专利名称：测定血红素突变基因的方法及使用此方法的固态基材的制作方法
技术领域：
本发明是关于一种测定血红素(hemoglobin)突变基因的方法，更明确地是，本发明是一种测定血红素中α血球蛋白基因(α globin gene，以下简称α基因)-α3.7、-α4.2、SEA、FIL、THAI突变型的方法，并进一步包含使用此测定方法的固态基材。
海洋性贫血形成的主要原因为构成红血球之血红素合成发生问题，正常血红素的合成是由四条血球蛋白链(globin chain)2条α链及2条β链所构成，而当控制α链或β链生成的基因发生问题时，便会造成血红素的合成发生问题，进而产生贫血的现象，临床症状可从全无症状到致命的重度贫血。
海洋性贫血可分为两大类α型海洋性贫血及β型海洋性贫血。α型海洋性贫血多为基因缺失(deletion)所致，β型海洋性贫血则是基因突变(如点突变、基因缺失、或插入基因)所致，α型和β型海洋性贫血两者皆是独立遗传，所以有的人可能同时遗传到两型海洋性贫血。
对于α型海洋性贫血而言，全台湾约有100万人带有α型海洋性贫血的致病基因，若有两个带因者结婚，胎儿就有1/4的机会为罹患中度至重度α型海洋性贫血的水肿新生儿，而可能于妊娠末期在子宫内死亡，或者出生后不久，即因肺部发育不良及严重贫血缺氧死亡。为了落实优生保健，节省社会成本，所以婚前健康检查及早期的产前诊断相当地重要。
已知的海洋性贫血检测，通常采用Hb电泳、等电焦距、高效液相色谱分析和胺基酸分析测序等关于血液学上的检定结果，像是在血液常规检查中，如果平均红血球体积(MCV)和平均血红蛋白量(MCH)皆显著偏低，则可能为海洋性贫血带因者。值得注意的是，因为α型海洋性贫血是小血球性贫血，临床上除了红血球体积较小外，大部份的带因者并无其它症状。但是，其它的疾病，像是缺铁性贫血、慢性疾病、含铁母细胞性贫血也会造成小血球性贫血，造成诊断病因上的不确定。
近年来，随着分子生物学技术的进步，已可直接从α型海洋性贫血带因者体内选殖出(cloning)α血球蛋白基因，并对α血球蛋白基因作进一步定序。最近，已发现一些缺失性突变会导致海洋性贫血的表现型，而这些表现型会与特定的片段缺失有关联。所以，随着DNA分析技术的不断发展，使用基因型检查是可对α型海洋性贫血有较佳确认诊断，从而对揭露其发病原理、有效监控此类疾病、提高人口素质有重要意义。
在人体内HBA1基因(hemoglobin，alphal gene，以下称为α1基因)及HBA2基因(hemoglobin，alpha2gene，以下称为α2基因)是专司表现α血球蛋白之基因，同时位于第16条染色体上。绝大多数的α型海洋性贫血，是因缺少至少一个以上的α基因片段所致，见Kazazian(1990)，supra；Embury et al.(1980)。例如-α3.7突变型便是α2和α1基因片段部份缺失，其缺失片段长度约为3.7千碱基(kilobase，kb)。若是个体所遗传到的异型结合子(heterozygotes)中的第16对染色体上，有一条是-α3.7缺失的染色体，一条为正常的染色体，此种情况可以用-α3.7/αα来表示。另外，-α4.2突变型则是α2基因向左缺失了4.2千碱基的片段，可以用-α4.2/αα来表示。在整个美国的族群中，-α4.2/αα的基因型是很少见的(Higgs et al.(1989))，但在某些中国人的族群中约有58％有此种基因型(Baysal and Huisman(1994))。
为了研究疾病背后的基因异常组合，且探测这些基因的缺失片段，便发展出各式的聚合酵素链锁反应(PCR)，见Innis et al.，PCR ProtocolsA Guide toMethods and Applications.San DiegoAcademic Press(1990)。使用PCR来放大DNA或病变基因的部分片段，以协助了解被放大部分的特性。不过，当PCR技术放大(amplify)出来的产物已非常干净的同时，有部分(Dode et al.(1990)；Lebo et al.(1990))在分析之前，仍需要使用限制酵素切割放大的产物，才能达到适当的效果。另外，上述的方法中，并未在使用定量PCR(Quantitative PCR)时，能客观及可信赖地辨别出同型结合子(homozygotes)、杂合子(heterozygotes)及正常型之间的差别，见Lundeberget al.(1991)；Lubin et al.，Mol.Cell.Probes，5307-17(1991)。所以，在测定α血红素蛋白突变基因上，目前需要一种快速且花费较少的改良方法，且能够准确地分别出α血红素蛋白的各种基因型。
