专利名称：一种提高昆虫病毒增殖效率的方法
技术领域：
本发明涉及昆虫病毒的增殖和对昆虫幼虫的敏感性。具体地说，涉及一种利用昆虫病毒增效蛋白和昆虫病毒包涵体在体外经爆破技术获得的病毒粒子，提高昆虫病毒有效增殖的方法；还涉及提高昆虫幼虫对昆虫病毒的敏感性，提高昆虫病毒杀虫剂活性的方法。
背景技术：
1956年，Tanada等首次从美洲一星粘虫颗粒体病毒(Pseudaletia unipunctagranulosis virus，PuGV)分离出增效蛋白，并证实该增效蛋白对美洲粘虫核型多角体病毒(Pseudaletia unipuncta nuclear polyhedrosis virus，PuNPV)具有增强感染的作用(Tanada Y et al.，J Invertebr Pathol，1959，1215-231)。Hashimoto(Hashimoto Y et al.，J Gen Virol，1991，722645-2651)和Roelvink(Roelvink P Wet al.，J Gen Virol，1995，762693-2705)分别对粉纹夜蛾颗粒体病毒(Trichoplusiani granulosis virus，TnGV)、PuGV、棉铃虫颗粒体病毒(Heliothis armigeragranulosis virus，HaGV)增效蛋白基因进行了克隆和序列分析，比较了它们的同源性。目前，已在9种颗粒体病毒、舞毒蛾核型多角体病毒(Lymantria disparnuclear polyhedrosis virus，LdNPV)和东方粘虫痘病毒(Pseudaletia separataentomopovirus，PsEPV)等4种痘病毒中发现了昆虫病毒增效蛋白(Hayakawa T etal.，Gene，1996，177269-270)。
昆虫病毒增效蛋白是病毒基因编码的一种金属蛋白酶，分子量为89-110kDa，具有一个典型的金属蛋白酶锌-结合域HEXXH，位置十分保守，且对中肠围食膜的降解作用受到金属螯合剂的抑制(Lepore L S et al.，Invertebr Pathol，1996，68131-140)。
昆虫病毒增效蛋白能提高昆虫的敏感性，加速NPV的感染进程(Tanada Y etal.，Insect Pathol，1959，1215-231)，同时能提高苏云金杆菌伴孢晶体对幼虫的毒力(Corsaro B G et al.，A parasites and pathogens of insectsII.Pathogens.San DiegoAcademic Press，1993.127-145)。增效蛋白的作用机制有两种一种是增效蛋白能与中肠细胞膜上的特异位点结合，介导病毒囊膜与细胞质膜之间的融合，促进病毒进入宿主细胞内，从而增加病毒感染的效果。另一种机制是增效蛋白通过降解肠粘蛋白IIM而破坏昆虫幼虫中肠围食膜，使病毒粒子更容易进入中肠细胞，同时提高了某些必须穿透围食膜而发生作用的生物杀虫剂的效能(Wang P et al.，Natl Acad Sci USA，1997，946977-6982)。
目前，获得昆虫病毒增效蛋白的方式有以下几种(1)从颗粒体病毒、核型多角体和痘病毒中分离纯化获得增效蛋白。(2)将增效蛋白基因重组在AcMNPV等广谱MNPV中，构建广谱高效的重组病毒。含增效蛋白基因的重组AcMNPV比野生型AcMNPV的感染能力略低，但当与野生型AcMNPV适当比例混合时，则其感染能力高于野生型病毒。(3)构建含增效蛋白基因的转基因植物，提高害虫对昆虫病毒的敏感性。(4)在原核细胞和真核细胞中表达增效蛋白。
昆虫包涵体病毒包括核型多角体病毒、质型多角体病毒、颗粒体病毒和痘病毒。在自然环境下，昆虫包涵体病毒以包涵体形式存在。包涵体由包涵体蛋白组成，其内包埋有病毒粒子。包涵体在自然环境中，非常稳定，能长时间保存其活性。当昆虫吞食包涵体后，进入中肠的包涵体，在高pH下迅速碱解，释放出病毒粒子。继而病毒粒子在细胞中复制，产生子代病毒，引起昆虫幼虫罹病死亡。病毒的作用效果与宿主的龄期、温度、阳光照射以及多角体浓度有关。
