一种干细胞、其制备方法及其用途的制作方法

专利名称：一种干细胞、其制备方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种干细胞、其制备方法及其用途，特别是从人或其他哺乳动物的胚胎、脐带血、脊髓、软骨等组织中制备的干细胞、其制备方法及其在治疗、修复失去功能的病变组织或器官中的应用。
干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞原始细胞。它包括胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞是全能的，具有分化为几乎全部组织和器官的能力，例如在胚胎的发生发育中，单个受精卵可以分裂发育为多细胞的组织或器官。最新研究发现，成体干细胞可以横向分化为其他类型的细胞和组织，例如，在成年动物中，正常的生理代谢或病理损伤也会引起组织或器官的修复再生。由于胚胎的分化形成和成年组织的再生是干细胞进一步分化的结果，为干细胞的广泛应用提供了基础。
干细胞具有自我更新能力，能够产生高度分化的功能细胞。组织特异性干细胞同样具有分化成其他细胞或组织的潜能，这为干细胞的应用开创了更广泛的空间。通过定向诱导，干细胞可以分化成不同组织细胞，包括角膜、神经及其他器官细胞、因此被称为“源泉细胞”。因此通过干细胞技术培育出来的细胞、组织，可以移植到失去功能的病变组织或器官中，使其恢复正常功能。
目前许多研究工作都是以小鼠畸胎瘤干细胞(EC细胞)为研究对象展开的，如德美医学小组在去年成功的向试验鼠体内移植了由ES细胞培养出的神经胶质细胞。此后，密苏里的研究人员通过鼠胚细胞移植技术，使瘫痪的猫恢复了部分肢体活动能力。随着ES细胞的研究日益深入，生命科学家对人类ES细胞的了解迈入了一个新的阶段。在1998年末，美国两个研究小组成功地培养出人类ES细胞，保持了ES细胞分化为各种体细胞的全能性。这样就使科学家利用人类ES细胞治疗各种疾病成为可能。
但由于哺乳动物胚胎植入子宫后的不可接近性，ES细胞的研究一直徘徊不前。1995年Thomson从恒河猴的胚泡分离并建立了ES细胞系，这是第一个建系的灵长类动物的胚胎干细胞。这种具有正常XY核型的ES细胞，在持续传代中保持未分化状态达一年以上，而且它表达某些人畸胎瘤细胞的表面标志。在恒河猴ES细胞的培养中发现了饲养细胞及LIF(leukemia inhibitory factor)的重要作用，这为人类ES细胞系的建立奠定了基础，并为探讨人胚胎发育、组织分化的体外模型提供了相对可靠的参照。
在人ES细胞研究过程中，畸胎瘤一直是主要研究素材。但这种人的胚胎肿瘤细胞系的分化范围非常有限，细胞系之间变异大，更关键的是它并不能完全精确地代表正常分化的特点；研究对象来源的匮乏以及伦理道德的约束，使人胚胎干细胞的体外研究一直是空白。这种状况在1998年被打破，Thomson再创先河，他借助Gardner，DK发明的G1.2和G2.2培养基，解决了早期胚胎对输卵管环境的依赖性问题，从而将新鲜或冰冻的人体外受精卵(IVF，in vitro fertilization)由4-8细胞阶段培养至胚泡期，分离内细胞团(ICM，inner cell mass)后逐渐传代建系为ES细胞系；同期，John.D Gearheart从人原始生殖细胞(primordial germ cell)中建立了与ES细胞功能相似的多能干细胞系——胚胎生殖细胞系(EG细胞，embryonic germ cell)，这两个实验小组的结果在《Science》和《Proc.Natl.Acad.Sci.USA》上一经刊出，立即引起了研究者们的极大兴趣。这不仅掀起了新一轮的胚胎干细胞研究热潮，还由于人类胚胎干细胞建系及诱导胚胎干细胞分化为神经干细胞和心肌干细胞获得成功，使得胚胎干细胞应用于临床的研究产生了突破性的进展。
ES细胞可作为评价新药及化学产品的毒性及效能的检测系统。ES细胞系具有组织、细胞的广谱性，它发展为胚体后的生物系统，可模似体内细胞间复杂的相互作用，这在药物和农用化学品工业上有广泛的用途，可减少动物检测，降低成本，有重要的商业价值。ES细胞最引人注目之处在于它有重要的临床意义，即ES细胞有可能成为今后细胞替代疗法的主角。ES细胞作为个体发育之初的原始干细胞，遵循着细胞分化的普遍规律，这是发育潜能逐渐局限、细胞功能专一化的过程，内涵不断增加，外延逐渐缩小，最后的命运是某种组织细胞。从理论上讲，ES细胞可以无限地提供可为移植所有的特异性的细胞类型，置换疾病组织和放化疗损伤后的造血系统，这为遗传病、肿瘤和衰老等疾病的解决提供了新的思路，许多医疗分支的研究均可受益于此项创举。
