专利名称：人工内切酶及其制法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和酶学领域，更具体地涉及选择性切割核酸中磷酸二酯键的人工内切酶及其制法和用途。
背景技术：
众所周知，核酸是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。它在生物的生长、发育、繁殖等正常生命活动中具有十分重要的作用，但另一方面，核酸与生命的异常情况，如肿瘤的发生、放射损伤和遗传疾病等也密切相关。所以，对核酸的研究已成为现代分子生物学、医学和化学生物学研究的重要课题。选择性地切断核酸中的磷酸二酯键是基因工程的重要问题，但是，在生理条件及非酶存在下，核酸具有很高的稳定性。如在pH7及温度为25℃的环境中，水解DNA和RNA中磷酸二酯键的半衰期分别为8亿年和2亿年。
目前，水解切断核酸除用天然酶外还没有其它有效的办法，但天然酶识别序列短，一般仅为4～8个碱基，且切断位点有限，价格昂贵，远远不能满足分子生物学和基因工程的需要。因此，开发出高效的人工核酸切割试剂的研究，具有非常重要的理论意义和应用价值。
首先，对人工核酸切割试剂的切割机理的研究将大大有助于人们对核酸酶催化机理等生命过程的透彻了解，例如Breslo等通过研究核糖核酸酶A＜RNaseA)的模拟物对RNA的切割机理，来研究RNase A的酶催化机理。而对金属离子催化核酸水解的机理的研究，可以有助于理解金属离子参与核酸水解时所起的作用。
其次，核酸切割试剂尤其是定位切割试剂可以作为重要的工具酶。如前所述，天然的核酸限制性内切酶所能识别的碱基序列非常短，只有4～8个碱基对，而在较长的核酸链中，这样短的识别序列出现的频率会很高，所以当一条较长的核酸链被限制性内切酶切断时，将产生非常多的碎片，这些碎片很难被进一步利用。人工合成的定位切割试剂的识别系统可根据需要识别任意序列、任意碱基数的核苷酸，其切割所产生的碎片很少，有利于进一步利用。
第三，人工核酸切割试剂可作为DNA或RNA构象变化的探针及核酸或基因分析的印迹试剂。印迹技术中往往使用化学试剂或是核酸酶来水解与蛋白结合在一起的核酸，但大多数核酸酶，如脱氧核糖核酸酶I(DNA I)，由于体积太大而只具有有限的分辩率，因此需要更小的化学探针来获得更高的分辩率。人工核酸切割试剂便可以充当这种化学探针。同理，它也可以作为研究核酸高级结构的探针。
此外，人工核酸切割试剂在疾病的基因治疗中有着十分重要的应用。它可以用作各种病症的DNA碱基诊断试剂、癌症及爱滋病的特效药物。
目前的人工核酸切断试剂大多是以氧化还原反应或自由基的产生为作用机理。其共同特点是要破坏DNA的戊糖环，从而切断DNA，应用有局限性。
某些金属离子虽然水解切断磷酸二酯键，但对DNA的位点无识别作用。例如，沈鹤柏等人在中国科学第31卷第2期(2001年4月)公开了Ce离子可水解寡核苷酸DNA中的磷酸二酯键，但都没有实现对DNA底物(靶序列)的特异性或选择性切割。
因此，本领域迫切需要开发可特异性或选择性识别靶核酸序列的人工内切酶。
发明内容
本发明的目的就是提供一种选择性切割核酸中磷酸二酯键的人工内切酶。
本发明的另一目的是提供所述特异性人工内切酶的制法和用途。
在本发明的第一方面，提供了一种人工内切酶，它含有识别元件和切割元件，所述的识别元件是6-200个核苷酸的单链，切割元件是稀土元素金属离子，且在单链的5′端或3’端具有与铈离子螯合的鳌合剂，在鳌合剂与单链之间具有接头，且所述的稀土元素选自La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Bo、Y、或其组合。
在一优选例中，所述识别元件的核苷酸序列与待切割的核酸分子的核苷酸序列是特异性互补的。
在另一优选例中，稀土金属离子与识别元件之比为0.1∶1-100∶1。更佳地，稀土金属离子与识别元件之比为1∶1-10∶1。
在另一优选例中，识别元件如式(I)所示 式中，ODN为6-50个核苷酸的单链。
在另一优选例中，稀土金属离子选自4价铈离子，所述的接头源自乙二胺，所述的鳌合剂源自EDTA酸酐。
在本发明的第二方面，提供了一种制备人工内切酶的方法，包括步骤(a)用磷酸基活化剂使寡核苷酸单链上的磷酸基活化，得到磷酸基活化的寡核苷酸单链；(b)将步骤(a)中活化的寡核苷酸单链与接头剂连接，形成带有接头的寡核苷酸单链；(c)将步骤(b)中获得的寡核苷酸单链与鳌合剂反应，形成带有鳌合剂的寡核苷酸单链；(d)将稀土元素金属离子加入步骤(c)获得的带有鳌合剂的寡核苷酸单链，形成内切酶，所述的稀土元素选自La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Bo、Y、或其组合。
