专利名称：生产重组色氨酸酶的表达系统及重组色氨酸酶的制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，具体地说，本发明涉及一种生产重组色氨酸酶的表达系统，还涉及一种重组色氨酸酶的制备方法及在色氨酸生产中的应用。
背景技术：
L-色氨酸，是一种芳香族氨基酸，是人和动物体内的必需氨基酸，对人和动物的营养供给和促进生长发育十分重要。它被广泛应用于药品和食品工业，并且是继苏氨酸、赖氨酸之后的第三大动物饲料添加氨基酸。
色氨酸的研究和生产前后经历了20多年，生产途径多种多样，主要有蛋白水解提取法、化学合成法、微生物发酵法和酶促转化法四种。就目前的情况来看，无论从高产量还是高效率来说，这四种方法中还没有十分满意的大规模生产色氨酸的方法。但是相比较而言，酶促转化法是目前较为有效的工业化方法。但是迄今为止，掌握这种技术进行工业化生产的还仅限于美国、日本、德国等少数发达国家，我国虽有中国科学院微生物研究所进行了多年的研究工作，正在进行中试放大研究，但他们的工艺仍然使用比较昂贵的丝氨酸为前体原料，工艺上也需要进一步完善。因此，我国还没有比较理想的批量生产色氨酸的高收率、高产量、稳定的生产工艺。故色氨酸非常昂贵，药用原料市价达每公斤上千元人民币，我国目前基本依赖进口。
细菌合成色氨酸是由一系列酶所催化的反应过程，这些酶是由一基因簇表达的，它们组成了色氨酸操纵子。反应的最后一步由色氨酸合成酶(EC4.2.1.20)催化，它能够在细菌细胞中催化L-丝氨酸和吲哚甘油磷酸酯反应产生色氨酸。色氨酸合成酶也可以在体外直接催化吲哚和丝氨酸反应生成色氨酸。为了能够在体外控制反应的合成方向，如要使反应朝着色氨酸的合成方向，就要使用高浓度的丝氨酸或者吲哚。然而，丝氨酸是一种非常贵的原材料，就使得这种方法不经济，而吲哚在低浓度下就对细菌有毒性，因此通过控制吲哚浓度的方法来控制在细菌中的合成反应也是极为不利的。
在细菌细胞中，同时存在着起分解作用的酶——色氨酸酶(EC4.1.99.1)，分子量为220KD，是由4个相同的亚基组成的同质四聚体，每一亚基含有一个磷酸吡哆醛结合位点，催化活性需要单价阳离子如K+和NH4+，它能够催化L-色氨酸分解为吲哚、丙酮酸和氨。其中，丙酮酸和氨都是十分便宜的原料，可以它们的浓度来控制反应向色氨酸合成的方向进行，同时，色氨酸酶对吲哚则具有良好的稳定性。因此，使用色氨酸酶来催化产生色氨酸就具有潜在的经济价值，虽然动力学特征不如色氨酸合成酶，但由于色氨酸酶在生产上具有色氨酸合成酶所无法替代的优点，近年来受到了人们更为广泛的关注，不断寻找着将其用于L-色氨酸生物合成的最佳方法。
然而，使用色氨酸酶在操作过程上也有一定的困难。使用细菌产生高水平的色氨酸酶难度比较大由于普通使用的廉价的细菌生长培养基中含有色氨酸，它会破坏色氨酸酶的存在，而自身被分解产生吲哚，而吲哚在低浓度下对细菌就是有害的，必须克服这一困难。
为了克服吲哚的毒性问题，已知的工序是在培养基中使用表面活性剂。表面活性剂将吲哚同生长环境分离开，从而使细菌周围的吲哚浓度降到最低。然而研究发现，表面活性剂的存在可能对色氨酸酶的活性产生不利的影响。并且，由于表面活性剂的存在，使下游的色氨酸生产过程，变得更加难以操作。
作为普通培养基的替代物，缺乏色氨酸的培养基可以被用来培养色氨酸酶产生菌。然而，这种培养基很贵，使生产成本过高，不适合工业应用。
因此，人们建立了以下的步骤来生产色氨酸。
1)生物催化剂的产生过程增殖宿主细菌细胞，该细菌细胞中转入了带有编码色氨酸酶基因的DNA序列的载体。在载体中，上述的色氨酸酶基因的表达可以直接得到控制。
2)通过诱导色氨酸酶基因的表达来诱导上述宿主细胞合成色氨酸酶。
3)将反应底物加入到高效表达重组色氨酸酶的细菌混合液中使色氨酸在反应混合物中积累。
4)色谱法分离色氨酸。
此生产过程中的生物催化剂的生产和生物转化(酶法合成过程)分开，这样就具有实际用处在生物催化剂的生产阶段，细菌可以充分进行生长，在没有吲哚的情况下，色氨酸酶的生产将达到很高的水平；在随后的生物转化过程中，色氨酸的合成反应也可以充分的进行，因为不需要考虑影响细胞生长的因素，也不需要采取措施来克服吲哚的毒性。这样，应用所发明的生产过程，就解决了传统工艺中为获得高转化率而加入表面活性剂所带来的种种问题。
