专利名称：格尔德霉素及其衍生物的制备工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种广谱抗癌抗生素——格尔德霉素及其衍生物的制备工艺，具体地说涉及从格尔德纳斯潮湿链霉菌(Streptomyces hygroscopicus varGeldanus)中制备高纯度、高收率的格尔德霉素及其衍生物的工艺。
本发明还涉及培养格尔德纳斯潮湿链霉菌的液体培养基。
格尔德霉素通过对HSP90特异性的抑制，导致致癌蛋白的不稳定及降解。格尔德霉素对HSP90功能的抑制实现了对多种癌靶点和途径的抑制，这种多途径的组合抑制作用，使格尔德霉素具有了广谱抗肿瘤细胞活性。HSP90属应激反应蛋白，在正常组织中的含量极低，在恶性肿瘤组织中的含量较高，因此格尔德霉素类药物可以对肿瘤细胞发挥选择性的抑制作用。格尔德霉素的优势还在于其作用的广泛性，HSP90对维持某些关键的癌细胞伴随蛋白的构象、稳定其功能等非常重要。由HSP90负责维系的蛋白包括受体酪氨酸激酶、跨膜传导调节蛋白、丝氨酸/苏氨酸激酶、突变的p53、c-erbB、Bcr-Ab1、Rafl、Akt及低氧诱导因子1等，它们在导致增殖、细胞周期行进和凋亡的信号转导途径中起作用；另外，它们对于维持诸如浸润、血管生长和转移等恶性肿瘤表型的特点也很重要。GA通过HSP90对多种癌靶点的同时抑制作用还有另外一个优点，就是肿瘤细胞不易对其产生抗性，因为一个肿瘤细胞难以同时改变维持其生长的多种信号途径，以逃避，药物的杀伤作用。
GA虽然在人肿瘤细胞及荷瘤动物模型上表现出良好的抑制肿瘤活性，但由于其生产困难和对肝脏的毒性较大，未能应用于临床肿瘤的治疗。经过对多种格尔德霉素衍生物的筛选实验，发现17-烯丙胺基格尔德霉素(17-allylamino，17-demethoxygeldanamycin，17AAG)保持了GA对HSP90的抑制作用，在体外癌细胞培养和肿瘤移植模型中表现出了明显的抗肿瘤活性，在水溶液中的溶解度高于GA，且对肝脏毒性低于GA。体外细胞实验表明，格尔德霉素，17-烯丙胺基格尔德霉素可用于白血病、肺癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌等多种癌症的治疗。
低剂量的格尔德霉素或17-烯丙胺基格尔德霉素与常用的抗肿瘤药物联合使用时，可以显著增强顺铂、丝裂霉素C、阿霉素和阿糖胞苷对人肝癌BEL-7402细胞的细胞毒性。细胞周期分析表明格尔德霉素能增强顺铂的G2-M期阻断作用。
格尔德霉素对肝脏的毒性较大，难以在临床上单独应用。将格尔德霉素或17-烯丙胺基格尔德霉素与CEA单抗(或其它抗癌细胞表面标志物的单抗)交联后，得到免疫偶联物。单抗可将格尔德霉素带到癌细胞所在的部位，对癌细胞进行定位杀伤，显示出更高的杀伤乳腺癌、结肠癌、胃癌、肺癌等癌细胞活性。应用于人体肿瘤治疗时，可大大降低格尔德霉素的毒性。
格尔德霉素是合成多种安莎霉素类抗肿瘤药物的原料，由于自潮湿链霉菌发酵液中提取高纯度的格尔德霉素较为困难，回收率较低，长期以来成为了研究格尔德霉素类抗生素的障碍。潮湿链霉菌发酵产物中的成分十分复杂，从中提取格尔德霉素的工艺繁琐，多步骤的有机溶剂萃取及柱层析是造成格尔德霉素回收率低的主要原因，因此在以往的报道中，未见每升发酵液中格尔德霉素产量超过100mg的报道。
潮湿链霉菌发酵液的配方未经科学的优化，也是造成格尔德霉素单位体积产量较低的主要原因。
