专利名称：一种利用微生物发酵高产α、ω－正长链十四碳二元酸的方法
技术领域：
本发明涉及发酵领域，更具体地，涉及利用微生物同步发酵正十四烷(nC14)高产α、ω-正长链十四碳二元酸(DCA14)的方法。
背景技术：
长链二元酸(DCA)是合成香料、工程塑料、耐寒增塑剂、高级润滑油和聚酰胺热熔胶等产品的重要原料。发酵法生产DCA是70年代兴起的微生物发酵技术在石油化工领域的应用。它以原料来源广、反应专一性强和反应条件温和等优点取代了传统的化学合成法，在国内外受到普遍重视。以DCA为原料的下游产品开发不仅可以增加精细化工新产品种类，还可以进一步提高DCA的附加值，为液体石蜡深加工开辟市场。
长链二元酸是一系列特种合成材料的基础单体原料，长链二元酸及其衍生单体可以生产特种尼龙、聚碳酸酯、粉末涂料、香料、热熔胶、特种润滑剂等。目前市场上只有化学法生产和半合成法生产的两三种长链二元酸单体在工业规模上应用于以上产品中。
生物法可提供多达十四种以上的系列长链二元酸单体，这些新型特种长链二元酸单体的应用一方面可以替代化学法生产的长链二元酸单体市场，同时，不同性质的系列特种长链二元酸单体将会产生一系列具有不同性质的新功能材料。
目前国际上大规模产业应用的长链二元酸主要是癸二酸(中国，约3万吨/年)和十二碳二元酸(美国杜邦，约10万吨/年)。癸二酸的出发原料为蓖麻油，由于受气候、种植面积、蓖麻油的其它工业用途等因素的制约，癸二酸的工业用量一直徘徊不前；十二碳二元酸是美国杜邦公司采用化学法生产的产品，在国际上居绝对垄断地位，价格长期据高不下，严重影响下游产品的成本；同时由于化学法不能生产十二碳二元酸以外的其它长链二元酸，使得下游产品应用领域有所局限。
十四碳二元酸的理化性质与目前大量使用的十二碳二元酸最为接近，以其为单体制备的聚合材料性能在某些方面优于十二碳二元酸衍生物，同时，还具有某些特殊的用途。由于没有商品化的十四碳二元酸产品供应市场，其下游应用无法广泛开展。
在现有的专利文献中，有从正十四烷发酵生产十四碳二元酸的实验例子，但都是实验室水平。在CN 1048754C(申请人陈远童，申请日1995年11月9日)中，由生产DCA14的实验例，但只在摇瓶中做到72g/L。在CN 1257126A(申请人中国石油化工集团公司等，申请日1998.12.16)中，在13.7L的发酵罐中生产DCA14，发酵120小时，发酵清液的产酸达到148g/L，重量转化率为88％。在US6066480(申请人美国General Electric Company，申请日1998年9月21日)中，利用假丝酵母发酵97小时，DCA14产量达到94g/L。
综上所述，目前尚没有适用于大规模生产十四碳二元酸的有效的生物学方法。因此，本领域迫切需要开发新的有效地大规模生产十四碳二元酸的工艺。
发明内容
本发明的目的就是提供一种有效和大规模生产十四碳二元酸的方法。
本发明的另一目的是提供用于该方法的微生物。
在本发明的第一方面，提供了一种热带假丝酵母，其特征在于它是热带假丝酵母(Candida Tropicalis)诱变菌株ES4-6-5，保藏号为CCTCC M202042。
在本发明的第二方面，提供了本发明热带假丝酵母的用途，它被用于生产α、ω-正长链十四碳二元酸。
在本发明的第三方面，提供了一种生产α、ω-正长链十四碳二元酸的方法，它包括步骤(a)用热带假丝酵母(Candida tropicals)诱变株ES4-6-5，保藏号CCTCC M202042，在含有糖质作生长碳源的液体培养基中，并在添加正烷烃C14的条件下发酵，(b)从培养基中分离出α、ω-正长链十四碳二元酸。
在本发明的一优选例中，所述的发酵条件是在28-35℃下，发酵90-200小时，较佳地120-150小时。
在另一优选例中，所述的液体培养基包括葡萄糖10-50g/L，金属磷酸盐1-12g/L，酵母膏0-3.0g/L，玉米浆0-6g/L，尿素1.0-4.0g/L，NaCl 0.5-1.5g/L，KNO35-15g/L，pH5.5-7.5。
在另一优选例中，在步骤(a)中，所述正烷烃C14采用流加的方式加入发酵罐中，发酵起始培养基中不含正烷烃C14，其流加总量控制在放罐体积的25-35％。
在另一优选例中，所述的热带假丝酵母为接种于麦芽汁克氏瓶斜面的种子。
