专利名称：与小麦茎抗倒伏相关的咖啡酸甲基转移酶、编码该酶的基因和含有该基因的表达载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及与小麦茎发育和抗倒伏相关的咖啡酸甲基转移酶，编码该酶的基因和含有该基因的表达载体。
背景技术：
在包括蕨类、裸子植物和被子植物在内的维管植物中，木质素的出现对于植物向陆生进化具有重要作用，它使植物能够适应较干燥的外界环境，并向更大的空间发展，从而形成了更为多样化的植物类群(Facchini，P.J，1999，Trends in Plant Sci，4382-384)。木质素的合成对于植物的生长发育也具有重要作用。木质素主要沉积在植物的导管、射线、厚壁细胞等的细胞壁上，能够增加细胞壁的机械强度，降低其通透性，因此，木质素的合成增强了植物的机械支持作用。在植物受伤和受到病虫害侵袭时，植物细胞能够迅速木质化以有效地保护其内部组织免受进一步的危害，因此增强了植物对于外界机械损伤和病虫害侵袭的抵抗力(Whetten，R.W.等，1998，Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol，49585-609)。
木质素属高分子有机酚类化合物，在地球上所有高分子有机化合物中，其含量居纤维素之后，居第二位。在植物体中通常占干重的10-20％，在树木中甚至可达30％。木质素合成是以苯丙氨酸为前体，经过一系列酶促反应，形成几种简单酚类的醇衍生物，被称为木质素单体(monolignol)，再由这些木质素单体聚合形成高分子木质素。构成木质素的单体主要有三类，即香豆醇(p-coumaryl alcohol)、松柏醇(coniferylalcohol)和丁香醇(sinapyl alcohol)。这三类化合物在结构上的区别是甲氧基的数量。
不同种类的植物其木质素在组成上有明显的区别。裸子植物的木质素主要有松柏醇组成，双子叶植物的木质素由松柏醇和丁香醇组成，而单子叶植物的木质素则包括香豆醇、松柏醇和丁香醇等三种单体。此外，植物在不同的发育时期、不同的环境条件以及不同的部位，其木质素的组成也有明显的差异。
木质素的生物合成反应涉及如下几个基本过程(1)苯丙氨酸经过氨解作用形成肉桂酸(苯丙稀酸，cinnamic acid)，(2)羟基化和转甲基，在苯环的不同部位形成羟基和甲氧基，(3)已酰化，即在羧基侧链已酰化，(4)还原反应，使羧基侧链经过醛基最后形成醇(Baucher，M.B.等，1998，Crit.Rev.Plant Sci.，17125-197)。
咖啡酸甲基转移酶(caffeic acid 3-O-methyltransferase，COMT，EC2.1.1.68)负责木质素合成中多步转甲基反应，包括咖啡酸转甲基形成阿魏酸，5-羟基阿魏酸转甲基形成丁香酸，肉桂醛转甲基形成松柏醛，肉桂醇转甲基形成松柏醇，5-羟基松柏醛转甲基形成丁香醛，5-羟基松柏醇转甲基形成丁香醇等。咖啡酸甲基转移酶是木质素合成反应中具有控制作用的关键酶。来自不同植物的咖啡酸甲基转移酶对不同的底物具有不同的专一性，因此咖啡酸甲基转移酶不仅调控着木质素合成的数量，同时也决定了木质素的组成。
咖啡酸甲基转移酶最早是从松树中分离纯化(Shimada等，1972，Phytochem，112657-2662，Kuroda等，1975，Phytochem，141759-1763)。其后在杨树和烟草中也分离出咖啡酸甲基转移酶蛋白(Bugos等，1992，Phytochem，311495-1498，Dumas等，1988，Planta，17636-41)。在烟草中存在三种咖啡酸甲基转移酶的异构酶，负责不同条件下木质素的合成，其中COMTII和COMTIII是同一基因产物经过不同的翻译后加工而形成的。
咖啡酸甲基转移酶基因首先是从杨树(Populus tremuloid)和苜蓿(Medicago sativa)中分离(Bugos等，1991，Plant Mol Biol，171203-1215，Gowri等，1991，Plant Physiol，977-14)，其后在烟草(Nicotiana tabacum)(Jaeck等，1992，Mol Plant-Microbe Interact，5294-300)、桉树(Eucalyptus gunnii)(Poeydomengo等，1994，Plant Physiol，105749-750)、百日草(Zinnia elegans)(Ye等，1995，Plant Physiol，108459-467)、笔豆花(Stylosanthes humulis)(McIntyre等，1995，Australia J PlantPhysiol，22471-478)、软壳甜扁桃(Prunus amygdalus)(Garcia-Mas等，1995，Plant Physiol，1081341)、玉米(Zea mays)(Collazo等，Plant MolBiol，20857-867)和黑麦草(Lolium perenne)(McAlister等，1998，Australia J Plant Physiol，25225-235)中也分离出咖啡酸甲基转移酶基因。
