专利名称：对有机磷农药具有广谱降解能力的菌株及其筛选方法
技术领域：
本发明涉及一种菌株，特别是一种对有机磷农药具有广谱降解能力的菌株，还涉及该菌株的筛选方法。
背景技术：
有机磷农药是农药中的主要类别，占农药总量的60％(张立言，有机磷农药，北京燃料化学工业出版社，1973)，是农业生产必不可少的，2000年我国的农药生产产量为60.7万吨(中华人民共和国国家统计局，2001中国统计年鉴，中国统计出版社)。在有机磷农药中80％以上是剧毒的，如甲胺磷、甲基对硫磷、对硫磷、久效磷、敌敌畏等，仅甲胺磷的使用量一年就高达6.5万吨，其它大吨位的有机磷农药还有乐果、氧化乐果和辛硫磷等。但随着农药的发展，它对环境所造成的污染问题也引起了人们的高度重视。
由于有机磷农药具有与乙酰胆碱类似的结构，因此它们均具有抑制人体乙酰胆碱酯酶的功能，对人存在着不同程度的毒性。急性中毒可引起人肌肉痉挛、瞳孔收缩、呼吸困难直至死亡。低剂量的慢性中毒，会诱导多发性神经病、中风等。因此开发新产品，有效降解农药残留已成为迫切需要解决的问题。
有机磷含有三个磷酯键，所以常被称为磷酸三酯。一般有机磷可被分为两种类型，一是磷通过双键与氧结合(P＝O)，如甲胺磷、氧化乐果、敌敌畏等；另一种是磷通过双键与硫结合(P＝S)，如对硫磷、甲基对硫磷、辛硫磷、水胺硫磷、毒死蜱(乐斯本)等。有研究表明，如果有机磷中的一个磷酸酯键被水解将大大降低其毒性，以对硫磷为例，将使其毒性降低100倍(Serdar，C.M.，and D.T.Gibson.1985.Bio/Technology3567-571；Serdar，C.M.December 1996.U.S.patent 5,589,386)。因此，破坏有机磷的磷脂键是降低有机磷农药毒性的行之有效的方法。
近年来大量研究发现一些土壤微生物(细菌、真菌)能够降解有机磷农药，这主要是由于它能够分泌一种磷酸酯酶降解有机磷，同时降解后的产物可作为微生物生长的碳、氮、磷源，为其生长提供营养(Sethunathan，N.，and T.Yoshida.1973.Can.J.Microbiol.19873-875；Chaudhry，G.R.，et al.，1988.Appl.Environ.Microbiol.54288-293；李淑彬，周仁超等，微生物学通报，1999，26，No.127-30)。但目前报道的可降解有机磷的微生物多数只能降解一种或是一类有机磷。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能有效降解多种有机磷农药的菌株，并对该菌株的培养条件和降解特性进行了研究。目的是为了进一步研究这个有优良降解特性的菌株，利用基因工程的手段克隆其有机磷农药消解酶基因，并将其高效表达，廉价生产有机磷农药消解酶。
本发明提供一种可降解多种有机磷农药的菌株，它是属于土壤杆菌属的放射型土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter，CGMCC菌种编号1150)，我们将其命名为OP150。该菌株是一株革兰氏染色反应阴性菌，菌体呈短杆状，大小为0.8×1.5-3.0微米，一般有1-2根鞭毛，无芽孢，氧化酶和过氧化氢酶测定为阳性，菌落一般是光滑的。此菌能够在加有有机磷农药的无机盐培养基上生长，消解农药为其生长提供碳源。
本发明中菌OP150是采用农药富集方法分离得到。主要步骤如下
1.选本实验室保存和购自中国微生物菌种保藏中心的11株菌(菌名列表如下)进行筛选。
表1 筛选所用菌种一栏表菌名 来源 本实验编号F85(黑曲霉) 本实验室保存F8592-1(酵母)本实验室保存92-190-2(酵母)本实验室保存90-266-1(细菌)本实验室保存66-183-4(细菌)本实验室保存83-489-1(细菌)本实验室保存89-1根癌土壤杆菌 CGMCC，1.1415 1415放射型土壤杆菌CGMCC，1.150150缺陷假单胞菌 CGMCC，1.220220Flavobacterium sp.ATCC，27551 27551
