专利名称：一种生物晶片的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种生物晶片的制备方法；特别是，涉及采用微注射方式制造的生物晶片的制备方法。
背景技术：
生物晶片是二十世纪末生物科技上一项突破性的发明，对于生物科技产业的发展可媲美当年亨利福特所组织的汽车生产线对汽车工业的大革命，或是类似半导体对于电脑工业的革命性发展。广义来说，生物晶片是指在玻璃(glass)、硅片(slica)、塑料(plastic)或硝化纤维(nitrocellulose)等材质上，利用微电子、微机械、光电、自动化等工业技术来制成应用于生物化学分析的产品，其作用对象可以为基因、蛋白质或细胞组织等。生物晶片技术的主要特点是分析可信度及精确度高、分析速度快，所使用的样品及试剂少，可同时处理大量样品，并获得整体性且平行化的实验数据。
总体来说，生物晶片研究在国际上仍属于初期发展阶段，但已有许多重大成果。目前生物晶片的种类有微阵列(microarray)、DNA晶片(DNAchip)、蛋白质/抗体晶片(protein/antibody chip)、组织晶片(tissue chip)及实验室晶片(lab-on-a-chip)等，其中以微阵列(microarray)及DNA晶片(DNA chip)发展较为成熟。而生物晶片的用途十分广泛，包括基因测序、毒理学分析、疾病基因表现、单一核糖核酸多形性检定、法医学上的应用、药物的筛选及生化武器的侦测等，由此可见生物晶片必定是未来产业界竞相争食的大饼。但是，如何掌握竞争优势则取决于如何以较低成本制备出高密度的生物晶片。
生物晶片依探针(probe)制备的方式不同可分为三种，第一种是Affymetrix公司研发出的光蚀刻法(photolithography)与化学合成法相结合的光引导原位合成法(light-directed synthesis)。第二种是史丹福大学所使用的接触式点样法(pin)，是利用预先合成好的DNA、RNA或蛋白质以机器手臂快速、高密度地固定到基质上。第三种为微注射法(micro-injection method)，如Rosetta Inpharmatics公司利用微注射(micro-injection)方式去制备互补核苷酸。最后资料的判读方式是将欲检测的样品与晶片进行杂交作用(hybridization)，之后再以样品中标的物(target)上的标记(label)，例如萤光、放射物质或酵素呈色等方式进行电脑扫描以及资料分析。
目前制作生物晶片常见的方法可能是(a)利用微阵列点制机将合成的探针溶液藉由精密的定位机构布植到晶片上，或是(b)利用光学蚀刻的技术进行核苷酸光直接原位合成法(light-directed in-situ synthesis)。其中，点制机中输送探针溶液的机械结构可分为接触式的针头(pin)与非接触式的微注射器(micro-injector)。接触式的针头(pin)成本低，但液滴较大，阵列密度较低(每一点约150～200μm)，且易破坏晶片表面；而非接触式的微注射器(micro-injector)不会破坏晶片表面，液滴较小，阵列密度较高(每一点约50～150μm)。
例如，以源自光学蚀刻的技术在玻璃表面进行光直接原位DNA合成法的方式，可以在面积1.6cm2的玻璃上制备种类多达40万种核酸探针的高密度微阵列。虽然是目前最领先的技术，但受限于光化学反应率依核酸探针长度增加而递减的速度太快且光罩成本昂贵，所以未能普及。因此，目前常用的方法为点针式(pin)及微注射法(micro-injection method)，其中微注射法又分为压电式微注射法及热气泡式微注射法。例如Protogene公司利用压电式微注射技术(piezo micro-injection，U.S.Pat.No.5985551；6,177,558 B1)在晶片表面进行DNA原位合成(DNA in-situ synthesis)，成本较低，但密度仅约为10～104spots/cm2。