Deeley等(1981)报道了E.coliK-12的色氨酸酶基因序列。Shibatani等(1987)克隆了Alcaligenes fecalis的色氨酸酶基因，工程菌色氨酸酶产量比野生菌高4倍。Tani等(1990)构建了含色氨酸酶基因的重组质粒pMD6B，转化E.coliK-12 MD55，工程菌色氨酸酶表达量占整个可溶性蛋白的30％。张玉彬等(1996)构建重组质粒pTase 9，转化E.coli JM105，其色氨酸酶表达量占菌体总蛋白的30％，但酶活只是供体菌的2倍。
韦平和等应用PCR技术从E.coli JM105中扩增出长约1.4Kb的色氨酸酶基因，将其插入表达载体pET3a的Nde I/Bam HI位点，转化E.coli BL21(DE3)，所构建的产色氨酸酶基因工程菌，其色氨酸酶的表达量占细胞总可溶性蛋白的69.8％，并且做了色氨酸酶活力的测定，其中酶活力最高的工程菌比宿主菌高16倍。但这种表达蛋白分离纯化困难，回收率仅20％，而且采用这种表达载体生产的色氨酸酶活性低，很多蛋白在分离纯化中丢失，而且费力耗时，特别是需要制备大量的色氨酸酶蛋白尤其如此。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生产重组色氨酸酶的表达系统，该表达系统产生的色氨酸酶蛋白产量高，容易分离纯化。
本发明的另一个目的是提供一种重组色氨酸酶蛋白的制备方法。
本发明的再一个目的是提供高活性的色氨酸酶蛋白从而进行色氨酸生产的应用。
本发明提供了一个新的生产色氨酸酶蛋白的表达系统，该系统含有连接至质粒的编码色氨酸酶的DNA片段，其特征是在T7噬菌体启动子下游，连接有15-18个编码5-6个连续组氨酸的碱基。在本发明中，首先设计一对引物，5’ggaattcatgaaggattatg taatggaa 3’，5’gaagctttta aacttcttta agttttgcg 3’；其次是应用PCR技术从大肠杆菌(E.coli)TG1株中扩增出长约1.4Kb的色氨酸酶基因，将其插入到表达载体pET28a的EcoRI/HindIII位点以构建重组质粒pEVT，重组载体pEVT在T7噬菌体启动子下游，连接有15-18个编码5-6个连续组氨酸的碱基；第三是将重组载体转化克隆宿主E.coli TG1，挑单菌落培养，提取并筛选阳性重组质粒，再将其转入表达宿主E.coli BL21(DE3)，构建色氨酸酶基因工程菌。
在本发明的一种优化方案是本发明提供了一种表达载体，是连接有18个编码6个连续的组氨酸的碱基的载体pVET，CCTCC M202038。其含有能编码色氨酸酶蛋白的DNA片段，适宜的PCR引物选自SEQ ID NO1和SEQ ID NO2组成的引物而获得该DNA片段，并且在T7噬菌体启动子下游，连接有18个编码6个连续组氨酸的碱基。这样含有该表达系统的宿主细胞将表达易分离纯化且有生物学活性的色氨酸酶蛋白，而且产量稳定，活性高。
本发明提供的DNA片段可在大肠杆菌中表达，优选大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。
本发明还提供了一种分离纯化色氨酸酶蛋白的方法。使用本发明提供的重组载体表达的色氨酸酶蛋白，是一融合蛋白，其显著特征是在N端含有5-6个连续的组氨酸，偏碱性，带正电荷，这样易于结合在固定化的组氨酸-蛋白质镍亲和层析树脂柱上，并且该融合蛋白N端附加的氨基酸不会对酶的活性造成任何的影响。当进行色氨酸酶蛋白纯化时，首先离心沉淀收集菌液中的菌体，再将菌体悬浮于由Tris·Cl、NaCl等组成的缓冲液中，超声波裂解菌体，离心，收集上清液，过柱，色氨酸酶蛋白便选择性地吸附至固定化的组氨酸-蛋白质镍亲和层析树脂柱上，先用洗涤液(50mM Na3PO4，pH 8.0、0.3M NaCl、10mM咪唑)洗涤，然后利用洗脱液(50mM Na3PO4，pH 8.0、0.3M NaCl、250mM咪唑)洗脱结合的色氨酸酶蛋白，从而获得含有色氨酸酶蛋白的溶液。洗脱的色氨酸酶蛋白分子量在50KD与60KD之间。