天然格尔德霉素(GA)和经化学修饰的17-烯丙胺基格尔德霉素(17AAG)的化学结构式分别如下(A)(B)式所示 Geldanamycin17AAG根据本发明的一方面，提供了一种适合潮湿链霉菌生长的液体培养基，包括含有葡萄糖、胰蛋白胨、精制食用油、蛋白水解物、酵母提取物、酵母氮碱、可溶性淀粉、蜂蜜等有机物，每升培养基中各成分的含量为葡萄糖0.1～100克蛋白胨0.5～15克精制葵花油1～50毫升蛋白水解物0.1～25克酵母提取物0.1～20克酵母氮碱 0.1～50克可溶性淀粉0.1～15克糖蜜 0.1～10毫升；以及适量的无机微量元素；调培养基的pH至5.0～8.0；将上述培养基在25～35℃培养潮湿链霉菌(Streptomyces hygroscopicus varGeldanus)，获得含有格尔德霉素的培养液。
根据本发明的另一方面，提供了从培养潮湿链霉菌的液体培养基中制备格尔德霉素的工艺，包括采用本发明的液体培养基于不同体积的生物反应器中发酵培养潮湿链霉菌，离心或过滤除去菌体等不溶性物质。利用GA在有机溶剂中溶解度高而在水溶液中溶解度低的特点，向澄清后的培养液上清中加入乙酸乙酯或正丁醇等有机溶剂，有机溶剂与上清液的体积比为1∶1～1∶8，充分搅拌后静置分层，收集有机相。减压蒸馏回收有机溶剂，残留物用硅藻土粉末吸附，干燥后装填柱层析，依次用己烷、二氯甲烷、二氯甲烷-甲醇及甲醇洗层析柱，收集馏分浓缩至适当的体积，低温冷却后，过滤除去沉渣，滤过液再次浓缩至原体积，冰浴。离心收获沉淀，用二氯甲烷/甲醇(1∶1)溶解，并置于硅藻土上干燥吸附(2.5kg硅藻土/1kg沉淀)，吸附后的硅藻土置于未使用过的硅藻土上(16kg硅藻土/1kg沉淀)，装层析柱，依次用不同体积的二氯甲烷、二氯甲烷-甲醇、甲醇流洗，所获馏分置于真空干燥箱中干燥过夜，获得的固形物即为格尔德霉素。
根据本发明的又一方面，进一步提供制备格尔德霉素衍生物——17-烯丙胺基格尔德霉素的工艺，其主要通过将高纯度的格尔德霉素与过量的丙烯氨反应而合成17-烯丙胺基格尔德霉素。
根据本发明工艺制备的格尔德霉素经HPLC测定，其纯度大于98.5％，因此，本发明工艺可获得高纯度的格尔德霉素，进而在后续的工艺中可获得高收率的衍生物——17-烯丙胺基格尔德霉素(收率98.1％)，每升发酵液可获得格尔德霉素200mg以上，因此产量较高。本发明为工业化、大规模生产格尔德霉素及其衍生物奠定了基础。
附图的简要说明
图1为C18反相柱高效液相色谱(HPLC)，50％乙腈流动相色谱图；图2为C18反相柱高效液相色谱(HPLC)，甲醇色谱图，流动相50％乙腈；图3为C18反相柱高效液相色谱(HPLC)，格尔德霉素(甲醇溶剂)色谱图，流动相50％乙腈；图4为C18反相柱高效液相色谱(HPLC)，17-烯丙胺基格尔德霉素(甲醇溶剂)色谱图，流动相50％乙腈。
优选的一种液体培养基的成分如下(每升)葡萄糖 40 克胰蛋白胨2.5 克可溶性淀粉 5克酵母提取物 2.5 克精制葵花油 10 毫升蛋白水解物 2.5 克酵母氮碱1克糖蜜10 毫升磷酸氢二钾 0.015克磷酸二氢钠 0.005克氯化钙 0.03 克微量元素混合液 1 毫升微量元素混合液含硫酸酮、硫酸锰、氯化铁、硫酸锌、氯化钴、锰酸钠、硼酸钠及硼酸等，各自的浓度为0.1～10mmol/L；调整pH至7.0～7.2。高压灭菌或过滤除菌后备用。
(2)种子菌接种及发酵本发明所用格尔德纳斯潮湿链霉菌(Streptomyces hygroscopicus varGeldanus)菌种得自美国农业部农业研究机构保藏中心(Northern Utilizationand Research Division，Agricultural Research，U.S.Department of Agriculture，Peoria，Ill.，U.S.A.)，该菌种于1969年提交永久保藏，保藏号为NRRL 3602，目前可无任何限制地发放给公众。