在特定条件下，成体干细胞或者产生新的干细胞，或者按一定的程序分化，形成新的功能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。过去认为成体干细胞主要包括上皮干细胞和造血干细胞。最近研究表明，以往认为不能再生的神经组织仍然包含神经干细胞，说明成体干细胞普遍存在，问题是如何寻找和分离各种组织特异性干细胞。成体干细胞经常位于特定的微环境中。微环境中的间质细胞能够产生一系列生长因子或配体，与干细胞相互作用，控制干细胞的更新和分化。
造血干细胞是体内各种血细胞的唯一来源，它主要存在于骨髓、外周血、脐带血中。2000年科学家又在肌肉组织中发现了具有造血潜能的干细胞。造血干细胞的移植是治疗血液系统疾病、先天性遗传疾病以及多发性和转移性恶性肿瘤疾病的最有效方法。
在临床治疗中，造血干细胞应用较早，在20世纪五十年代，临床上就开始应用骨髓移植(BMT)方法来治疗血液系统疾病。到八十年代末，外周血干细胞移植(PBSCT)技术逐渐推广开来，绝大多数为自体外周血干细胞移植(APBSCT)，在提高治疗有效率和缩短疗程方面优于常规治疗，且效果令人满意。
与两者相比，脐血干细胞移植的长处在于无来源的限制，对HLA配型要求不高，不易受病毒或肿瘤的污染。在2000年年初，东北地区首例脐血干细胞移植成功，又为中国造血干细胞移植技术注入新的活力。随着脐血干细胞移植技术的不断完善，它可能会代替目前APBSCT的地位，为全世界更多的血液病及恶性肿瘤的患者带来福音。
关于神经干细胞研究起步较晚，由于分离神经干细胞所需的胎儿脑组织较难取材，加之胚胎细胞研究的争议尚未平息，神经干细胞的研究仍处于初级阶段。理论上讲，任何一种中枢神经系统疾病都可归结为神经干细胞功能的紊乱。脑和脊髓由于血脑屏障的存在使之在干细胞移植到中枢神经系统后不会产生免疫排斥反应，如给帕金森氏综合症患者的脑内移植含有多巴胺生成细胞的神经干细胞，可治愈部分患者症状。除此之外，神经干细胞的功能还可延伸到药物检测方面，对判断药物有效性、毒性有一定的作用。
基于组织工程和基因工程技术发展起来的细胞(或组织)替代治疗和基因治疗是近年来医学领域乃至整个生命科学领域中的研究热点和前沿，为人类征服多种疾病提供了新的途径和希望。其中一个关键问题是选择满足要求和易于操作的耙细胞，干细胞因其具有高度自我更新能力和多向分化潜能，是细胞治疗和基因治疗的首选靶细胞。
间充质干细胞是骨髓中除造血干细胞外的另一类中胚层发育的早期细胞，这类细胞可以通过体外贴壁培养加以分离，不仅可分化为造血实质和基质细胞，还可分化为多种造血以外的组织，特别是中胚层和神经外胚层来源组织的细胞，并易于外源基因的转染和表达，因而可能是细胞治疗和基因治疗理想的靶细胞。近年来，这类干细胞开始受到学者的广泛关注。
本世纪70年代，Friedenstech等发现在塑料培养皿中培养的贴壁的骨髓单个核细胞在一定条件下可分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞，而且这些细胞经过20～30个培养周期，仍能保持其多向分化潜能，这类细胞被称为骨髓间充质干细胞(MSCs)。将这些细胞植入小鼠的肝脏或肾脏包膜发现可以形成骨样和软骨样细胞。骨髓间充质干细胞的多向分化能力具有高度的进化保守性。近年来还证实骨髓间充质干细胞在动物体内可以参与损伤肌组织的再生和形成星形神经胶质细胞，从而为这些细胞、器官、系统相关疾病的治疗提供了新的极有价值的线索，引起更广泛的关注。
骨髓间质来源的细胞，形态成纤维样，可聚集成均匀的集落，细胞表面蛋白如SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124等呈阳性，但CD14、CD34和CD45造血谱系标记则呈阴性。目前，MSCs鉴定的方法都是通过在培养过程中出现分化表型，然后逆推得知是否为间质干细胞，尚无直接方法可鉴定得到MSCs。
