤能力的蛋白质的基因。
优选地，所述非病毒载体中的受体多肽是能够与HIV/SIV表面分子gp120和/或gp41特异性结合的CD4分子、CD4V1V2或CD4V1，或它们的相关片段、类似物或突变体；或者是能够与gp120和/或gp41特异性结合的CXCR4或其相关片段、类似物或突变体；或者是能够与gp120和/或gp41特异性结合的CCR5或其相关片段、类似物或突变体。
优选地，所述非病毒载体中的富含阳性氨基酸的多肽是人组蛋白H1或其片段或类似物，特别是组蛋白H1中的一段86个氨基酸的片段，其氨基酸序列如下AKKPKKVAGAATPKKSIKKTPKKVKKPATAAGTKKVAKSAKKVKTPQPKKAAKSPAKAKAPKPKAAKPKSGKPKVTKAKKAAPKKK或者是组蛋白H1中的一段24个氨基酸的片段，其氨基酸序列如下AKKPKKVAGAATPKKSIKKTPKKV。
由于使用组蛋白H1或其片段，因此本发明人将本发明的非病毒载体称为H型非病毒载体。
优选地，通过基因工程方法在体外重组获得融合基因，并在原核与真核细胞中表达该融合基因而获得本发明的非病毒载体(融合蛋白)。
最优选地，所述非病毒载体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6所示。
优选地，所述对细胞具有杀伤能力的蛋白质为绿脓杆菌毒素、白喉毒素、商陆、蓖麻毒素，或其他对细胞具有杀伤能力的来自人体、动植物或者微生物的蛋白，或者是它们的活性功能区域、突变体或类似物；更优选地，其中所述对细胞具有杀伤能力的蛋白质为绿脓杆菌毒素，或者是其第二和第三结构域；最优选地，所述对细胞具有杀伤能力的蛋白质是绿脓杆菌毒素的第三结构域或其突变体，其中所述突变体的氨基酸序列SEQ ID NO.8所示。
优选地，所述表达型重组体为基于pcDNA3.1mychisA而构建的表达型重组体pcDNA3.1-PEIIImut；或者是受HIV-1或HIV-2的5′-LTR和CMV启动子双重控制的真核重组表达型重组体pYL-PEIIImut。
在另一方面，本发明提供三种融合基因及其所编码的特定的本发明的非病毒载体(融合蛋白)，所述融合基因的DNA序列分别如SEQID NO.1、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5所示。它们编码的融合蛋白包括人CD4的V1V2结构域的179个氨基酸和人组蛋白H1的86个氨基酸，或者包括人CXCR4的309个氨基酸和人组蛋白H1的86个氨基酸，或者包括人CCR5的300个氨基酸人组蛋白和H1的24个氨基酸，它们的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.4和SEQ ID NO.6所示。这些融合蛋白是运用基因工程技术方法生产的，同固相合成相比较，其造价约降低2-3个数量级，以便于临床实验及可能的临床应用。
在另一方面，本发明涉及序列如SEQ ID NO.7所示的突变改型的编码绿脓杆菌毒素第III结构域的重组DNA，PEIIImut；涉及其表达产物，所述表达产物的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；并涉及包含PEIIImut的表达型重组体，如基于pcDNA3.1mychisA而构建的表达型重组体pcDNA3.1-PEIIImut，或者受HIV-1或HIV-2的5′-LTR和CMV启动子双重控制的真核重组表达型重组体pYL-PEIIImut。
图1为本发明的药物组合物的总体设计图。
图2为表达型重组体pcDNA3.1-PEIIImut的构建图谱。
图3为重组质粒pBS-PEIIImut的构建图谱。
图4为表达型重组体pYL-PEIIImut的构建图谱。
图5为重组体pPIC9K-H1的构建图谱。
图6为含有融合基因CD4V1V2-H1的重组体pPIC9K-CD4-H1的构建图谱。
图7为含有融合基因CXCR4-H1的重组体pPIC9K-X4-H1的构建图谱。
图8为含有融合基因CCR5-H1-24的重组体pPIC9K-CCR5-H1-24的构建图谱。
图9为表达型载体pYL-PEIIImut的酶切鉴定结果，其中序号1～7分别代表1.pBR322/BstNI(1875bp、1060bp、929bp、383bp、121bp)；2.pYL158/PstI&ClaI；3.pYL-PEIIImut/PstI&ClaI；4.pBS-PEIIImut/PstI&ClaI；5.pA-PEIIImut/HindIII&EcoRV(690bp，5452bp)；6.pBS-PEIIImut/EcoRI&HindIII；7.λDNA/HindIII(23130bp、9416bp、6557bp、4361bp、2322bp、；2027bp、564bp)。
图10a是CXCR4H1的5′端测序图；图10b是CXCR4H1的3′端测序图；图10c是CD4H1的5′端测序图；图10d是CD4H1的3′端测序图；图10e是CCR5H1的5′端测序图；图10f是CCR5H1的3′端测序图。
图11-1～11-5是显示杀伤试验中各组细胞的形态的荧光照片，其中图11-1为正常细胞；图11-2为A组被SIV感染的CEMX-174细胞；图11-3为D组细胞；图11-4为E组细胞；图11-5为F组细胞；放大倍数均为200X。
图12-2～12-5是显示中和试验中各组细胞的形态的荧光照片，其中图12-2为B组细胞；图12-3为D组细胞；图12-4为E组细胞；图12-5为H组细胞；放大倍数均为200X，该中和试验中的正常细胞形态与图11-1所示相同。
具体实施例方式
绿脓杆菌毒素(PE)是由绿脓杆菌分泌的一种毒素，其是一种极毒的毒素，仅仅对小鼠一次静脉注射0.3微克即可使之在24小时内死亡。对一个细胞来说几个分子的毒素的导入即可使这个细胞死亡。由于PE这种独特的性能，使其作为一种很有前途的毒素被应用到艾滋病的基因治疗中去。PE具有三个结构域，结构域Ia(AA1-252)为细胞结合结构域，结构域III(AA405-613)为ADP糖基化区域，结构域II和结构域III又合称为PE40，而结构域Ib(AA365-404)无明显的生物学功能。
为了增加毒素基因PEIIImut在人体内表达的安全性，本发明人另将毒素基因连接在HIV-1或HIV-2的5′-LTR(-158～+80)下游，以期通过TAT/Tat的调控作用，将毒素基因的表达限制在被病毒感染的细胞内。被HIV感染的细胞中有Tat的存在，能和LTR中的TAR序列结合，从而启动毒素基因的表达。即使毒素基因被非特异性地导入正常细胞，因正常细胞内无Tat的存在，TAR序列不能活化，毒素基因也不会表达。为了在体外检测pYL-PEIIImut以及融合蛋白CXCR4-H186的作用，也可利用稳定表达HIV-1 Tat蛋白的模型细胞。上述设计确保了毒素使用的靶向性和安全性。
因此，在本发明的第一个优选的实施方案中，提供了包含突变改型的编码绿脓杆菌毒素第III结构域的重组DNA，PEIIImut的表达型重组体，所述重组DNA PEIIImut的序列如SEQ ID NO.7所示，其编码的突变绿脓杆菌毒素结构域III的毒力，即杀伤力更强。
毒力的增强如下实现通过将绿脓杆菌毒素第III结构域C端的5个氨基酸残基RDELK的密码子突变为KDEL的密码子，并引入终止密码子TGATAA而得到重组DNA PEIIImut，其编码的毒素蛋白的毒力比原来的PEIII强20倍左右。PEIIImut可根据本领域公知的技术引入各种表达载体以用于构建表达型重组体，从而表达毒素蛋白。这种表达型重组体的一个例子是pcDNA3.1-PEIIImut，本发明人得到了以pcDNA3.1-PEIIImut转化的大肠杆菌DH5α/pcDNA3.1-PEIIImut。
在本发明的第二个优选的实施方案中，提供了用于艾滋病靶向基因治疗的药物组合物，其包含上述表达型重组体与非病毒载体(融合蛋白)的复合物。所述融合蛋白包括人CD4V1V2的179个氨基酸和人组蛋白H1(第134位至219位)的86个氨基酸，或者所述融合蛋白包括人CXCR4的309个氨基酸组蛋白和人H1的86个氨基酸，或者包括人CCR5的氨基末端的300个氨基酸和人组蛋白H1(第134位至157位)的24个氨基酸。该融合蛋白对人体无免疫原性。在本发明的这种用于靶向性基因治疗的药物的应用中，包含PEIIImut的表达型重组体与融合蛋白中可结合DNA的组分，人组蛋白H1紧密结合，融合蛋白中的定向组分CD4V1V2、CXCR4或CCR5通过与被HIV/SIV感染的CD4+细胞(包括Hut-78细胞、CEMX-174细胞等)的gp120结合而将复合物导入被HIV/SIV感染的CD4+细胞，在被感染的细胞中PEIIImut表达型重组体表达毒素蛋白，从而将被SIV/HIV的CD4+细胞杀死。