在本发明的又一个优选实施方案中，本发明提供了采用本发明生产的色氨酸酶蛋白在制备色氨酸中的应用。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果其纯度在90％以上，回收率在60％以上。本发明提供的色氨酸酶蛋白额外地含有不影响该酶生物学活性却对该酶的的分离纯化至关重要的5-6个连续组氨酸，偏碱性，带正电荷，易于同固定化的含有组氨酸-蛋白质镍亲和层析树脂柱结合。这样不需额外的化学处理而降低生产成本，提高回收率。
图1产色氨酸酶蛋白表达载体的构建示意2色氨酸酶蛋白tnaA基因PCR扩增电泳图谱，图中1、2、3、4PCR产物5PCRMarker图3用Pst I消化PCR产物电泳图，图中1、2PCR产物被PstI消化所得的两个片段3Lambda DNA/HindIII+EcoR I Marker 4、5PCR产物图4连接反应电泳图，图中1、2、3、4连接反应产物5PCRmarker 6质粒pET 28a图中a.外源DNA.PCR产物经双酶切后回b.载体DNA.pET 28a质粒经双酶切后回收的产物c.重组的质粒DNApET 28a+tnaA gene图5重组质粒DNA的酶切电泳图谱，图中1、2用HindIII和EcoR I消化重组质粒所得产物3Lambda DNA/HindIII+EcoR I Marke 4PCR产物5质粒pET28a图6重组色氨酸酶蛋白SDS-PAGE图谱，图中1、2、3所构建的工程菌所表达的色氨酸酶4宿主菌(E.coil BL21)5标准蛋白分子量图7单克隆菌落平板划线示意图。
具体实施例方式
下面结合具体实施例。进一步阐述本发明，应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南(第二版)；D.L.斯佩克特等，科学出版社，2001，细胞实验指南等书中所述的条件；或接照制造厂商所建议的条件。
实施例1、色氨酸酶蛋白表达载体的构建PCR扩增色氨酸酶基因用灭菌枪头挑取E.coli TG1单菌落悬作为克隆基因所用的模板，浮于20μL裂解液(裂解液组成为NP-40与Tween-20分别取0.5体积，溶于99体积的双蒸水中，混匀，每种浓度均为0.5％)，再加20μL的水，充分振散后于100C温浴15min，离心(15000rpm，10min)取上清10μL用于总体积100μL的PCR反应。PCR反应体系为100μL，加样清单如下10×buffer10μL引物11μL引物21μL4dNTP2μL灭菌ddH2O75μL模板10μLTaq DNA聚合酶1μL95℃预变性5min循环条件94℃变性1min、57℃复性1min、72℃延伸1min，循环反应30次，再72℃延伸10min。
其中引物1(引导引物，5OD)溶于500μL无菌水，浓度为37.8μmol/L，贮于-20℃，含有SEQ ID NO1；引物2(折返引物，5OD)溶于500μL无菌水，浓度为37.2μmol/L，贮于-20℃，含有SEQ ID NO2；10×buffer为500mmol/L KCl、100mmol/L Tris·Cl，PH 9.0(25℃)、0.1％(v/v)Triton X-100、15mmol/L MgCl2；DNA模板为E.coli TG1的DNA；DNA聚合酶为2u/μL Taq。获得含有色氨酸酶蛋白基因的DNA片段，再将此DNA片段经EcoRI和HindIII双酶切，与经EcoRI和HindIII双酶切的载体pET 28a通过T4DNA连接酶连接，构建重组表达载体tnaA/pET 28a，此表达载体保藏在国家知识产权局指定并认可的中国典型培养物保藏中心作申请专利目的的保藏保藏号CCTCC M202038保藏日2002年9月29日载体名称pEVT