节杆菌CGMCC，1.8 8注CGMCC中国普通微生物菌种保藏管理中心ATCCThe Global Bioresource Center(全球生物资源中心)2.将菌分别接于5mL LB完全培养基(蛋白胨1％，酵母粉0.5％，NaCl1％，pH7.0)中活化，取活化好的菌离心收集菌体，弃去培养基上清，用Burk培养基(K2HPO40.02％、KH2PO40.08％、MgSO4.7H2O 0.02％、CaSO4.H2O 0.01％、NaMoO4.2H2O 0.0003％、FeSO4.7H2O 0.0005％、(NH4)2SO40.1％、酵母粉0.05％，pH7.2)悬起菌体后，按1％接于50mL液体Burk无机盐培养基中，培养基中加有甲基对硫磷0.5mg/mL(纯品)，32℃震荡培养36小时。
2.菌液用无菌水梯度稀释后分别涂布于加有0.2mg/mL敌敌畏(纯品)和0.2mg/mL甲基对硫磷(纯品)的Burk无机盐固体培养基上，置于32℃培养箱中培养。挑取单菌落，经平板划线纯化。
3.将分离到的单菌落菌株分别接种于含有有机磷农药甲基对硫磷(0.05％)、甲胺磷(0.05％)、对硫磷(0.05％)的Burk无机盐固体培养基平板上，观察消解圈。
4.选择在几种农药平板上消解圈均较大的菌株，编号，保存于斜面上。其中，编号为150的菌在三种农药平板上消解圈均最大，说明其有机磷农药降解特性最为优良。
本发明菌株OP150与目前已报道的其他农药降解菌相比其优点在于1)降解率高，对于甲基对硫磷可100％降解，对于其他有机磷农药其降解率也高达60-80％；2)具有广谱性，可作用于多种有机磷农药，无论底物是磷氧双键的有机磷(甲胺磷、氧化乐果、敌敌畏等)还是磷硫双键的有机磷(如对硫磷、甲基对硫磷、辛硫磷、水胺硫磷、毒死蜱(乐斯本)等)，都具有很好的效果。3)表达的有机磷农药消解酶活性高，因此可用于分离克隆新的有机磷农药消解酶基因，生产基因工程菌株，从而大规模廉价生产有机磷农药消解酶。
具体实施例方式
实施例1将保存于斜面上的菌株OP150接种于含有0.5mg/mL甲基对硫磷的液体无机盐培养基中活化，活化后的菌液挑一环分别接种于分别含有0.05％甲基对硫磷、对硫磷、甲胺磷、氧化乐果、敌敌畏、辛硫磷、毒死蜱的固体Burk无机盐培养基平板上，置于32℃培养箱中培养，分别在培养24小时、48小时和72小时后观察农药平板上的消解圈以及细菌的生长情况。24小时后，在甲基对硫磷、甲胺磷、敌敌畏、氧化乐果、对硫磷平板上即有消解圈出现，菌也有少量生长；48小时后，各农药平板上均有消解圈出现；72小时后消解圈进一步扩大，细菌也进一步生长。
图1为72小时后氧化乐果平板，可明显看出中央的消解圈。值得一提的是在甲基对硫磷和对硫磷平板中央的培养基呈现黄色，这是由于甲基对硫磷和对硫磷水解后的产物是对硝基酚为黄色所致。同时可以看出，甲基对硫磷平板上的消解圈比对硫磷平板上的大，这说明此菌所产生的有机磷农药消解酶能更好的作用于甲基对硫磷。
从本实施例可看出，本发明菌株可降解有机磷农药，并在无机盐培养基上生长，说明此菌可利用降解产物为其生长提供所需的碳源。
实施例2
将保存于斜面上的OP150菌株接种于含有0.5mg/mL甲基对硫磷的液体无机盐培养基中活化，将活化好的菌转接于50mL LB培养基中大量培养，将生长至对数生长期的菌离心收集菌体，去除培养基，并将菌用Burk无机盐培养基洗两次以彻底去除细菌表面上粘的LB完全培养基。用50mL Burk无机盐培养基将菌体悬起，取2％接种于5mL Burk液体无机盐培养基中，在此培养基中分别加有甲基对硫磷、对硫磷、甲胺磷、氧化乐果、敌敌畏和毒死蜱，同时做对照，对照中的有机磷农药量与实验管相同，但未接种菌液，而是用Burk培养基代替。在32℃摇床上震荡培养36小时后，分别用氯仿萃取培养液，气相色谱测定培养基中各种农药的含量，结果列于表2中。
从表所列的结果可以看出，此菌对于甲基对硫磷的消解效果最好，经过培养后甲基对硫磷已被完全消解，未从培养液中检出。
表2 不同农药与细菌OP150培养36小时后的农药残留量农药名称 培养前培养基中 培养后培养基中农消解率コ入的农药量(μg) 药的剩余量(μg) (％)甲基对硫磷 421.7 0 100对硫磷 457 169.5 62.9甲胺磷 489.8 97.2 80.2氧化乐果489.1 101.2 79.3敌敌畏 469.5 113.4 75.8