在本发明的第三个实施方案中，提供了融合基因，所述融合基因编码本发明的药物组合物中使用的融合蛋白，所述融合蛋白从5′到3′依次包括人CD4V1V2的179个氨基酸和人组蛋白H1的86个氨基酸(含53个赖氨酸和6个精氨酸，即59个带正电氨基酸)，或者从5′到3′依次包括人CXCR4的309个氨基酸和人组蛋白H1的86个氨基酸(含52个赖氨酸和11个精氨酸，即63个带正电氨基酸)，或者从5′到3′依次包括人CCR5的300个氨基酸和人组蛋白H1的24个氨基酸(含21个赖氨酸和12个精氨酸，即33个带正电氨基酸)。分别将以上三种融合基因命名为CD4V1V2-H1、CXCR4-H1、CCR5-H1-24，它们的DNA序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5所示。用上述质粒分别转化巴氏毕赤酵母KM71，获得转化子巴氏毕赤酵母/KM71。用含有CD4V1V2-H1编码的质粒pPIC9K-CD4V1V2、含有CXCR4-H1编码的质粒pPIC9K-CXCR4-H1以及含有CC54-H1-24编码的质粒pPIC9K-CCR5-H1-24分别转化大肠杆菌DH5α，获得转化子大肠杆菌DH5α/pPIC9K-CD4V1V2、DH5α/pPIC9K-CXCR4-H1及DH5α/pPIC9K-CCR5-H1-24。
具体地说，由于本发明的药物组合物是将毒素基因导入被HIV/SIV感染的CD4+细胞中表达，因此，就不需要毒素的跨膜转运结构域。正是由于这种原因，本发明的毒素基因PEIIImut中仅含有绿脓杆菌毒素的具有ADP糖基化酶活性的第III结构域的编码序列。该编码序列在靶细胞中表达出的蛋白可作为杀死靶细胞的毒素。另外，本发明人用白喉毒素C端的4个氨基酸残基KDEL替代了PE毒素C端的5个氨基酸残基REDLK，由此大大增强了毒素的杀死细胞能力。另外，由于毒素蛋白是在细胞内进行表达，这就彻底避免了毒素蛋白的免疫原性问题。即使在靶细胞崩解后，其中的毒素蛋白也许可能被机体免疫识别捕获，从而产生抗体，但这些抗体既无法清除细胞内的毒素蛋白，也不会和作为毒素蛋白表达载体的质粒DNA发生反应。事实上，这类被杀灭的细胞将迅速被机体的免疫机制所清除。
关于本发明的非病毒载体中的特异性受体CD4V1V2，CXCR4和CCR5，已知单独的CD4胞外可变区V1V2即可与gp120充分结合，故在此选取其V1V2部分。利用RT-PCR技术从正常中国人外周血中获得的CD4V1V2、CXCR4和CCR5的编码序列。CXCR4和CCR5为化学趋化因子受体，作为CD4的辅助受体可以配合CD4与HIV Env结合，也可直接与Env结合。其C端细胞内部分的作用是将信号传递给GTP结合蛋白，它的缺失并不影响受体与gp120的结合，而受体分布于整个胞外区的部位对于HIV的结合及病毒进入细胞均有作用。为了使靶向蛋白尽可能在维持功能的基础上减小体积，进一步利用PCR分别去掉CXCR4和CCR5羧基端的34和52个氨基酸，同时在C端引入一个AvrII酶切位点，便于组蛋白H1的加入。本发明的融合蛋白中利用人体内正常存在的组蛋白H1作为DNA的结合分子。组蛋白H1含有足够量的碱性氨基酸，特别是大量的赖氨酸，在一定pH条件下带正电荷，能通过静电作用与带负电荷的DNA结合。其自然形态本身就在真核生物基因组DNA的折叠、浓聚方面有重要的作用。这样设计可以保证DNA分子充分浓聚的基础上保证了低免疫原性。
以下通过实施例进一步描述本发明。实施例1 PEIIImut的克隆及其表达型重组体的构建1、PEIIImut的扩增和克隆以含有绿脓杆菌毒素PE40的质粒pZM3为模板，用序列如下的引物经PCR扩增出绿脓杆菌毒素的III结构域的编码序列。所用的引物序列中引入了EcoRV和EcoRI的识别序列，并且引入了以使PEIII编码序列3′端如上所述的5个氨基酸的密码子突变为4个氨基酸的密码子的序列，引物序列为上游引物(33bp)5′-tcgatatcaccatgctcggcgacggcggcgacg-3′EcoRV Kozak下游引物(40bp)5′-ggaattcttacagttcgtccttcggcggtttgccgggctg-3′EcoRIPCR反应条件为94℃变性5分钟后开始循环94℃变性40秒，56℃退火40秒，70℃延伸40秒。经35个循环后，70℃延伸10分钟。使用的扩增酶为Promega公司(麦迪逊，威斯康星，美国)的高保真Pfu。以琼脂糖凝胶电泳、玻璃奶法回收PCR产物中的660bp的目的DNA片段。所得扩增片段经EcoRV和EcoRI双酶切，再以琼脂糖凝胶电泳、玻璃奶法回收酶切产物的目的DNA片段。2、表达型重组体pcDNA3.1-PEIIImut的构建将上述回收的目的DNA片段与同样经EcoRV和EcoRI处理的哺乳动物表达载体pcDNA3.1(-)/Myc-HisA(Invitrogen公司，Carlsbad，加州，美国)的DNA片段相连接，并转化大肠杆菌DH5α。筛选出阳性克隆，从中制备质粒，用EcoRV和EcoRI酶切鉴定所的质粒。由此鉴定出约含有650bp插入片段的阳性重组质粒，命名为pcDNA3.1-PEIIImut，其构建过程如图2所示。经测序显示所得PEIIImut片段的序列与所设计的序列吻合。PEIIImut的大小为642bp，其序列如SEQ ID NO.7所示。实施例2 重组质粒pYL-PEIIImut的构建1、pBS-PEIIImut的构建用EcoRV和HindIII(六合通公司，大连，中国)对含有PEIIImut毒素基因的DNA片段的载体pcDNA3.1-PEIIImut(见实施例1)进行双酶切，纯化、回收649bp大小的片段。同样地，对质粒pBSKS进行双酶切，纯化、回收大片段。用连接酶连接上述所获得的两片段，取部分连接产物转化大肠杆菌DH5α。筛选出阳性克隆，从中制备质粒，用EcoRV和HindIII酶切鉴定所得的质粒。由此鉴定出约含有650bp插入片段的阳性重组质粒，命名为pBS-PEIIImut，其构建过程如图3所示。2、重组质粒pYL-PEIIImut的构建pYL158是以HIV-1 5′-LTR-158到+80的片段为启动子，含荧光酶报告基因的表达质粒。用PstI和ClaI(六合通公司，大连，中国)将带有PEIIImut的DNA片段从pBS-PEIIImut中酶切下，与经同样酶切处理的pYL158载体片段相连接。取部分连接产物转化大肠杆菌DH5α，筛选出阳性克隆，并对阳性克隆进行小量质粒制备，对质粒进行酶切鉴定，确定有PEIIImut片段正确插入的阳性重组质粒，命名为pYL-PEIIImut，其构建过程如图4所示。实施例3 含有H1基因的重组体的构建1、组蛋白H1基因片段的扩增用人类白细胞的基因组DNA为模板，以如下引物经PCR扩增人组蛋白H1基因，所用引物如下上游引物5′-TTTCCTAGGGCCAAGAAGCCCAAGAAGGT-3′AvrII下游引物5′-GCTGCGGCCGCTTATCACTTTTTCTTCGGAGCTG-3′NotIPCR反应条件为94℃变性5分钟后开始循环94℃变性35秒，60℃退火30秒，72℃延伸60秒。经35个循环后，72℃延伸5分钟。使用的扩增酶为Promega公司(麦迪逊，威斯康星，美国)的高保真Pfu。以2.0％琼脂糖凝胶回收PCR产物中的目的片段，得到283bp的DNA片段。2、重组体pPIC9KH1的构建分别用AvrII和NotI酶切步骤1纯化回收的酶切产物，同时用这两种酶分别酶切酵母表达型载体pPIC9K，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳，用玻璃奶法分别纯化、回收283bp和载体大片段，用T4 DNA连接酶连接这两个片段，连接产物转化大肠杆菌(DH5α)，在含氨苄青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)的LB琼脂平板上筛选抗性克隆，按照《分子克隆实验指南》(第二版)(J.萨姆布鲁克等主编，金冬雁等译，科学出版社，1992)的碱裂解法小量制备抗性克隆的质粒DNA，限制性分析证实质粒插入片段大小与融合基因相符。将该重组体命名为pPIC9KH1，其构建过程如图5所示。