实施例2色氨酸酶蛋白基因PCR产物的回收用PCR产物回收试剂盒(购于CLONTECH公司)回收PGR产物1)使用前，在缓冲液NT3中加入64mL 95％的乙醇。
2)用TE缓冲液(pH 8.0)将反应混合物的体积调到100μL。
3)仔细旋转NucleoTrap PCR悬液直到小珠子完全的重悬。
4)加入400μL缓冲液NT2和10μL NucleoTrap PCR悬液到反应混合物中。
5)在室温放置样品10分钟。此间每隔2-3分钟快速旋转一下管子。
6)将样品于室温离心，14000rpm，30秒，弃上清。
7)在小珠子中加入400μL缓冲液NT2，快速摇动一下，又于室温离心14000rpm，30秒，弃上清。
8)在样品中加400μL的缓冲液NT3，快速摇动于室温14000rpm离心30秒。弃上清。
9)重复步骤8。
10)再次于室温离心小珠子，14000rpm，30秒。于室温下空气干燥小珠子15分钟。
11)先加20μL的无菌水，旋转重旋小珠子。
12)在室温将样品放置10分钟以洗脱DNA，在放置期间旋转混合物2-3次。
13)于室温14000rpm离心样品30秒，转移含有纯化的DNA片段的上清夜到另一个100μL的EP管中。
14)再在小珠子中加10μL的无菌水，旋转小珠子，再重复12)、13)步的操作。这样100μL的PCR产物可以回收为30μL。该方法也适用于酶切PCR产物的回收以及酶切质粒的回收。
实施例3、色氨酸酶蛋白DNA片段的确定PCR产物cDNA片段的粗检取5μL PCR产物在1％的琼脂糖凝胶(预加溴化乙锭)上检查PCR产物。Marker选用PCR Markers(参照片段1543，994，697，515，377，237)。
如果片段大小与预期一致，并且没有杂带，则接着做下面的步骤。如果有杂带，则需提高复性温度，并适当减少循环次数，直到没有杂带为止。
如附图2所示。
由于tnaA基因上存在一个Aat I(AGGCCT)酶切位点，pos381；一个PstI(CTGCAG)酶切位点，pos616；Alu I(AGCT)酶切位点，pos.252，873，1168，所以可用酶切方法进行PCR产物的再检测，本实验选用Pst I进行酶切，用PCR产物回收试剂盒回收的PCR产物，用Pst I酶切PCR产物，再进行电泳，有0.6Kb和0.8Kb的片段产生，则证明PCR产物为预期的所要扩增的基因。选用20μL的酶切体系进行鉴定1μL DNA+2μL 10×buffer B+1μL Pst I+2μL BSA+14μLBSA+71μLH2O将PCR扩增产物在1％琼脂凝胶上电泳，可以得到一条长度约1.4kb的DNA片段，该片段与Deeley等(1981)报道的色氨酸酶基因(maA)的大小一致，如图2所示。E.coli色氨酸酶基因上存在单一的Pst I酶切位点，所以酶切以后应该得到两个片段，大小分别为0.8kb和0.6kb，如附图3所示实施例4、含色氨酸酶蛋白基因重组质粒的构建及该质粒的鉴定质粒与回收PCR产物的酶切处理质粒单酶切预实验由于选用双酶切体系，所以并不能保证在两个酶切位点都能酶切完全，也就是说可能只有一种酶起了作用，这对于后面的连接反应是非常不利的，所以只有用同一种缓冲液进行单酶切预实验，摸一下对两种酶都合适的反应条件，再在此条件下进行双酶切。
将质粒载体pET 28a取1μL跑电泳，与适当的1μL Marker进行对比，因为Marker的最亮的带为0.5μg/μL，就可以粗略估计其浓度以确定反应物的量，进行20μL体系的预试验1μLDNA+2μL 10×bufferB+1μLEcoRI+2μLBSA+14μLH2O1μLDNA+2μL 10×bufferB+1μLHindIII+2μLBSA+14μLH2O
对产物进行电泳，如果产物带清晰且只有一条，就可以进行下面的双酶切实验。
质粒载体与回收的PCR产物的双酶切取1μL质粒pET 28a用EcoRI、HindIII进行酶切。
先进行20μL体系的小试1μLDNA+2μL 10×bufferB+1μLhindIII+1μLEcoR I+2μLBSA+13μL H2O于37℃水浴保温4h-7h，也可以过夜，以保证酶切的完全。