上述提到以聚合酵素链锁反应(PCR)为基础的各种方法中，使用于基因诊断例如有缺口PCR(Gap-PCR)，其原理是，设计的引子和缺失序列的两侧端序列互补，由于缺失两端相接，使本来在正常DNA序列中相距很远的这一对引子之间的距离，因断端连接而靠近，以至于能扩增出特定长度的片段。另外一对引子则设计位于缺失区域，这样仅在杂合子或完全正常的情况下，其中的正常等位基因才会扩增出来。此法可以检出大片段缺失的杂合子，如东南亚国家常见的SEA型。此法针对分析突变型-α3.7和-α4.2会有相当地困难度。因在第16条染色体上的α基因群区存在着大量同源序列，对设计PCR引子造成困难并会影响反应的结果。
另外，还有一种用于诊断基因的聚合酵素链锁反应为多重PCR(Multiplex PCR)，其原理为同时引入数对引子，使数个PCR得以在同一反应体是中完成。现已能用于同时诊断以下几种类型的突变(--SEA)、(--MED)、-(α20.5)(Bowden DK et al.BrJ Haematol，1992，81104)，或(--MED)(-α3.7)(Bowie IJ et al.Clin Chem，1994，40(12)2260)，或是(-α3.7)(-α4.2)(-MED)(Oron Karni V et al.Am J Hematol，1998，58306)，但并非所有的突变类型都能并在一起同时检测出，其中最大的困难是反应中的基因片段会彼此干扰，而大幅降低检测的准确度及可靠度。
目前在α型海洋性贫血基因型检查方面，最常见的是基因电泳分析法利用聚合酵素链锁反应(PCR)将基因放大后，再由电泳结果判断，或用杂交方式进行确认，例如凝胶电泳法配合使用特定的探针，就可以测定未知片段的尺寸、核酸序列、以及杂交的研究，可参见Sambrook et al.，Molecular Cloning--ALaboratory Manual，Second Edition，Cold SpringHarborCold Spring Harbor Press(1989)。
美国专利第6322981号中所揭示的检测血红素突变基因方法，是在聚合酵素链锁反应(PCR)过程中，藉由三种引子(primers)放大检体染色体的α1及α2基因，且与对照组的PCR产物量作定量方式比较，以间接推测是否有基因缺失。同样地，在美国专利第5750345号中所揭示的方法，则是以比较染色体三个位置PCR的产物量，而间接推测是否有基因缺失。上述对于基因缺失的检测方法，皆需加上定量方式来判断基因缺失，不过由于人类有两套染色体，且PCR通常会造成过量的反应，因此这种方法很可能造成结果不易判读(见Acta ChemicaScandinavia，199650141-145)。另一方面，若以定量实时PCR(Quantitative real-time PCR)来执行则大大提高检测的成本。
发明内容
本发明主要(aspect)是提供一种快速、简便测定血红素突变基因的方法，所有反应均能在相同的反应体系中进行，并可同时检测出α血球蛋白基因的突变型，能使用在像是海洋性贫血带因者检测、婚前健康检查、或是产前检查。
本发明的另一方面是提供一种测定血红素中α血球蛋白基因突变型的固态基材，此处的突变型是指-α3.7、-α4.2、SEA、FIL、THAI型基因缺失，而此固态基材能在低成本达到高准确度的效果，并预防因电泳定量缺失所造成的错误。
鉴于已有技术存在应用上与使用上的缺失，本发明遂提供一种在生物检体中测定血红素突变基因的方法，此种生物检体中内含编码出血红素的核酸序列，而在此方法中可检测出亚洲人常见的-α3.7、-α4.2、SEA、FIL、THAI五种突变型，这些突变型会与α型海洋性贫血有关。本发明以聚合酵素链锁(PCR)放大检体核酸序列，并用标定物标定放大的序列，进一步使用具有探针的固态基材，把放大的序列与探针进行杂交反应后，进行呈色反应，而呈色结果可迅速用肉眼判断出。
为了达到上述目的，在本发明的一种较佳实施例中，测定此生物检体中血红素突变基因的方法，可测定-α3.7、-α4.2、SEA、FIL、THAI五种突变型，是包含下列步骤利用引子(primers)，以多重引子-缺口聚合酵素链锁(Multiplex-Gap-PCR)做两管放大含编码(encode)出α血球蛋白核酸序列的生物检体，其中一个反应管内含可把FIL、SEA、-α4.2缺失突变基因放大的引子，而另一个反应管内含可把THAI缺失突变基因放大的引子(包含SEQ ID NO1的核酸序列)和-α3.7缺失突变基因放大的引子(包含SEQ ID NO2的核酸序列)，并以标定物标定此放大的检体核酸序列；提供一种具有特定序列群组的探针(SEQ ID NOs3至10)的之固态基材，并把已标定的放大检体序列于此固态基材与上述探针杂交，进行呈色反应。