实施例4 含有融合基因CD4V1V2-H1的重组体pPIC9K-CD4V1V2-H1的构建1、CD4V1V2基因片段的获得用含CD4V1V2基因的pPIC9-CD4V1V2重组体为模板，以如下引物经PCR扩增人CD4V1V2区段的编码序列，所用引物如下上游引物序列5′-CAGGGAAAGAAAGTGGTGCTG-3′下游引物序列5′-CGCCCTAGGGAAAGCTAGCACCACGATG-3′AvrIIPCR反应条件为94℃变性3分钟后开始循环94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸60秒。经35个循环后，72℃延伸5分钟，4℃5分钟。使用的扩增酶为Promega公司(麦迪逊，威斯康星，美国)的高保真Pfu。以1.5％琼脂糖凝胶回收PCR产物中的目的片段，得到556bp的DNA片段。2、PIC9K-CD4V1V2-H1融合基因的构建和测序用AvrII酶切步骤1中回收的基因片段CD4V1V2，同时用AvrII和SnaBI酶切pPIC9KH1，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳，用玻璃奶法分别纯化、回收546bp和9300bp左右的片段。用Gibco-BRL公司(洛克维尔，马里兰州，美国)的连接酶(5u/μl)连接上述获得的两种酶切产物。具体步骤按照试剂盒说明书进行操作。上述连接产物转化大肠杆菌(DH5α)，在含氨苄青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)的LB琼脂平板上筛选抗性克隆。按照《分子克隆实验指南》(第二版)(J.萨姆布鲁克等主编，金冬雁等译，科学出版社，1992)的碱裂解法小量制备抗性克隆的质粒DNA，限制性分析证实质粒插入片段大小与融合基因相符。其构建过程如图6所示。经测序表明CD4V1V2-H1融合基因的序列如SEQ ID NO.6所示。实施例5 含有融合基因CXCR4-H1的重组体pPIC9K-CXCR4-H1的构建1、CXCR4基因片段的扩增用含基因CXCR4的pPIC9-CXCR4重组质粒为模板，以如下引物经PCR扩增人CXCR4的N端的编码序列，所用引物如下上游引物序列5′-ACTTCAGATAACTACACCGAG-3′下游引物序列5′-AATCCTAGGACAGGTGAGTGCGTGCTG-3′AvrIIPCR反应条件为94℃变性3分钟后开始循环94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸2分钟。经35个循环后，72℃延伸5分钟，4℃、5分钟。使用的扩增酶为Promega公司(麦迪逊，威斯康星，美国)的高保真Pfu。以1％琼脂糖凝胶回收PCR产物中的目的片段，得到936bp左右的DNA片段。2、pPIC9K-CXCR4-H1融合基因的构建和测序用AvrII酶切步骤1中回收的基因片段CXCR4，同时用AvrII和SnaBI酶切pPIC9KH1，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳，用玻璃奶法分别纯化、回收936bp和9300bp左右的片段。用Gibco-BRL公司(洛克维尔，马里兰州，美国)的连接酶(5u/μl)连接上述获得的两种酶切产物。具体步骤按照试剂盒说明书进行操作。上述连接产物转化大肠杆菌(DH5α)，在含氨苄青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)的LB琼脂平板上筛选抗性克隆。按照《分子克隆实验指南》(第二版)(J.萨姆布鲁克等主编，金冬雁等译，科学出版社，1992)的碱裂解法小量制备抗性克隆的质粒DNA，限制性分析证实质粒插入片段大小与融合基因相符。其构建过程如图7所示。经测序表明CXCR4-H1融合基因的序列如SEQ ID NO.7所示。实施例6 含有融合基因CCR5-H1-24的重组体pPIC9K-CCR5-H1-24的构建1、CCR5基因片段的扩增含基因CCR5的pPIC9重组质粒为模板，以如下引物经PCR扩增人CCR5的N端的编码序列，所用引物如下上游引物序列5′-GTAGATTATCAAGTGTCAAGTCCAAT-3′下游引物序列5′-CTTCCTAGGCCCGACAAAGGCATAGATGATG-3′AvrIIPCR反应条件为94℃变性3分钟后开始循环94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸2分钟。经35个循环后，72℃延伸5分钟，4℃5分钟。使用的扩增酶为Promega公司(麦迪逊，威斯康星，美国)的高保真Pfu。以1％琼脂糖凝胶回收PCR产物中的目的片段，得到912bp左右的DNA片段。2、pPIC9K-CCR5-H1融合基因的构建和测序AvrII酶切步骤1中回收的基因片段CCR5，同时用AvrII和SnaBI酶切pPIC9KH1，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳，用玻璃奶法分别纯化、回收912bp和9300bp左右的片段。用Gibco-BRL公司(洛克维尔，马里兰州，美国)的连接酶(5u/μl)连接上述获得的两种酶切产物。具体步骤按照试剂盒说明书进行操作。上述连接产物转化大肠杆菌(DH5α)，在含氨苄青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)的LB琼脂平板上筛选抗性克隆。按照《分子克隆实验指南》(第二版)(J.萨姆布鲁克等主编，金冬雁等译，科学出版社，1992)的碱裂解法小量制备抗性克隆的质粒DNA，限制性分析证实质粒插入片段大小与融合基因相符。其构建过程如图8所示。经测序表明CCR5-H1融合基因的序列如SEQ ID NO.8所示。实施例7 融合基因CD4V1V2-H1、CXCR4-H1和CCR5-H1-24在甲醇营养型酵母中的表达1、表达载体的线性化及酵母的转化所用表达载体为实施例4、5、6制备的pPIC9K-CD4V1V2-H1、pPIC9K-CXCR4-H1及pPIC9K-CCR5-H1-24，酵母为巴氏毕赤酵母KM71。KM71(黄秉人教授惠赠)是aox-1缺陷型巴氏酵母株，其AOX1基因被野生型ARG4基因插入破坏，基因型为ARG4HIS4(缺陷型)AOX1∷ARG，所有转化子均为Muts。
质粒转化酵母细胞前需经线性化处理。线性化表达载体进入巴氏酵母后，外援基因表达单元可以分别在基因组的his4位点或5‘AOX1位点通过单交换插入酵母染色体产生Mut+(MethanolUtilization Plus)酵母株，也可在AOX1位点通过双交换插入酵母染色体产生Muts酵母株。整合后，表达质粒上的his4替换了酵母宿主细胞基因组上原有的缺陷型his4基因，使酵母株表型转变为HIS+，能在组氨酸(HIS)缺陷的MD培养基上生长。染色体中没有外援基因整合的酵母细胞则不能在HIS缺陷的培养基中生长。因此，转化产物首先需涂布于MD培养基上，以筛选由外援基因整合的转化子。
具体地，酵母细胞的转化方法如下(1)转化质粒的准备取2-3μg大量制备并纯化的质粒DNA，用SalI或BglII进行单酶切。去少量酶切反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，确证酶切完全。酚、氯仿抽提，乙醇沉淀，70％乙醇脱盐后于超净台无菌条件下晾干备用。
酵母表达载体线性化常用酶SalI于HIS4位点插入基因组。(SMD1168，Mut+或KM71，Muts)BglII于AOX1位点取代(SMD1168，Muts)本发明优选使用SalI。(2)电转a.取冷冻的毕赤酵母菌种划线于YPD板，30℃培养2-3天。条取单个菌落接种，于5ml YPD，30℃剧烈振荡(大于200rpm)培养过液。以1/1000-1/1500转接量接种于50mlYPD，再一次培养过夜，至OD600＝1.3-1.5。b.4℃1500g离心5分钟收集细胞。用40ml冰冷的无菌去离子水沉淀。同样条件离心5分钟收集细胞。c.20ml冰冷的无菌去离子重复上述操作一次。d.重悬细胞于20冰冷的1mol/L山梨醇溶液中，放置冰上备用。e.细胞沉淀重悬于400μl冰冷的1mol/L山梨醇溶液中，放置冰上备用。f.取1.5ml Eppendorf管，每管加入40μl制备好的细胞。分别加入3-5μg线性化的质粒DNA。混匀后转入冰冷的电转杯中，冰浴5分钟以上。g.设置电穿孔仪以产生7500V/cm，4-5ms的电脉冲。使用Bio-Rad产品是的具体设置为电压1500V，电容25uF，电阻200Ω。电击后立即在电转杯中加入0.8ml冰冷的1mol/L山梨醇，混匀。h.细胞混悬液涂布于MD培养基上，每个9cm直径平板涂300μl，15cm平板涂600μl。30℃培养至转化子出现。2、分泌表达目的蛋白的阳性转化子的筛选挑取在MD培养基上生长的His+转化子于500ml离心管中进行小量培养诱导，以筛选分泌表达目的蛋白的阳性酵母株。诱导3-4天后，离心收集培养上清进行SDS-PAGE分析，观察目的蛋白的表达情况。