在体外MSCs向多种类型的细胞分化。MSCs在体外培养时，保持干细胞的特性自身不断地增殖，在不同诱导条件下能够向不同谱系分化。通过密度梯度离心从狗或成人骨髓分离的MSCs，用地塞米松、β-磷酸甘油和抗坏血酸等单独或联合诱导，可以形成聚集体或结节，碱性磷酸酶活性增高，基质明显钙化，可分化为成骨细胞。一些生长因子如BMP、TGFβ、bFGF等也可以诱导MSCs成骨分化。对鼠颅骨来源的永生化间质前体细胞株2T3分化的分析表明，配体与BMP受体IB结合，可导致成骨分化；配体与BMP受体IA结合，可导致成脂肪分化。可能因为BMPR IA或BMPR IB与BMP受体II形成复合体之后，激活不同的信号转导途径，引起不同基因的表达。对于成软骨细胞分化的机制目前尚不清楚，但MSCs在体外培养过程中，可以自动或经诱导分化成为软骨细胞。Fortier等(1998)从马的胸骨骨髓离心得到的MSCs，单层培养，其形态从纺锤状成纤维细胞样外形逐渐变为圆形，形成集落斑，并且经历从I型胶原的表达向II型胶原表达的转变，蛋白聚糖的合成也不断增加，表明来自成年马骨髓的MSCs在单层培养时成软骨分化。Johnstone等(1998)通过单层培养分离得到的兔MSCs，转入试管中形成聚集体，在含10-7mol/L地塞米松的培养基中培养，经组织染色和免疫组化检测，有II、X型胶原表达，表明诱导成软骨分化；用TGFβ1处理，有或无地塞米松，均可诱导所有细胞进行分化，并伴随聚集体细胞碱性磷酸酶活性的提高。Mackay等(1998)将成人骨髓来源的MSCs在地塞米松和TGFβ3的诱导下，第14天，在细胞外基质中检测到II型胶原、aggrecan；用地塞米松和甲状腺素处理，MSCs可以进一步向肥大软骨细胞分化。另有很多实验证明，将MSCs形成聚集体后，可能有利于成软骨分化，这与体内软骨发育的情形类似。在聚集体内部细胞缺乏血管提供养分，依靠细胞与细胞之间的相互作用，也许是成软骨分化的一个有利条件。MSCs在体外诱导因素的作用下，也可定向分化形成脂肪细胞和肌细胞。Pittenger等(1999)用1-甲基-3异丁基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素和茚甲新诱导人的MSCs，在细胞内逐渐聚集含脂丰富的小泡，这些细胞表达过氧化物酶体增殖激活受体2(PPAR2)、脂蛋白脂酶(LPL)和脂肪酸结合蛋白αP2。多种诱导处理导致95％以上的细胞定向分化为脂肪细胞，并且脂肪泡不断地长大、融合，最终充满细胞。这些脂肪细胞在体外培养可健康生长至少3个月。Wakitani等(1995)将大鼠骨髓来源的第二代MSCs在培养皿中经5氮胞苷处理24小时，7～11天后，在某些培养皿中可以观察到长的多核肌管，也可在细胞的细胞质中观察到苏丹黑阳性小滴。这些观察说明出生后有机体骨髓中的MSCs可以成为肌祖细胞的来源，可为肌肉再生的临床研究提供基础。
近年来，人们不断地探索利用MSCs进行细胞治疗和基因治疗。首先，可以用体外培养扩增的MSCs，作为组织工程的种子细胞，修复各种组织。前述的动物实验中已提及用体外培养扩增的MSCs来修复各种损伤，并且具有良好的效果。尽管人们已成功地利用自身的成骨细胞或软骨细胞修复骨或软骨的损伤，但MSCs与这些分化细胞相比，具有更大的优势。因为在体外培养过程中，MSCs可以保持未分化表型不断增殖，达到所需的数目，然后经诱导可定向分化为所需表型；而已分化的细胞来源有限，在体外培养时，增殖速度较慢，而且还存在去分化的问题。第二，可通过转基因的方法，将外源基因导入MSCs。可以将利于定向分化的生长因子基因转入MSCs，促进定向分化，加快体内组织修复的进程。Lou等将人的BMP2基因通过腺病毒转染，间质祖细胞能定向进行骨分化，并且在注射到裸鼠肌肉后，可以发育成具有骨小梁、骨髓和软骨组织的骨。Guinn等证实，转染了IX因子基因的MSCs，在有序地注入SDID小鼠后，可以分泌蛋白至少达8周。所以，基因工程MSCs可以作为一个有效的载体来治疗诸如血友病B和其它由于缺乏循环蛋白引起的遗传疾病。第三，在一定的条件下有序地植入MSCs，替代有缺陷的骨髓，为其它组织提供MSCs的后代。表达突变胶原基因而衰弱的幼鼠，在将正常鼠的MSCs大量植入后，经过发育，在成鼠的骨、软骨和脑中正常供体细胞替代率可达30％。在人类也存在由于I型胶原基因的突变，小孩的骨形成不完善，那么这些结果为临床治疗此类疾病提供了试验基础，可给年幼病人移植正常的人白细胞抗原(HLA)匹配的供体骨髓，缓解重度骨缺陷症状。将来可能的策略是从病人身上分离MSCs，在体外培养时，通过同源重组替代突变的I型胶原基因，然后再回植到病人身上。I期临床试验证明，有序地植入自体MSCs是安全的。所以，能够利用病人自身的基因工程MSCs，治疗诸如骨质疏松症等疾病。
