专利名称：棉花几丁质酶及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域中几丁质酶及其编码基因与应用，特别是来源于棉花的几丁质酶及其编码基因与应用。
背景技术：
植物体能启动一系列防御基因以抵抗病原的侵害，其中包括一大类能编码病理(PR)相关蛋白的基因，目前已经证实病理相关蛋白几乎存在于所有的植物体内，其中几丁质酶是一个重要的家族。几丁质酶(EC3.2.1.14)是一种糖苷酶，能够催化几丁质的水解反应。研究发现，几丁质并不存在于高等植物体内，它是很多真菌细胞壁的主要成分。植物在受到病原菌侵害或者其他因素(如乙烯、水杨酸、重金属、伤害等等)的激发后，几丁质酶的水平和活性会大大提高(Collinge，D.B.，Kragh，K.M.，Mikkelsen，J.D.，Nielsen，K.K.，Rasmussen，U.and Vad，K.(1993)Plant J.3，31-40.；Berglund，L.，Brunstedt，J.，Nielsen，K.K.，Chen，Z.，Mikkelsen，J.D.and Marcker，K.A.(1995)Plant Mol.Biol.27，211-216.；Wu，S.，Kriz，A.L.andWidholm，J.M.(1994)Plant Physiol.105，1097-1105.；Cordero，M.J.，Raventós，D.and Segundo，B.S.(1994)MPMI 7，23-31.；Hong，J.K.，Jung，H.W.，Kim，Y.J.and Hwang B.K.(2000)Plant Sci.159，39-49.)。
通常情况下，这种诱导过程会伴随着β-1，3-葡聚糖酶和其他一些病理相关蛋白水平和活性的同时提高，从而激发植物体更有效地进行防御。体外实验已经证明了纯化的几丁质酶能够抑止细胞壁含几丁质的真菌的生长，尤其是与β-1，3-葡聚糖酶协同作用时效果更明显(Melchers，L.S.，Groot，M.A.，van der Knaap，J.A.，Ponsyein，A.S.，Sela-Buurlage，M.B.，Bol，J.F.，Cornelissen，B.J.C.，ven den Elzen，P.J.M.and Linthorst，H.J.M.(1994)Plant J.5，469-480.)。在提高几丁质酶表达量的转基因植物中也证明了几丁质酶的抗病作用(Broglie，K.，Chet，I.，Holliday，M.，Cressman，R.，Biddle，P.，Knowlton，S.，Mauvais，C.J.and Broglie，R.(1991)Science 254，1194-1197.；Zhu，Y.，Maher，E.A.，Masoud，S.，Dixon，R.A.and Lamb，C.J.(1994)Bio/technology 12，807-812.)。
迄今为止在植物中已经发现了很多种几丁质酶，它们在结构、酶活以及细胞定位上都有很大的区别。根据它们氨基酸一级结构的特点，它们被分为六类(如图1中的B部分所示)。Class I几丁质酶N端含一段几丁质结合区(CBD)，紧接着一段富含甘氨酸和脯氨酸的交连区，以及一段催化区。多数class I几丁质酶定位于液泡中。ClassII几丁质酶与class I几丁质酶在序列上有60％的同源性，但缺乏CBD区和交连区，它们通常是酸性几丁质酶，定位在细胞间质中。Class III几丁质酶与class II几丁质酶结构相似，但与class I和class II没有同源性。Class VI类似class I，包含CBD、交连区和催化区，但序列中在4个位点有缺失，因此比class I短一些。ClassV与class I非常相像，但它N端含2个CBD。Class VI几丁质酶与其他植物几丁质酶没有同源性，相反它与细菌的几丁质酶同源性较高。
棉花是一种非常重要的经济作物，但它受很多病害的威胁，其中一个最严重的病害是由Verticillium dahliae引起的黄萎病。在棉花中已经克隆到了class I和classII几丁质酶基因。棉花class I几丁质酶基因(Goshi；Chil；1，Goshi；Chil；2 andGoshi；Chil；3)能够被乙烯诱导，而棉花class II几丁质酶基因(Chi2；1 and Chi2；2)则被水杨酸诱导。本发明发明人以前的工作已经发现，用水杨酸处理棉花幼苗能够提高棉苗对黄萎病的抗性。
发明内容
本发明的目的是提供棉花的一种几丁质酶及其编码基因。
本发明所提供的棉花几丁质酶名称为GhChia7，是具有序列表中序列2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。
序列表中序列2氨基酸残基序列是由325个氨基酸残基组成的蛋白质。
本发明所提供的棉花几丁质酶GhChia7的编码基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
序列表中序列1的DNA由1469个碱基组成，该基因的读码框为自5’端第192到第1169位碱基。