取3μL酶切反应物电泳，如果电泳的带细、无杂带，而且亮度还可以，则可以将反应体系放大为100μL。
100μL酶切体系5μL DNA+10μL 10×buffer+2μL hindIII+2μLEcoR I+10μL BSA+71μL H2O将检测剩下回收PCR产物按1.2.2.1的方法粗略估计其浓度，以确定反应物的量，进行双酶切处理。PCR产物酶切的完全与否是无法用电泳检测，不过由于有对质粒载体进行处理的经验，所以酶切体系直接定为100μL5μL DNA+10μL 10×buffer+2μL hindIII+2μLEcoR I+10μL BSA+71μL H2O载体和PCR产物的酶切可以同时进行，于37℃水浴保温4h-7h，也可以过夜，以保证酶切的完全。
用PCR产物回收试剂盒回收酶切产物，并与上面回收的tnaA基因PCR产物一起用电泳分析，观察酶切的效果，并比较酶切质粒与酶切PCR产物之间的亮度。
本实验得到两管酶切PCR产物的回收产物，两管酶切质粒的回收产物。
连接反应1)取四支eppendorf离心管，标上记号1#、2#、3#、4#。
2)根据电泳的亮度按表二的量依次加入水、buffer、V-DNA、P-DNA、T4DNA连接酶。
表二连接反应加样清单
3)用微量吸样枪头轻轻搅几下使混合，然后离心3分钟，置室温下(约18℃过夜。
4)次日取出，1#、2#、3#、4#、5#、6#各取3μL反应液进行电泳，看连接效果。如附图4所示。
感受态细胞制备1)在5mL的培养液中接种一环E.coli TG1(从平皿的菌落挑)，37℃振荡培养过夜。
2)用1.5×18cm试管装10mL的培养液，接种0.01mL的上述培养过夜的细菌，37℃快速振荡，培养2-3小时，此时可见试管内液体呈浑浊状，如果感觉仍比较清亮，可适当延长培养时间，但是一定注意不要太久，否则细菌就长老了，制备感受态细胞效果很差。有条件可以测OD550，其范围应在0.4-0.6之间。
3)用6支1.5mL的离心管(带盖子)每管装1mL培养物于4℃ 5500rpm离心5分钟，弃上清液。
4)在每管中加入4℃预冷的CaCl20.50mL(50mmol/L CaCl2，用蒸馏水配制，pH 6.6至6.9之间)后，用100mL的枪头一端温和地吸吹使沉淀地细胞分散悬浮。把管子插入冰中放20分钟，以后操作过程管子尽量不离4℃或冰。
5)于4℃5500rpm离心5分钟弃去上清。
6)每管加入0.10mL地冷的50mmol/L CaCl2，使细胞悬浮和分散，操作同4)，然后把管子插入冰中放4℃保存，在12-24h内做转染用。
DNA转染1)取3支无菌试管标上号码，插入冰中预冷。
2)依下表在其中四支管中加入感受态细胞0.3mL(吸取前先轻轻摇匀)。
DNA转化加样清单
3)如上表所示地相应的管中加入相应的DNA。
4)轻摇几下管子使DNA和细胞均匀接触，插入冰中保持40分钟。
5)把管子转到42℃水浴中，保温2分钟后加入3mL的LB培养液，在37℃培养2-3小时。
6)分别取75μL涂平板(含卡那霉素Kan的LB平板)。倒置平皿于37℃培养过夜。然后检查结果。
7)随机挑选的带质粒的细菌，在事先划好格子的培养基(含kan的LB培养基)中划线，如图7所示。
质粒DNA的小量制备收获1)将3mL含相应抗生素的LB加入到容量为1.5×18mL并通气良好(不盖紧)的试管中，然后接入一单菌落，于37℃剧烈振摇下培养过夜。
2)将1.5mL培养物倒入微量离心管中，用微量离心机于4℃以4000rpm离心5min，将剩余的培养物贮于4℃。
3)吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。
碱裂解法提取1)将细菌沉淀重悬于100μL用冰预冷的溶液I中，剧烈振荡。
2)加100μL新配制的溶液II。
盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物。应确保离心管的整个内表面均与溶液II接触。不要振荡，将离心管放置于冰上。
3)加200μL用冰预冷的溶液III。