总之，骨髓来源的间质干细胞，在体外可以定向分化为不同类型的细胞，能够作为组织工程中不同细胞的来源；在体内正常循环中能够分布于多种组织和器官，可以用于细胞和基因治疗。
曾有人报道从软骨中可以分离出形态较为均一的成纤维形的细胞，但未有人对这类的细胞进行鉴定过，也未对该种细胞是否具有多向分化能力进行探讨。而且软骨组织成分单一，不象骨髓、脐血、肝脏有多种成分，所以利用软骨来源的间充质干细胞来研究间充质干细胞的生物学特征、定向分化条件、分化的分子机制以及细胞治疗、基因治疗的应用将具有更广泛的前景。由于软骨成分单一，如能从软骨中建立间充质干细胞系，将比从其他来源的组织中建立间充质干细胞系更为纯化、更具有前景。
可见，获取干细胞，并进一步检测其活性及在治疗、修复失去功能的病变组织或器官中的应用，可以为遗传病、肿瘤和衰老等疾病提供新的解决思路。
本发明的目的在于公开一种从人或其他哺乳动物的胚胎、脐带血、脊髓、软骨等组织中制备的干细胞，所述干细胞具有生物学活性，能够分化为细胞或组织。
本发明的另一目的在于公开一种从人或其他哺乳动物的胚胎、脐带血、脊髓、软骨等组织中获取干细胞的方法，该方法简便快捷、特异性强、实用有效。
本发明的次一目的在于公开干细胞在用于制备治疗各种疾病药物中的用途。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种干细胞，是以人或其他哺乳动物的胚胎、脐带血、脊髓等组织为原料，通过免疫磁珠阳性筛选制备的。
具体地说，本发明干细胞的制备方法包括如下步骤4)将原料稀释得到稀释液；5)单核细胞的获得；6)免疫磁珠阳性筛选。
其中步骤1)中的原料稀释是采用以20ml枸橼酸-枸橼酸钠(简称ACD)和葡萄糖(简称CB)的PBS缓冲溶液稀释脐带血或脊髓块等，得到脐带血或脊髓稀释液；缓冲溶液中ACD∶CB＝1∶6，CB∶PBS＝1∶4。
或将人或其他哺乳动物的胚胎匀浆。
步骤2)中通过下述方法获得单核细胞按照Ficoll∶CB＝3∶7的量用Ficoll分层，，4℃ 800g离心30分钟，收集界面层后，在4℃ 500g离心20分钟，弃上清，得到脊髓单核细胞收集界面层。
上述制备方法中还包括采用流式细胞仪分选干细胞。
当采用脐带血为原料时，还包括将弃上清后的沉淀物用红细胞裂解液4℃下裂解10分钟。用PBS缓冲液洗涤细胞，300g离心20分钟，采用流式细胞仪分选干细胞，得到脐带血的单核细胞(MNC)。
步骤3)中的免疫磁珠阳性筛选为采用MNC∶Dynabeads M-450CD34∶Detachabead CD34＝4×108∶4×107∶4×107＝1ml∶100μl∶100μl。Dynabeads M-450 CD34洗涤，置于磁板(MPC)1分钟，弃清液，PBS缓冲液洗涤2次。混合磁珠(MACS，Miltenyi公司产品)和脐带血的单核细胞的CD34溶液，4℃微旋孵育30分钟，阳性筛选CD34+细胞。
玫瑰花环状细胞—磁珠重新悬起，置于磁板(MPC)2分钟，弃清液，重复3次，得玫瑰花环状细胞—磁珠，悬于100μl PBS缓冲液。Detachabead CD34解离细胞，微旋孵育45分钟，加2ml PBS缓冲液，混匀，置于磁板(MPC)2分钟，收集细胞清液，重复3次，汇集细胞清液，置于MPC 2分钟，除去残留磁珠，将细胞清液移入锥形试管。离心、洗涤2次，细胞计数，流式细胞仪FACS检测。
为避免胞内冰晶损伤和溶液损伤，采用人胚胎细胞较多应用的玻璃化冻存方法。首先冰浴预冷冻存液，细胞离心管置于冰水浴操作，沿离心管壁缓加冻存液(何种冻存液)，至细胞终浓度为1×1061.5×106，吹吸匀。分装于冻存管中，火焰封口，将冻存管直接投入液氮罐保存，降温速度约为600℃/min，进行细胞冻存。细胞培养时，细胞浓度调至1×106培养。
