专利名称：一种用农杆菌介导对兰花进行基因转化的方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域中进行基因转化的方法，特别是对兰花进行基因转化的方法。
兰花育种是兰花产业技术的制高点，也是影响该产业发展的重要因素。不断推出新品种是加速和保证该产业持续发展的重要因素。但是由于兰花生长缓慢，生活周期长，种子成熟所需时间长，发芽率极低，且成苗非常困难，因此应用传统的杂交育种方法很难获得预期的新品种。基因转化技术是一种非常有效、快速的获得新品种的方法。目前，应用基因工程方法得到的许多农作物已进入大规模商品化生产，如抗棉铃虫的基因工程棉花、抗虫玉米和抗除草剂的大豆在美国和加拿大已分别占种植面积的40％、30％和60％。花卉基因工程育种已经开始，并逐渐成为该领域的一个研究热点。本发明的发明人已将花色相关基因CHS转入矮牵牛中，得到了花色改变的转基因矮牵牛新品种。
基因工程育种与常规育种相比有着省时省力和目标性强的优点。利用转基因技术来改善兰花品质，获得抗病、抗逆、提前开花、花色、花型改变的兰花新品种将具有巨大的商业优势和广阔的市场前景。所以利用现代基因工程技术提高兰花品质显得很有必要。但是，目前在兰花转化上进展较为缓慢，国际上只在6个属的兰花转化上有过报道。Kuehnle和Sugii(1992)应用微弹轰击法将卡那霉素抗性基因(NPT II)和番木瓜环斑病毒(PRV)外壳蛋白基因转入石斛兰杂交种(Dendrobium x JaquelynThomas)得到了转基因兰花，但转化效率不高，而且由于兰花对卡那霉素不敏感，不能有效抑制未转入基因的植株，易产生嵌合体。Chia等(1994)通过微弹轰击法将萤火虫荧光素酶基因(Luc)转入石斛兰(White Angel)，并利用Luc基因作为筛选标记，得到了转基因植株。但此法所需设备昂贵，且费时费力。Anzai等(1996)利用微弹轰击法成功转化了蝴蝶兰，但转化率和再生率都较低。Yang等(1999)利用微弹轰击法将NPT II基因和GUS基因转入兰属兰花(Cymbidium orchid)，得到了转基因植株。Yu等(2000)应用微弹轰击法转化石斛兰杂交种，用潮霉素抗性基因(HPT)作筛选标记，得到了转基因兰花，转化效率有所提高，约为5-10％。Knapp等(2000)应用基因枪法对三个属的兰花进行了转化卡特兰属(Cattleya)；长萼兰属(Brassia)和一个杂交属Doritaenopsis(Doritis x Phalaenopsis)，利用除草剂抗性基因(bar)作为筛选标记，得到了转基因植株。Belarmino和Mii(2000)应用农杆菌介导的转化方法成功转化了蝴蝶兰(Doritaenopsis Coral x FantasyPhalaenopsis(Baby Hat x Ann Jessica))。他们将含有GUS基因和潮霉素抗性基因(HPT)的农杆菌LBA4404和EHA105与蝴蝶兰悬浮细胞共培养后，用50mg/L潮霉素筛选，7个月后得到了转基因植株，但转化效率较低。
目前所进行的兰花转化，效率都不是很高，采用的方法大多是微弹轰击法，受体材料多用原球茎(protocome)或类原球茎体(protocome like body，PLB)，由于从原球茎能直接出苗，不经过愈伤或从头开始的胚胎发生阶段，因而不能有效去除未转化的细胞，易产生嵌合体。而唯一采用农杆菌介导的转化方法的报道，受体材料又采用的是悬浮细胞，利用悬浮细胞作为受体材料，虽然可以避免产生嵌合体，但操作烦琐。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案一种用农杆菌介导对兰花进行基因转化的方法，是将兰花愈伤组织与携带外源基因片段的农杆菌共培养，将供体的外源基因片段转移到受体基因组中。
所述农杆菌应先在液体LB培养基中，28℃振荡培养至对数生长期，然后涂布于固体AB培养基，28℃培养2-3天后将菌刮下来收集到无菌水中，兰花愈伤组织在其中浸泡半个小时后，取出用无菌滤纸吸干，接入共培养培养基，共培养2天后，转入筛选培养基(所述筛选培养基中含有30mg/L潮霉素和250mg/L的头孢霉素)。得到抗性愈伤组织后转接入分化培养基，诱导出苗和生根，从而得到转基因兰花植株。
侵染时农杆菌的浓度为OD600≈0.8-1，为提高转化效率，所述AB培养基、无菌水菌液及共培养培养基中还加入了浓度为100μmol/L的乙酰丁香酮诱导物。