在一优选例中，所述寡核苷酸单链含有6-200个核苷酸。
在另一优选例中，所述的磷酸基活化剂是咪唑-HCl，所述的接头剂是乙二胺，所述的鳌合剂是EDTA酸酐。
在另一优选例中，步骤(a)是加入pH＝5.5-7.5的咪唑-HCl缓冲液，使磷酸基活化；步骤(b)是加入1-乙基-(3，3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸盐和乙二胺，于5-30℃搅拌反应6-48小时；步骤(c)是加入pH＝5-8的Tris-HCl缓冲液配成的EDTA酸酐溶液，在5-50℃下搅拌反应0.2-2h；步骤(d)是加入Ce(NO3)4或(NH4)2Ce(NO3)6。
在本发明的第三方面，提供了一种所述人工内切酶在切割核酸方面的用途，即一种核酸切割方法，其中使用本发明的人工内切酶进行切割。
图1是本发明一种人工内切酶的合成路线示意图。
图2是本发明一种人工内切酶与待酶切底物的结合示意图。
图3是本发明一种人工内切酶的酶切产物的电泳图。其中，泳道a，0.01MCe4+对26-聚寡核苷酸水解切断结果；泳道b.限制性人工内切酶水解切断26-聚寡核苷酸结果。箭头所指的各物质如下(1)26-聚寡核苷酸；(2)16-聚寡核苷酸；(3)10-聚寡核苷酸和限制性人工内切酶的混合物图4是lgDNA分子量(lgMW)-DNA相对迁移率(Rf)图。其中，相对迁移率(Rf)指条带迁移距离占整个凝胶图像高度的比值。
具体实施例方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次将特异性切割所需的识别元件与由铈离子构成的切割元件连接起来，形成了可识别特定序列并切割DNA中磷酸二酯键的人工内切酶。在此基础上完成了本发明。
如本文所用，术语“识别元件”指识别并结合于待切割的核酸底物上特定序列的元件。通常，识别元件就是多个核苷酸构成的、序列与靶序列相同或互补的核酸单链。识别元件可以是DNA、RNA或其混合物。
识别元件的长度没有特别限制。取决于人工内切酶的用途，识别元件的长度可以是至少4个核苷酸，较佳的为6-200个核苷酸，更佳的为8-100个核苷酸，最佳的为10-50个核苷酸。一种特别优选的识别元件是寡核苷酸(缩写为“ODN”)。由于PCR合成技术、DNA合成技术以及众多分离技术的发展，本领域技术人员可以轻易地获得或合成识别元件。
如本文所用，术语“切割元件”指人工内切酶中能够切割DNA的部分。较佳地，所切割的是DNA中的磷酸二酯键。一种优选的切割元件是稀土元素金属离子，如铈离子等，尤其是与鳌合剂部分形成稳定结构的铈离子。
如本文所用，“鳌合剂”指与切割元件(如铈离子)螯合，从而起稳定作用并形成配合物的试剂。可用于本发明的鳌合剂没有特别限制，可以是任何起螯合作用，且对识别元件的识别功能和切割元件的切割功能没有实质性损害的分子。代表性的例子包括(但并不限于)EDTA、氨三乙酸等。
如本文所用，“接头”指位于识别元件和切割元件之间，起连接作用的分子。由于稀土元素离子如铈离子通常被鳌合剂所螯合，因此，接头通常位于识别元件的5’端或3’端和与铈离子螯合的鳌合剂之间。可用于本发明的接头没有特别限制，可以是任何起连接作用，且对识别元件的识别功能和切割元件的切割功能没有实质性损害的分子。代表性的例子包括(但并不限于)乙二胺。
本发明的人工内切酶是人工合成的、能选择性水解切断DNA的切断试剂，由通过接头连接在一起的识别元件和切割元件组成。在一优选例中，本发明的识别元件是用不同长度和不同碱基序列寡聚DNA，切断系统是用Ce离子。将寡聚DNA和Ce离子连结合成人工内切酶。
由于识别元件可以识别DNA特定的核苷酸序列，切割元件就可以在想切断的部位水解切断DNA的磷酸二酯键。
本发明还提供了制备人工内切酶的方法，该方法包括以下四个步骤(a)磷酸基的活化。
用磷酸基活化剂使寡核苷酸单链上的磷酸基活化，从而得到磷酸基活化的寡核苷酸单链。可用于本发明的活化剂没有特别限制。优选的活化剂包括(但并不限于)咪唑-HCl等。反应通常在pH5.0-8.0，较佳地在pH 5.5-7.5下，以及0-50℃(较佳地5-35℃)的温度下进行0.1-10小时，较佳地0.5-2小时。