自-70℃冰箱或液氮罐中取出低温冻存的菌种(4ml)，接种到2个50ml烧瓶中，28℃，220转/分培养60小时后，转接入4个200ml烧瓶，28℃、200转/分继续培养36小时后，接种到6个2000ml烧瓶，28℃、220转/分培养36小时后接种到150升的种子发酵罐中，连续培养30小时，每6小时取样检查一次(控制溶氧、pH及泡沫)，之后接种于1500升(或更大容积)的发酵罐中，培养过程控制泡沫、溶氧及pH，每6小时取样一次检测格尔德霉素的含量(高效液相色谱)，至格尔德霉素含量不再明显增加时停止培养，末次培养时间约为100～170小时。
(3)格尔德霉素的提取(乙酸乙酯抽提法)采用过滤或离心法澄清培养液，在过滤液或上清液中按1∶2(乙酸乙酯滤过液)加入乙酸乙酯，放置2小时，去除含水液相，将有机相浓缩干燥，残余物用硅藻土吸附，将干燥后的硅藻土装入层析柱，依次用4倍体积的己烷、2倍体积二氯甲烷、7倍体积二氯甲烷/甲醇(99∶1)及2倍体积甲醇冲洗，收集馏分浓缩至1/5体积，置冰浴中过夜后过滤除去沉渣，滤过液再次浓缩至1/5体积，冰浴。离心收集沉淀，沉淀用二氯甲烷/甲醇(1∶1)溶解，并置于硅藻土上干燥吸附(2.5kg硅藻土/1kg沉淀)，吸附后的硅藻土置于未使用过的硅藻土上(16kg硅藻土/1kg沉淀)，装层析柱，依次用2倍体积二氯甲烷、6倍体积二氯甲烷/甲醇(98∶2)、4倍体积二氯甲烷/甲醇(95∶5)、2倍体积甲醇冲洗，所获馏分分置于真空干燥箱中干燥过夜，获得的固形物即为格尔德霉素，HPLC测定纯度大于98.5％。质谱仪测定分子量为560，熔点252-255℃，易溶于氯仿、二氯甲烷、二甲基亚砜等有机溶剂，稍溶于丙酮、甲醇等，微溶于水，冻干后室温保存稳定。结果见图1、图2和图3。
实施例217-烯丙胺基格尔德霉素的化学合成向盛有100ml三氯甲烷的磨口玻璃烧瓶中加入560mg格尔德霉素(纯度不低于98.5％)，充分振摇10分钟，完全溶解后，用G6/G3烧结玻璃漏斗抽滤，滤液中加入2ml丙烯氨(纯度不低于99％)，低速搅拌反应20～24小时。此后向反应器中加入100ml预冷(2～4℃)的超纯水，用6M盐酸调pH至3.0，高速搅拌至少30分钟，停止搅拌后将液体移入250ml分液漏斗内静置，待其自然分层，收集下层的三氯甲烷相。向水相中再次加入100ml三氯甲烷，充分搅拌，待其分层后收集三氯甲烷相，将两次收集的三氯甲烷相合并，倒入含无水硫酸钠的烧结玻璃漏斗内，用玻璃棒搅拌，抽滤除去固体硫酸钠，收集滤过液，用旋转蒸发器减压浓缩后得橙色固形物。此固形物用丙酮-n-己烷重结晶，减压干燥后可获575mg 17-烯丙胺基格尔德霉素(回收率98.1％)，熔点为212～214℃，质谱仪测定分子量约为586，熔点212-214℃，结果见图4。易溶于氯仿、二氯甲烷、二甲基亚砜等有机溶剂，稍溶于丙酮、甲醇等，微溶于水。冻干后室温保存稳定。
实施例3用于白血病的化疗白血病的治疗目前主要依赖化疗及骨髓/干细胞移植，治疗失败的主要原因是白血病细胞对化疗药物的耐受。实验研究发现格尔德霉素能诱导K562细胞发生显著的细胞周期抑制，使绝大多数细胞停滞于G2/M期。发现17AAG能通过清除白血病细胞中高表达的Bcr-Ab1，使Bcr-Ab1阳性细胞对化疗药物的敏感性提高3-8倍，同时17AAG能使白血病细胞发生明显的凋亡并促使其向正常细胞分化，从而自多个不同的途径提高到白血病的治疗效果。临床研究发现联合应用17AAG可将Bcr-Ab1阳性的白血病治愈率从58％提高到92％。
实施例4用于肺癌的治疗实验研究发现，17AAG对肺癌细胞的生长能从多个方面发挥抑制作用，除了像在对其他肿瘤细胞那样发挥抗增殖及使肿瘤细胞对化疗药物敏感性增强等作用外，17AAG还能明显抑制erB1/erB2的表达，抑制肿瘤细胞分泌MMP-9及VEGF，增强E-钙粘素的表达，从而抑制肿瘤细胞的转移。动物体内实验表明，含有17AAG的化疗方案能较其他方案明显缩小裸鼠荷瘤的体积，延长小鼠生存期，17AAG治疗组约有50％的核瘤小鼠的肿瘤完全消失。
