专利名称：一种非手术构建人/山羊嵌合体的方法
技术领域：
本发明属于生物细胞技术领域，涉及人源性干细胞宫内异种移植构建人/山羊嵌合体的方法，具体涉及人源性干细胞在非手术条件下进行宫内异种移植，构建人/山羊嵌合体的的方法。
本发明是在B超仪的监视下，用非手术的方法将从人新鲜脐血分离富集的人造血干细胞(hHSC)或骨髓、肝脏等人体组织分离获得的组织成体干细胞，直接注射于胎龄为45-55天的山羊腹腔中，建立人/山羊嵌合模型。
本发明通过以下步骤建立人/山羊嵌合模型1、收集获得新鲜人脐血或骨髓、肝脏等人体组织分离获得的组织成体干细胞，所得人新鲜脐血首先用NycoPrepTM(1.077g/mL，Nycomed Pharma AS，Oslo，Norway)梯度离心分离脐血中单个核细胞，然后用“人原始祖细胞富集鸡尾酒”(Human PrimitiveProgenitor Enrichment Cocktail，Stemcell Technologies，Vancouver，Canada)试剂盒进一步分离获得人造血干细胞(hHSC)。
将获得的骨髓、肝脏组织分别进行灌注、冲洗、研磨、过滤，然后用“人原始祖细胞富集鸡尾酒”试剂盒进一步分离获得人组织成体干细胞。
2、将山羊在B超仪的监视下，定位到子宫内的胎山羊，确定其头部、脊柱等定位标志，然后用穿刺针经母体皮肤、子宫壁直接穿刺入胎山羊的腹腔，将人组织成体干细胞直接注射于胎山羊腹腔内，建立人/山羊嵌合模型。本发明所用胎山羊其胎龄为45-55天。本发明避免了用开腹手术作异体移植。本发明为32头胎羊进行宫内异种移植，注射1×105的组织成体干细胞，每头羊的移植全过程只需3-5分钟。注射后定期用B超观察胎羊生长发育的情况。
本发明所述直接注射方法可反复进行。
3、非手术移植获得的人/山羊嵌合体中人源细胞进行扩增、分化和基因表达检测(1)进行FACS分析本发明采用的PE(phycoerythrin)和FITC共价标记的鼠抗人CD抗原，GPA和HLA抗原的单克隆抗体购自美国B.D.公司，流式细胞仪为美国B.D.公司产品。本发明中FACS的分析步骤按美国B.D.公司的操作指南进行，通过鼠抗人单抗对正常山羊和人两者之间的细胞结合能力的比较分析。
(2)DNA分析①抽提DNA；②设计PCR引物通过Genbank分别查询人CD34、血型糖蛋白A(Glycophorin A，Gly A)，与山羊的序列进行同源性比对，选取非同源的部分设计引物。
③检测引物特异性将合成的各对引物分别扩增人基因组DNA和对照组羊DNA，检测其特异性。
④按常规方法进行PCR检测人/山羊造血干细胞嵌合模型中的人CD34基因和Gly A基因，其中阳性特异性扩增带分别为437bp和479bp。
⑤RT-PCR检测人/山羊造血干细胞嵌合模型抽提总RNA使用QIAGEN公司的QIAampRNA Blood Kit从羊外周血中抽提总RNA。将RNA逆转录为cDNA使用BRL公司的逆转录试剂盒进行逆转录反应。
PCR扩增CD34基因、GlyA基因以逆转录生成的cDNA为模板，具体扩增过程同上。⑥对移植的胎羊进行组织学和免疫组织化学检查。⑦对被移植胎羊的母体血液行血液学检查。
其中1、山羊子宫壁；2、山羊羊膜囊；3、胎山羊头部；4、胎山羊腹腔；5、宫内胎山羊腹腔穿刺点；6、胎山羊脊柱
32头正常妊娠受试的山羊，取其中3头妊娠110天山羊，剖腹取胎后，抽取其心脏血作FACS、PCR、Southern杂交分析，并对肝脏组织进行RT-PCR、免疫组化和FISH分析，以观察山羊的组织中是否出现人源细胞。经FACS分析，结果显示，所有经检测的受试胎山羊的血液中均有组织成体干细胞的嵌合，CD34+细胞的频率分别为0.64％、0.6％和1.44％，GPA+细胞的频率分别为0.87％、2.61％和2.65％，PCR结果显示CD34和GPA DNA均为阳性，Southern杂交结果表明组织成体干细胞阳性嵌合的山羊基因组中含有人类特异的α-卫星序列。阳性山羊肝脏切片的免疫组化实验证明有人肝细胞特异抗原(HSA)存在。RT-PCR结果显示人的肝细胞核因子(hHNF-3β)和人血清白蛋白mRNA表达。FISH分析表明在山羊肝组织中嵌合有人基因特异杂交信号的人源细胞。
受试的32头胎羊中，仅一头于移植组织成体干细胞的一周内流产，其余均正常妊娠；而在另一组50头手术注射组织成体干细胞的受体山羊中，有11头胎羊于移植后一周内流产。
本发明在B超监视下经皮穿刺胎山羊腹腔内注射人组织成体干细胞，完成异种移植，形成人/山羊嵌合模型。本方法的优点是非手术方法建立人/山羊嵌合模型，较目前采用的手术方法快捷、安全、可靠、流产率低、成功率高，移植全过程仅需3-5分钟，32头非手术移植羊中仅一头流产，手术移植组50头羊11头流产。证实本方法的安全可靠、成功率高。本发明对加速干细胞体内扩增、分化的研究并，对进行宫内移植与宫内治疗均具有重要的价值。
权利要求
1.一种非手术构建人/山羊嵌合体的方法，其特征是在影像监视下，直接注射人源干细胞至胎山羊腹腔内，建立人/山羊嵌合体模型。
2.按权利要求1所述的非手术构建人/山羊嵌合体的方法，其特征是所述影像监视包括X线监视和B超监视。
3.按权利要求1所述的非手术构建人/山羊嵌合体的方法，其特征是所述人源干细胞指来源于人体任何组织的细胞，包括干细胞和间充质细胞。
4.按权利要求1所述的非手术构建人/山羊嵌合体的方法，其特征是所述嵌合体模型是人和非人哺乳动物构成的嵌合模型。
5.按权利要求1所述的非手术构建人/山羊嵌合体的方法，其特征是所述直接注射方式可以重复多次。
全文摘要
本发明属于生物组织细胞技术领域，具体涉及人源性干细胞在影象监视下非手术进行宫内异种移植，构建人/山羊嵌合体的方法。本方法在移植山羊体的循环血液、肝脏等重要组织中成功形成人源性细胞，并具有相应组织人源细胞的基因表达和功能。与手术移植比较，该方法快捷、安全、流产率低、成功率高。为建立人/非人哺乳动物嵌合模型创建了新的技术平台。对加速干细胞体内扩增、分化的研究并对进行官内移植与官内治疗均具有重要的价值。
文档编号C12N5/08GK1429561SQ02136780
公开日2003年7月16日 申请日期2002年9月3日 优先权日2002年9月3日
发明者曾凡一, 黄淑帧, 曾溢滔 申请人:上海凡华生物技术有限公司