在另一优选例中，所述的热带假丝酵母为生长在液体种子培养基的热带假丝酵母，且所述的液体种子培养基包括葡萄糖10-50g/L，金属磷酸盐1-12g/L，酵母膏1.0-3.0g/L，玉米浆1.0-3.0g/L，尿素1.0-3.0g/L，NaCl 0.5-1.5g/L，C14正烷烃0-50mL/L，自来水配制，pH自然。
在另一优选例中，在步骤(a)中，分批次补加碳源和/或氮源。较佳地，补加的碳源为葡萄糖或蔗糖，补加的氮源为玉米浆、酵母膏、铵盐、尿素。
图1是用本发明方法制备的十四碳二元酸的气相色谱图。
具体实施例方式
本发明人经过深入而广泛的研究，发现并分离了一株能高效地产生α、ω-正长链十四碳二元酸的热带假丝酵母(Candida Tropicalis)，即诱变菌株ES4-6-5，并在此基础上完成了本发明。
本发明所用的菌株热带假丝酵母(Candida Tropicalis)诱变株ES4-6-5已经于2002年11月4日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉市)，保藏号为M202042。其主要生理特性如下，其中+表示利用，-表示不利用。
一.糖类的发酵葡萄糖+，半乳糖+，蔗糖+，麦芽糖+，乳糖。
二.同化葡萄糖+，半乳糖+，山梨糖-，蔗糖+，麦芽糖+，纤维二糖+，海藻糖+，乳糖-，密二糖-，棉籽糖-，松三糖+，菊芋糖-，可溶性淀粉+，木糖+，L-阿戊糖+，D-阿戊糖-，核糖-，鼠李糖-，α-甲基葡萄糖苷+，甘油+，乙醇+，赤藓醇-，甘露醇+，肌醇-，核糖醇+，半乳糖醇-，葡萄糖醇+，柠檬酸钠-，丁二酸钠+，乳酸钙-。
三.生长素的需要生物素++，维生素B1++，维生素B2+，维生素B6+，维生素B12+，叶酸+，烟酸+，泛酸+，肌醇+，对氨基苯甲酸+。
四.其它硝酸盐-，冻化牛奶-，熊果酸分解-，凝固牛奶-，油脂酶-。
形态特征奶油白色，褶皱型，菌落为蛋糕状和桃酥状。
培养特征在麦芽汁液体培养基中培养时，假菌丝多而长；在烷烃种子培养基中培养时，有一定数量的短假菌丝；在发酵培养基中发酵时，大部分是单个椭圆的细胞。
在本发明的实施过程中，通常先制备发酵种子。可用于本发明的种子培养基包括(但并不限于)(1)10个巴林糖度的麦芽汁加2％琼脂制成的固体克氏瓶斜面；(2)烷烃液体种子培养基包含葡萄糖10-50g/L，金属磷酸盐1-12g/L，酵母膏1.0-3.0g/L，玉米浆1.0-3.0g/L，尿素1.0-3.0g/L，NaCl 0.5-1.5g/L，C14正烷烃0-0.5％(V∶V)，自来水配制，pH自然。
通常，培养种子的过程为取一环接种酵母菌体，涂布在克氏瓶麦芽汁固体斜面上，于28-30℃培养40-48小时。取上述培养好的克氏瓶2-3个将菌种全部刮入100mL无菌水中，适当摇匀后作为一级种子罐的种子。接种一级种子罐后，28-30℃培养24-32小时，当菌株生长光密度(OD)达到0.5以上，接种二级种子罐，28-30℃培养16-24小时，当菌株生长光密度(OD)达到0.5以上，准备接种发酵罐。
在获得了发酵种子后，将其接种于生产发酵罐中。发酵可以是间歇式，也可以是连续式。
间歇式发酵通常分为两个阶段(1)菌体生长阶段即让菌体在适合生长的条件下生长，直至菌体生长到预定程度(如光密度大于0.6)。
(2)生产阶段当菌体生长到预定程度(如光密度大于0.6)后，添加C14烷烃，从而在本发明热带假丝酵母(Candida Tropicalis)诱变株ES4-6-5的作用下产生α、ω-正长链十四碳二元酸。
在本发明的一个优选例中，把生长好的种子接入pH4.0-7.0，最好为5.5-6.5的培养基中，发酵培养基的组成为葡萄糖10-50g/L，金属磷酸盐1-12g/L，酵母膏0-3.0g/L，玉米浆0-6g/L，尿素1.0-4.0g/L，NaCl 0.5-1.5g/L，KNO30.5-1.5g/L，在25-35℃，最好在28-32℃通气发酵140-170小时。20小时前，pH控制在6.0以下，以菌体生长为主。当菌体生长光密度(OD)大于0.6，开始流加烷烃，控制发酵液中烷烃浓度维持在5％(V∶V)左右，同时调节pH至7.0，48小时以内，每4小时用NaOH溶液调节pH至7.0，48-72小时，每4小时用NaOH溶液调节pH至7.5，72-120小时，每4小时用NaOH溶液调节pH至7.8，120小时至放罐，每4小时用NaOH溶液调节pH至8.0。
