专利名称：一种活菌生物净水剂的高密度活菌发酵工艺的制作方法
技术领域：
本发明是指一种活菌生物净水剂的发酵工艺，具体是指在发酵过程中不断添加复合微量元素、复合生长因子及生物素，使发酵液始终保持着复合微量元素、复合生长因子及生物素在最佳浓度范围内，保证细菌在分裂过程中不断地获得各种所需的离子，促进细菌高速地生长以达到高密度活菌发酵的生产工艺。
背景技术：
现在的活菌生物净水剂生产工艺中，主要有1、固体发酵；2、液体发酵。若采用固体发酵工艺，获得的活菌数量很少，并且产品中活菌数不稳定；而现有的发酵芽孢杆菌的工艺，均难以达到高密度发酵，其通常发酵液光密度(OD600)值都小于40，常规的芽孢杆菌液体发酵工艺均都在发酵培养基中，配含有C、N、K、P、Mg、Ca、S元素的营养液，以满足细菌生长所需的营养物质，这种常规的工艺配方只能提供大部分所需的元素，而其中有些元素在细菌生长过程中摄入量极少，但在分裂增殖中又是不可缺的微量元素、生长因子，而在配置的培养基中含量极少或根本没有。这些元素的不足很难达到高密度发酵，通常只能使发酵液光密度(OD600)＜40，即使在发酵过程中补加营养液，也难以使OD600值有明显的增加。经查中国申请专利公开了一种活菌生物净水剂的高密度活菌发酵工艺，该专利申请通过在芽孢杆菌发酵的全过程中不断添加铁离子营养液，使发酵液如终保持铁离子浓度在一定范围的工艺路线，但该专利申请片面强调控制铁离子的浓度，其声称的发酵液光密度(OD)值也只能达到32.6，因而现有技术极大地限制了这类功能显著的活菌生物净水剂的大规模工业化生产和推广应用。
发明内容
本发明的目的就是在于提供一种活菌生物净水剂的高密度活菌发酵工艺，以通过在芽孢杆菌发酵的全过程中不断添加复合微量元素及复合生长因子，使发酵液始终保持复合微量元素、复合生长因子及生物素浓度在一定范围的生产工艺，以有效地保证芽孢杆菌在发酵过程中对三者的需求，从而使其在较好地保留现有技术的优点的同时，还具有工艺简单、操作方便、发酵液光密度高等优点，其芽孢杆菌的发酵液光密度(OD600)值＞100，有效地克服了现有技术的不足。本发明的目的是通过以下方式来实现的一种活菌生物净水剂的高密度活菌发酵工艺，主要是采用从自然界中筛选、分离、优化的芽孢杆菌为菌种，在按常规配方配置发酵培养基(经高温灭菌)，接种发酵罐开始后，当细菌处于对数生长期时缓慢持续地加入复合微量元素、复合生长因子及生物素浓度，同时补加碳源和氮源，其生产工艺流程为在发酵罐内配制一定量的培养基—→灭菌—→降温后加入一定量的微量元素、生长因子、生物素—→接种芽孢菌(由种子罐培养好)—→发酵(过程中缓慢加入复合微量元素、复合生长因子及生物素)至发酵液OD600值为100以上即停止发酵。
采用本发明的高密度活菌发酵工艺，由于采用了在芽孢杆菌发酵的全过程使发酵液始终保持复合微量元素、复合生长因子及生物素在一定范围的生产工艺，从而使其在较好地保留现有技术的优点的同时，还具有工艺简单、操作方便、发酵液光密度高等优点其芽孢杆菌的发酵液光密度(OD600)值＞100，本工艺不仅有效地保证了芽孢杆菌在发酵过程中对复合微量元素、复合生长因子及生素的需求，同时又避免了一次加入过量的复合微量元素、复合生长因子及生物素所产生的不利影响，并且所述的复合微量元素、复合生长因及生物素配制及除菌工艺简单，操作易行，有效地克服了现有技术的不足。
具体实施例方式
以下结合实施方式对本发明作进一步描述一种活菌生物净水剂的高密度活菌发酵工艺，主要是采用现有的芽孢杆菌为菌种(如YPD系列)，其接种和发酵均采用现有技术，按常规配方配置好的发酵培养基(经高温灭菌)，降温后加入一定量的微量元素、生长因子及生物素，当接种入发酵罐后，在细菌处于对数生长期后向发酵罐内缓慢持续地加入复合微量元素、复合生长因子及生物素，并保持发酵罐内发酵液中的复合微量元素、复合生长因子及生物素以控制复合微量元素含量为3.3ml/L、复合生长因子含量为5ml/L、生物素含量为4ml/L，在加入复合微量元素及复合生长因子及生物素的同时，还要补加碳源和氮源，其生产工艺流程为在发酵罐内配制一定量的培养基—→灭菌—→降温后加入一定量的微量元素、生长因子、生物素—→接种芽孢菌(由种子罐培养好)—→发酵(过程中缓慢加入复合微量元素、复合生长因子及生物素)至发酵液OD600值为100以上即停止发酵。