利用可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的编码几丁质酶GhChia7的基因导入植物细胞，可获得抗病的转基因细胞系及转基因植株。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种组成性启动子或组织特异性启动子或诱导型启动子；为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记或具有抗性的抗生素标记物。携带有本发明几丁质酶GhChia7基因的表达载体可通过常规生物技术方法导入植物细胞，被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物。本发明基因可应用于植物的抗病育种，特别抗真菌病害的基因工程育种，尤其是棉花抗枯黄萎病的基因工程育种。本发明基因的发现不仅对培育抗逆植物品种，特别是培育抗病植物品种，提高农作物产量具有重要意义，而且还为进一步阐明几丁质酶在植物、特别是棉花中的抗病以及在发育过程中的作用提供了新线索。
图1为六类几丁质酶氨基酸结构示意图。
图2为GhChia7的核苷酸和氨基酸序列。
图3为GhChia7蛋白与已报道的几丁质酶的多序列比对图。
图4为GhChia7蛋白于其他植物几丁质酶的进化关系。
图5为Northern杂交结果。
具体实施例方式
实施例1、GhChia7的克隆及一级结构特征将陆地棉(Gossypium hirsutum)的低酚品系(中棉所13)棉种在25℃下培养，待植株的真叶初露时，用不同浓度水杨酸溶液进行喷雾处理，对照组用ddH2O喷洒处理。处理后用塑料薄膜密封以保湿，12小时后再重复处理一次，12小时后取子叶提取总RNA。另一组棉苗用7.5mM水杨酸处理，分别在处理6小时、12小时、18小时、24小时和36小时后摘取子叶提取总RNA。其他材料还包括健康的未处理过的棉苗子叶、茎、根和成株的5天的纤维。
用异硫氰酸胍法(Salzman，R.A.，Fujita，T.，Zhu-Salzman，K.，Hasegawa，P.M.and Bressan，R.A.(1999)Plant Mol.Biol.Rep.17，11-17.)提取总RNA并测量总RNA在260nm和280nm下的吸光度(Gene Spec III，Naka Instruments Co.，Ltd)以确定纯度和浓度。
通过差异显示PCR(DD-PCR)从棉花子叶总RNA中克隆到一系列受水杨酸诱导的cDNA片段，其中一条511bp的cDNA片段编码的多肽与拟南芥中的class I几丁质酶有很高的同源性，但5’端缺失。为了克隆这个基因的全长，发明人采用了普通PCR与生物信息学方法相结合的策略。通过与植物EST数据库中的序列进行Blast比对，发现了一段来自于棉花7天纤维的cDNA片段(F1)与已有的片段有95％的同源性。这条837bp片段的5’端比已有的序列更完整。用F1重复比对过程并将得到的来自于棉花的高同源性(＞95％)的cDNA片段继续进行比对，拼接出一条包含起始密码的全长序列。利用这条预计的序列设计了引物并通过常规PCR克隆到这个基因的全长cDNA，并命名为GhChia7。测序结果表明GhChia7有1469bp，包括5’端非编码区(UTR)191bp，开放阅读框架(ORF)978bp和3’端非编码区300bp，最后以poly A结尾。相应的核DNA序列分析结果揭示核基因中含两个内含子(分别长445bp和521bp)和三个外显子(1-397bp，843-1002bp和1536-1956bp)，两个内含子序列均富含A+T(分别为67.9％和63.8％)，5’端和3’端都具有典型的GT和AG序列，其结构如图1中的A部分及图2所示，A图中(1)(2)分别代表GhChia7蛋白和基因的结构。在大多数几丁质酶中高度保守的并且对催化活性非常重要的NYNYG序列已经用阴影标出，多聚腺苷酸信号序列AATAA位于基因的3’端。图2中起始密码和终止密码用阴影标出，多聚腺苷酸信号序列AATAA用框标出，黑三角所在的位置代表N-信号肽可能的剪切位点。NYNYG序列用黑色方块标明，其中下划线注明的是关键残基Y。两个内含子的位置如箭头所示。在终止密码下游56bp处有普遍存在的多聚腺苷酸信号序列(AATAA)。GhChia7编码的多肽有325aa，预计的分子量为36.2kD，等电点为6.34。与蛋白质数据库中的序列进行比对，发现GhChia7与已经报道的Class I和Class II几丁质酶同源性较低(-30％左右)，但它们的催化区是高度保守的(如图3中的A和B部分所示)。GhChia7与Class III植物几丁质酶同源性相对更低(如图3中的C部分及图1的B部分所示)。此外，在GhChia7的催化区中发现了一个高度保守的区域NYNYG，如图2及图3的A部分所示。尽管GhChia7的催化区与Class I和Class II几丁质酶同源性很高，但它不含Class I几丁质酶典型的几丁质结合区和交连区，也比Class II几丁质酶更长(如图1的B部分所示)，与其他类型的几丁质酶同源性很低。通过对GhChia7的序列进一步分析发现，它的N端包含一段24aa长的疏水序列(如图1的A部分及图2所示)，在C端它缺少液泡导向肽(如图1的B部分所示)，而多数class I几丁质酶是定位于植物细胞的液泡中的。