上述所提及的不论是光蚀刻法、点针法或压电法都有其缺点，因此就生物晶片的制备而言，如何制备出品质好、解析度够及价格便宜的生物晶片将是主要的致胜因素。以微注射方式制备生物晶片需注意探针液滴彼此间的污染。为了克服污染问题，美国专利第5,552,270号已揭露用聚丙烯酰胺胶体(polyacrylamide)做成许多小隔间，其胶体的厚度为30μm，可防止探针溶液的相互污染，且可增加探针溶液固定的量，但是缺点是制程麻烦、花费高且因水分易蒸发所以需储存在非挥发性的油中，因此，使用之前需再以氯仿(chloroform)或乙醇(ethanol)洗净，整体而言使用并不方便。另外，也可以利用半导体蚀刻的方式在硅片(silicon)上蚀刻成许多小槽室来防止探针溶液间的污染，但是此法制程麻烦且花费高昂。上述现有技术的缺点即是本发明所欲解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种简单且便宜的生物晶片的制备方法，其包括下列步骤以微注射方式将一疏水性物质喷洒于一基材上；于该基材表面形成一疏水性区，并由该疏水性区区隔出复数个小隔间；以及以微注射方式将一探针固定于该小隔间上。本发明方法不但可防止探针液滴间彼此的干扰现象，还可增加探针密度及晶片的解析度。因此，本发明方法可制备出高密度、液滴小、解析力佳且成本低的生物晶片。
图1A至图1B为显示本发明以微注射器将疏水性物质喷洒于基材上的示意图。图1A显示利用微注射器可以垂直方向喷洒疏水性物质至基材表面；图1B显示利用微注射器可以水平方向喷洒疏水性物质至基材表面。
图2A至图2B显示本发明利用微注射器喷洒疏水性物质至基材表面后，在基材表面形成小隔间的可能形状。图2A显示方形的小隔间；图2B显示圆形的小隔间。
图3显示本发明的基材表面上疏水性物质的分布以及探针液滴覆盖情形的剖面图。
图4A至图4D显示本发明以疏水性物质区隔出的小隔间后，固定核酸探针至基材的示意图。图4A显示以微注射器将带有保护基的核苷酸溶液滴入不同的小隔间(亲水性区)；图4B显示以酸性溶液将保护基去除；图4C显示以微注射器将第2层带有保护基的核苷酸溶液滴入不同的小隔间(亲水性区)；以及图4D显示制备完成的生物晶片。
图5是本发明最佳实施例所采用的热气泡式微注射器的构造图。
图6A-图6D是图5的微注射器的操作示意图，图6A为微注射器的横截面图，图6B为形成第一气泡的情形，图6C为接着形成第二气泡，使二气泡结合而挤出液滴的情形，图6D为两气泡消失使多余液体流回液体槽的情形。
具体实施例方式
本发明提供一种生物晶片的制备方法，首先以微注射方式将一疏水性物质喷洒于一基材上，于该基材表面形成一疏水性区，并由该疏水性物质区隔出复数个小隔间。接着，再以微注射方式将一探针固定于每一小隔间中。
通常可用来作为生物晶片基材的材料可以是疏水性基材或亲水性基材。疏水性基材包括但不限于下列物质--玻璃、硅片、塑胶、尼龙膜、树酯、石英、陶瓷、以及金属材质。亲水性基材则多为聚合物，包括如聚苯乙烯(polystyrene)、聚酯(polyester)、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚氯乙烯(polyvinylchloride)、聚乙烯(polyethylene)、聚丙烯(polypropylene)、聚砜(polysulfone)、聚氨基甲酸酯(polyurethane)或聚基丙烯酸甲酯(PMMA)等材料，但不限于此处所列举者。
若采用疏水性基材，则当喷洒完疏水性物质后，疏水性物质形成的疏水性区所区隔出的小隔间表面，必需先处理成具有亲水性官能团才能与探针结合。此处所指的亲水性官能团可以为胺基(-NH2)、羧基(-COOH)、硫羟基(-SH)、环氧基(epoxide)、醛基(aldehyde)或是抗生蛋白链菌素(Streptavidin)等。