在整个发酵过程中，发酵液的PH值控制在7.0左右(以氨水调控)，其溶氧相对值控制在20％～40％之间(以调节气流量搅拌机转速、罐压来控制)，温度控制在32～35℃(以冷冻水控制)。在整个发酵过程中，通过补加复合微量元素、复合生长因子及生物素以控制复合微量元素含量为3.3ml/L、复合生长因子含量为5ml/L、生物素含量为4ml/L。
上述复合微量元素的组成为100L蒸馏水中，至少包括将6.3份硫酸铜、3份硫酸镁、21份氯化锌、68份七水硫酸亚铁，所述组成完全溶解后即得。
在上述复合微量元素的组成中，还可以包括碘化钠0.23份，钼酸钠0.21份，氯化钴0.5份，硼酸0.63份，硫酸500ml。
所述复合生长因子组成为100L蒸馏水中，至少包括肌醇32份，盐酸吡哆辛12.8份，维生素B112.8份，硫酸锰12.8份，D-泛酸钙12.8份，核黄素6.4份，对氯苯甲酸6.4份，碘化钾3.3份，叶酸0.7份。
实施例以5000升发酵罐发酵YPD系列菌种为例1、进行一级菌种培养挑取YPD系列菌种中一种到1L一级菌种培养液中，经过10小时培养(温度为33℃)，转接入二级菌种培养液中。
2、二级菌种培养将一级菌种培养好的菌利，在无菌操作台倒入二级菌种培养液，经过8小时扩大培养(温度为33℃)。
3、配制150L种子罐培养基种子罐掊养基成分主要是含碳、氮、磷、硫、钾、镁、钙为主的物质，经高温灭菌(121℃，0.1MPa，30分钟)后，降温至60℃时，将配置好的复合微量元素200ml、复合生长因子500ml、生物素300ml用0.2微米的过滤器加入种子罐中，将温度降之33℃时，用火焰法在接种口处把二级种倒入种子罐中经8小时培养。
4、配制5000L发酵罐培养基按种子罐相同的物料经放大后，配制成3000L的培养液，也经高温灭菌(121℃，0.1MPa，30分钟)后，降温至60℃时，用0.2微米的过滤器将复合微量元素10L、复合生长因子15L、生物素12L加入发酵罐中，将温度降至33～35℃。
5、接种入发酵罐中发酵将种子罐培养好的菌种，加压后经已灭菌的接利管道，接入发酵罐中发酵。
6、发酵过程控制随着细菌的不断分裂增殖、根据发酵液复合微量元素、复合生长因子及生物素的消耗，控制发酵液中复合微量元素含量为3.3ml/L、复合生长因子含量为5ml/L、生物素含量为4ml/L，采用可以调速的蠕动泵经0.2微米的过滤器缓慢地加入，加入氨水控制发酵液值7.0左右，溶氧相对值为20％～40％之间，搅拌机转速控制在1200转/分钟，控制发酵液温度为32-35℃。
7、发酵后期发酵至24小时，取样检测发酵液OD600＞100，大部分细菌形成芽孢后，停止发酵，进行下游的提取。
权利要求
1.一种活菌生物净水剂的高密度活菌发酵工艺，主要是采用现有的芽孢杆菌为菌种(如YPD系列)，其接种和发酵均采用现有技术，将现有的芽孢杆菌菌中接种于按常规配方配置的发酵培养基中，其特征在于接种发酵开始后，当细菌处于对数生长期后向发酵灌内缓慢持续地加入复合微量元素、复合生长因子及生物素，并保持发酵罐内发酵液中的复合微量元素、复合生长因子及生物素以控制复合微量元素含量为3.3ml/L、复合生长因子含量为5ml/L、生物素含量为4ml/L，在加入复合微量元素、复合生长因子及生物素的同时，还要补加碳源和氮源，其生产流程为在发酵罐内配制一定量的培养基→灭菌→降温后加入一定量的复合微量元素、复合生长因子及生物素→接种芽孢杆菌(由种子罐培养好)→发酵(过程中缓慢加入复合微量元素、复合生长因子及生物素发酵液OD600值为100以上即停止发酵。