各挑取20个KM71/CD4V1V2-H1、KM71/pPIC9K-CXCR4-H1及KM71/pPIC9K-CCR5-H1-24的His+转化株进行筛选，分别得到2、2、4个有CD4V1V2-H1分泌表达的转化株。其中，在表达株KM71/CD4V1V2-H1培养上清经SDS-PAGE分析显示，在约30KD处有蛋白带出现，比理论氨基酸序列推算分子量大，考虑由糖基化修饰所致。杂蛋白大多在43KD以上，目的蛋白附近并没有明显杂蛋白带。经SDS-PAGE凝胶激光扫描分析，目的蛋白占培养基总蛋白的11％，粗略计算表达量为13mg/L。用同样的方法，对高表达株KM71/pPIC9K-CXCR4-H1和KM71/CCR5-H1-24的培养上清进行SDS-PAGE分析显示，分别在约47KD和40KD处有蛋白带出现，比理论推算分子量大，可能由糖基化修饰所致。而pPIC9K空载体相应的位置没有相应的目的条带，经SDS-PAGE凝胶激光扫描分析，目的蛋白占培养上清中总蛋白的6％和8％，粗略计算表达量为8mg/L和10mg/L。实施例8 融合蛋白的大量制备与纯化1、大体积培养菌种接种于2ml BMGY培养基中，30℃剧烈振荡培养过夜后接种于200～500ml BMGY培养基中，培养至OD600＝2-5(约需36小时)。室温3000g离心10分钟收集菌体，换入相应于原体积1/4或1/5的BMMY培养基，30℃诱导培养3～5天，每天补加甲醇至1％，同时加入适当的灭菌去离子水补充蒸发掉的水分。4℃6000g离心10分钟收集上清，菌体可重悬于新鲜的BMMY进行第二次甲醇诱导培养。大体积培养时，特别是在甲醇诱导时，要注意通风和温度，所以培养体积不应超过摇瓶体积的1/8，瓶口用两层纱布罩住，控制摇床转速在200-250rpm，温度28-30℃，不得超过30℃。2、培养上清的处理收集摇瓶大规模培养诱导后的工程酵母菌培养液，6000g离心后收集培养上清液，于上清液中加入蛋白酶抑制剂PMSF以保护蛋白不被降解，每30ml培养上清液加入300μl PMSF。培养上清液经0.4μm的滤膜过滤处理后，装入透析袋中对水透析2天。注意透析袋留出一半空间，并尽可能排除其中的空气。最初每1小时更换一次透析外液，4小时以后，2～4小时更换一次外液。透析结束后，将装有培养上清液的透析袋置于20mm的培养皿中，在其外面撒适量的8000或10000PEG，于4℃冰箱中浓缩。浓缩液收集至50ml离心管中，加入5倍体积的冰冻丙酮，混匀后于-20℃沉淀蛋白12小时。10000r/min离心蛋白沉淀，蛋白用氮气吹干后，用灭菌去离子溶解，加入2×样品缓冲液，100℃加热3～5分钟，上样12％～15％PAGE凝胶进行电泳。一时不用的蛋白沉淀保存于-20℃冰箱中。3、从PAGE凝胶中回收目的蛋白a.凝胶切割SDS-PAGE电泳后，切下蛋白Marker泳道所在的胶条和少部分样品胶条，将其放入快速染色液中速染15分钟，剩余凝胶用保鲜膜包好置于4℃冰箱。速染的胶条脱色显出条带后，将胶条与剩余的凝胶对比，切下含目的带部分的凝胶条。b.电洗脱将切下的凝胶条装入透析袋中并置于水平电泳槽中，加入蛋白电泳缓冲液进行电泳。电泳2～4h后反向电泳5分钟。将透析袋中的缓冲液倒入50ml离心管中，并转入另一透析袋对去离子水透析1天。透析后的溶液转入另一灭菌的干净50ml离心管中c.痕量SDS的去除在离心管中加入5倍体积以上的冰冻酸性丙酮-甲醇蛋白沉淀液，20℃沉淀过夜。10,000r/m离心10分钟，去掉上清收集沉淀。将收集的沉淀用蛋白沉淀液洗涤1次。d.蛋白沉淀的保存用氮气吹干蛋白沉淀。沉淀干粉置-20℃冰箱可保存1个月。实施例9 靶向基因药物CCR5-H1-24或CD4V1V2-H1或CXCR4-H1+pcDNA3.1-PEIIImut的制备及其对SIV感染的CEMX-174的杀伤作用1、表达型重组体pcDNA3.1-PEIIImut分别与蛋白CDV1V2-H1、CXCR4-H1、CCR5-H1-24的电荷数及质量比1.1表达型重组体pcDNA3.1-PEIIImut和蛋白CDV1V2-H1电荷数及质量比表达型重组体pcDNA3.1-PEIIImut(见实施例1)共有6142bp，其中A+T＝2854，G+C＝3288。根据美国PE公司的DNA分子量计算公式MW＝A×312+C×288+G×328+T×303-61该质粒的分子量为3780557。其所含负电荷数为2×6142＝12284。其质量电荷比为307.76蛋白CD4V1V2-H1来自酵母系统，其分子量为28955Dalton，静电荷数为40，其质量电荷之比应为723.88。
根据电荷相等结合的原则，蛋白质CD4V1V2-H1和表达型重组体pcDNA3.1-PEIIImut的质量之比应为2.35∶1，但考虑到蛋白质的纯度，将此比例定为2.5∶l。1.2表达型重组体pcDNA3.1-PEIIImut和蛋白CXCR4-H1电荷数及质量比同样地，蛋白质CXCR4-H1也来自酵母表达系统，其分子量为44409 Dalton，静电荷为40，其质量电荷之比应为1110.23。根据电荷相等结合的原则，融合蛋白CXCR4-H1与表达型重组体pcDNA3.1-PEIIImut的质量之比应为3.61∶1，但考虑到蛋白质的纯度等因素，将此比例定为4∶1。1.3表达型重组体pcDNA3.1-PEIIImut和蛋白CCR5-H1-24电荷数及质量比同样地，蛋白质CCR5-H1-24也来自较酵母表达系统，其分子量为37207.55 Dalton，静电荷为21，其质量电荷之比应为1771.79。根据电荷相等结合的原则，融合蛋白CCR5-H1-24与表达型重组体pcDNA3.1-PEIIImut的质量之比应为5.76∶1，但考虑到蛋白质的纯度等因素，将此比例定为6∶1。2、靶向基因药物(即转染复合物)的制备本实施例所用融合蛋白CCR5-H1-24或CD4V1V2-H1或CXCR4-H1(见实施例4、5、6)既作为靶向蛋白，又作为DNA结合蛋白；所用质粒DNA为实施例1的毒素基因表达载体pcDNA3.1-PEIIImut。由于H1富含带正电的赖氨酸，将与带负电性的DNA分子结合，从而使整个复合物分子整体电性趋近于中性，在琼脂糖电泳上表现出电泳迁移率滞后的现象。
具体地，用PIERCE公司(Rockford，伊利诺易州，美国)的蛋白质定量试剂盒分别对上述三种融合蛋白CCR5-H1-24、CD4V1V2-H1和CXCR4-H1进行定量测定。具体方法按照试剂盒提供的方法进行。再以紫外吸收法测定所制备的pcDNA3.1-PEIIImut质粒的浓度。分别将蛋白质和DNA溶于适量无血清的1640培养基，制备蛋白质-DNA复合物。具体如下将10μg的表达型重组体pcDNA3.1-PEIIImut分别和60、25、40μg的CCR5-H1-24、CD4V1V2-H1和CXCR4-H1溶于2ml 1640培养基中，在室温下放至4小时，让它们结合。然后，放置4℃过夜。将此蛋白和DNA结合产物用0.8％的琼脂糖电泳进行检测(同时用牛血清白蛋白代替融合蛋白，作对照试验)。紫外灯下观察，可见上述三种蛋白质和DNA的结合明显。
将制备的蛋白质-DNA复合物以0.22μm滤膜过滤除菌，进行以下试验。转染前在混合物中加入1％的胎牛血清。3、培养基中的正常和被感染的CEMX-174细胞形态细胞培养基中不含有融合蛋白CCR5-H1-24和/或CD4V1V2-H1和/或CXCR4-H1与表达型重组体pcDNA3.1-PEIIImut的结合物。细胞呈正常状态生长，呈圆形或卵圆形，边缘整齐，细胞内的结构清晰，折光性好，如图11a所示。