盖紧管口，将管倒置后温和地振荡10秒钟使溶液III在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上3-5分钟。
4)用微量离心机于4℃以12000g离心5分钟，将上清转移到另一离心管中。
5)加等量酚氯仿，振荡混匀，用微量离心机于4℃以15000rpm离心2分钟，将上清转移到另一离心管中。
6)用2倍体积的乙醇于室温沉淀双链DNA。振荡混合，于室温放置2分钟。
7)用微量离心机于4℃以15000rpm离心5分钟。
8)小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。
9)用1mL 70％乙醇于4℃洗涤双链DNA沉淀，按步骤8)所述方法去掉上清，在空气中使核酸沉淀干燥至呈现透明状。
10)溶于30μL水中，贮存于-20℃，再逐一进行酶切分析。
限制性酶切鉴定质粒中外源DNA片段的插入1)用EcoRI、HindIII双酶切所提取质粒，方法同前质粒载体与回收的PCR产物双酶切。琼脂糖凝胶电泳观测。
2)如果发现能从质粒上切下大小为1.4Kb的DNA片段，则此质粒基本确定为所需的重组质粒。将此质粒转入表达宿主E.coli BL21(DE3)，涂平板，挑选单菌落进行划线培养。方法与转入克隆宿主菌E.coli TG1是一致的。
鉴定结果如附图5所示。
实施例5、色氨酸酶蛋白表达系统的制备与诱导表达色氨酸酶蛋白表达系统的制备将此质粒转入表达宿主E.coli BL21(DE3)，涂平板，挑选单菌落进行划线培养。方法与转入克隆宿主菌E.coli TG1是一致的。
色氨酸酶的诱导表达1)含质粒pET 28a的E.coli BL21单克隆菌落、含重组质粒的E.coli BL21单克隆菌落分别接种于5mL的含Kan的LB培养基，于37℃振荡培养过夜以获得饱和培养物。
2)将含质粒pET 28a E.coli BL21单克隆菌落、含重组质粒的E.coli BL21单克隆菌落的饱和培养物50mL分别接种于5mL、7mL的含Kan的LB培养基中，于37℃培养2小时。
3)取1mL两种未诱导的培养物转移至微量离心管中。按步骤4)和5)进行处理。其余加IPTG至种浓度为1mmol/L，对培养物进行诱导。
5)含质粒pET 28a的E.coli BL21单克隆菌落在诱导后3小时取出1mL经过诱导的培养物，含重组质粒的E.coli BL21单克隆菌落分别在诱导后0.5、1、2、3和6小时取出1mL经过诱导的培养物，迅速在室温下以12000g离心1分钟，弃去上清夜。
6)将每一沉淀重悬于100μL含Tris·Cl和NaCl，pH 8.0的缓冲液中，40Hz超声波破碎细菌，离心取上清。
7)加入100μL的2×SDS凝胶加样缓冲液中，100℃加热3分钟。所有被收集样品均贮存于0℃，以备在凝胶上加样。
实施例6、色氨酸酶蛋白确定聚丙烯酰胺凝胶电泳1)所选用丙烯酰胺浓度为12％，2)安装玻璃板。
3)按表一给出的数值在一三角锥瓶中按所需丙烯酰胺浓度配制一定体积的分离胶溶液。依次混合各成分。一旦加入TEMED，马上开始聚合，故应立即快速旋转混合物并进入下步操作。
4)迅速在两玻璃板间的间隙中灌注丙烯酰胺溶液，留出灌注浓缩胶所需空间，梳子的齿长再加1cm。用巴斯德吸管小心地在丙烯酰胺溶液上覆盖一层乙醇，将凝胶垂直放置于室温下。
5)分离聚合完全后30分钟，倾出覆盖层液体，用去离子水洗涤凝胶顶部数次以除去未聚合的丙烯酰胺，尽可能排去凝胶上的液体，再用纸巾的边缘吸净残留液体。
6)按下法制备浓缩胶按表一给出的数据在一个一次性使用的塑料试管中制备一定体积及一定浓度的丙烯酰胺溶液，依次混合各成分，一旦加入TEMED，马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下一步操作。
7)在已聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶，立即在浓缩胶溶液中插入干净的Teflon梳子。小心避免混入气泡，再加浓缩胶溶液以充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下。