本发明中采用MTT法测定干细胞增殖来鉴定所得干细胞的活性。具体为以无血清培养基制备单细胞悬液，接种于培养板中，加入MTT(中文名)溶液，孵育，离心，弃培养板孔内上清，加入二甲基亚砜。酶联免役检测仪测定OD570检测干细胞是否出现明显增殖，如有增殖说明所制备的干细胞具有活性。
本发明中采用免疫组化法检查干细胞是否向肝细胞转化，具体为取细胞涂片，丙酮固定，加稀释一抗(白蛋白1∶50；CK81∶10)，37℃40分钟，PBS洗3次，每次3分钟。加FITC标记的二抗(1∶50稀释)，37℃条件下保存40分钟。PBS洗3次每次3分钟。缓冲甘油封片，荧光显微镜下检查是否向向肝细胞转化。
依实验分组情况进行实验，CD34+细胞用Hoechest33342、PKH26双标，尾静脉注射干细胞药物。取观察脏器制成冰冻切片、石蜡切片。细胞形态学鉴定采用紫外荧光显微成像，激光共聚焦细胞仪观察。细胞人源性检测采用PCR技术，提取组织中的DNA，用PCR的方法特异性的扩增人Alu序列，用于区分人和鼠的细胞。如果PCR扩增有阳性结果，可进一步通过用人Alu序列的核酸探针进行原位杂交鉴定。细胞造血干细胞性质检测采用CD34+CD38+双标，Confolcal检测。CD34+细胞，Hoechest33342、PHK26双标，尾静脉注射入裸鼠，加干细胞诱导因子SIF，取肝制成冰冻切片，激光共聚焦细胞仪检测。CD34+细胞，Hoechest33342、PHK26双标，尾静脉注射入裸鼠，加SIF的PBS缓冲液，取肝制成冰冻切片，激光共聚焦细胞仪检测。CD34+细胞，Hoechest33342、PHK26双标，尾静脉注射入裸鼠，取肝制成冰冻切片，激光共聚焦细胞仪检测。
肝性化检测，采用免疫组化方法可用CK14、CK19、清蛋白、AFP分别鉴定。肝细胞标记还可用HepParl，OC可采用OV-6和CD-117标记。免疫组化设立人肝阳性对照、鼠肝阴性对照。
在本发明的另一个实施方案中，还涉及以从人或其他哺乳动物的胚胎软骨为原料制备胚胎软骨来源的间充质干细胞的制备。
胚胎软骨来源的间充质干细胞是通过下述方法制备取人或其他哺乳动物的软骨，通过胰蛋白酶、胶原蛋白酶消化、在培养基中培养，传代，得到间充质干细胞。
由于胚胎软骨在胚胎发育时期就是从间充质发育而来，估计在胎儿软骨中可能存在一部分间充质干细胞，以弥补由于意外造成的软骨缺损。本发明中对胚胎的软骨通过胰酶、胶原酶消化，从胚胎软骨中分离间充质干细胞，获得了比较均一的细胞群，该细胞群的表面标志与文献报道的间充质干细胞的表面标志十分相似，且细胞增殖旺盛，形态较为均一，在体外对其进行成骨、成脂、成神经的多向分化能力检测，发现该群细胞具有成骨、成脂、成神经的多向分化能力。
本发明的干细胞及其制备方法具有下述优点1.简便快捷经MNC细胞获取、CD34抗体标记、流式细胞仪分选及细胞接种分离干细胞。
2.特异性强通过MTT法测定干细胞增殖，免疫组化法检查干细胞是否向肝细胞转化，结果证明，本发明的干细胞可以定向转化。
3.实用有效经诱导可定向转化，用于干细胞治疗各种疾病及进行细胞药物的筛选。
下面结合附图和具体实施例详细描述本发明，所述的实施例是用于描述本发明，而不是限制本发明。


图1.CD34+细胞，Hoechest33342、PHK26双标，干细胞诱导因子SIF作用于肝脏的激光共聚焦细胞仪检测结果图；图2.CD34+细胞，Hoechest33342、PHK26双标，加SIF的PBS缓冲液，取肝制成冰冻切片，激光共聚焦细胞仪检测结果图；图3.CD34+细胞，Hoechest33342、PHK26双标，取肝制成冰冻切片，激光共聚焦细胞仪检测结果图；图4.本发明的间充质干细胞流式细胞仪鉴定结果图；
图5-8.本发明的间充质干细胞流式细胞仪鉴定结果图；实施例1取人14周胚胎脊髓约5g剪碎，以20ml枸橼酸-枸橼酸钠(简称ACD)和葡萄糖(简称CB)的PBS缓冲溶液稀释，得到脊髓稀释液；缓冲溶液中ACD∶CB＝1∶6，CB∶PBS＝1∶4。
脊髓稀释液用Ficoll(Sigma公司产品)分层，Ficoll∶CB＝3∶7，4℃ 800g离心30分钟。收集界面层后，在4℃ 500g离心20分钟，弃上清，得到脊髓单核细胞(MNC)。
以磁珠(MACS，Miltenyi公司产品)阳性筛选CD34(抗体)和脊髓单核细胞(MNC)，所用抗体为Dynabeads M-450 CD34和Detachabead CD34，与MNC的比例及用量为MNC∶Dynabeads M-450 CD34抗体(Dynal公司产品)Detachabead CD34抗体(Dynal公司产品)＝4×108∶4×107∶4×107(浓度)＝1ml∶100μl∶100μl(用量)。