昆虫病毒是一种很好的生物杀虫剂，是生物防治的重要手段之一。昆虫病毒杀虫剂的优点在于特异性强、致病力高、稳定性好、安全、不污染环境，用后能引起害虫群体病毒性疾病流行传播，可自然控制害虫消长，并导致相继世代持续带毒，罹病死亡。目前，国内外已有30多种昆虫病毒杀虫剂进行了登记、注册、生产和应用。但是，昆虫病毒杀虫剂仍存在诸多问题，解决病毒增殖技术和降低生产成本是病毒商品化生产的关键问题之一。目前，采用细胞培养生产病毒存在产量、成本等一些问题。昆虫病毒杀虫剂大多采用人工饲料饲毒或天然食料田间接毒感染增殖病毒。
人工增殖病毒时，一般以2龄幼虫感染增殖病毒，但病毒增殖水平较低。尽管4、5龄幼虫最好，但由于大龄幼虫抗病性强，潜育期长，化蛹率高。采用增效蛋白与昆虫病毒包涵体经爆破所获得的病毒粒子混合感染大龄幼虫，缩短了潜育期，降低了化蛹率，老龄幼虫虫体大，内容物丰富，从而提高了病毒增殖效率。
昆虫病毒杀虫剂杀虫速度缓慢。昆虫病毒在体内潜育期较长，感病昆虫发病时间拖得很长，而虫口基数较大，虫子仍会对作物造成危害，防治效率较低。低龄幼虫敏感性强，幼虫龄期越小，对病毒的敏感性越强，死亡率高。随着虫龄龄期的增长，幼虫的抗病性越来越强，死亡率降低，防治效果越差。昆虫病毒增效蛋白与昆虫病毒包涵体经爆破获得的病毒粒子混配，感染昆虫幼虫，能缩短潜育期，加速死亡，且对大龄期的昆虫幼虫防治效果好。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术存在的问题和不足，而提供一种提高昆虫病毒增殖效率的方法，即提供一种提高昆虫病毒增殖水平，提高昆虫病毒杀虫剂及其含有昆虫病毒的复合杀虫剂的杀虫活性，提高生防效率的方法。
具体地说第一，利用昆虫病毒增效蛋白与昆虫病毒包涵体经爆破获得的病毒粒子混合感染大龄昆虫幼虫，体内高效高水平增殖病毒的方法。
第二，利用昆虫病毒增效蛋白和病毒粒子复配，提高昆虫病毒杀虫活性、提高生防效率的方法。
第三，利用体外昆虫病毒包涵体爆破，制备病毒粒子，用于提高昆虫病毒杀虫剂及其含有昆虫病毒的复合杀虫剂针对转昆虫病毒增效蛋白基因的植物杀虫活性、提高生防效率的方法。
本发明的目的是这样实现的通过凝胶过滤和离子交换等生化技术从粉纹夜蛾颗粒体病毒等昆虫病毒中分离纯化获得增效蛋白，或者通过基因工程的方法从原核生物或真核生物中表达纯化获得昆虫病毒增效蛋白。在体外，用人工爆破技术，如碱解液碱解昆虫病毒包涵体，获得病毒粒子。
利用昆虫病毒增效蛋白与昆虫病毒包涵体经爆破获得的病毒粒子混合感染大龄昆虫幼虫，体内高效高水平增殖病毒的方法人工增殖病毒时，用昆虫病毒增效蛋白与昆虫病毒粒子混合感染3-4龄昆虫幼虫，感染幼虫潜育期缩短、化蛹率降低，幼虫虫体大，内容物丰富，病毒增殖效率高。
利用昆虫病毒增效蛋白和病毒粒子复配，提高昆虫病毒杀虫活性、提高生防效率的方法用昆虫病毒增效蛋白和经人工爆破技术获得的病毒粒子复配，用于病毒杀虫剂或含病毒的复合杀虫剂的制备，应用于生物防治，缩短了病毒在幼虫中的潜育期，加速了幼虫死亡，且对大龄期的昆虫幼虫防治效果好，提高了昆虫病毒的杀虫活性。
利用体外爆破昆虫病毒包涵体，制备病毒粒子，用于提高昆虫病毒杀虫剂及其含有昆虫病毒的复合杀虫剂针对转昆虫病毒增效蛋白基因的植物杀虫活性、提高生防效率的方法采用爆破技术获得的昆虫病毒粒子制备昆虫病毒杀虫剂，用于转增效蛋白基因植物的虫害防治。由于该转基因植物能表达昆虫病毒增效蛋白，增效蛋白破坏了幼虫中肠围食膜，使直接进入中肠中的病毒粒子不需碱解过程感染中肠细胞，提高了病毒的感染效率，较包涵体病毒杀虫活性高。
利用基因工程方法构建工程菌株，表达、纯化获得昆虫病毒增效蛋白，包括美洲一星粘虫颗粒体病毒(Pseudaletia unipuncta granulosis virus，PuGV)增效蛋白；粉纹夜蛾颗粒体病毒(Trichoplusia ni granulosis virus，TnGV)；棉铃虫颗粒体病毒(Heliothis armigera granulosis virus，HaGV)；舞毒蛾核型多角体病毒(Lymantria dispar nuclear polyhedrosis virus，LdNPV)；东方粘虫痘病毒(Pseudaletia separata entomopovirus，PsEPV)；黄地老虎颗粒体病毒(Agrotissetegum granulosis virus，AsGV)等昆虫病毒增效蛋白。