如图4所示，进化树分析更清楚地表明了GhChia7在进化过程中与其他类型几丁质酶的亲缘关系，进化树所需要的序列全部来自于SWISS-PROT蛋白数据库中的几丁质酶蛋白全长序列。图中，At拟南芥，P19171；At2P19172；Bn芸苔，Q06209；Bn2Q09023；Bv甜菜，P42820；Bv2P36910；Ca鹰嘴豆，P36908；Cs黄瓜，P17541；Dj山药，P80052；Gh棉花，Q39799；Hv大麦，P11955；LcLycopersiconchilense(Solanum chilense)，Q40114；Le西红柿，Q05538；Le2Q05540；Le3Q05539；Nt烟草，P08252；Nt2P29059；Nt3P17514；Nt4P17513；Nt5P29060；Nt6P29061；Os水稻，P25765；Os2P24626；Pa小豆，P29024；Ph矮牵牛花，P29021；Ps豌豆，P36907；Ps2P21226；Pt白杨，P16061；Pv云豆，P06215；Pv2P27054；St马铃薯，P05315；Tc可可，Q41596；Vv葡萄，P51613；Vv2P51614；Zm玉米，P29022；从进化树中可以看出，GhChia7处于一个相对独立的分枝上。
实施例2、Northern杂交显示GhChia7 mRNA的组织分布及水杨酸的诱导表达总RNA在65℃下变性后用1.2％甲醛变性胶进行电泳，随后转移到尼龙膜上(HybondTM-N+，Amersham Pharmacia Biotech)。杂交在55℃条件下进行(RobbinsScientificModel 1000)，所用的DNA探针用辣根过氧化物酶(HRP)标记(North2SouthDirect HRP Labeling and Detection Kit，Pierce)。杂交完毕后在55℃下用2×SSC，0.1％SDS溶液洗膜3次，每次5分钟，随后用在室温下用2×SSC洗膜3次，每次5分钟。
Northern杂交结果表明GhChia7 mRNA在健康的未处理过的棉花中的组织分布具有高度特异性，在棉苗的茎中GhChia7 mRNA没有表达，而在5天纤维和棉苗的根中GhChia7mRNA的水平非常高，相比之下在子叶中GhChia7 mRNA有微量的积累(如图5中的A部分所示)。几丁质酶在植物抗病害中的作用已经得到广泛的认识，它能直接催化水解真菌细胞壁中的几丁质从而抵御真菌对植物的侵害。由于植物的根暴露在土壤之中，它是植物中最易受到病原菌侵染的器官之一，因此植物的根必须需要一系列复杂的防御机制来保护它们。已有研究发现在根瘤中几丁质酶可起到保护受外来病原菌侵染部位的作用，甚至可它可能保护整个根不受根瘤菌的攻击。此外，在烟草，拟南芥和其他很多植物的根中也发现了高水平的几丁质酶mRNA，因此在棉苗的根中检测到大量GhChia7 mRNA是意料之中的。GhChia7几丁质酶定位于细胞间质中，它在抵御病原菌侵害的过程中很可能还有另外一个非常重要的作用，即在细胞外建立第一道保护屏障充当早期的防御反应，同时，它还能通过释放出降解产物几丁质寡聚体来活化胞内的几丁质酶以及启动其他一些防御反应。
在5天棉纤维中也检测到了高水平的GhChia7 mRNA，是迄今为止首次在棉纤维中发现的几丁质酶。已往的研究发现几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶在一些特定的组织中表达水平很高，例如几丁质酶SK2在马铃薯花柱的子房中富集，水稻中class I几丁质酶基因OsChial；175也主要在花中表达。GhChia7除了能够在棉纤维形成关键阶段保护纤维细胞外，还可能具有在棉纤维形成过程中促进细胞壁松弛的活性。此外deJong曾提出，几丁质酶的降解产物几丁质寡聚体很可能也是一种能够启动植物发育过程的信号(de Jong，A.J.，Heidstra，R.，Spanik，H.P.，Hartog，M.V，Meijer，E.A.，Hendriks，T.，Loschiavo，F.，Terzi，M.，Bisseling，T.，van Kammen，A.and de Vries，S.C.(1993)Plant Cell 5,615-620.)。发明人的实验结果以及过去的研究都证明，虽然在植物体内几丁质酶能够受病原菌侵染或其他条件诱导，但它们在健康的植株中也具有组织分布特异性，说明植物几丁质酶的作用不仅仅局限于防御反应中，它们很可能也参与了植物的发育过程。