在发酵过程中，可以补加碳源和/或氮源，以及其他成分。例如，在发酵至24、48、72小时时批式补加1％(W∶V)的葡萄糖或蔗糖；发酵至96小时补加2％(W∶V)的氮源，补加的氮源为玉米浆、酵母膏等有机氮源或铵盐、尿素等无机氮源。培养基中的磷酸盐可以从KH2PO4，NaH2PO4，K2HPO4和Na2HPO4中选一种。硝酸盐可从钾盐或钠盐中选一种。
发酵过程中或发酵结束后，将产生的α、ω-正长链十四碳二元酸从发酵液中分离出来。在本发明的一优选例中，在发酵结束后，加入适量的水，加碱至pH10-12，加热至85-90℃，静置过夜，进行破乳分层，上层为残烃，回收再用，放出中间清液，下层菌体层或压滤或离心，合并清液，加入适量活性炭，在80-90℃脱色30分钟，过滤除去活性炭后，脱色液加热至60-70℃，用HCl或H2SO4调节pH至3-4进行酸化结晶，冷却至30℃后，压滤，用空气吹干，60℃烘干，得白色的DCA14结晶。
用本发明发酵生产十四碳二元酸的方法，在5吨罐上发酵144小时，发酵144小时发酵原液DCA14含量高达190g/L以上(相当于清液产酸220g/L)，发酵重量转化率达到90％以上，后处理总收率大于94％，产品纯度达到98％以上。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1小规模发酵(1)取一接种环菌种(热带假丝酵母(Candida Tropicalis)诱变株ES4-6-5，保藏号CCTCC M202042)，涂布在克氏瓶麦芽汁斜面上，29℃培养两天。
(2)取上述菌种克氏瓶斜面一个，用100mL无菌水将菌体全部洗下，接入装有6L烷烃种子培养基的10L搅拌式发酵罐中，于29℃培养24小时。烷烃种子培养基的成分为葡萄糖15g/L，KH2PO48g/L，酵母膏2g/L，玉米浆1g/L，尿素1.5g/L，NaCl 0.5g/L，C14正烷烃40mL/L，自来水配制，pH自然。
(3)在装有6L培养基的10L发酵罐中，接入1.0L上述种子液，开始发酵。发酵培养基成分为葡萄糖10g/L，KH2PO48g/L，酵母膏1g/L，玉米浆1.5g/L，尿素1g/L，NaCl 1g/L，KNO37g/L，自来水配制，pH自然，121℃灭菌20分钟。烷烃和补料糖分消。于29℃、600rpm、通气量0.8vvm、罐压1.0Mpa条件下培养。发酵前20小时pH自然，以菌体生长为主，当菌体生长光密度(OD)大于0.6，开始流加烷烃，控制发酵液中烷烃浓度维持在5％(V∶V)左右，同时调节pH至7.0，48小时以内，每4小时用NaOH溶液调节pH至7.0，48-72小时，每4小时用NaOH溶液调节pH至7.5，72-120小时，每4小时用NaOH溶液调节pH至7.8，120小时至放罐，每4小时用NaOH溶液调节pH至8.0。发酵至24、48、72小时时批式补加1％(W∶V)的葡萄糖，发酵至96小时补加2％(W∶V)的玉米浆。从接种到发酵结束，总培养时间为142小时，发酵液中湿菌体80g/L，残烃3.4％，放罐体积6.5L，加入烷烃总量1500g，用乙醚萃取NaOH滴定法测定发酵原液DC14含量为186.5g/L，烷烃对二元酸的重量转化率为90.5％，摩尔转化率为70％。将发酵液加水稀释一倍，加碱调pH至10.0，加热到90℃，趁热离心，除去菌体和残烃。离心清液加活性炭脱色后用硫酸调节pH至3.0，冷却至室温，过滤、洗涤至中性，80℃烘干12小时，得到产品1138g，气相色谱分析总酸纯度为99.0％，DC14纯度为98.1％，提取收率为93％。
实施例2 大规模发酵按照实施例1的工艺控制，进行5M3罐中试生产。一级种子罐200L，接种两个克氏瓶，培养时间24-32小时，二级种子罐1M3，培养18-24小时。发酵148小时，共投烷烃905.83kg，放罐体积4.224M3，气相色谱法测定发酵原液中DC14含量为197.4g/L，发酵重量收率为92.18％，摩尔收率为70.74％。后提取共得到779kg产物，收率为93.3％，产品经气相色谱分析总酸纯度为98.9％，单酸含量为98.5％(图1)。
实施例3发酵过程不补加糖条件下的小规模生产在10L发酵罐中装液6.0L进行十四碳二元酸发酵，发酵培养基组成为蔗糖20g/L，KH2PO48g/L，酵母膏1g/L，玉米浆1.5g/L，尿素1g/L，NaCl 1g/L，KNO37g/L，C14烷烃20％，自来水配制，pH自然，121℃灭菌20分钟。发酵24、48、72、96小时分四批各补300mL烷烃，过程中不补糖，其余工艺条件及控制同实施例1，发酵160小时，放罐体积7.0L，共补烷烃2400mL。