在本发明进一步实施例中，根据本发明测定血红素突变基因的方法所使用到的固态基材，是包含一检测区及一对照区，其中此检测区中放置一种以上突变型的探针，此一种以上突变型包含-α3.7、-α4.2、SEA、FIL、THAI突变型，而对照区放置一检定基因探针和对照组探针，此检定基因探针是为此一种以上突变型共同缺失的基因部分。一种用于测定血红素突变基因方法中引子的核酸组成物，其中该引子是包含SEQ ID NO1的核酸序列及SEQID NO2的核酸序列。其中该SEQ ID NO1的核酸序列是用于把THAI缺失突变的基因组DNA进行放大。其中该SEQ ID NO2的核酸序列是用于把-α3.7缺失突变的基因组DNA进行放大。一种用于测定血红素突变基因方法中探针的核酸组成物，其中该探针是包含选自SEQ ID NOs3至7组成的序列群组。所述的核酸组成物，其中该探针进一步包含选自SEQID NOs8至10组成的序列群组。一种在一生物检体中测定血红素突变基因的方法，供测定-α3.7、-α4.2、SEA、FIL、THAI五种突变型，该方法包含下列步骤放大该生物检体，并以标定物标定该放大生物检体的核酸序列；放置选自SEQ ID NOs3至8组成之序列群组的探针于一固态基材上；以及把已标定的该放大生物检体于该固态基材上与探针进行杂交，进行呈色反应。一种在一生物检体中测定血红素突变基因的方法，其中该生物检体中内含编码出血球蛋白的核酸序列。一种在一生物检体中测定血红素突变基因的方法，其中放大该生物检体是以聚合酵素链锁反应进行放大。一种在一生物检体中测定血红素突变基因的方法，其中放大该生物检体是以一管以上的多重引子-缺口聚合酵素链锁反应进行放大。一种在一生物检体中测定血红素突变基因的方法，其中一管内含可把FIL、SEA、-α4.2缺失突变基因放大的引子，而另一管内含可把THAI、-α3.7缺失突变基因放大的引子。一种在一生物检体中测定血红素突变基因的方法，其中该可把THAI、-α3.7缺失突变基因放大的引子，是包含SEQ ID NO1的核酸序列以及SEQ ID NO2的核酸序列。一种在一生物检体中测定血红素突变基因的方法，其中SEQ ID NOs3是探测α血球蛋白基因的SEA缺失突变。其中SEQ ID NOs4是探测α血球蛋白基因的FIL缺失突变。一种在一生物检体中测定血红素突变基因的方法，其中SEQ ID NOs5是探测α血球蛋白基因的THAI缺失突变。一种在一生物检体中测定血红素突变基因的方法，其中SEQ ID NOs6是探测α血球蛋白基因的-α3.7缺失突变。一种在一生物检体中测定血红素突变基因的方法，其中SEQ ID NOs7是探测α血球蛋白基因的-α4.2缺失突变。一种在一生物检体中测定血红素突变基因的方法，其中SEQ ID NOs8是α2基因探针，用以探测制造α血球蛋白基因是否正常。一种在一生物检体中测定血红素突变基因的方法，其中该固态基材选自于玻璃、硅芯片、尼龙、高分子聚合物、金属以及合金组成的群组。一种在一生物检体中测定血红素突变基因 的方法，其中该固态基材是为一生物芯片。一种在一生物检体中测定血红素突变基因的方法，其中该生物芯片选自于玻璃、硅芯片、尼龙、高分子聚合物、金属以及合金组成的群组。一种在一生物检体中测定血红素突变基因的方法，其中该放置的步骤进一步包含放置SEQ ID NOs9与10组成的序列群组的探针于该固态基材上。一种在一生物检体中测定血红素突变基因的方法，其中SEQ ID NOs9与10为对照组探针，用于确定该放大生物检体步骤是否完成。一种在一生物检体中测定血红素突变基因的方法，供检测出SEA突变型，该方法包含下列步骤放大该生物检体，并以标定物标定该放大生物检体的核酸序列；放置SEQ ID NOs3与8的探针于一固态基材上；以及把已标定的该放大生物检体于该固态基材上与探针进行杂交，进行呈色反应。一种在一生物检体中测定血红素突变基因的方法，供检测出FIL突变型，该方法包含下列步骤放大该生物检体，并以标定物标定该放大生物检体的核酸序列；放置SEQ ID NOs4与8的探针于一固态基材上；以及把已标定的该放大生物检体于该固态基材上与探针进行杂交，进行呈色反应。一种在一生物检体中测定血红素突变基因的方法，供检测出THAI突变型，该方法包含下列步骤放大该生物检体，并以标定物标定该放大生物检体的核酸序列；放置SEQ ID NOs5与8的探针于一固态基材上；以及把已标定的该放大生物检体于该固态基材上与探针进行杂交，进行呈色反应。一种在一生物检体中测定血红素突变基因的方法，供检测出-α3.7突变型，该方法包含下列步骤放大该生物检体，并以标定物标定该放大生物检体的核酸序列；放置SEQ ID NOs6与8的探针于一固态基材上；以及把已标定的该放大生物检体于该固态基材上与探针进行杂交，进行呈色反应。一种在一生物检体中测定血红素突变基因的方法，供检测出-α4.2突变型，该方法包含下列步骤放大该生物检体，并以标定物标定该放大生物检体的核酸序列；放置SEQ ID NOs7与8的探针于一固态基材上；以及把已标定的该放大生物检体于该固态基材上与探针进行杂交，进行呈色反应。一种在一生物检体中测定血红素突变基因的方法，供检测出一种以上突变型，该方法包含下列步骤放大该生物检体，并以标定物标定该放大生物检体的核酸序列；