感染对照组为经SIV感染后的CEMX-174细胞。显微镜下观察发现，被感染的细胞占75％左右，被感染的细胞呈不规则状，如梭形，皱纸团状等，特征性改变为多个细胞发生融合，形成合胞体细胞；细胞膜发生破裂或皱缩，有时细胞质内见到空泡，严重时细胞的亚结构破坏甚至消失，细胞的折光性差，如图11b所示。4、毒素基因的转染、表达以及对感染细胞的杀伤作用4.1模式细胞的制备本试验所使用的模式细胞为CEMX-174细胞株(中国医学科学院试验动物研究所病毒室)。具体地，将液氮保存的CEMX-174细胞复苏，转接于含10％胎牛血清(天津三利公司，天津)的1640培养基(Gibco-BRL公司，洛克维尔，马里兰州，美国)的100ml的培养瓶中，37℃、5％CO2的培养箱中培养，48小时后换液，随后在培养液中加入病毒滴度大于5120的SIV，来感染CEMX-174细胞。由于该细胞易于被感染且效率高，所以每隔6-8小时在显微镜下观察细胞被感染情况，包括被感染细胞的百分率以及细胞的形态改变等。通常在加入病毒3-5天后(视加入的病毒量而定)，即可达70％以上的感染率。本实验所使用的模式细胞(CEMX-174细胞)的被感染率为75.8％。在病毒感染72小时后，轻轻弃去上层的培养液，再补加新鲜的培养液，充分混悬细胞，计数细胞数，调整细胞浓度在4×105cells/ml。4.2实验分组与实施本实验分7组，每组3个平行试验，每种蛋白-DNA复合物由分三个剂量，即2、4、6微克。7组分别为A.感染对照组，为受SIV感染的CEMX-174细胞，用作观察CEMX-174细胞在感染状态下的生长情况；B.pcDNA3.1-PEIIImut组.C.CXCR4-H1-pcDNA3.1-PEIIImut组；D.CD4V1V2-H1-pcDNA3.1-PEIIImut组；E.CCR5-H1-24/pcDNA3.1-PEIIImut；F.(C+D)组合；G.(D+E)组合。本实验所使用的培养板为灭菌的一次性24孔细胞培养板(Costar公司，哥本哈根，丹麦)，每孔加入的细胞数为2.0×105/ml，即0.5ml细胞悬液。
转染24小时后，于显微镜下观察细胞生长情况。CCR5-H1-24或CD4V1V2-H1或CXCR4-H1/pcDNA3.1-PEIIImut复合物处理组的细胞生长状况明显劣于其它各组细胞，细胞数相对较少，出现许多死亡细胞。吸取少量上清进行病毒滴度检测(见实施例11)。48小时后计数存活细胞数。用血球计数器观察计数各孔的存活细胞数。同时取少量细胞涂片作荧光染色，观察被感染细胞的情况(见实施例12)。所得各孔存活细胞数进行方差分析和T检验(T-Test)分析，结果显示，以感染对照组中存活细胞数作对照，计算出各转染复合物对CEMX-174细胞的杀伤率。5、加入各处理因素后各组的细胞计数的统计结果如图11c、11d和11e所示，与感染对照组相比，在细胞培养基中加入融合蛋白-表达型重组体pcDNA3.1-PEIIImut结合产物的各组，细胞数显著减少(p＜0.05)。细胞减少的数量随复合物浓度的增加而加剧。此结果表明，这三种融合蛋白-质粒复合物可以显著杀伤被SIV感染的CEMX-174细胞，并具有剂量依赖性。详细数据如表1所示。表1.CD4V1V2-H1/pcDNA3.1-PEIIImut、CXCR4-H1/pcDNA3.1-PEIIImut和CCR5-H1-24/pcDNA3.1-PEIIImut复合物对SIV感染的CMEX-174细胞的杀伤与病毒滴度试验结果(n＝12，x±SD)
说明1、每组有3个平行孔，每个孔计数4次细胞，共12次(n＝12)，以减少孔间误差。2、剂量列中的数值2、4、6μg，以DNA计，同时还包括相应的蛋白质。3、显著性水准为*p＜0.05。分别与感染对照组比较。4、数值计算方法，见相应的实施例。
CD4V1V2-H1/pcDNA3.1-PEIIImut复合物的2、4、6μg三个剂量组的细胞存活相对于空白对照均明显的减少(p＜0.05)。CCR5-H1-24/pcDNA3.1-PEIIImut、CXCR4-H1/pcDNA3.1-PEIIImut、以及CD4V1V2-H1/CXCR4-H1/pcDNA3.1-PEIIImut、CD4V1V2-H1/CCR5-H1-24/pcDNA3.1-PEIIImut等的三个剂量组与空白对照组相比，存活细胞也显著减少(p＜0.05)，其中CCR5-H1-24/pcDNA3.1-PEIIImut复合物各剂量转染组与CD4V1V2-Hl86/CCR5-H124/pcDNA3.1-PEIII复合物的2μg和4μg DNA剂量转染组的细胞存活数各自相近，后者略低于前者，而CD4V1V2-H186/CCR5-H124/pcDNA3.1-PEIIImut复合物的6μgDNA剂量转染组的存活细胞数为1.072×105，明显小于其它各组。
由于所用的CEMX-174细胞在感染组中有约75.8％的细胞感染了SIV，故实际上所用的细胞是正常细胞和SIV感染细胞的混合物，根据正常细胞组的转染结果可知，正常细胞并不受转染复合物的影响。为了更明确地了解所用毒素基因转移系统在多大程度上影响了被SIV感染的细胞的生长，有必要排除正常细胞的遮蔽作用。在此以24.2％的百分含量计算出空白对照组中的正常细胞数，以之作为正常细胞的标准含量，从各组存活细胞数中减去该标准数，得到实际上感染了SIV病毒的细胞(CEMX-174/SIV)的存活数。进一步以空白对照的CEMX-174/SIV存活细胞数作对照，计算出各转染复合物对CEMX-174/SIV细胞的杀伤率。该数据能更明显地显示出细胞生长所受到的影响。所得数据显示，2、4、6μg DNA剂量的CD4V1V2-H1/pcDNA3.1-PEIIImut对CEMX-174/SIV细胞的杀伤率约为46.2％、52.2％、62.2％；三种剂量的CCR5-H1-24/pcDNA3.1-PEIIImut对CEMX-174/SIV细胞的杀伤率约分别为33.1％、41.2％、48.3％；三种剂量的CXCR4-H1-86/pcDNA3.1-PEIIImut对感染细胞的杀伤率分别为42.8％、51.2％、63.5％；联用组2μg、4μg、6μg DNA剂量的CD4V1V2-H1/CCR5-H1-24/pcDNA3.1-PEIIImut复合物对CEMX-174/SIV的杀伤率分别为47.2％、50.7％和61.9％。联用组2μg、4μg、6μg DNA剂量的CD4V1V2-H1/CXCR4-H1/pcDNA3.1-PEIIImut复合物对CEMX-174/SIV的杀伤率分别为52.2％、60.4％和71.9％。实施例10靶向基因药物CCR5-H1-24或CD4V1V2-H1或CXCR4-H1+pcDNA3.1-PEIIImut的制备及其对SIV感染的CEMX-174细胞和游离SIV的中和作用1、靶向基因药物(即转染复合物)的制备制备方法同实施例9中的步骤1。2、靶向基因药物(即转染复合物)的制备制备方法同实施例9中的步骤2。3、培养基中的正常和被感染的CEMX-174细胞形态制备方法同实施例9中的步骤3。4、毒素基因的转染、表达以及对被感染的CEMX-174细胞和SIV的中和作用4.1模式细胞的制备本试验所使用的模式细胞为CEMX-174细胞株(中国医学科学院试验动物研究所病毒室)。具体地，将液氮保存的CEMX-174细胞复苏，转接于含10％胎牛血清(天津)的1640培养基(Gibco-BRL公司，洛克维尔，马里兰州，美国)的100ml的培养瓶中，37℃、5％CO2的培养箱中培养，24小时后观察细胞的生长情况，并计数细胞，48小时后换液，继续培养，至细胞数为106cells/ml。弃上清，加入新鲜的培养基，调整细胞浓度至4×105cells/ml。4.2试验分组与实施本实验分8组，每组3个平行试验，每种蛋白-DNA复合物由分三个剂量，即2、4、6微克。8组分别为A.正常对照组，正常对照组为不加任何处理因素(如SIV和各种蛋白质-DNA复合物)的CEMX-174细胞组，用作正常生长对照；B.感染对照组，SIV+CEMX-174细胞；C.SIV+CEMX-174细胞+pcDNA3.1-PEIIImut组；D.SIV+CEMX-174细胞+CXCR4-H1-pcDNA3.1-PEIIImut组；E.SIV+CEMX-174细胞+CD4V1V2-H1-pcDNA3.1-PEIIImut组；F.SIV+CEMX-174细胞+CCR5-H1-24/pcDNA3.1-PEIIImut；G.(D+E)组合；H.(E+F)。本实验所使用的培养板为灭菌的一次性24孔细胞培养板(Costar公司，哥本哈根，丹麦)，每孔加入的细胞数为2.0×105/ml，即0.5ml细胞悬液。然后按照需要分别加入0.5ml分别含有2、4、6μg质粒DNA与相应融合蛋白所形成的复合物的溶液，充分混匀。然后，每孔分别加入0.5ml含有SIV的病毒液，置于二氧化碳孵箱中(95％空气，5％CO2)于37℃孵育，48小时后，观察细胞生长情况，并换液。