8)积层胶聚合完全后30分钟，小心移出Teflon梳子，使用能喷射水流的瓶子，立即用去离子水洗涤加样槽以除去未聚合的丙烯酰胺。如有必要，使用接于注射器的平头皮下注射针头把积层胶上加样槽之间的齿弄直。把凝胶固定于电泳装置上，上、下槽各加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡，为此最好使用接上注射器的弯形皮下注射针头。
9)按预定顺序加样，每样品加15μL，为能把样品加到样品孔底部，最好使用Hamilton微量注射器，每加完一个样品应在下槽缓冲液中洗涤加样注射器，最后在所有不用的样品孔中加上等体积的1×SDS凝胶加样缓冲液。
10)将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为8V/cm。当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到15V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部(约需4小时)，然后关闭电源。
11)从电泳装置上卸下玻璃板，放在纸巾上，用刮勺撬开玻璃板。紧靠最左边一孔凝胶下部切去一角以标注凝胶的方位。
12)用至少5倍体积的染液浸泡凝胶，放在平缓摇动的平台上于室温染色4小时以上。
13)移出并回收染液以被后用，将凝胶浸泡于不加染料的甲醇-乙酸溶液中，平缓摇动4-8小时，其间应更换脱色液三四次。
14)脱色后，将凝胶拍照，获得的蛋白质分子量大小为58KD，与色氨酸酶蛋白的分子量大小一致。
经过SDS-PAGE检测，检测到了一条分子量约为5.8KDa的显著加深的蛋白。因为所表达的色氨酸酶其实是融合蛋白，色氨酸酶前面有一段附加的氨基酸序列。扫描结果表明，色氨酸酶的表达量占细胞中总可溶性蛋白的百分率平均为40％左右。
如附图6所示。
实施例7、色氨酸酶蛋白的纯化方法使用His-Bond Ni Affinity Resin(组氨酸-蛋白质镍亲和层析树脂)抽提1)用超声波裂解菌液，方法见色氨酸酶的诱导表达。
2)细菌彻底裂解后，超速离心，将上清小心移入一干净的离心管中，将咪唑的浓度调节至1-20mM，氯化钠的浓度调节至0.15-0.5M，pH值调节至7.0-8.0之间，开始纯化。
小量纯化(试纯化)1)彻底悬浮His-Bond Ni Affinity Resin，移取40μL至一离心管中，5000×g离心30秒，小心弃上清。
2)加入200μL平衡液(参看使用说明书的配方)温和混匀后，5000×g离心30秒，小心弃上清。
3)加入100μL澄清的含目的蛋白质的溶液，温和地混匀1分钟后，5000×g离心30秒，小心将上清移入一个干净地离心管中。
4)在树脂沉淀中加入500μL洗涤液(参看使用说明书的配方)，温和混匀后，5000×g离心30秒，小心将上清液移入一个干净地离心管中，同样再洗涤一次。
5)加入50μL洗脱液，温和混匀后，5000×g离心30秒，小心将上清移入一个干净的离心管中，同样再洗涤一次。
6)将收集于各离心管中的液体上样电泳(SDS-PAGE)，以检测目的蛋白质是否很好的纯化。
大量纯化
1)彻底悬浮His-Bond Ni Affinity Resin，移取适量的至一个层析柱中，先用2倍体积的去离子水洗涤，再用3倍体积的平衡液洗涤。
2)加入澄清的含目的蛋白质的溶液，将流速控制于2-10倍体积柱/小时。
3)当含目的蛋白质的溶液不再流出时，加入洗涤液洗涤树脂，将流速控制于10-20倍柱体积/小时。当流出液的280nm值接近洗涤液的值时，洗涤完成。
4)加入3-10倍体积的洗脱液洗脱目的蛋白质，将流速控制于2-10倍柱体积/小时。分步收集流出液，并测定出蛋白质的所在。
采用本发明生产的色氨酸酶蛋白其纯度在95％以上，回收率在60％以上。