若是采用亲水性基材，则需先将表面处理成疏水性，然后才能喷洒疏水性物质，以形成疏水性区。之后，需再将小隔间处理成亲水性，才能与探针结合。基材表面修饰方法可参考下述论文Souther，Chem.abst.113；152979r(1990)和Anal.Biochem.157；283(1986)，在此不再赘述。
本发明的微注射方式是采用一微注射器(micro-injector)，以垂直、水平或任意方向，单向或双向来回喷洒，如图1A及图1B所显示。所采用的微注射器包含热气泡式微注射器以及压电式微注射器。所采用的热气泡式微注射器包括一槽室，用以放置液体；一微注射孔，位于槽室上，可使槽室中的液体流出；以及一第一加热器与一第二加热器，分别排列于该微注射孔的两侧。当槽室装满液体时，第一加热器会产生第一气泡，接着，第二加热器会产生第二气泡，利用两气泡将液体切断喷出，并且第一加热器与第二加热器是由一共同讯号所驱动。此外，第一气泡的产生是作为一阀门，限制该槽室中的液体流出，下文将详细说明。
本发明以微注射方式喷洒的疏水性物质包括，但不限于，聚四氟乙烯(Teflon)、聚酰亚胺(polyimide)、含硅及含氟泼水剂、以及含氟及含硅化合物等。当将疏水性物质喷洒至基材上后，疏水性物质会在基材表面形成疏水区，由疏水区区隔出复数个小隔间，小隔间可以为方形、圆形或任意几何图形，如图2A与图2B所示。小隔间大小范围可以为20～200μm，疏水性物质的厚度范围可以为1～30μm，宽度范围可以为5～100μm。
如图3所示，欲固定于基材表面上的探针是以液滴的形式由微注射器喷洒出来，覆盖在小隔间(亲水性区)中。微注射器中装有探针溶液，该探针溶液可以是脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、核苷酸(Nucleotides)、寡核苷酸(Oligonucleotides)、蛋白质(Protein)、抗体(Antibodies)或肽(Peptides)等，但不限于以上列举者。上述探针固定于小隔间的方法是经由一官能团结合的方式达成，而官能团结合方式包括吸附(adsorption)法、共价结合法(covalent binding)、包覆法(encapsulation)、交联法(cross-linking)及包埋法(entrapment)等，但不限于上述方法。通常探针溶液若为DNA、RNA或核苷酸时，必须先经过一些化学修饰使得其与基材表面上的官能团结合更紧密，例如修饰成膦酸盐(phosphonate)、膦酸氢盐(hydrogen phosphonate)、亚膦酰胺(phosphonamidite)、亚磷酰胺(phosphoramidite)、亚磷酸盐(phosphite)或甲基亚膦酰胺(methylphosphonamidite)类化合物，若是制备寡核苷酸微阵列(oligonucleotide microarray)的话，在核苷酸的5′或3′端必须接上保护基以防止同一层的核苷酸结合在一起。
要产生液滴小的微阵列生物晶片，其中核苷酸溶液本身的表面张力、粘度及微注射孔的大小是主要决定因子，通常一般液滴大小约为25～250μm。
若是以热气泡式微注射器来制备核苷酸微阵列的话，则必须更考虑到核苷酸溶液中溶剂的选择以及溶剂的粘度。一般来说，液滴愈小则愈容易挥发，因此，通常所使用的溶剂中必须至少含有一种高沸点溶剂，例如沸点大于140℃的溶剂，来防止核酸溶液的挥发。所选择的溶剂以极性非质子溶剂较为适合，常用的有如双腈类(dinitriles)、单腈类(mononitriles)、甘醇二甲醚类(glymes)、双甘醇二甲醚类(diglymes)、三甘醇二甲醚类(triglymes)、三甲基磷酸酯(trimethylphosphates)、二甲基甲酰胺(dimethylformamides，DMF)和N-甲基吡咯烷酮(N-methyl pyrrolidinone，NMP)等。