放置对应该一种以上突变型的探针以及一检定基因探针，于一固态基材上；以及把已标定的该放大生物检体于该固态基材上与探针进行杂交，进行呈色反应。一种在一生物检体中测定血红素突变基因的方法，其中该检定基因探针为该一种以上突变型共同缺失的基因部分。一种用于测定血红素突变基因的固态基材，是包含一检测区及一对照区，其中该检测区包含一种以上突变型的探针，而该对照区包含一检定基因探针为其特征。一种用于测定血红素突变基因的固态基材，其中该对照区进一步包含对照组探针。一种用于测定血红素突变基因的固态基材，其中该一种以上突变型包含-α3.7、-α4.2、SEA、FIL、THAI突变型。一种用于测定血红素突变基因的固态基材，其中该检定基因探针为该一种以上突变型共同缺失的基因部分。如上所述，本发明方法是为首例以固态基材检测方式进行α型海洋性贫血的检测，可以迅速确定不同类型的突变基因型，且不需要昂贵的仪器(如HPLC)，一般分子生物实验室即可，改善了已知电泳技术的技术操作繁杂、或是定量PCR分析的高价、耗时、难以满足临床实验室常规检测的需要。
更进一步，本发明的方法准确率高，藉由具有多种专一性探针的固态基材，同时鉴定多种引成疾病之缺失基因片段，且避免噪声及误判，大大提高检测结果之可信度。
另一方面，使用本发明的方法检测结果容易判读，直接以肉眼判读即可，不需借助任何仪器，并且操作过程对环境友善，不使用有毒的反应药剂(如电泳检测法之EtBr)，故操作安全性高， 同时可兼具环保功效。
进一步完整地说明本发明，及其伴随的诸多优点，将从下述详细说明及所附图式，得到进一步地了解。
在进一步描述本发明的详细说明前，本发明所使用的”引子”一词，是指一段寡核苷酸，可藉由使用限制酵素做出或是藉由人工合成制作。当想要合成一段特定的核酸序列时，便把引子置于有模板DNA、核酸、诱导剂像是DNA聚合酵素、并有适当温度及pH值的环境中，在此种环境下，引子是作为合成的起始点，开始进行核 酸序列的延展。单股的引子在放大时有较佳的效果，不过，也可以是双股的结构，而长度则需要足够长到能在诱导剂出现的情况下，进行接合延长。而引子的精确长度实际上需考量到多种因素，像是温度、引子的来源和所使用的方式。举例来说，使用目的为检测疾病的基因型时，依照目标序列的复杂度，引子通常包含15-25个或是更多的核酸，若是其它的使用目的，则引子长度通常较短，像是7-15个核苷酸。
首先参考
图1所示，是显示本发明方法的流程图100。本发明用于测定血红素突变基因的方法，是供-α3.7、-α4.2、SEA、FIL和THAI五种突变型的测定，此方法在步骤102至步骤106的作用，是在聚合酵素链锁反应(PCR)中，利用引子(primers)以放大含编码出血球蛋白的核酸序列之生物检体。
在本发明的较佳实施例中，关于步骤102，需做生物检体的采样，一般为人体血液，但不限于此，只要能取得人体的DNA即可(如绒毛、羊水分泌物)，接下来，步骤104时使用市面上商业化产品的操作进行萃取DNA，而萃取纯化后的DNA(浓度至少100ng/μl)便进一步进行步骤106，一多重引子-缺口-非对称性聚合酵素链锁反应(Multiplex-gapAsymmetric PCR)的放大，并在PCR反应的同时加入标定物质(如毛地黄Digoxigenin，DIG)作标定。
在步骤106的具体实施例，PCR反应的操作过程中，是有二个反应管进行反应，其中PCR各管的内容物含有模板DNA 0.7μl、引子混合物2μl、10XPCR缓冲液1μl、dNTP 1mM 3.6μl、Dig-dNTP(2mM)0.4μl、Taq 0.3μl、甜菜碱(Betaine)2μl。在本发明的较佳实施例中，PCR的反应步验如下分别先进行先前变性反应(92至97℃，5分钟)然后再进行以下三个步验之循环反应1)，变性(denaturation)，以高温(92至97℃，45秒)加热变性，使双股模板DNA成为单股模板DNA，2)，令引子于一定的温度下附着于模板DNA两端(60至62℃，1分钟15秒)，3)，再将温度调整到DNA聚合酵素作用的有效温度而合成新的DNA股(72℃，2.5分钟)，在重复进行上述3个反应步骤30个循环后，最后再以72℃10分钟进行最终延展，整个PCR反应较好是在2至3小时之内执行完成。