阳性筛选CD34+细胞(MNC)——混合磁珠和细胞，4℃下微旋孵育30分钟。
首先用Dynabeads M-450 CD34洗涤脊髓单核细胞，置于磁板(MPC)1分钟，弃清液后，用PBS缓冲液洗涤4次。
阳性筛选CD34+细胞(MNC)，——将玫瑰花环状细胞——磁珠重新悬起，置于磁板(MPC)2分钟，弃清液，重复3次，得玫瑰花环状细胞—磁珠，悬于100mlPBS缓冲液中。用Detachabead CD34解离细胞，微旋孵育45分钟，加2ml PBS缓冲液混匀，置于磁板(MPC)2分钟，收集细胞清液，重复3次，汇集细胞清液，置于磁板(MPC)2分钟，除去残留磁珠，将细胞清液移入锥形试管。离心、洗涤2次，细胞计数，CD34、CD3双标，流式细胞仪(FACS)检测MACS阳性筛选CD34+细胞。得到脊髓干细胞。
为避免胞内冰晶损伤和溶液损伤，采用人胚胎细胞较多应用的玻璃化冻存方法。首先冰浴预冷冻存液，细胞离心管置于冰水浴操作，沿离心管壁缓加冻存液，细胞终浓度为1×1061.5×106，吹吸匀。分装于冻存管中，火焰封口，将冻存管直接投入液氮罐保存，降温速度约为600℃/min，进行细胞冻存。
实施例2参考实施例1的方法，具体操作如下取人脐带血约100ml，以枸橼酸-枸橼酸钠(简称ACD)和葡萄糖(简称CB)的PBS缓冲溶液稀释，得到脐带血的稀释液，缓冲溶液中ACD∶CB＝1∶6，CB∶PBS＝1∶4。
人脐带血稀释液用Ficoll(Sigma公司产品)分层，Ficoll∶CB＝3∶7，4℃ 800g离心30分钟。收集界面层后，在4℃ 500g离心20分钟，弃上清。沉淀物用红细胞裂解液4℃下裂解10分钟。用PBS缓冲液洗涤细胞，300g离心20分钟，采用流式细胞仪分选干细胞，细胞计数，FASC检测，调整细胞至4×107，得到脐带血的单核细胞(MNC)。
采用MNC∶Dynabeads M-450 CD34∶Detachabead CD34＝4×108∶4×107∶4×107＝1ml∶100μl∶100μl。Dynabeads M-450 CD34洗涤，置于磁板(MPC)1分钟，弃清液，PBS缓冲液洗涤2次。混合磁珠(MACS，Miltenyi公司产品)和脐带血的单核细胞的CD34溶液，4℃微旋孵育30分钟，阳性筛选CD34+细胞。
玫瑰花环状细胞—磁珠重新悬起，置于磁板(MPC)2分钟，弃清液，重复3次，得玫瑰花环状细胞—磁珠，悬于100μl PBS缓冲液。Detachabead CD34解离细胞，微旋孵育45分钟，加2ml PBS缓冲液，混匀，置于磁板(MPC)2分钟，收集细胞清液，重复3次，汇集细胞清液，置于MPC 2分钟，除去残留磁珠，将细胞清液移入锥形试管。离心、洗涤2次，细胞计数，流式细胞仪FACS检测。
实施例3同实施例1，不同之处在于采用10周猪胚胎脊髓为原料，得到猪脊髓干细胞。
实施例4同实施例2，不同之处在于采用牛脐带血为原料，得到牛脐带血干细胞。
实施例5本实施例涉及软骨来源的间充质干细胞的制备15周胚胎进行常规的无菌消毒，充分暴露四肢的关节软骨后将其切取，去除关节软骨表面的软骨膜等成分，用PBS反复冲洗干净，用剪刀剪切软骨至不大于1立方厘米大小，37℃水浴中按照软骨与胰蛋白酶1∶5的比例，用0.25％胰蛋白酶消化30分钟，去胰蛋白酶后，按照软骨与胰蛋白酶1∶5的比例加入含有血清的0.2％II型胶原蛋白酶酶，37℃水浴中搅拌消化90分钟后，过筛，用冷的hanks缓冲溶液充分洗涤5次，至细胞沉淀明显，种于75cm2培养瓶中，培养基为10ml IMDM(Hyclone公司产品，ISCOVE’S MODIFIED DUIBECLO’S MEDIUM的缩写)+1ml 10％胎牛血清+2.5umol/L两性霉素B+双抗(100μg/ml青霉素+100μ/ml链霉素)。当细胞长至80％～90％融合时，按照1∶3的比例加入0.25％胰酶-1mmol/L EDTA常规消化，以1∶3(1瓶传3代)比例传代，液氮冻存。