水杨酸已经被认为可能在植物的系统获得抗性(SAR)和过敏反应(HR)中扮演信号分子的角色，并且在植物防御反应中起到非常重要的作用。在不同植物中越来越多的实验证据表明水杨酸与几丁质酶有着非常密切的关系。如图5的B部分所示，Northern杂交结果表明水杨酸能够诱导高水平的GhChia7 mRNA，并且当水杨酸浓度达到7.5mM时GhChia7转录物水平最高。当水杨酸浓度从0到7.5mM升高时，诱导的mRNA水平也相应升高；水杨酸浓度超过7.5mM时诱导的mRNA水平迅速下降。说明水杨酸与几丁质酶之间并不是简单的对应关系，其中必定有一定的机制来调节诱导过程。此外，如图5的C部分所示，在用7.5mM水杨酸处理后，处理18小时后诱导的mRNA水平最高，18小时后开始下降。以上结果充分说明GhChia7基因的表达受水杨酸的诱导，而早期研究又表明水杨酸可诱导棉花幼苗对黄萎病害的抗性，由此可以推断GhChia7在棉花幼苗抗黄萎病害中发挥重要作用。
序列表<160>2<210>1<211>1469<212>DNA<213>棉属陆地棉(Gossypium hirsutum L.)<400>1catttaacca ttgctcaaaa acacaccact ggcttgtaga acgccatgaa atagaccttc60gatctaacac ctttcctttt catttcccct ttccttaaaa acaagctcaa tcaattcccc120cattaaccct aaacgaaaat cagctgaaaa aaaaaccatt tatttttctt cagctctaag180cgacaacaac aatggctgac ttcaagaaag ccactgcttt gattctcaca gtggctttgc240ttgtgaatct cgctttaatg gttgatgctg atggtgatga tgataagaag attcgagtca300ggaaacataa gggtgagaag cagtgtatac aaggatggga atgttcctac tggtcgaaat360attgttgcaa caaaacggtt tcagatgtct tccaggttta tcaatttgag gacctgtttg420ctaaaaggaa ttcgccggtg gctcatgctg ttggattttg ggattaccat tcttttattt480tggctgcttc catttatgag cctttgggtt ttgggactac tggtggtaag cgtatgcaaa540tgaaggaagt cgcggctttt cttgcacatg tcggcgccaa gacatcttgt ggagatggtg600tcatagacgg aggaccgttg gcatggggtc tttgcttcaa gagagaaatg agtcctagcc660aggattactg tgatgattac tacaaataca tgtatccatg tgcccctgga gctcaatact720atggccgtgg tgctttgcca atttactgga actacaacta tggagctgct ggcgatggta780taaaagttga tttgttgcac caccctgagt atctcgagca gaacgcaact attgctttcc840aggccgccat ctggaggtgg atgaccccaa tcaagaagaa ccaaccttca gcacacgaca900ttttcgtggg caactggaaa ccaaccaaga acgacacaga ggaaaaacgg ggtcctactt960ttggctccac catgaacgtt ctctacggag attacacttg cgggcaaggc gatattgatc1020ccatgaacat catcatctcc cattaccttc attaccttga cttactaggt gtcgggcgag1080aggaagcagg gccacacgag gagctaagct gtgccgagca gaaagcattc aacccaaccc1140cagctccacc tgctgccagt gcttcctaat ctttggttca gccaatttca ttgttaaaat1200gtagttgtca atgaagggta atttaataag agagctggca attaggttgt tgtaaaatca1260tggtctatgt cggtgtgaga aaagggccca tcaatttcat gatattatat atagttatat1320acgtttgatt tgttgctgtt aggcggtctt tattatttgc attttgcgtg cgtgtagatt1380ttgatatatt tgatgcttgt tgtgctgtcc acgacattca tataaaattg tatgtattga1440accaccattt ttattcgaaa aaaaaaaaa 1469<210>2<211>325<212>PRT<213>棉属陆地棉(Gossypium hirsutum L.)