于制备寡核苷酸微阵列(oligonucleotide microarray)晶片时，利用微注射器将各个受保护的核苷酸(protected nucleotides)有如堆积木的方式依序地固定于基材上，在核苷酸上接的保护基是用来预防每一层的核苷酸彼此重叠在一起。当第一层的核苷酸溶液固定上去之后，利用酸性溶液将核苷酸上的保护基去除，然后再固定上第二层的核苷酸，以此类推可快速地制备出所要的生物晶片，此种方法在核苷酸探针的设计上较有弹性。若是制备DNA、RNA或蛋白质晶片时，则直接将已合成好的脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或蛋白质直接喷洒于基材的小隔间中。而制备肽(peptides)晶片时则如同核苷酸微阵列方式将肽一个一个接上去。
最后将欲检测的样品与上述制备好的生物晶片进行杂交作用(hybridization)，之后再由样品中标的物(target)上的标记(label)进行不同反应，例如萤光、放射物质、酵素呈色等方式，进行电脑扫描以及资料分析。
实施例以下将以实施例具体说明本发明，然本发明的范畴并不限于实施例所示的范围。
实施例1第一种以热气泡式微注射器进行批次式寡核苷酸微阵列(oligonucleotide microarray)的制备方法。
1.以微注射器的玻璃表面形成小隔间以玻璃为基材，先在玻璃表面以含有疏水性物质，如特氟隆(Teflon)的热气泡式微注射器直接、规律地喷洒疏水性物质，以形成疏水性物质区隔而出的方形小隔间，如图2A所示。其中隔间的宽度范围约为50μm，而疏水性物质喷洒的厚度为2μm，宽度为5μm。
2.于小隔间中进行亲水性处理在疏水性区隔出的方形小隔间中，以含有辛基三氯硅烷(octyltrichlorosilane)的微注射器，进行硅烷化(silanization)处理，使小隔间区域成为亲水性区，其表面具有硫羟基(-SH)得以与核苷酸探针结合，详细方法如美国专利第6,159,695号，可以形成一永久性的硫醚键或是一化学选择可逆性的双硫键至亲水性区表面的硫羟键。
3.使寡核苷酸结合于微阵列片上将含有四唑(tetrazole)活化剂的二甲氧基三苄基核苷酸磷酰胺酸溶液(DMTr-nucleotide phosphoramidite)以微注射器喷洒于已硅烷化处理的亲水性区上，第一层核苷酸会与亲水性区上的硫羟基(-SH)结合。然后利用酸性溶液，如三氯醋酸(trichloroacetic acid)或盐酸(HCl)溶液将保护基去除，再喷洒第二层核苷酸。以上述程序依次接上各个核苷酸，最后可得到寡核苷酸微阵列(oligonucleotide microarray)，详细的步骤可参考美国专利第6,184,347B1号、第5,985,551号，在此不再赘述。
4.以得到的寡核苷酸微阵列进行杂交反应(hybridization)最后将欲检测的目标核苷酸序列(target)与上述的寡核苷酸微阵列进行杂交反应，然后藉由目标核苷酸(target)上的标记(Label)，即可得知目标核苷酸(target)的序列是什么，详细做法可参考美国专利第5,985,551号。
实施例2第二种批次式寡核苷酸微阵列的制备方法。
寡核苷酸微阵列(oligonucleotide microarray)的隔间形状亦可以为圆形，如图2B所示。可直接以微注射器喷洒疏水性物质形成圆形的隔间。或是先做一相对应的圆形板罩在基材上，然后以微注射器喷洒疏水性物质，随后拿掉圆形板，最后可得到圆形的隔间。其中圆形板材料以亲水性物质为佳，例如尼龙膜等。之后的制备过程与实施例1相同。
实施例3以压电式微注射器进行蛋白质晶片(Protein chip)的制备方法。
1.以微注射器在玻璃表面形成疏水性隔间以玻璃为基材，先在玻璃表面以含有疏水性物质，如聚酰亚胺(polyimide)，的压电式微注射器直接、规律地喷洒疏水性物质，用以形成方形疏水性隔间，如图2A所示，其中隔间的宽度范围约为50μm，而疏水性物质喷洒的厚度为2μm，宽度为5μm。