(b)添加接头在该步骤中，将步骤(a)中活化的寡核苷酸单链与接头剂连接，形成带有接头的单链寡聚核苷酸。可用于本发明的接头剂没有特别限制。优选的接头剂包括(但并不限于)乙二胺等。反应通常在pH5.0-8.0，较佳地在pH 5.5-7.5下，以及0-50℃(较佳地5-35℃)的温度下进行1-100小时，较佳地2-50小时。
此外，该步骤宜在偶联剂如1-乙基-(3，3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(CDI)存在下进行。一种优选方式是先添加CDI，反应约1小时，然后在添加接头剂。
(c)添加鳌合剂在该步骤中，将步骤(b)中获得的寡核苷酸单链与鳌合剂反应，形成带有鳌合剂的寡核苷酸单链。可用于本发明的鳌合剂没有特别限制。优选的鳌合剂包括(但并不限于)EDTA、氨三乙酸等。反应通常在pH4.5-8.5，较佳地在pH5.0-8.0下，以及0-60℃(较佳地10-40℃)的温度下进行0.1-10小时，较佳地0.5-2小时。
(d)添加稀土元素离子将稀土元素离子(如铈离子)加入步骤(c)获得的带有鳌合剂的寡核苷酸单链，即可形成本发明的内切酶。铈离子通常以盐形式加入。
研究已表明，下列稀土元素的金属离子均对DNA的磷酸二酯键具有水解断裂作用La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Bo、Y、或其组合。关于稀土元素的金属离子均对DNA的磷酸二酯键的水解断裂作用，可参见各种文献，例如Komiyama M等人，Nucleosides & Nucleotides，1994，13(6-7)1297-1309；朱兵等人，“稀土元素对3′-腺嘌呤及3′-鸟嘌呤核苷酸的水解裂解作用”化学学报，1998，5647-51；以及康玉专、沈鹤柏等人，稀土，2000，21卷，第6期，第10页。
可用于本发明的铈离子源没有特别限制。优选的铈离子源包括(但并不限于)铈的无机酸盐如盐酸盐、硝酸盐、硫酸盐，和铈的有机酸盐如乙酸盐，或其混合物等。铈的化合价可以是2价、3价或4价，或其组合。优选的铈的化合价是4价。特别优选的是铈的无机酸盐如盐酸盐、硝酸盐。
本发明的人工内切酶在大范围的pH值、温度和工作浓度下均可有效地切割核酸分子。通常其工作pH约为4.0-8.5，较佳地pH约为5-7.5。工作温度约为0-60℃，较佳地约25-50℃。工作浓度以铈离子计大于约1×10-4mol/L即可，例如1×10-4mol/L-5×10-1mol/L。
本发明的人工内切酶作为一种工具酶在分子生物学、遗传工程和医疗领域中有广泛的应用。其主要优点在于(1)对于不被天然内切酶识别序列，可以设计和合成特异性的本发明的人工内切酶。例如对于某些与疾病相关的单核苷酸多态性(SNP)，可以通过PCR扩增特定片段，然后用识别该SNP的内切酶切割，从而进行检测。
(2)特异性地识别和切割核酸底物。
(3)制法简便，成本低廉。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
试剂和仪器26聚寡聚核苷酸的DNA序列为5’-GGAGGCGAACGATACGCATCGACTGT-3’，10聚寡核苷酸的DNA序列是5’-GTTCGCCTCC-3’，均购自上海生工生物工程有限公司。其余试剂均为市售分析纯。
实施例1人工内切酶的合成识别元件是10-聚寡核苷酸(ODN)，其序列为5’-X GTT CGC CTC C-3’，其中X为磷酸基团。用该序列的ODN，按图1所示路线合成人工内切酶。方法如下(1)磷酸基活化往5’-P-10-mers ODN中加入pH＝5-8的咪唑-HCl(Imidazole-HCl)缓冲液，于25℃搅拌反应1-2小时，使5’-P-10-mers ODN上的磷酸基活化。
(2)添加接头在充分振荡后加入1-乙基-(3，3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(CDI)，再加入乙二胺，于25℃搅拌反应12-24小时。纯化后得到带EDA的5’-P-10-mersODN(5’-EDA-P-10-mers ODN)。
(3)添加鳌合剂向5’-EDA-P-10-mers ODN中加入pH＝5-8的Tris-HCl缓冲液，使其溶解，再加EDTA酸酐，在30℃下搅拌反应0.5-1h后得到5’-EDTA-P-10-mers ODN。
(4)添加铈离子加入Ce离子(Ce(NO3)4形式)，得到ODN-Ce配合物，即人工内切酶。
实施例2定位切断在该实施例中，测试实施例1中制备的10-mers ODN-铈配合物人工核酸酶定位切断26-mers Oligo DNA的能力。