在上段描述中，其中一个PCR反应管内的引子混合物含有可把FIL、SEA、-α4.2缺失突变基因放大的引子，而另一个PCR反应管内的引子混合物含有可把THAI缺失突变基因放大的引子(包含SEQ IDNO1的核酸序列)和-α3.7缺失突变基因放大的引子(包含SEQ ID NO2的核酸序列)。之后把各管的10μl PCR放大产物加入含200μl缓冲溶液的管中，以95℃温度加热10分钟，使PCR放大产物的双股序列变性(denature)为单股序列，并接着在冰上(4℃)保持10分钟，以避免单股序列重新回复为双股序列，此种单股序列有利于接下来与置于固态基材上的探针进行杂交。
而上述多重引子-缺口聚合酵素链锁反应的原理，是由缺口连接PCR的原理进一步衍生出，缺口连接PCR所设计的引子，会与缺失序列的两侧端序列互补，当片段有所缺失时，缺失两端会连接，使本来在正常DNA序列中相距很远的一对引子之间的距离，因断端连接而靠近，此时即可扩增出特定长度的片段。而同时，另外一对引子则设计位于缺失区域，这样仅在杂合子或完全正常的情况下，其中的正常等位基因才会扩增出来。因此，能测定出大片段缺失的杂合子，而由于α型海洋性贫血是基因缺失所致，故只有基因缺失者才可以使聚合酵素链锁反应进行，而推知出是否为带因型。
特别值得注意的是，α型海洋性贫血的基因缺失是有多种不同片段缺失，本发明便在反应中利用针对不同种片段缺失的多对引子，在同一反应体系中进行数个聚合酵素链锁反应(多重-PCR)，而此种联合多重-PCR和缺口连接-PCR的反应，便称为多重引子-缺口聚合酵素链锁反应。此外，本发明在进行PCR的聚合反应时，加入标定物质，使放大增幅的片段带有标定物。
上述PCR反应所利用的多对引子(primers)，是在同一操作条件下，同时进行多段的聚合反应，而此多对引子是从血红素α基因组序列区域内选出，其中部分的引子序列，如测定SEA、FIL、THAI(F)、3.7(R)、4.2及α2基因的序列可参考Foglietta et al.，Haematologica，81387-396(1996)、Barry et al.，Amer.J.Hematology，6354-56(2000)、以及Chong et al.，Blood，95(1)360-362(2000)，其中引子的(F)意谓是5’端的引子，而(R)意谓是3’端的引子，而测定α2基因引子的设计，是位于各个突变型共同的缺失区域，这样仅在杂合子或完全正常的情况下，其中的正常α2基因才会扩增出来。
接着参考图2，显示第16条染色体上(粗黑线)α血红素蛋白基因缺失的位置和范围，以及在PCR反应中各个引子的相关位置。在图2中，第16条染色体上的基因”HBA1(hemoglobin，alpha 1)”50是指α1基因，而”HBA2(hemoglobin，alpha 2)”60是指α2基因。在第16条染色体下方所对应的关系，是指α-海洋性贫血所缺失的各种基因片段，其中缺失片段32为-α3.7缺失、缺失片段34为-α4.2缺失、缺失片段36为SEA缺失、缺失片段38为FIL缺失、以及基因片段40为THAI缺失，而基因片段两侧的虚线，是代表基因片段的边界，可看出-α3.7是α1和α2的基因部分有缺失，-α4.2是α2基因缺失α1基因仍然存在，SEA、FIL和THAI是α1和α2的基因全部缺失。
另外，在第16条染色体上方的三角形记号，是表示多对引子的起始位置。在反应管1中的引子混合物引子22(F，R)对应缺失片段34，引子23(F，R)对应缺失片段36、引子24(F，R)对应缺失片段38、以及引子26(F，R)对应α2基因引子，而在反应管2中的引子混合物引子21(F，R)对应缺失片段32、以及引子25(F，R)对应缺失片段40，而引子25(R)即为THAI(R)引子(SEQ ID NO1)，引子21(F)即为-α3.7(F)引子(SEQ ID NO2)。
另外，因α1和α2基因中存在着大量同源序列，设计PCR引子有一定的难度，本发明为了达到较佳的测定效果，及避免单个基因间的干扰，因此在测定THAI和3.7时，特别设计包含5’-GGTGGAGATTGCAGCGAGTTGAG-3’序列(即SEQ IDNO1)的THAI(R)引子，以及包含5’-CCTCCCCCTCGCCAAGTC-3’序列(即SEQ ID NO2)的3.7(F)引子，可参见图3，其中SEQ ID NO1序列是用于把THAI缺失突变的基因组DNA进行放大(amplification)，而SEQ ID NO2的核酸序列是用于把-α3.7缺失突变的基因组DNA进行放大。