<400>2Met Ala Asp Phe Lys Lys Ala Thr Ala Leu Ile Leu Thr Val Ala5 10 15Leu Leu Val Asn Leu Ala Leu Met Val Asp Ala Asp Gly Asp Asp20 25 30Asp Lys Lys Ile Arg Val Arg Lys His Lys Gly Glu Lys Gln Cys35 40 45Ile Gln Gly Trp Glu Cys Ser Tyr Trp Ser Lys Tyr Cys Cys Asn50 55 60Lys Thr Val Ser Asp Val Phe Gln Val Tyr Gln Phe Glu Asp Leu65 70 75Phe Ala Lys Arg Asn Ser Pro Val Ala His Ala Val Gly Phe Trp80 85 90Asp Tyr His Ser Phe Ile Leu Ala Ala Ser Ile Tyr Glu Pro Leu95 100 105Gly Phe Gly Thr Thr Gly Gly Lys Arg Met Gln Met Lys Glu Val110 115 120Ala Ala Phe Leu Ala His Val Gly Ala Lys Thr Ser Cys Gly Asp125 130 135Gly Val Ile Asp Gly Gly Pro Leu Ala Trp Gly Leu Cys Phe Lys140 145 150Arg Glu Met Ser Pro Ser Gln Asp Tyr Cys Asp Asp Tyr Tyr Lys155 160 165Tyr Met Tyr Pro Cys Ala Pro Gly Ala Gln Tyr Tyr Gly Arg Gly170 175 180Ala Leu Pro Ile Tyr Trp Asn Tyr Asn Tyr Gly Ala Ala Gly Asp185 190 195Gly Ile Lys Val Asp Leu Leu His His Pro Glu Tyr Leu Glu Gln200 205 210Asn Ala Thr Ile Ala Phe Gln Ala Ala Ile Trp Arg Trp Met Thr215 220 225Pro Ile Lys Lys Asn Gln Pro Ser Ala His Asp Ile Phe Val Gly230 235 240Asn Trp Lys Pro Thr Lys Asn Asp Thr Glu Glu Lys Arg Gly Pro245 250 255Thr Phe Gly Ser Thr Met Ash Val Leu Tyr Gly Asp Tyr Thr Cys260 265 270Gly Gln Gly Asp Ile Asp Pro Met Asn Ile Ile Ile Ser His Tyr275 280 285Leu His Tyr Leu Asp Leu Leu Gly Val Gly Arg Glu Glu Ala Gly290 295 300Pro His Glu Glu Leu Ser Cys Ala Glu Gln Lys Ala Phe Ash Pro
305 310 315Thr Pro Ala Pro Pro Ala Ala Ser Ala Ser320 32权利要求
1.棉花几丁质酶GhChia7，是具有序列表中序列2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的几丁质酶，其特征在于它是具有序列表中序列2氨基酸残基序列的蛋白质。
3.棉花几丁质酶GhChia7的编码基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于所述棉花几丁质酶GhChia7的编码基因是序列表中序列1的DNA序列。
5.根据权利要求4所述的基因，其特征在于该基因的读码框为自5’端第192到第1169位碱基。
6.含有权利要求3所述基因的表达载体。
7.含有权利要求3所述基因的细胞系。
8.权利要求3所述基因在培育抗病植物品种中的应用。
9.权利要求3所述基因在培育抗逆植物品种中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种棉花几丁质酶及其编码基因与应用，本发明所提供的棉花几丁质酶名称为GhChia7，是具有序列表中序列2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。本发明所提供的棉花几丁质酶GhChia7的编码基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。本发明基因的发现不仅对培育抗逆植物品种，提高农作物产量具有重要意义，而且还为进一步阐明几丁质酶在植物抗病以及发育过程中的作用提供了新线索。
文档编号C12N5/04GK1485425SQ0213126
公开日2004年3月31日 申请日期2002年9月23日 优先权日2002年9月23日
发明者刘进元, 李骥 申请人:清华大学