发酵原液产酸用乙醚萃取NaOH滴定法测浓度为177g/L，残烃2.7％，发酵重量收率85％。结果表明，在不补加糖条件下，本发明的的热带假丝酵母(Candidatropicals)突变株ES4-6-6仍可高效地生产α、ω-正长链十四碳二元酸，只是稍差于补糖条件的生产。
实施例4发酵过程不补加糖条件下的大规模生产在5M3罐中重复实施例3的工艺，发酵172小时，共补烷烃1270L，放罐体积3.8M3，残烃5.0％，发酵原液产酸浓度乙醚萃取NaOH滴定法测定为185.6g/L，发酵重量收率为87.3％。
结果表明，在不补加糖条件下，本发明的的热带假丝酵母(Candida tropicals)突变株ES4-6-6仍可高效地、大规模地生产α、ω-正长链十四碳二元酸，只是稍差于补糖条件的生产。
菌种保藏本发明的菌株热带假丝酵母(Candida Tropicalis)诱变株ES4-6-5已经于2002年11月4日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉市)，保藏号为M202042。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种热带假丝酵母，其特征在于它是热带假丝酵母(Candida Tropicalis)诱变菌株ES4-6-5，保藏号为CCTCC M202042。
2.如权利要求1所述的热带假丝酵母的用途，其特征在于，用于生产α、ω-正长链十四碳二元酸。
3.一种生产α、ω-正长链十四碳二元酸的方法，其特征在于，包括步骤(a)用热带假丝酵母(Candida tropicals)诱变株ES4-6-5，保藏号CCTCC M202042，在含有糖质作生长碳源的液体培养基中，并在添加正烷烃C14的条件下发酵，(b)从培养基中分离出α、ω-正长链十四碳二元酸。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的发酵条件是在28-35℃下，发酵90-200小时。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的液体培养基包括葡萄糖10-50g/L，金属磷酸盐1-12g/L，酵母膏0-3.0g/L，玉米浆0-6g/L，尿素1.0-4.0g/L，NaCl 0.5-1.5g/L，KN035-15g/L，pH5.5-7.5。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，所述正烷烃C14采用流加的方式加入发酵罐中，发酵起始培养基中不含正烷烃C14，其流加总量控制在放罐体积的25-35％。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的热带假丝酵母为接种于麦芽汁克氏瓶斜面的种子。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的热带假丝酵母为生长在液体种子培养基的热带假丝酵母，且所述的液体种子培养基包括葡萄糖10-50g/L，金属磷酸盐1-12g/L，酵母膏1.0-3.0g/L，玉米浆1.0-3.0g/L，尿素1.0-3.0g/L，NaCl 0.5-1.5g/L，C14正烷烃0-50mL/L，自来水配制，pH自然。
9.如权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，分批次补加碳源和/或氮源。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，补加的碳源为葡萄糖或蔗糖，补加的氮源为玉米浆、酵母膏、铵盐、尿素。
全文摘要
本发明公开了一种利用微生物氧化C14正烷烃高产α、ω－正长链十四碳二元酸(DCA
文档编号C12P7/46GK1502700SQ0214543
公开日2004年6月9日 申请日期2002年11月20日 优先权日2002年11月20日
发明者陈远童, 衷金生, 刘文凤, 李乃强, 陈建康, 邱勇隽 申请人:上海凯赛生物技术有限公司