因此，本发明方法中步骤102至106的目的，是针对检体进行特定缺失型进行放大(amplification)、标志(labeling)、制成单股DNA标的物(target)，以增加讯号强度。
在图1所示的步骤108，提供一种含有探针的固态基材，此探针是与步骤106得到的检体单股DNA进行杂交。此种固态基材是包含一检测区及一对照区，皆含有特定序列的探针，藉由探针与检验样品的单股DNA结合，而以肉眼检验固态基材的呈色结果及呈色位置，分析检体的提供者是否为α海洋性贫血的病患或带因者。在本发明的一种实施例中，步骤108提供的固态基材同时针对α型海洋性贫血五种突变型SEA、FIL、THAI、α3.7、α4.2进行检测。
上述的固态基材的材质，是选自于玻璃(glass)、硅芯片(silica)、尼龙(nylon)、高分子聚合物(polymer)、金属以及合金组成之群组，并也能是固态基材。而此固态基材上探针配置的平面图，可参考图4(A)，其中-α3.7、-α4.2、SEA、FIL、THAI探针是位于检测区，而α2基因探针、ControlI(ACTB基因)探针和ControlII(GAPD基因)探针是位于对照区。另外，固态基材所包含的探针，是选自SEQID NOs3至10组成之序列群组，可参见图3，探针放置的方式可有点制、喷墨、压电等，密度为Probe/dot0.1ul(200nmole/200ul)，经由UV照射以使探针序列与基材材质进行交联(crosslink)。在固态基材的检测区所放置的SEQ ID NOs3至7的序列探针，是各自检测α血球蛋白基因的SEA、FIL、THAI、-α3.7、-α4.2的缺失突变，而在对照区的SEQ ID NO8序列探针是为α2基因检定探针，此α2基因检定探针是为各个突变型共同缺失区域的序列，用以探测制造α血球蛋白基因的DNA是否正常。另外，可进一步在此固态基材上的对照区放置SEQ ID NOs9与10组成之序列群组的探针，其中SEQ ID NO9是为ACTB(actin-beta)基因的序列，而SEQ ID NO10是为GAPD(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)基因的序列，这两种基因是人类的基本基因(hosuekeepinggene)。上述的二探针序列(SEQ ID NOs9与10)是位于其它条染色体上，可用于确定该放大生物检体的步骤是否完成。
在本发明的另一实施例中，放置于固态基材上的探针，包含有对照区的SEQ ID NO8序列探针，以及在检测区的一种探针，此探针是选自SEQ ID NOs3至7的序列群组探针的任一种，也就是可以只单独测定SEA、FIL、THAI、-α3.7、-α4.2的其中一种突变型。
继续参考图1，步骤110至114是将已标定的放大检体于此固态基材上与探针进行杂交反应，在同一个反应中，以含有多种专一性探针数组(probes array)的固态基材，同时针对多种标的物进行杂交反应确认多种疾病之基因型。如果有因为基因缺失而能进行PCR放大增幅的片段存在，便可与固态基材上的探针进行专一性互补杂交反应，并在反应一段时间后，用缓冲液洗掉过量未进行互补杂交反应的放大检体，接下来，加入呈色反应试剂，呈色反应后，便能用肉眼判读结果。
在本发明的较佳实施例中，为了在步骤110达到较佳的杂交效果，便先把含有探针的固态基材置于反应槽中，并以400μl缓冲液浸润，置于63℃之杂交箱中摇动3分钟，接着，倒掉反应槽中的缓冲液，再把含有已标定放大检体的缓冲溶液加入反应槽中，此溶液要盖满整片固态基材，并置于63℃杂交箱摇动60分钟，以进行杂交反应，反应一段时间后，倒掉上述缓冲液，加入400μl、60℃的缓冲液摇动5分钟，并重复一次，以洗掉未进行杂交反应的放大检体，接下来，倒掉上述冲洗缓冲液，加入200μl的阻隔缓冲液(blockingbuffer)摇动30分钟，以阻断抗体不专一结合的作用位置。
紧接着步骤6便是呈色反应的进行，是在倒掉阻隔缓冲液之后，加入含有呈色反应试剂(抗-DIG抗体和其它试剂)的反应缓冲液200μl，此呈色反应试剂像是接合上碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase)的抗-DIG抗体，及阻隔缓冲液(两者比例为1∶12500)。摇动反应缓冲液30分钟后，倒掉上述缓冲液，加入400μl的冲洗缓冲液摇动5分钟，并重复一次，以洗掉未进行结合的抗体，接下来，倒掉上述冲洗缓冲液，加入200μl的平衡缓冲液(Balance buffer)摇动2分钟，使固态基材与呈色反应溶液达到平衡。最后，倒掉上述缓冲液，加入200μl的显色缓冲液(color developbuffer)，此缓冲液的成分为NBT/BCIPdetectionbuffer(1∶50)，室温下避光静置，以使抗体上携带之碱性磷酸酵素分解NBT/BCIP，便出现呈色结果。