2.根据权利要求1所述的一种活菌生物净水剂的高密度活菌发酵工艺，其特征在于在整个发酵过程中，发酵液的PH值控制在7.0左右(以氨水调控)，其溶氧相对值控制在20％-40％之间(以调节气流量、搅拌机转速、罐压来控制)，温度控制在32-35℃(以冷冻水控制)，全过程包括(1)进行一级菌种培养挑取YPD系列菌种中的一种到1L一级菌种培养液中，经过10小时培养(温度为33℃)，转接入二级菌种培养液中，(2)二级菌种培养将一级菌种培养好的菌种，在无菌操作台倒入二级菌种培养液，经过8小时扩大培养(温度为33℃)，(3)配制150种子罐培养基种子罐培养基成分主要是含碳、氮、磷、硫、钾、镁、钙为主的物质，经高温灭菌(121℃，0.1MPa，30分钟)后，降温至60℃时，将配置好的复合微量元素200ml、复合生长因子500ml、生物素300ml用0.2微米的过滤器加入种子罐中，将温度降之33℃时，用火焰法在接种口处把二级种倒入种子罐中经8小时培养，(4)配制5000L发酵罐培养基按种子罐相同的物料经放大后，配制成3000L的培养液，也经高温灭菌(121℃，0.1MPa，30分钟)后，降温至60℃时，用0.2微米的过滤器将复合微量元素10L、复合生长因子15L、生物素12L加入发酵罐中，将温度降至33-35℃，(5)接种入发酵罐中发酵将种子罐培养好的菌种，加压后经已灭菌的接种管道，接入发酵罐中发酵，(6)发酵过程控制随着细菌的不断分裂增殖，根据发酵液复合微量元素、复合生长因子及生物素的消耗，控制复合微量元素含量为3.3ml/L、复合生长因子含量为5ml/L、生物素含量为4ml/L，采用可以调速的蠕动泵经0.2微米的过滤器缓慢地加入，加入氨水控制发酵液PH值在7.0左右，溶氧相对值为20％-40％之间搅拌机转速控制在1200转/分钟，控制发酵液温度为32-35℃，(7)发酵后期发酵至24小时，取样检测发酵液OD600＞100，大部分细菌形成芽孢后，停止发酵，进行下游的提取。
3.根据权利要求1或2所述的一种活菌生物净水剂的高密度活菌发酵工艺，其特征在于所述复合微量元素的组成为40-60L的蒸馏水中，至少包括将300g硫酸铜、150g硫酸镁、1000氯化锌、3200g七水硫酸亚铁，所述组成完全溶解后即得。
4.根据权利要求3所述的一种活菌生物净水剂的高密度活菌发酵工艺，其特征在于在所述复合微量元素的组成中，还可以包括碘化钠4g，钼酸钠10g，氯化钴25g，硼酸1g，硫酸250ml。
5.根据权利要求1或2所述的一种活菌生物净水剂的高密度活菌发酵工艺，其特征在于所述复合生长因子组成为40-60L蒸馏水中，至少包括肌醇2.5g，盐酸吡哆辛1g，维生素B11g，硫酸锰1g，D-泛酸钙1g，核黄素0.5g，对氯基苯甲酸0.5g，碘化钾0.3g，叶酸0.05g，硼酸1g，氯化锌1g，钼酸钠0.5g，氯化铁0.5g，硫酸铜0.05g。
6.根据权利要求3所述的一种活菌生物净水剂的高密度活菌发酵工艺，其特征在于所述生物素的组成为生物素1g，溶入40-60L的蒸馏水中即得。
全文摘要
一种活菌生物净水剂的高密度活菌发酵工艺，主要是采用现有的芽孢杆菌为菌种(如YPD系列)，其接种和发酵均采用现有技术，将现有的芽孢杆菌菌中接种于按常规配方配置的发酵培养基中，其特征在于接种发酵开始后，当细菌处于对数生长期后向发酵灌内缓慢持续地加入复合微量元素、复合生长因子及生物素，并保持发酵罐内发酵液中的复合微量元素、复合生长因子及生物素以控制复合微量元素含量为3.3ml/L、复合生长因子含量为5ml/L、生物素含量为4ml/L，在加入复合微量元素、复合生长因子及生物素的同时，还要补加碳源和氮源，发酵液OD
文档编号C12N1/20GK1508244SQ0214963
公开日2004年6月30日 申请日期2002年12月16日 优先权日2002年12月16日
发明者何文刚, 阮斌, 邹凌修, 莫东琰, 王云胜 申请人:珠海科恩生物工程有限公司