2.使蛋白质结合于微阵列片上以辛基三氯硅烷(octyltrichlorosilane)，使疏水性物质所隔出的方形小隔间表面修饰成具有硫羟基(-SH)，使得蛋白质探针可以结合于其上。蛋白质探针与基材的结合方法可参考美国专利第6,225,047 B1号，在此不再赘述。
3.以蛋白质晶片进行检测标的蛋白的试验当上述蛋白质晶片制备好之后，将蛋白质样品(sample)加入晶片上的小隔间中，藉由样品上的萤光标的物(Cy3，Cy5)可得知样品中含有何种蛋白质。
虽然本发明已以较佳实施例进行描述，然其并非用以限定本发明，本领域的普通技术人员熟悉此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围下，可作各种的更动与修饰，因此本发明的保护范围以权利要求书的范围为准。
为了让本发明的上述和其他目的、特征、以及优点能更明显易懂，下文通过优选实施例并结合所附图示，作详细说明如下符号的说明图1-4D的符号10～微注射器；12～疏水性物质；14～微注射器移动方向；16～基材；18～疏水性区；20～小隔间；21～亲水性区；22～核酸液滴；24～带有保护基的核苷酸液滴；26～保护基；28～酸性溶液；图5-6D的符号1～喷墨孔；2～第一加热器；3～第二加热器；4～电极；5～槽室；6～微管道；7～液体；8～晶圆片；a～第一气泡；b～第二气泡；P～气泡扩大方向；F～液滴喷出方向。
权利要求
1.一种生物晶片的制备方法，包括下列步骤(a)提供一基材；(b)以微注射方式将一疏水性物质喷洒于该基材上，于该基材表面形成一疏水性区，并由该疏水性区区隔出复数个小隔间；以及(c)以微注射方式将一探针固定于该小隔间。
2.如权利要求1所述的生物晶片的制备方法，其中该疏水性物质包括聚四氟乙烯(Teflon)、聚酰亚胺(polyimide)、含硅及含氟泼水剂、以及含氟或含硅化合物。
3.如权利要求1所述的生物晶片的制备方法，其中该微注射方式是采用一微注射器，以垂直、水平和任意方向，单向或双向喷洒。
4.如权利要求3所述的生物晶片的制备方法，其中该微注射器包含热气泡式微注射器或压电式微注射器。
5.如权利要求1所述的生物晶片的制备方法，其中该基材为一疏水性基材，其由下列任一材料组成玻璃、硅晶片、石英、云母、陶瓷材料或金属材质。
6.如权利要求5所述的生物晶片的制备方法，在步骤(b)之后，还包含步骤(d)，将每一小隔间内进行一亲水性处理，使每一小隔间的表面具有一亲水性官能团。
7.如权利要求6所述的生物晶片的制备方法，其中该亲水性官能团包括胺基(-NH2)、羧基(-COOH)、硫羟基(-SH)或是抗生蛋白链菌素(Streptavidin)。
8.如权利要求1所述的生物晶片的制备方法，其中该基材为一亲水性基材，其由下列任一材料组成聚苯乙烯、聚酯、聚碳酸盐、聚氯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚砜、聚氨基甲酸酯或聚甲烯顺丁烯二酸酐。
9.如权利要求8所述的生物晶片的制备方法，还包含下列步骤(e)于步骤(a)之后，在该亲水性基板表面进行一疏水性处理，使该基材表面处理成疏水性的；以及(f)于步骤(b)之后，于每一小隔间内进行一亲水性处理，使每一小隔间表面具有一亲水性官能团。
10.如权利要求9所述的生物晶片的制备方法，其中该亲水性官能团包括胺基(-NH2)、羧基(-COOH)、硫羟基(-SH)或是抗生蛋白链菌素(Streptavidin)。
11.如权利要求1所述的生物晶片的制备方法，其中该小隔间的形状包括方形、圆形或其他几何图形。
12.如权利要求1所述的生物晶片的制备方法，其中该探针包括脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、核苷酸(Nucleotides)、寡核苷酸(Oligonucleotides)、蛋白质(Protein)、抗体(Antibodies)或肽(Peptides)。