毒死蜱 445.5 155.3 65.1注消解率(％)＝培养前的农药量-培养后农药的剩余量/培养前的农药量实施例3我们的目的是利用基因工程的手段克隆有机磷农药消解酶基因，并将其高效表达，廉价生产有机磷农药消解酶。因此测定原菌株中农药消解酶的酶活性，是初步鉴定此菌株的农药降解特性的有力方法。由于甲基对硫磷和对硫磷经农药消解酶水解后产生对硝基酚，呈现黄色，因此我们可以通过比色的方法测定对硝基酚含量，测定参照Serdar等的方法(Serdar，C.M.et al.，1982，Appl.Environ.Microbiol.，44246)进行。
将活化好的菌OP150以2％的量转接于5mL Burk无机盐培养基中(加有0.05％甲胺磷)培养36小时后，离心收集菌体，将菌重新悬浮于50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中，离心去除细胞碎片，上清液用来进行酶活测定。
酶活性的测定方法取0.9mL Tris-HCl缓冲液(50mmol/L，pH7.5)加入0.005mL 10mg/mL的对硫磷和0.1mL待测酶液，摇均后在37℃保温10分钟，加入1mL1％碳酸氢钠显色，415nm波长下比色测定水解产物对硝基酚的含量。规定在上述条件下，一个酶活单位(u)定义为每分钟降解1μmol对硫磷所需酶量。
根据以上方法测出OP150所产生的有机磷农药消解酶酶活性是9.36u/mL培养液。
权利要求
1.一种筛选对有机磷农药具有广谱降解能力的菌株的方法，其特征在于，其包括以下步骤a)选取一定数量的菌株，将它们分别接于LB完全培养基中活化，取活化好的菌离心收集菌体，弃去培养基上清，用Burk培养基悬起菌体后，按1％接于50ml液体Burk无机盐培养基中，培养基中加有甲基对硫磷0.5mg/ml，在一定温度下震荡培养一定时间；b)菌液用无菌水梯度稀释后分别涂布于加有0.2mg/mL敌敌畏和0.2mg/mL甲基对硫磷的Burk无机盐固体培养基上，置于一定温度的培养箱中培养，挑取单菌落，经平板划线纯化；c)将分离到的单菌落菌株分别接种于几种含有有机磷农药的Burk无机盐固体培养基平板上，观察消解圈；d)选择在几种农药平板上消解圈均较大的菌株。
2.根据权利要求书1所述的方法，其特征在于，在步骤a)中，在32℃下震荡培养36小时。
3.根据权利要求书1所述的方法，其特征在于，在步骤b)中，培养箱的温度为32℃。
4.根据权利要求书1所述的方法，其特征在于，在步骤c)中，有机磷农药包括甲基对硫磷(0.05％)、甲胺磷(0.05％)及对硫磷(0.05％)。
5.根据上述权利要求任一项所述的方法筛选出的一种放射型土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter，CGMCC菌种编号1150)菌株。
6.根据权利要求5所述的菌株所产生的有机磷农药消解酶。
全文摘要
本发明涉及对有机磷农药具有广谱降解能力的菌株的筛选方法，还涉及筛选出的菌株。将菌株分别接于LB完全培养基中活化，取活化好的菌离心收集菌体，用Burk培养基悬起菌体后，于加有甲基对硫磷0.5mg/ml的液体Burk无机盐培养基中培养；菌液稀释后涂布于加有0.2mg/mL敌敌畏和0.2mg/mL甲基对硫磷的Burk无机盐固体培养基上，于培养箱中培养，挑取单菌落；将分离的单菌落菌株分别接种于几种含有有机磷农药的Burk无机盐固体培养基平板上，观察消解圈；选择在几种农药平板上消解圈均较大的菌株。由于它分泌有机磷农药消解酶，且酶活性达到9.36u/mL培养液，因此为克隆有机磷农药消解酶基因提供很好的基因源，最终达到廉价生产有机磷农药消解酶的目的。
文档编号C12N1/20GK1502688SQ0214888
公开日2004年6月9日 申请日期2002年11月22日 优先权日2002年11月22日
发明者伍宁丰, 姚斌, 范云六, 史秀云 申请人:中国农业科学院生物技术研究所, 中国农业科学院饲料研究所