7天后，于显微镜下观察细胞生长情况，CCR5-H1-24或CD4V1V2-H1或CXCR4-H1/pcDNA3.1-PEIIImut复合物处理组的细胞生长状况明显好于感染对照组细胞，正常细胞数相对较多，死亡细胞较感染对照组少，如图12a、12b、12c和12d所示。同时用血球计数器观察计数各孔的存活细胞数。所得各孔存活细胞数进行方差分析和T检验(T-Test)分析，结果显示，以感染对照组中存活细胞数作对照，计算出各复合物对CEMX-174细胞的中和作用。所得数据显示，2、4、6μg DNA剂量的CD4V1V2-H-PEIIImut对SIV的中和作用为52％、55.5％、62％；2、4、6μg DNA剂量的CXCR4-H1-PEIIImut对SIV的中和作用为48.3％、55.1％、59.2％；2、4、6μg DNA剂量的CCR5-H1-PEIIImut对SIV的中和作用为44.2％、51.1％、53.6％；2、4、6μg DNA剂量的CD4V1V2-H1/CXCR4-H1-PEIIImut对SIV的中和作用为57.9％、62.6％、71.7％；2、4、6μg DNA剂量的CD4V1V2-H1/CCR5-H1-PEIIImut对SIV的中和作用为52.3％、57.0％、62.3％。细胞实验结果见表1和表2。表2.CD4V1V2-H1/pcDNA3.1-PEIIImut、CXCR4-H1/pcDNA3.1-PEIIImut和CCR5-H1-24/pcDNA3.1-PEIIImut复合物对SIV感染的CMEX-174细胞的中和作用的病毒滴度结果(n＝12，x±SD)
说明1.每组有3个平行孔，每个孔计数4次细胞，共12次(n＝12)，以减少孔间误差。2.剂量列中的数值2、4、6μg，以DNA计，同时还包括相应的蛋白质。3.显著性水准为*p＜0.05。分别与(正常细胞+SIV)组比较。4.数值计算方法，见相应的实施例。实施例11 病毒的滴度试验1、杀伤试验后的病毒滴度试验取上述实施例9中的各试验组培养孔中的上清进行倍比稀释，按1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1280、1∶2560、1∶5120、1∶10240的比例用1640培养基进行稀释。每孔含有培养基量为100μl，再加入100μl正常的CEMX-174细胞，37℃、5％CO2下培养。7天后计数每个孔中被感染的细胞数，最后出现被感染细胞的孔所对应的稀释倍数即为病毒的滴度。结果显示，CXCR4-H1-PEIIImut三个剂量(2、4、6ug)处理组的病毒滴度分别为640、320、320；CD4V1V2-H1-PEIIImut的三个剂量组的病毒滴度分别为640、640、320；CCR5-H1-24-PEIIImut组分别为1280、640、640；2、4、6μg DNA剂量的CD4V1V2-H1/CXCR4-H1-PEIIImut对SIV的中和作用为320、320、160；CD4V1V2-H1/CCR5-H1-PEIIImut的三个剂量组(2、4、6μg)的滴度分别为640、320、320。而对照组的滴毒大于5120，显著的大于上述各试验组。细胞实验结果见表1。2、中和试验后的病毒滴度试验取实施例10中的各培养孔中的上清进行倍比稀释，方法同实施例11中的步骤1。计算出病毒的滴度。结果显示CXCR4-H1-PEIIImut三个剂量(2、4、6ug)处理组的病毒滴度分别为640、640、320；CD4V1V2-H1-PEIIImut的三个剂量组的病毒滴度分别为640、640、320；CCR5-H1-24-PEIIImut组分别为1280、640、640；2、4、6μg DNA剂量的CD4V1V2-H1/CXCR4-H1-PEIIImut对SIV的中和作用为640、320、160；CD4V1V2-H1/CCR5-H1-PEIIImut的三个剂量组(2、4、6μg)的滴度分别为640、640、320。而对照组的滴毒大于5120，显著的大于上述各试验组。细胞实验结果见表2。实施例14 感染细胞的荧光计数将杀伤试验和中和试验中各培养孔的细胞充分混悬，取1ml细胞培养液，3000rpm离心3分钟，弃上清。再用1ml的PBS洗一次，弃上清，在逐渐加入PBS，混悬细胞，调整细胞浓度为2×105/ml。取15μl混悬液滴加在载玻片上的环内，自然晾干，在丙酮中4℃固定20分钟，取出晾干，加入gp120的抗体(猴抗SIV抗体，来自感染SIV猴的血清)，37℃、水浴30分钟。然后用pH7.2的PBS冲洗，并置于其中浸泡10分钟，其间不断振摇。取出片子后，再加入用万分之二的Evens兰配制的兔抗猴抗体(即二抗)，37℃水浴30分钟，用PBS冲洗，晾干后在荧光显微镜下观察、计数荧光细胞数并拍照。在荧光显微镜下观察被SIV/HIV感染的细胞在蓝色光的激发下发黄色荧光，可以看到细胞周边呈黄色，而未被感染的细胞则不呈黄色，呈暗红色。杀伤试验组结果为(见表1)，CXCR4-H1-PEIIImut三个剂量(2、4、6ug)处理组的荧光细胞百分数分别为43.6％、37.2％、27.8％；CD4V1V2-H1-PEIIImut的三个剂量组的荧光细胞百分数分别为41.0％、36.4％、28.8％；CCR5-H1-24-PEIIImut组荧光细胞百分数分别为5 1.0％、44.8％、39.42％；2、4、6μg DNA剂量的CD4V1V2-H1/CXCR4-H1-PEIIImut的荧光细胞百分数分别为36.4％、30.2％、21.4％；CD4V1V2-H1/CCR5-H1-24-PEIIImut的三个剂量组(2、4、6μg)的荧光细胞百分数分别为40.2％、37.6％、29.0％。而感染对照组的荧光细胞的百分率为76.2％。试验组与对照组相比均显著减小(p＜0.05)。
如表2所示，中和试验组的结果分别为CXCR4-H1-PEIIImut三个剂量(2、4、6μg)处理组的荧光细胞百分数分别为33.2％、28.8％，26.2％；CD4V1V2-H1-PEIIImut的三个剂量组的荧光细胞百分数分别为30.8％、28.6％、24.4％；CCR5-H1-24-PEIIImut组荧光细胞百分数分别为35.8％、31.4％、29.8％；2、4、6μg DNA剂量的CD4V1V2-H1/CXCR4-H1-PEIIImut的荧光细胞百分数分别为27.0％、24.0％、18.2％；CD4V1V2-H1/CCR5-H1-24-PEIIImut的三个剂量组(2、4、6μg)的荧光细胞百分数分别为30.6％、27.6％、24.2％。而感染对照组的荧光细胞的百分率为76.2％。试验组与对照组相比均显著减小(p＜0.05)。
序列表<110>中国医学科学院基础医学研究所<120>H型非病毒载体以及包含其的药物组合物<130>I20021003CB<160>8<170>PatentIn version3.1<210>1<211>807<212>DNA<213>人<400>1cagggaaaga aagtggtgct gggcaaaaaa ggggatacag tggaactgac ctgtacagct 60tcccagaaga agagcataca attccactgg aaaaactcca accagataaa gattctggga120aatcagggct ccttcttaac taaaggtcca tccaagctga atgatcgcgc tgactcaaga180agaagccttt gggaccaagg aaacttcccc ctgatcatca agaatcttaa gatagaagac240tcagatactt acatctgtga agtggaggac cagaaggagg aggtgcaatt gctagtgttc300ggattgactg ccaactctga cacccacctg cttcaggggc agagcctgac cctgaccttg360gagagccccc ctggtagtag cccctcagtg caatgtagga gtccaagggg taaaaacata420caggggggga agaccctctc cgtgtctcag ctggagctcc aggatagtgg cacctggaca480tgcactgtct tgcagaacca gaagaaggtg gagttcaaaa tagacatcgt ggtgctagct540ttccctaggg ccaagaagcc caagaaggtg gctggcgccg ctaccccgaa gaaaagcatc600aaaaagactc ctaagaaggt aaagaagcca gcaaccgctg ctgggaccaa gaaagtggcc660aagagtgcga aaaaggtgaa aacacctcag ccaaaaaaag ctgccaagag tccagctaag720gccaaagccc ctaagcccaa ggcggccaag cctaagtcgg ggaagccgaa 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Pro Tyr Asn Ile Val Leu Leu Leu245 250 255Asn Thr Phe Gln Glu Phe Phe Gly Leu Asn Asn Cys Ser Ser Ser Asn260 265 270Arg Leu Asp Gln