本发明具有以下优点和积极效果①利用昆虫病毒增效蛋白与昆虫病毒包涵体经爆破获得的病毒粒子混合感染大龄昆虫幼虫，能高效高水平在体内增殖昆虫病毒，提高病毒增殖效率。
②利用昆虫病毒增效蛋白和经人工爆破技术获得的病毒粒子复配，用于病毒杀虫剂或含病毒的复合杀虫剂的制备，应用于生物防治，缩短了病毒在幼虫中的潜育期，加速了幼虫死亡，且对大龄期的昆虫幼虫防治效果好，提高了昆虫病毒的杀虫活性。
③采用爆破技术获得的昆虫病毒粒子制备昆虫病毒杀虫剂，用于转增效蛋白基因植物的虫害防治，能提高昆虫病毒杀虫剂及其含有昆虫病毒的复合杀虫剂针对转昆虫病毒增效蛋白基因的植物杀虫活性、提高生防效率。
具体实施例方式
1、昆虫病毒增效蛋白的制备(1)昆虫病毒增效蛋白的分离和纯化粉纹夜蛾颗粒体病毒等昆虫病毒增效蛋白的制备用昆虫病毒人工感染昆虫幼虫，收集病死的幼虫，匀浆，差异离心3次，得到较纯净的多角体。再经30-60％(w/w)蔗糖密度梯度离心，取出多角体带，洗去蔗糖可得纯净多角体。将沉淀配成1.0×109PIB/mL的病毒原液。将昆虫病毒包涵体调至2.0×109PIB/ml，与等体积0.1mol/LNa2CO3-0.17mol/LNaCl溶液充分混合，4℃作用50min，37℃保温至液体由浑浊变澄清时，中止反应，用1mol/L HCl将溶液调至pH7.0。
通过凝胶过滤和离子交换等生化技术从粉纹夜蛾颗粒体病毒等昆虫病毒中分离纯化获得增效蛋白。
(2)昆虫病毒基因工程增效蛋白的制备通过基因工程的方法从原核生物或真核生物中表达纯化获得昆虫病毒增效蛋白。
挑取含有昆虫杆状病毒增效蛋白基因的工程菌株，如E.coliM15(pQE-TnGVEnCp96)、E.coliM15(pQE-TnGVNp85)、E.coliM15(pQE-TnGVCp80)、E.coliM15(pQE-TnGV-Enp108)、E.coliM15(pQE/EnC)、E.coliM15(pQE32/En)等单菌落于含100μg/ml氨苄青霉素和25μg/ml卡那霉素的25ml LB培养基中，37℃，200rpm过夜培养。以1∶20接种含100μg氨苄青霉素和25μg/ml卡那霉素的500ml LB培养液中，继续培养，当其浓度OD600＝0.3时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷至终浓度1mmol/L，37℃诱导5h，收获菌液，4000rpm离心10min，收集菌体沉淀。
在细菌沉淀中加入2-5倍体积的超声波处理液(50mmol/L Tris-HCl pH8.0-0.1mol/L NaCl-2mg/ml溶菌酶)，反复冻融3次，37℃，保温1h，然后置于冰中用超声波破碎细菌。置于光学显微镜高倍物镜观察，有大量晶体。处理液上30-60％蔗糖梯度，4000rpm离心40min，取出包涵体带，用灭菌双蒸水洗3次，收获纯化的增效蛋白晶体，4℃保存。
2、增效蛋白的鉴定采用SDS-PAGE电泳分析。
(1)上样和电泳参照Sambrook“分子克隆手册”，制备10％分离胶和浓缩胶。在样品中加等体积2×SDS凝胶加样缓冲液，于100℃加热3-5min变性。样品上样。以100V电泳至溴酚兰进入分离胶，提高电压至150V，当溴酚兰到达底部前约1cm处结束电泳。
(2)固定、染色和脱色剥胶后以5倍体积染液固定、染色过夜，收凝胶浸泡于脱色液中平缓摇动4h以上，其间更换脱色液4-5次。
(3)结果分析脱色完全后即可观察照像，并用激光扫描确定增效蛋白的纯度和含量。
3、昆虫病毒粒子的制备将昆虫病毒包涵体调至2.0×109PIB/ml，与等体积0.1mol/L Na2CO3-0.17mol/LNaCl溶液充分混合，4℃作用50min，37℃保温至液体由浑浊变澄清时，中止反应，用1mol/L HCl将溶液调至pH7.0。