实施例8、色氨酸酶蛋白活力测定按韦平和论文中的方法并参考Wood等(1947)和胡永红方法并加以改进。并且将酶的活力单位定义为在上述反应条件下，于37℃、10min内每形成0.01μmoL吲哚所需要的酶量称为一个酶活力单位。
1)在10mL三角瓶中依次添加0.20mg/mL PLP溶液20μL 5mmol/L还原型谷胱甘肽溶液10μL、粗提酶液(磷酸二氢钾缓冲液悬浮，pH8.0，约100mg湿菌体所含酶量)270μL。
2)用甲苯1mL覆盖上述0.3mL溶液，于37℃保温水浴中保温5min后，加入5mg/mL的色氨酸溶液100μL，置37℃摇床振荡使反应进行10min。
3)添加5％PDAB和5％硫酸正丁醇混合显色液3mL中止反应，30min后于570nm处进行吸光度测定。
经过酶活力的测定，发现工程菌所表达的色氨酸酶的活力比宿主菌有较大程度的提高，其中最高的比宿主菌高20倍以上。
SEQUENCE LISTING<110>武汉大学<120>生产重组色氨酸酶的表达系统及重组色氨酸酶的制备方法和应用<130>生产重组色氨酸酶的表达系统及重组色氨酸酶的制备方法和应用<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>28<212>DNA<213>E.coli<400>1ggaattcatg aaggattatg taatggaa 28<210>2<211>29<212>DNA<213>E.coli<400>2gaagctttta aacttcttta agttttgcg29
权利要求
1.一种生产重组色氨酸酶的表达系统，其特征在于重组色氨酸酶表达系统，Escheuchia coli BL21/pET-28a，CCTCC NOM202038。
2.一种实现权利要求1所述的生产重组色氨酸酶的表达系统的制备方法，包括下列步骤A、首先设计一对引物，5’ggaattcatg aaggattatg taatggaa 3’，5’gaagcttttaaacttcttta agttttgcg 3’；B、应用PCR技术从大肠杆菌E.coli TG1株中扩增出长1.4Kb的色氨酸酶基因，将其插入到表达载体pET28a的EcoRI/HindIII位点以构建重组质粒pEVT；C、所述的重组载体pEVT在T7噬菌体启动子下游，连接有15-18个编码5-6个连续组氨酸的碱基；D、重组载体转化克隆宿主E.coli TG1，挑单菌落培养，提取并筛选阳性重组质粒，再将其转入表达宿主E.coli BL21，构建色氨酸酶基因工程菌。
3.一种用于权利要求1所述的生产重组色氨酸酶的表达系统，其特征在于N端含有5-6个连续的组氨酸，偏碱性，带正电荷，结合在固定化的组氨酸-蛋白质镍亲和层析树脂柱上；进行色氨酸酶蛋白纯化时，首先离心沉淀收集菌液中的菌体；其次是将菌体悬浮于由Tris·Cl、NaCl的缓冲液中；第三是用超声波裂解菌体，离心，收集上清液，过柱，色氨酸酶蛋白便吸附至固定化的组氨酸-蛋白质镍亲和层析树脂柱上，用洗涤液洗涤，利用洗脱液洗脱结合的色氨酸酶蛋白。
4.权利要求1所述的生产的色氨酸酶蛋白在制备色氨酸中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种生产重组色氨酸酶的表达系统及制备方法和应用，色氨酸酶的表达载体pEVT(CCTCCM202038)，生产该载体的方法及一种纯化菌种产色氨酸酶蛋白的方法。采用本发明提供的重组载体表达的色氨酸酶融合蛋白，由于含有6个连续的组氨酸，这样易于结合在固定化的组氨酸－蛋白质镍亲和层析树脂柱上，而且这一段组氨酸不会对目的蛋白的活性造成影响。由此可以提高目的蛋白的回收率，并且回收的生产成本很低。这样，在后续的色氨酸生产过程中，就避免了直接将细菌裂解液加到反应底物中而造成的产物中混合物过多，最终色氨酸纯化困难的问题。采用本发明生产的色氨酸酶蛋白其纯度在95％以上，回收率在60％以上。
文档编号C12N9/88GK1497047SQ02139189
公开日2004年5月19日 申请日期2002年10月18日 优先权日2002年10月18日
发明者王业富, 龚睿 申请人:武汉大学