Ala Met Gln Val Thr Glu Thr Leu Gly Met Thr His275 280 285Cys Cys Ile Asn Pro Ile Ile Tyr Ala Phe Val Gly Gly Thr Ala Lys290 295 300Lys Pro Lys Lys Val Ala Gly Ala Ala Thr Pro Lys Lys Ser Ile Lys305 310 315 320Lys Thr Pro Lys Lys Val325<210>7<211>642<212>DNA<213>绿脓杆菌<400>7atgctcggcg acggcggcga cgtcagcttc agcacccgcg gcacgcagaa ctggacggtg 60gagcggctgc tccaggcgca ccgccaactg gaggagcgcg gctatgtgtt cgtcggctac120cacggcacct tcctcgaagc ggcgcaaagc atcgtcttcg gcggggtgcg cgcgcgcaac180caggacctcg acgcgatctg gcgcggtttc tatatcgccg gcgatccggc gctggcctac240ggctacgccc aggaccagga acccgacgca cgcggccgga tccgcaacgg tgccctgctg300cgggtctatg tgccgcgctc gagcctgccg ggcttctacc gcaccagcct gaccctggcc360gcgccggagg cggcgggcga ggtcgaacgg ctgatcggcc atccgctgcc gctgcgcctg420gacgccatca ccggccccga ggaggaaggc gggcgcctgg agaccattct cggctggccg480ctggccgagc gcaccgtggt gattccctcg gcgatcccca 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Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu180 185 190Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro Gly Asp Pro195 200 205Pro Lys Asp Glu Leu210
权利要求
1.非病毒载体，其是包含受体多肽与富含阳性氨基酸的多肽的靶向性融合蛋白。
2.如权利要求1所述的非病毒载体，其特征在于所述受体多肽是能够与gp120和/或gp41特异性结合的CD4、CD4V1V2或CD4V1，或者是它们的相关片段、类似物或突变体，其中编码CD4V1V2的基因序列为CAGGGAAAGAAAGTGGTGCTGGGCAAAAAAGGGGATACAGTGGAACTGACCTGTACAGCTTCCCAGAAGAAGAGCATACAATTCCACTGGAAAAACTCCAACCAGATAAAGATTCTGGGAAATCAGGGCTCCTTCTTAACTAAAGGTCCATCCAAGCTGAATGATCGCGCTGACTCAAGAAGAAGCCTTTGGGACCAAGGAAACTTCCCCCTGATCATCAAGAATCTTAAGATAGAAGACTCAGATACTTACATCTGTGAAGTGGAGGACCAGAAGGAGGAGGTGCAATTGCTAGTGTTCGGATTGACTGCCAACTCTGACACCCACCTGCTTCAGGGGCAGAGCCTGACCCTGACCTTGGAGAGCCCCCCTGGTAGTAGCCCCTCAGTGCAATGTAGGAGTCCAAGGGGTAAAAACATACAGGGGGGGAAGACCCTCTCCGTGTCTCAGCTGGAGCTCCAGGATAGTGGCACCTGGACATGCACTGTCTTGCAGAACCAGAAGAAGGTGGAGTTCAAAATAGACATCGTGGTGCTAGCTTTC；其编码的CD4V1V2的氨基酸序列为QGKKVVLGKKGDTVELTCTASQKKSIQFHWKNSNQIKILGNQGSFLTKGPSKLNDRADSRRSLWDQGNFPLIIKNLKIEDSDTYICEVEDQKEEVQLLVFGLTANSDTHLLQGQSLTLTLESPPGSSPSVQCRSPRGKNIQGGKTLSVSQLELQDSGTWTCTVLQNQKKVEFKIDIVVLAF突变后的CD4V1的基因序列为AAAAAAGTAGTTCTGGGTAAAAAGGGTGACACCGTTGAACTGACTTGCACCGCTTCCCAGAAAAAGTCTATCCAGTTCCACTGGAAAAACTCCAACCAGATCAAAATCCTAGGTAACCAGGGTTCCTTCCTGACCAAAGGTCCGTCTAAACTGAACGATCGTGCTGACTCCCGCCGTTCTCTATGGGACCAGGGTAACTTCCCGCTGATTATCAAAAACCTGAAAATCGAAGATTCCGACACCTACATCTGTGAAGTTGAAGACCAGAAAGAAGAAGTTCAACTACTGGTTTTCGGTCTG；编码的CD4V1的氨基酸序列为KKVVLGKKGDTVELTCTASQKKSIQFHWKNSNQIKILGNQGSFLTKGPSKLNDRADSRRSLWDQGNFPLIIKNLKIEDSDTYICEVEDQKEEVQLLVFGL。
3.如权利要求1所述的非病毒载体，其特征在于所述受体多肽是能够与gp120和/或gp41特异性结合的CXCR4或其相关片段、类似物或突变体，其中编码CXCR4氨基末端的氨基酸的DNA序列为AACTACACCGAGGAAATGGGCTCAGGGGACTATGACTCCATGAAGGAACCCTGTTTCCGTGAAGAAAATGCTAATTTCAATAAAATCTTCCTGCCCACCATCTACTCCATCATCTTCTTAACTGGCATTGTGGGCAATGGATTGGTCATCCTGGTCATGGGTTACCAGAAGAAACTGAGAAGCATGACGGACAAGTACAGGCTGCACCTGTCAGTGGCCGACCTCCTCTTTGTCATCACGCTTCCCTTCTGGGCAGTTGATGCCGTGGCAAACTGGTACTTTGGGAACTTCCTATGCAAGGCAGTCCATGTCATCTACACAGTCAACCTCTACAGCAGTGTCCTCATCCTGGCCTTCATCAGTCTGGACCGCTACCTGGCCATCGTCCGCGCCACCAACAGTCAGAGGCCAAGGAAGCTGTTGGCTGAAAAGGTGGTCTATGTTGGCGTCTGGATCCCTGCCCTCCTGCTGACTATTCCCGACTTCATCTTTGCCAACGTCAGTGAGGCAGATGACAGATATATCTGTGACCGCTTCTATCCCAATGACTTGTGGGTGGTTGTGTTCCAGTTTCAGCACATCATGGTTGGCCTTATCCTGCCTGGTATTGTCATCCTGTCCTGCTATTGCATTATCATCTCCAAGCTGTCACACTCCAAGGGCCACCAGAAGCGCAAGGCCCTCAAGACCACAGTCATCCTCATCCTGGCTTTCTTCGCCTGTTGGCTGCCTTACTACATTGGGATCAGCATCGACTCCTTCATCCTCCTGGAAATCATCAAGCAAGGGTGTGAGTTTGAGAACACTGTGCACAAGTGGATTTCCATCACCGAGGCCCTAGCTTTCTTCCACTGTTGTCTGAACCCCATCCTCTATGCTTTCCTTGGAGCCAAATTTAAAACCTCTGCCCAGCACGCACTCACCTCT；所编码的氨基酸序列为NYTEEMGSGDYDSMKEPCFREENANFNKIFLPTIYSIIFLTGIVGNGLVILVMGYQKKLRSMTDKYRLHLSVADLLFVITLPFWAVDAVANWYFGNFLCKAVHVIYTVNLYSSVLILAFISLDRYLAIVRATNSQRPRKLLAEKVVYVGVWIPALLLTIPDFIFANVSEADDRYICDRFYPNDLWVVVFQFQHIMVGLILPGIVILSCYCIIISKLSHSKGHQKRKALKTTVILILAFFACWLPYYIGISIDSFILLEIIKQGCEFENTVHKWISITEALAFFHCCLNPILYAFLGAKFKTSAQHALTS。