以上对本发明的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变和变形，只有不脱离本发明的精神和内容，均应属于本发明所附权利要求的范围。
权利要求
1.格尔德霉素的制备工艺，包括以下步骤以液体培养基培养格尔德纳斯潮湿链霉菌，所述培养基每升含有葡萄糖 0.1～100 克蛋白胨 0.5～15 克精制葵花油 1～50毫升蛋白水解物 0.1～25 克酵母提取物 0.1～20 克酵母氮碱0.1～50 克可溶性淀粉 0.1～15 克糖蜜0.1～10 毫升；以及适量的无机微量元素；调培养基的pH至5.0～8.0；在25～35℃培养格尔德纳斯潮湿链霉菌(Streptomyces hygroscopicus varGeldanus)，获得含有格尔德霉素的培养液。
2.据权利要求1所述的工艺，其中所述培养基中每升含有葡萄糖40克胰蛋白胨 2.5 克可溶性淀粉5 克酵母提取物2.5 克精制葵花油10毫升蛋白水解物2.5 克酵母氮碱 1 克糖蜜 10毫升磷酸氢二钾0.015 克磷酸二氢钠0.005 克氯化钙0.103 克微量元素混合液1 毫升所述微量元素混合液含硫酸铜、硫酸锰、氯化铁、硫酸锌、氯化钴、锰酸钠、硼酸钠及硼酸，各自的浓度为0.1～10mmol/L；调整pH至7.0～7.2。
3.根据权利要求2所述的工艺，其中进一步包括从培养液中纯化格尔德霉素的步骤，包括1)离心或过滤培养液获得上清液；2)在所述上清液中加入有机溶剂，所述有机溶剂与上清液体积之比为1∶1～1∶8，搅拌后分层，收集有机相；3)去除有机溶剂后，以载体吸附残留物；4)将所述载体装填层析柱，用有机溶剂依次洗脱并浓缩获得纯化的格尔德霉素。
4.根据权利要求3所述的工艺，其中步骤2)所述的有机溶剂为正丁醇或乙酸乙酯。
5.根据权利要求3所述的工艺，其中步骤3)所述的载体为硅藻土粉末。
6.根据权利要求3所述的工艺，其中步骤4)所述的洗脱用有机溶剂分别为己烷、二氯甲烷、二氯甲烷与甲醇的混合物及甲醇。
7.备17-烯丙胺基格尔德霉素的工艺，其中将高纯度格尔德霉素与过量的丙烯氨反应制备17-烯丙胺基格尔德霉素。
8.根据权利要求6所述的工艺，其中进一步包括将获得的17-烯丙胺基格尔德霉素进行纯化的步骤。
9.用于培养格尔德纳斯潮湿链霉菌(Streptomyces hygroscopicus varGeldanus)的培养基，其特征在于所述培养基每升含有以下成分葡萄糖 0.1～100 克蛋白胨 0.5～15 克精制葵花油 1～50毫升蛋白水解物 0.1～25 克酵母提取物 0.1～20 克酵母氮碱0.1～50 克可溶性淀粉 0.1～15 克糖蜜0.1～10 毫升；以及适量的无机微量元素；培养基的pH为5.0～8.0。
10.根据权利要求9所述的培养基，其特征在于所述培养基每升含葡萄糖 40克胰蛋白胨 2.5 克可溶性淀粉 5 克酵母提取物 2.5 克精制葵花油 10毫升蛋白水解物 2.5 克酵母氮碱 1 克糖蜜 10毫升磷酸氢二钾 0.015 克磷酸二氢钠 0.005 克氯化钙 0.03 克微量元素混合液 1 毫升所述微量元素混合液含硫酸铜、硫酸锰、氯化铁、硫酸锌、氯化钴、锰酸钠、硼酸钠及硼酸，各自的浓度为0.1～10mmol/L；培养基pH为7.0～7.2。
全文摘要
本发明涉及一种广谱抗癌抗菌素——格尔德霉素及其衍生物的制备工艺，将格尔德纳斯潮湿链霉菌在本发明的液体培养基中培养，从培养液中提取并纯化获得格尔德霉素。采用该工艺可大量获得高纯度的格尔德霉素及其衍生物，为格尔德霉素的大规模、工业化生产奠定了基础。
文档编号C12N1/20GK1478901SQ0213216
公开日2004年3月3日 申请日期2002年8月30日 优先权日2002年8月30日
发明者周向阳, 孔健 申请人:深圳市生尔易实业发展有限责任公司