13.如权利要求1所述的生物晶片的制备方法，其中该探针固定于该小隔间是经由一官能团结合方式。
14.如权利要求13所述的生物晶片的制备方法，其中该官能团结合方式包括吸附(absorption)法、共价结合法(covalent binding)、包覆法(encapsulation)、交联法(cross-linking)或包埋法(entrapment)。
15.如权利要求1所述的生物晶片的制备方法，其中该微注射方式是应用一热气泡式微注射器，该热气泡式微注射器包括一槽室，用以放置液体；一微注射孔，位于槽室上，可使槽室中的液体流出；以及一第一加热器与一第二加热器，分别排列于该微注射孔的两侧；当该槽室装满液体时，该第一加热器会产生一第一气泡，该第二加热器会产生一第二气泡，利用两气泡将液体切断喷出。
16.如权利要求15所述的生物晶片的制备方法，其中该第一加热器与该第二加热器是由一共同讯号所驱动。
17.如权利要求15所述的生物晶片的制备方法，其中第一气泡的产生是作为一阀门，限制该槽室中的液体流出。
18.一种生物晶片，其包括(i)一基材；(ii)一疏水性区与复数个疏水性区所区隔出的小隔间，位于基材上，其中该疏水性区是由微注射方式喷洒一疏水性物质所形成；以及(iii)一探针，是以微注射方式固定于该小隔间上。
19.如权利要求18所述的生物晶片，其中该基材为一疏水性基材，其由下列任一材料组成玻璃、硅晶片、石英、云母、陶瓷材料或金属材质。
20.如权利要求19所述的生物晶片，其中每一小隔间内的疏水性基材表面，经过一亲水性处理后，该基材表面具有一亲水性官能团。
21.如权利要求20所述的生物晶片，其中该亲水性官能团包括胺基(-NH2)、羧基(-COOH)、硫羟基(-SH)或是抗生蛋白链菌素(Streptavidin)。
22.如权利要求21所述的生物晶片，其中该基材为一亲水性基材，可由下列任一材料组成聚苯乙烯、聚酯、聚碳酸盐、聚氯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚砜、聚氨基甲酸酯或聚甲烯顺丁烯二酸酐。
23.如权利要求20所述的生物晶片，其中形成该复数个小隔间之前，于该亲水性基板上还进行一疏水性前处理，使该基材表面处理成疏水性的。
24.如权利要求23所述的生物晶片，其中于该小隔间形成后，还进行一亲水性处理，使该小隔间表面具有一亲水性官能团。
25.如权利要求24所述的生物晶片，其中该亲水性官能团包括胺基(-NH2)、羧基(-COOH)、硫羟基(-SH)或是抗生蛋白链菌素(Streptavidin)。
26.如权利要求18所述的生物晶片，其中该疏水性物质包括聚四氟乙烯(Teflon)、聚酰亚胺(polyimide)、含硅及含氟泼水剂、或是含氟及含硅化合物。
27.如权利要求1 8所述的生物晶片，其中该探针包括脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、核苷酸(Nucleotides)、寡核苷酸(Oligonucleotides)、蛋白质(Protein)、抗体(Antibodies)或肽(Peptides)。
28.如权利要求18所述的生物晶片，其中该探针是以下列方式的一种固定于该小隔间上吸附(absorption)法、共价结合法(covalent binding)、包覆法(encapsulation)、交联法(cross-linking)或包埋法(entrapment)。
全文摘要
本发明提供一种生物晶片的制备方法，包括下列步骤以微注射方式将一疏水性物质喷洒于一基材上，于该基材表面形成一疏水性区，并由该疏水性区区隔出复数个小隔间；以及以微注射方式将一探针固定于该小隔间上。
文档编号C12Q1/68GK1472340SQ0212733
公开日2004年2月4日 申请日期2002年8月2日 优先权日2002年8月2日
发明者林郁庭, 沈昱璋, 佘怡璇 申请人:明基电通股份有限公司