本发明巧妙地以兰花愈伤组织为受体材料，通过农杆菌介导实现兰花基因的转化，即避免了嵌合体的产生，又易于操作，不需要涉及昂贵的仪器，转化效率达到20％以上，为利用转基因技术来改善兰花品质，获得抗病、抗逆、提前开花、花色、花型改变的兰花新品种奠定了良好的基础。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
具体操作步骤如下1、将质粒pCAMBIA1301转化入农杆菌菌株LBA4404中(农杆菌的菌株也可以是AGL-1等其它的菌株)；2、挑取含有pCAMBIA1301质粒的农杆菌在液体LB培养基中，28℃振荡培养至对数生长期，取菌液涂布于含有100μmol/L乙酰丁香酮的固体AB培养基上，28℃培养2天；3、将菌刮下来收集到含有100μmol/L乙酰丁香酮的无菌水中，使农杆菌的浓度为OD600≈0.8-1；4、将兰花愈伤组织在上述菌液中浸泡半个小时后，取出用无菌滤纸吸干，接入含有100μmol/L乙酰丁香酮的1/2MS培养基，共培养2天；5、将兰花愈伤组织转入含有30mg/L潮霉素和250mg/L头孢霉素的筛选培养基上培养；6、将得到的抗性愈伤组织转接入1/2MS分化培养基，诱导出苗和生根，得到转基因兰花植株。
按上述方法，对供试材料进行了遗传转化，共处理312块愈伤组织，结果得到62块抗性愈伤组织，转化效率达到20％，并已得到了再生苗，组织染色结果表明抗性愈伤及苗有GUS活性。
实施例2、转基因植株的分子检测随机取实施例1中得到的七株转基因植株，用CTAB法提取总DNA，采用地高辛标记的GUS基因片段作探针，进行southern杂交。杂交结果显示，所得到的转基因植株全部为阳性，如图2所示，图中，1.DNA分子量标准(λDNA/HindIII)；2，正对照pCAMBIA1301；3，未转基因的负对照；4--10，分别为转基因植株；其中探针为地高辛标记的GUS基因片段。
权利要求
1.一种用农杆菌介导对兰花进行基因转化的方法，是将兰花愈伤组织与携带外源基因片段的农杆菌共培养，将供体的外源基因片段转移到受体基因组中。
2.根据权利要求1所述的用农杆菌介导对兰花进行基因转化的方法，其特征在于所述农杆菌应先在液体LB培养基中，28℃振荡培养至对数生长期，然后涂布于固体AB培养基，28℃培养2-3天后收集菌体，进行共培养。
3.根据权利要求2所述的用农杆菌介导对兰花进行基因转化的方法，其特征在于所述AB培养基中还加入了乙酰丁香酮。
4.根据权利要求3所述的用农杆菌介导对兰花进行基因转化的方法，其特征在于所述乙酰丁香酮的浓度为100μmol/L。
5.根据权利要求2所述的用农杆菌介导对兰花进行基因转化的方法，其特征在于所述农杆菌在固体AB培养基上培养后收集于无菌水中，农杆菌的浓度为OD600≈0.8-1；所述兰花愈伤组织在该无菌水中浸泡半小时后，接入共培养培养基。
6.根据权利要求5所述的用农杆菌介导对兰花进行基因转化的方法，其特征在于所述无菌水中含有100μmol/L的乙酰丁香酮。
7.根据权利要求1-6中任何一项所述的用农杆菌介导对兰花进行基因转化的方法，其特征在于所述兰花愈伤组织与农杆菌共培养的时间是两天。
8.根据权利要求1-6中任何一项所述的用农杆菌介导对兰花进行基因转化的方法，其特征在于所述共培养培养基中含有100μmol/L乙酰丁香酮。
9.根据权利要求1-6中任何一项所述的用农杆菌介导对兰花进行基因转化的方法，其特征在于所述共培养后将所述兰花愈伤组织转入筛选培养基中培养。
10.根据权利要求9所述的用农杆菌介导转化兰花基因的方法，其特征在于所述筛选培养基中含有30mg/L潮霉素和250mg/L的头孢霉素。
全文摘要
本发明公开了一种用农杆菌介导对兰花进行基因转化的方法，以达到高效、稳定、简便地对兰花进行遗传转化的目的。本发明的技术方案是将兰花愈伤组织与携带外源基因片段的农杆菌共培养，将供体的外源基因片段转移到受体基因组中。所述农杆菌应先在液体LB培养基中，28℃振荡培养至对数生长期，然后涂布于固体AB培养基上培养2－3天后刮下收集到无菌水中，兰花愈伤组织在其中浸泡半个小时后，接入共培养培养基共培养。本发明巧妙地以兰花愈伤组织为受体材料，通过农杆菌介导实现兰花的基因转化，即避免了嵌合体的产生，又易于操作，转化效率达到20％以上。为利用转基因技术来改善兰花品质，获得抗病、抗逆、提前开花、花色、花型改变的兰花新品种奠定了良好的基础。
文档编号C12N1/20GK1475563SQ02128819
公开日2004年2月18日 申请日期2002年8月14日 优先权日2002年8月14日
发明者李毅, 门淑珍, 魏春红, 李 毅 申请人:北京大学