经流式细胞仪鉴定细胞表面抗原发现，本发明的间充质干细胞CD45(-)，CD44(+)(-)，参见图4；CD117(-)，CD147(+)，参见图5；CD34(-)，CD147(+)，参见图6；(-)为表面抗原阴性，(+)为表面抗原阳性。
本发明首次从软骨中提取到表面标志与文献报道的骨髓来源的间充质干细胞表面标志基本一致的细胞群，并证明从软骨中分离的细胞群不仅具有成脂、成骨的向中胚层分化的能力，而且具有成神经转化的向外胚层分化的能力。与目前文献报道的其他来源的间充质干细胞相比，从软骨中分离的细胞群具有细胞成分单一、纯化的特点，便于研究及建立细胞系。
实施例6同实施例5，不同之处在于采用家兔妊娠中期胚胎四肢软骨制备间充质干细胞。
实验例1干细胞活性的鉴定方法如下MTT法测定干细胞增殖将实施例1-4的干细胞细胞浓度分别调至1×106，以无血清培养基分别制备上述实施例的单细胞悬液，按每孔1×104个细胞接种于96孔培养中，每孔体积为200μl，培养3天，接种细胞。每孔加入MTT溶液20μl(5mg/ml)，孵育4小时。1000转/分，离心5分钟。弃培养板孔内上清。每孔加入150μl二甲基亚砜，震荡15分钟。酶联免役检测仪测定0D570，实施例1-4的实验结果都表明干细胞出现明显增殖，说明所制备的干细胞具有活性。
实验例2本实验例涉及干细胞向肝细胞转化活性的鉴定采用免疫组化法检查干细胞是否向肝细胞转化取细胞涂片，丙酮固定10分钟。加稀释一抗(白蛋白1∶50；CK81∶10)，37℃下放置40分钟，PBS缓冲液洗3次，每次3分钟。加FITC标记的二抗(1∶50稀释)，37℃条件下保存40分钟。PBS洗3次每次3分钟。缓冲甘油封片，荧光显微镜下检查。实验结果表明人干细胞增殖及向肝细胞转化。
实验例3本实验例涉及脐带血来源的干细胞对于肝脏损伤的修复。
裸鼠肝损伤模型造膜以40％CCl4橄榄油，0.3ml/100g，2次/周，皮下注射，6周制成肝纤维化模型。免疫磁珠阳性筛选获得实验所需脐带血CD34+细胞，并建立细胞药物筛选平台。
依实验分组情况进行实验，CD34+细胞用Hoechest33342、PKH26双标，尾静脉注射促肝细胞生长因子(市售产品)，首次因子剂量加倍，以后每天皮下注射追加促肝细胞生长因子。定期处死动物，取肝、脾，制成冰冻切片、石蜡切片。以紫外荧光显微成像、激光共聚焦细胞仪，进行细胞形态学鉴定。参见图1-3。
以PCR技术进行细胞人源性检测。提取组织中的DNA，用PCR的方法特异性的扩增人Alu序列，用于区分人和鼠的细胞。设立人肝阳性对照、鼠肝阴性对照。PCR步骤1mm3大小的组织块置于EP管中，加25μl 1×TE缓冲液，捣碎组织块，取1μl组织浆置于PCR反应管中，加基因释放剂20μl，振荡10-30秒，加一层石蜡油，置微波炉中加热5-7分钟，置预调至80-90度的扩增仪上，分别按要求加入引物、Mg2+、dNTP、ddH2O、TaqDNA聚合酶，进行反应。反应结束后，进行2％琼脂糖凝胶电泳，观察扩增条带。如果PCR扩增有阳性结果，可进一步通过用人Alu序列的核酸探针进行原位杂交鉴定。CD34+CD38+双标，Confolcal检测进行细胞造血干细胞性质检测。
采用免疫组化方法进行肝性化检测，设立人肝阳性对照、鼠肝阴性对照。免疫组化步骤载玻片酸洗、预处理、石蜡切片处理、冰冻切片处理。染色步骤3％H2O2室温孵育5～10分钟，以消除内源性过氧化物酶活性，蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟。饱和处理内源性生物素，将切片浸入25μg/ml亲和素溶液中15分钟，PBS清洗15分钟后即可染色。蛋白酶消化或抗原修复，具体按要求进行。5-10％正常二抗来源的动物血清封闭(PBS稀释)，室温孵育10分钟，倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗工作液，37度孵育1-2小时或4度过夜。(置湿盒中)PBS冲洗，5分钟3次。滴加适当比例稀释的生物素标记的二抗(1％BSA-PBS稀释)，37度孵育10-30分钟。PBS冲洗，5分钟3次。滴加适当比例稀释的LRP标记的链霉卵白素(PBS稀释)，37度孵育10-30分钟，PBS冲洗，5分钟3次。显色剂显色(DAB或AEC)，自来水充分冲洗，复染(苏木素)，正常羊血清封片，观察。
上述结果表明，所制备的干细胞可以用于治疗、修复病变或失去功能的组织或器官。