4、昆虫病毒的增殖水平用1×107PIB/mlAcMNPV碱解后的病毒粒子和103OB/ml粉纹夜蛾颗粒体病毒增效蛋白P108混合感染4龄银纹夜蛾幼虫，并设1×107PIB/ml AcMNPV多角体和单一碱解后1×107PIB/ml AcMNPV病毒粒子对照，以及健康虫对照。幼虫接毒后发育6-7天可化蛹。碱解后的AcMNPV病毒粒子感染死虫的平均重量和单头幼虫AcMNPV多角体的含量均低于AcMNPV多角体的死虫5-7％。由于基因工程增效蛋白P108的加入，病毒粒子与P108混合感染的幼虫平均重量和单头幼虫AcMNPV多角体的含量均高于单一病毒粒子和多角体的感染，并且其幼虫发育速度延滞，相对化蛹率降低35％，其LT50较病毒多角体感染提前1.48d。
5、昆虫病毒粒子与增效蛋白混剂的生物活性测定将AcMNPV(苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒)用血球计数板计数，经碱解后，稀释成其对应于多角体的浓度，即1×102、1×103、1×104、1×105、1×106PIB/ml，各稀释度溶液与增效蛋白P108包涵体复配，使其终浓度为1.0×103OB/ml，分别制成感染饲料。
取3龄初银纹夜蛾幼虫室温下单头饲养于24孔Costar细胞培养皿中，每孔加适量人工饲料，并加30μl上述各种处理液于人工饲料表面，使其充分吸收，幼虫取食48h后补加足量新鲜人工饲料，144h统计死亡和存活虫数，采用DPS系统进行数据处理。结果表明，病毒粒子和增效蛋白P108混剂较病毒多角体增效倍数为4.38。缩短LT501.81d。
权利要求
1.一种提高昆虫病毒增殖效率的方法，包括一种利用昆虫病毒增效蛋白和体外爆破昆虫病毒包涵体，提高昆虫病毒对昆虫幼虫的敏感性，提高昆虫病毒的增殖效率，提高其生防效果的方法；其特征在于利用增效蛋白与体外爆破昆虫病毒包涵体获得的昆虫病毒粒子混配，感染低龄或大龄昆虫幼虫。
2.按权利要求1所述的一种提高昆虫病毒增殖效率的方法，其特征在于利用纯化的昆虫病毒包涵体，分离纯化获得昆虫病毒增效蛋白。
3.按权利要求1所述的一种提高昆虫病毒增殖效率的方法，其特征在于利用基因工程方法构建工程菌株，表达、纯化获得昆虫病毒增效蛋白，包括美洲一星粘虫颗粒体病毒(Pseudaletia unipuncta granulosis virus，PuGV)增效蛋白；粉纹夜蛾颗粒体病毒(Trichoplusia ni granulosis virus，TnGV)；棉铃虫颗粒体病毒(Heliothis armigera granulosis virus，HaGV)；舞毒蛾核型多角体病毒(Lymantriadispar nuclear polyhedrosis virus，LdNPV)；东方粘虫痘病毒(Pseudaletia separataentomopovirus，PsEPV)；黄地老虎颗粒体病毒(Agrotis setegum granulosis virus.AsGV)等昆虫病毒增效蛋白。
4.按权利要求1所述的一种提高昆虫病毒增殖效率的方法，其特征在于通过体外爆破技术，如碱解昆虫病毒包涵体，破坏包涵体蛋白，获得病毒粒子。
5.按权利要求1所述的一种提高昆虫病毒增殖效率的方法，其特征在于利用体外爆破后的病毒粒子针对转增效蛋白基因植物作用，提高了昆虫杆状病毒对昆虫幼虫的敏感性。
全文摘要
本发明公开了一种提高昆虫病毒增殖效率的方法，涉及昆虫病毒的增殖和昆虫幼虫的敏感性。本发明主要是利用昆虫病毒增效蛋白与昆虫病毒包涵体经爆破获得的病毒粒子混合感染大龄昆虫幼虫，使其体内高效高水平增殖病毒；利用昆虫病毒增效蛋白和病毒粒子复配，提高昆虫病毒杀虫活性、提高生防效率；利用体外昆虫病毒包涵体爆破，制备病毒粒子，用于提高昆虫病毒杀虫剂及其含有昆虫病毒的复合杀虫剂针对转昆虫病毒增效蛋白基因的植物杀虫活性、提高生防效率。本发明可广泛适用于昆虫病毒的增殖、病毒杀虫剂及其复合杀虫剂的制备与应用。
文档编号C12N7/00GK1401767SQ0213910
公开日2003年3月12日 申请日期2002年9月26日 优先权日2002年9月26日
发明者孟小林, 徐进平, 王健, 鲁伟 申请人:武汉大学