在本发明方法之步骤114，呈色结果只要用肉眼判读，并藉由呈色与否和呈色的位置，便可以轻易了解是否有血红素突变基因，而进一步了解是否为α型海洋性贫血之带因者。
在本发明的较佳实施例中，可同时针对五种α型海洋性贫血SEA、FIL、THAI、α3.7、α4.2型进行检测，而呈色结果的显示，可参见图4(B)至图4(H)，是为图4(A)中的探针与正常人和不同基因型的α海洋性贫血病人检体杂交后，进行呈色反应的结果，而因为人类的染色体是成对的，所以在检测结果中常有在同一对染色体中，一条基因缺失，一条为正常染色体的异型结合子现象，例如基因型为SEA缺失/正常。
图4(B)显示出正常的α2基因，表示检体来源不具有此五种α海洋性贫血带因者；图4(C)同时显示出正常的α2基因与SEA缺失片段，其基因型为SEA缺失/正常，表示检体来源为SEA型的α海洋性贫血带因者；图4(D)同时显示出正常的α2基因与FIL缺失片段，其基因型为FIL缺失/正常，表示检体来源为FIL型的α海洋性贫血带因者；图4(E)同时显示出正常的α2基因与THAI缺失片段，其基因型为THAI缺失/正常，表示检体来源为THAI型的α海洋性贫血带因者；图4(F)同时显示出正常的α2基因与α4.2缺失片段，其基因型为α4.2缺失/正常，表示检体来源为-α4.2型的α海洋性贫血带因者；图4(G)同时显示出正常的α2基因与α3.7缺失片段，其基因型为α3.7缺失/正常，表示检体来源为α3.7型的α海洋性贫血带因者；图4(H)显示出SEA缺失片段，其基因型为SEA缺失/SEA缺失，表示检体来源为SEA型的重度α海洋性贫血病患。
虽然本发明以具体实施例显示并描述如上，惟熟悉此技艺者应当了解的是，任何不脱离本发明精神下所为之修饰或改变，都将包含于本发明之中，因此本发明的保护范围当视后附之申请专利范围所界定者为准。
权利要求
1.一种用于测定血红素突变基因方法中引子的核酸组成物，其特征在于，其中该引子是包含SEQ ID NO1的核酸序列及S EQ ID NO2的核酸序列。
2.如权利要求1所述的核酸组成物，其特征在于，其中该SEQ ID NO1的核酸序列是用于把THAI缺失突变的基因组DNA进行放大。
3.如权利要求1所述的核酸组成物，其特征在于，其中该SEQ ID NO2的核酸序列是用于把-α3.7缺失突变的基因组DNA进行放大。
4.一种用于测定血红素突变基因方法中探针的核酸组成物，其特征在于，其中该探针是包含选自SEQ ID NOs3至7组成的序列群组。
5.如权利要求4所述的核酸组成物，其特征在于，其中该探针进一步包含选自SEQ ID NOs8至10组成的序列群组。
6.一种在一生物检体中测定血红素突变基因的方法，其特征在于，供测定-α3.7、-α4.2、SEA、FIL、THAI五种突变型，该方法包含下列步骤放大该生物检体，并以标定物标定该放大生物检体的核酸序列；放置选自SEQ ID NOs3至8组成之序列群组的探针于一固态基材上；以及把已标定的该放大生物检体于该固态基材上与探针进行杂交，进行呈色反应。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，其中该生物检体中内含编码出血球蛋白的核酸序列。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，其中放大该生物检体是以聚合酵素链锁反应进行放大。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，其中放大该生物检体是以一管以上的多重引子-缺口聚合酵素链锁反应进行放大。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，其中一管内含可把FIL、SEA、-α4.2缺失突变基因放大的引子，而另一管内含可把THAI、-α3.7缺失突变基因放大的引子。
11.如权利要求10所述之方法，其特征在于，其中该可把THAI、-α3.7缺失突变基因放大的引子，是包含SEQ IDNO1的核酸序列以及SEQ ID NO2的核酸序列。
12.如权利要求6所述之方法，其特征在于，其中SEQID NOs3是探测α血球蛋白基因的SEA缺失突变。
13.如权利要求6所述的方法，其特征在于，其中SEQID NOs4是探测α血球蛋白基因的FIL缺失突变。