权利要求
1.一种干细胞，是以人或其他哺乳动物的胚胎、脐带血、脊髓组织为原料，通过免疫磁珠阳性筛选制备的。
2.根据权利要求1所述的一种干细胞，其制备方法包括如下步骤1)将原料稀释得到稀释液；2)单核细胞的获得；3)免疫磁珠阳性筛选。
3.根据权利要求2所述的一种干细胞，其中步骤1)中的原料稀释为以20ml枸橼酸-枸橼酸钠(简称ACD)和葡萄糖(简称CB)的PBS缓冲溶液稀释脐带血或脊髓块等，得到脐带血或脊髓稀释液；缓冲溶液中ACD∶CB＝1∶6，CB∶PBS＝1∶4；或将人或其他哺乳动物的胚胎匀浆后稀释。
4.根据权利要求2所述的一种干细胞，其中步骤2)中通过下述方法获得单核细胞按照Ficoll∶CB＝3∶7的量用Ficoll将脊髓或胚胎稀释液分层，4℃ 800g离心30分钟，收集界面层后，在4℃ 500g离心20分钟，弃上清，得到脊髓单核细胞收集界面层。
5.根据权利要求4所述的一种干细胞，上还包括采用流式细胞仪分选干细胞。
6.根据权利要求2所述的一种干细胞，其中步骤2)中通过下述方法获得单核细胞按照Ficoll∶CB＝3∶7的量用Ficoll将脐带血稀释液分层，4℃ 800g离心30分钟，收集界面层后，在4℃ 500g离心20分钟，弃上清，将弃上清后的沉淀物用红细胞裂解液4℃下裂解10分钟，用PBS缓冲液洗涤细胞，300g离心20分钟，采用流式细胞仪分选干细胞，得到脐带血的单核细胞(MNC)。
7.根据权利要求2所述的一种干细胞，步骤3)中的免疫磁珠阳性筛选为Dynabeads M-450 CD34洗涤，置于磁板(MPC)1分钟，弃清液，PBS缓冲液洗涤2次，混合磁珠(MACS，Miltenyi公司产品)和脐带血的单核细胞的CD34溶液，4℃微旋孵育30分钟，阳性筛选CD34+细胞；玫瑰花环状细胞一磁珠重新悬起，置于磁板(MPC)2分钟，弃清液，重复3次，得玫瑰花环状细胞—磁珠，悬于100μl PBS缓冲液；Detachabead CD34解离细胞，微旋孵育45分钟，加2ml PBS缓冲液，混匀，置于磁板(MPC)2分钟，收集细胞清液，重复3次，汇集细胞清液，置于MPC 2分钟，除去残留磁珠，将细胞清液移入锥形试管；离心、洗涤2次，细胞计数，流式细胞仪FACS检测。其中MNC∶Dynabeads M-450 CD34∶Detachabead CD34＝4×108∶4×107∶4×107＝1ml∶100μl∶100μl；
8.一种干细胞，通过下述方法制备取人或其他哺乳动物的软骨，通过胰蛋白酶、胶原蛋白酶消化、在培养基中培养，传代，得到的间充质干细胞。
9.根据权利要求8所述的一种干细胞，通过下述方法制备胚胎进行常规的无菌消毒，充分暴露四肢的关节软骨后将其切取，去除关节软骨表面的软骨膜等成分，用PBS反复冲洗干净，用剪刀剪切软骨至不大于1立方厘米大小，37℃水浴中按照软骨与胰蛋白酶1∶5的比例，用0.25％胰蛋白酶消化30分钟，去胰蛋白酶后，按照软骨与胰蛋白酶1∶5的比例加入含有血清的0.2％II型胶原蛋白酶酶，37℃水浴中搅拌消化90分钟后，过筛，用冷的hanks缓冲溶液充分洗涤5次，至细胞沉淀明显，种于75cm2培养瓶中，培养基为10ml IMDM(Hyclone公司产品，ISCOVE’S MODIFIED DUIBECLO’S MEDIUM的缩写)+1ml 10％胎牛血清+2.5umol/L两性霉素B+双抗(100μg/ml青霉素+100μ/ml链霉素)；当细胞长至80％～90％融合时，按照1∶3的比例加入0.25％胰酶-1mmol/L EDTA常规消化，以1∶3(1瓶传3代)比例传代，液氮冻存。
全文摘要
本发明涉及一种来源于人类胚胎、脐带血、脊髓的干细胞、其制备方法及其在治疗、修复失去功能的器官或病变组织中的应用，通过免疫磁珠阳性筛选制备干细胞，经MNC细胞获取、CD34抗体标记、流式细胞仪分选及细胞接种分离干细胞，以MTT法测定干细胞增殖，免疫组化法检查干细胞是否向肝细胞转化。所制备的干细胞经诱导可定向转化，用于治疗、修复失去功能的器官或病变组织、各种疾病以及进行细胞药物的筛选。
文档编号C12N5/0786GK1397640SQ02123638
公开日2003年2月19日 申请日期2002年7月2日 优先权日2001年7月2日
发明者韩梅, 王宁, 李凌松 申请人:北京北医基因科技投资有限公司