4.如权利要求1所述的非病毒载体，其特征在于所述受体多肽是能够与gp120和/或gp41特异性结合的CCR5或其相关片段、类似物或突变体，其中编码CCR5氨基末端的氨基酸的DNA序列为GATTATCAAGTGTCAAGTCCAATCTATGACATCAATTATTATACATCGGAGCCCTGCCAAAAAATCAATGTGAAGCAAATCGCAGCCCGCCTCCTGCCTCCGCTCTACTCACTGGTGTTCATCTTTGGTTTTGTGGGCAACATGCTGGTCATCCTCATCCTGATAAACTGCAAAAGGCTGAAGAGCATGACTGACATCTACCTGCTCAACCTGGCCATCTCTGACCTGTTTTTCCTTCTTACTGTCCCCTTCTGGGCTCACTATGCTGCCGCCCAGTGGGACTTTGGAAATACAATGTGTCAACTCTTGACAGGGCTCTATTTTATAGGCTTCTTCTCTGGAATCTTCTTCATCATCCTCCTGACAATCGATAGGTACCTGGCTGTCGTCCATGCTGTGTTTGCTTTAAAAGCCAGGACGGTCACCTTTGGGGTGGTGACAAGTGTGATCACTTGGGTGGTGGCTGTGTTTGCGTCTCTCCCAGGAATCATCTTTACCAGATCTCAAAAAGAAGGTCTTCATTACACCTGCAGCTCTCATTTTCCATACAGTCAGTATCAATTCTGGAAGAATTTCCAGACATTAAAGATAGTCATCTTGGGGCTGGTCCTGCCGCTGCTTGTCATGGTCATCTGCTACTCGGGAATCCTAAAAACTCTGCTTCGGTGTCGAAATGAGAAGAAGAGGCACAGGGCTGTGAGGCTTATCTTCACCATCATGATTGTTTATTTTCTCTTCTGGGCTCCCTACAACATTGTCCTTCTCCTGAACACCTTCCAGGAATTCTTTGGCCTGAATAATTGCAGTAGCTCTAACAGGTTGGACCAAGCTATGCAGGTGACAGAGACTCTTGGGATGACGCACTGCTGCATCAACCCCATCATCTATGCCTTTGTCGGG；所编码的氨基酸序列为EYQVSSPIYDINYYTSEPCQKINVKQIAARLLPPLYSLVFIFGFVGNMLVILILINCKRLKSMTDIYLLNLAISDLFFLLTVPFWAHYAAAQWDFGNTMCQLLTGLYFIGFFSGIFFIILLTIDRYLAVVHAVFALKARTVTFGVVTSVITWVVAVFASLPGIIFTRSQKEGLHYTCSSHFPYSQYQFWKNFQTLKIVILGLVLPLLVMVICYSGILKTLLRCRNEKKRHRAVRLIFTIMIVYFLFWAPYNIVLLLNTFQEFFGLNNCSSSNRLDQAMQVTETLGMTHCCINPIIYAFVG。
5.如权利要求1所述的非病毒载体，其特征在于所述富含阳性氨基酸的多肽是组蛋白H1或其片段或类似物。
6.如权利要求5所述的非病毒载体，其特征在于所述富含阳性氨基酸的多肽是组蛋白H1中的一段86个氨基酸的片段，其编码DNA序列为GCCAAGAAGCCCAAGAAGGTGGCTGGCGCCGCTACCCCGAAGAAAAGCATCAAAAAGACTCCTAAGAAGGTAAAGAAGCCAGCAACCGCTGCTGGGACCAAGAAAGTGGCCAAGAGTGCGAAAAAGGTGAAAACACCTCAGCCAAAAAAAGCTGCCAAGAGTCCAGCTAAGGCCAAAGCCCCTAAGCCCAAGGCGGCCAAGCCTAAGTCGGGGAAGCCGAAGGTTACAAAGGCAAAGAAGGCAGCTCCGAAGAAAAAG；所编码的氨基酸序列为AKKPKKVAGAATPKKSIKKTPKKVKKPATAAGTKKVAKSAKKVKTPQPKKAAKSPAKAKAPKPKAAKPKSGKPKVTKAKKAAPKKK。
7.如权利要求5所述的非病毒载体，其特征在于所述富含阳性氨基酸的多肽是组蛋白H1中的一段24个氨基酸的片段，其编码DNA序列为GCCAAGAAGCCCAAGAAGGTGGCTGGCGCCGCTACCCCGAAGAAAAGCATCAAAAAGACTCCTAAGAAGGTA；所编码的序列为AKKPKKVAGAATPKKSIKKTPKKV。
8.如权利要求1至7之一所述的非病毒载体，其特征在于通过基因工程方法在体外重组获得融合基因，并在原核与真核细胞中表达该融合基因而获得该融合蛋白。
9.如权利要求8所述的非病毒载体，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
10.如权利要求8所述的非病毒载体，其氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。
11.如权利要求8所述的非病毒载体，其氨基酸序列如SEQ IDNO.6所示。
12.编码权利要求9的非病毒载体的融合基因CD4V1V2-H1，其DNA序列如SEQ ID NO.1所示。
13.编码权利要求10的非病毒载体的融合基因CXCR4-H1，其DNA序列如SEQ ID NO.3所示。
14.编码权利要求11的非病毒载体的融合基因CCR5-H1-24，其DNA序列如SEQ ID NO.5所示。
15.用于靶向性艾滋病基因治疗的药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1至11之一种或多种的非病毒载体，以及表达型重组体，所述表达型重组体包含表达对细胞具有杀伤能力的蛋白质的基因。
16.如权利要求15所述的药物组合物，其中所述对细胞具有杀伤能力的蛋白质为绿脓杆菌毒素、白喉毒素、商陆、蓖麻毒素，或其他对细胞具有杀伤能力的来自人体、动植物或者微生物的蛋白，或者是它们的活性功能区域、突变体或类似物。
17.如权利要求16所述的药物组合物，其中所述对细胞具有杀伤能力的蛋白质为绿脓杆菌毒素，或者是其第二和第三功能结构域。
18.如权利要求16所述的药物组合物，其中所述对细胞具有杀伤能力的蛋白质是绿脓杆菌毒素的第三功能结构域或其突变体，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
19.如权利要求15-18之一所述的药物组合物，其中所述表达型重组体在细胞内表达对细胞具有杀伤作用的毒素蛋白。
20.如权利要求15-18之一所述的药物组合物，其中所述表达型重组体为基于pcDNA3.1mychisA而构建的表达型重组体pcDNA3.1-PEIIImut。
21.如权利要求15-18之一所述的药物组合物，其中所述表达型重组体为受HIV-1或HIV-2的5′-LTR和CMV启动子双重控制的真核重组表达型重组体pYL-PEIIImut。
22.突变改型的编码绿脓杆菌毒素第III结构域的重组DNA，PEIIImut，其DNA序列如SEQ ID NO.7所示。
23.由权利要求22的基因PEIIImut编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
24.以权利要求22的基因PEIIImut作为目的基因，基于pcDNA3.1mychisA而构建的表达型重组体pcDNA3.1-PEIIImut。
25.以权利要求22的基因PEIIImut作为目的基因，受HIV-1或HIV-2的5′-LTR和CMV启动子双重控制的真核重组表达型重组体pYL-PEIIImut。
全文摘要
本发明涉及非病毒载体及编码其的融合基因，所述非病毒载体是包含受体多肽与富含阳性氨基酸的多肽的靶向性融合蛋白，其将能够在体内表达对细胞具有杀伤作用的蛋白质的表达型重组体靶向性地导入被HIV/SIV感染的CD4+细胞，以使该表达型重组体在该细胞内表达蛋白，从而杀伤清除所述被感染的细胞；该非病毒载体同时在细胞外中和游离的HIV/SIV；本发明还涉及包含所述非病毒载体和所述表达型重组体的药物组合物，并涉及特定的表达型重组体及用于构建所述表达型重组体的特定目的基因。
文档编号C12N15/11GK1461753SQ02121670
公开日2003年12月17日 申请日期2002年5月31日 优先权日2002年5月31日
发明者卢圣栋, 申景平, 洪梅, 杜延平, 张树民, 原菊, 蒋虹, 丛喆, 李兆忠, 李静轩 申请人:中国医学科学院基础医学研究所