14.如权利要求6所述的方法，其特征在于，其中SEQID NOs5是探测α血球蛋白基因的THAI缺失突变。
15.如权利要求6所述的方法，其特征在于，其中SEQID NOs6是探测α血球蛋白基因的-α3.7缺失突变。
16.如权利要求6所述的方法，其特征在于，其中SEQID NOs7是探测α血球蛋白基因的-α4.2缺失突变。
17.如权利要求6所述的方法，其特征在于，其中SEQID NOs8是α2基因探针，用以探测制造α血球蛋白基因是否正常。
18.如权利要求6所述的方法，其特征在于，其中该固态基材选自于玻璃、硅芯片、尼龙、高分子聚合物、金属以及合金组成的群组。
19.如权利要求6所述的方法，其特征在于，其中该固态基材是为一生物芯片。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，其中该生物芯片选自于玻璃、硅芯片、尼龙、高分子聚合物、金属以及合金组成的群组。
21.如权利要求6所述的方法，其特征在于，其中该放置的步骤进一步包含放置SEQ ID NOs9与10组成的序列群组的探针于该固态基材上。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，其中SEQID NOs9与10为对照组探针，用于确定该放大生物检体步骤是否完成。
23.一种在一生物检体中测定血红素突变基因的方法，供检测出SEA突变型，其特征在于，该方法包含下列步骤放大该生物检体，并以标定物标定该放大生物检体的核酸序列；放置SEQ ID NOs3与8的探针于一固态基材上；以及把已标定的该放大生物检体于该固态基材上与探针进行杂交，进行呈色反应。
24.一种在一生物检体中测定血红素突变基因的方法，供检测出FIL突变型，其特征在于，该方法包含下列步骤放大该生物检体，并以标定物标定该放大生物检体的核酸序列；放置SEQ ID NOs4与8的探针于一固态基材上；以及把已标定的该放大生物检体于该固态基材上与探针进行杂交，进行呈色反应。
25.一种在一生物检体中测定血红素突变基因的方法，供检测出THAI突变型，其特征在于，该方法包含下列步骤放大该生物检体，并以标定物标定该放大生物检体的核酸序列；放置SEQ ID NOs5与8的探针于一固态基材上；以及把已标定的该放大生物检体于该固态基材上与探针进行杂交，进行呈色反应。
26.一种在一生物检体中测定血红素突变基因的方法，供检测出-α3.7突变型，其特征在于，该方法包含下列步骤放大该生物检体，并以标定物标定该放大生物检体的核酸序列；放置SEQ ID NOs6与8的探针于一固态基材上；以及把已标定的该放大生物检体于该固态基材上与探针进行杂交，进行呈色反应。
27.一种在一生物检体中测定血红素突变基因的方法，供检测出-α4.2突变型，其特征在于，该方法包含下列步骤放大该生物检体，并以标定物标定该放大生物检体的核酸序列；放置SEQ ID NOs7与8的探针于一固态基材上；以及把已标定的该放大生物检体于该固态基材上与探针进行杂交，进行呈色反应。
28.一种在一生物检体中测定血红素突变基因的方法，供检测出一种以上突变型，其特征在于该方法包含下列步骤放大该生物检体，并以标定物标定该放大生物检体的核酸序列；放置对应该一种以上突变型的探针以及一检定基因探针，于一固态基材上；以及把已标定的该放大生物检体于该固态基材上与探针进行杂交，进行呈色反应。
29.如权利要求28所述的方法，其特征在于，其中该检定基因探针为该一种以上突变型共同缺失的基因部分。
30.一种用于测定血红素突变基因的固态基材，其特征在于，是包含一检测区及一对照区，其中该检测区包含一种以上突变型的探针，而该对照区包含一检定基因探针为其特征。
31.如权利要求30所述的固态基材，其特征在于，其中该对照区进一步包含对照组探针。
32.如权利要求30所述的固态基材，其特征在于，其中该一种以上突变型包含-α3.7、-α4.2、SEA、FIL、THAI突变型。
33.如权利要求30所述之固态基材，其特征在于，其中该检定基因探针为该一种以上突变型共同缺失的基因部分。
全文摘要
一种测定血红素突变基因的方法，是在检体的血红素基因中，可同时检测多种基因缺失突变。另外，本发明进一步提供一种使用此方法的固态基材，是包含多种专一性的探针，以便对于常出现于亚洲族群的血红素基因突变，做特定的筛选。
文档编号C12Q1/68GK1465711SQ0212305
公开日2004年1月7日 申请日期2002年6月11日 优先权日2002年6月11日
发明者吴满潮, 杜明哲, 黄献龙, 赵守宇 申请人:晶碁生化科技股份有限公司, 晶 生化科技股份有限公司