不同来源的DNA单链之间若有互补序列或同源顺序部分，则能通过分子杂交，在退火条件下形成杂合双链。5’-EDTA-P-10-mers ODN中寡聚核苷酸结构中的10个碱基与26-mers ODN(序列为5’-GGA GGC GAA CGA TAC GCA TCG ACTGT-3’)中的10个碱基互补，所以在适当的条件下可以以碱基互补配对原则，杂交形成双螺旋结构，如图2所示。
将26聚的寡核苷酸底物和实施例1的人工内切酶，在pH＝6-8的Tris-HCl缓冲液中与30℃-40℃温度下，反应24-48小时。然后取反应产物进行电泳。
定位切断的电泳图如图3所示。结果，26聚的核酸底物被切割成10聚和16聚的产物。这表明人工核酸酶能对Oligo DNA进行高效的定位切断。
实施例3相对迁移率的测定重复实施例2并测定相对迁移率。这里的相对迁移率是指条带迁移距离占整个凝胶图象高度的比值。采用Smart View2001软件得到已知分子的lgMW和Rf，由最小二乘法算出相应的一次方程，并最终求出未知分子量。
结果如图4所示，图中数据点的分子量分别对应于10和16个碱基的寡核苷酸。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种人工内切酶，其特征在于，它含有识别元件和切割元件，所述的识别元件是6-200个核苷酸的单链，切割元件是稀土元素金属离子，且在单链的5′端或3’端具有与铈离子螯合的鳌合剂，在鳌合剂与单链之间具有接头，且所述的稀土元素选自La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Bo、Y、或其组合。
2.如权利要求1所述的内切酶，其特征在于，所述识别元件的核苷酸序列与待切割的核酸分子的核苷酸序列是特异性互补的。
3.如权利要求1所述的内切酶，其特征在于，稀土金属离子与识别元件之比为0.1∶1-100∶1。
4.如权利要求1所述的内切酶，其特征在于，稀土金属离子与识别元件之比为1∶1-10∶1。
5.如权利要求1所述的内切酶，其特征在于，识别元件如式(I)所示 式中，ODN为6-50个核苷酸的单链。
6.如权利要求1所述的内切酶，其特征在于，稀土金属离子选自4价铈离子，所述的接头源自乙二胺，所述的鳌合剂源自EDTA酸酐。
7.一种制备人工内切酶的方法，其特征在于，包括步骤(a)用磷酸基活化剂使寡核苷酸单链上的磷酸基活化，得到磷酸基活化的寡核苷酸单链；(b)将步骤(a)中活化的寡核苷酸单链与接头剂连接，形成带有接头的寡核苷酸单链；(c)将步骤(b)中获得的寡核苷酸单链与鳌合剂反应，形成带有鳌合剂的寡核苷酸单链；(d)将稀土元素金属离子加入步骤(c)获得的带有鳌合剂的寡核苷酸单链，形成内切酶，所述的稀土元素选自La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Bo、Y、或其组合。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，寡核苷酸单链含有6-200个核苷酸。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的磷酸基活化剂是咪唑-HCl，所述的接头剂是乙二胺，所述的鳌合剂是EDTA酸酐。
10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(a)是加入pH＝5.5-7.5的咪唑-HCl缓冲液，使磷酸基活化；步骤(b)是加入1-乙基-(3，3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸盐和乙二胺，于5-30℃搅拌反应6-48小时；步骤(c)是加入pH＝5-8的Tris-HCl缓冲液配成的EDTA酸酐溶液，在5-50℃下搅拌反应0.2-2h；步骤(d)是加入Ce(NO3)4或(NH4)2Ce(NO3)6。
全文摘要
本发明提供了可选择性切割核酸中磷酸二酯键的人工内切酶及其制法和用途。所述的内切酶含有识别元件和切割元件，所述的识别元件是6－200个核苷酸的单链，切割元件是稀土金属离子，在单链核苷酸的5′端或3’端具有与金属离子螯合的螯合剂，且在螯合剂与单链之间具有接头。本发明的人工内切酶可作为工具酶广泛应用于分子生物学、遗传工程和医疗领域。
文档编号C12N9/14GK1475564SQ0213648
公开日2004年2月18日 申请日期2002年8月14日 优先权日2002年8月14日
发明者沈鹤柏 申请人:上海师范大学