对咖啡酸甲基转移酶在植物生长发育中的作用研究表明，咖啡酸甲基转移酶基因主要在植物的木质化组织中表达。利用反义RNA在转基因烟草(Atanassova等1995，Plant J，8465-477)、苜蓿(Ni等，1994，Transgenic Research，3120-126)和杨树(Dwivedi等，1994，Plant MolBiol，2661-71)中抑制咖啡酸甲基转移酶基因的表达，可以明显改变木质素的含量和组成，表明咖啡酸甲基转移酶在控制木质素合成中具有重要作用。在玉米中分离到一种突变体bm3，分析结果表明是由于咖啡酸甲基转移酶结构基因失活，而使咖啡酸甲基转移酶活性下降所造成的，这使得其木质素含量下降30％以上，并导致茎机械强度的降低(Vignols等1995，Plant Cell，7407-416)，这从反面证明咖啡酸甲基转移酶基因作为木质素合成的关键酶基因，在控制植物茎的生长发育过程，特别是茎的机械支持方面具有重要作用，因而在植物基因工程技术领域中具有广泛的应用潜力。
国际上虽然已经从包括树木和牧草等数种植物中分离出了咖啡酸甲基转移酶基因，但对小麦(Triticum aestivum)咖啡酸甲基转移酶基因的分离和鉴定工作，目前仍是空白。也没有相关基因专利的报道。
无论在中国还是在世界范围内，小麦都是最重要的农作物之一，在水稻、玉米和马铃薯等重要农作物中位居首位。在生产实践中，由于小麦茎杆机械强度不足引起的倒伏可使产量损失20％以上。此外，由于病虫害侵袭所造成的损失也十分巨大。利用小麦咖啡酸甲基转移酶基因，通过基因工程手段，调节基因的表达活性，则可能获得高产抗倒伏和抗病虫害的小麦新品系。
本发明通过提供小麦的咖啡酸甲基转移酶基因和由其编码的蛋白质，达到控制小麦中木质素合成、并进一步控制小麦茎生长、发育和倒伏的目的。本发明的另一个目的是提供可将上述基因翻译成活性蛋白质的表达质粒。
发明目的本发明的一个目的是提供一种与小麦茎发育和抗倒伏相关的咖啡酸甲基转移酶。
本发明的另一个目的是提供一种编码小麦咖啡酸甲基转移酶的基因。
本发明的再一个目的是提供一种含有本发明的基因的表达载体。
技术方案本发明提供了一种与小麦茎发育和抗倒伏相关的咖啡酸甲基转移酶。该蛋白质序列包括356个氨基酸，如SEQ ID NO 2所示。在该蛋白质序列中，疏水氨基酸占135个，亲水氨基酸占72个，碱性氨基酸占32个，酸性氨基酸占40个，该蛋白质的分子量为38.6 KD，等电点为5.9。该蛋白质是国际上未曾报道的新蛋白质。
本发明还提供了一种编码小麦咖啡酸甲基转移酶基因(COMT)的全长cDNA，并命名为Ta-CM1。对Ta-CM1基因全长cDNA序列进行分析，得到其序列，以SEQ ID NO 1表示。该序列共由1344个碱基组成，其中，5’端未翻译区包括75个碱基，3’端未翻译区包括198个碱基(其中包括17个碱基组成的PolyA)，编码区由1071个碱基(从76位到1146位)组成，其中A占18.77％(201个)，C占32.68％(350个)，G占31.56％(338个)，T占16.99％(182个)，A+T占35.76％(383个)，C+G占64.24％(688个)。在国际基因序列数据库(GenBank\EMBL\DDBJ)中的基因同源性分析表明，Ta-CM1基因是小麦中未曾报道的新基因，它与从桉树(Eucalyptus gunnii)、杨树(Populus tremuloid)、烟草(Nicotiana tabacum)、玉米(Zea mays)、苜蓿(Medicago sativa)、百日草(Zinnia elegans)、笔豆花(Stylosanthes humulis)、软壳甜扁桃(Prunus amygdalus)和黑麦草(Loliumperenne)中分离出的咖啡酸甲基转移酶基因具有同源性。
本发明还提供了一种含有本发明的基因的表达载体。
在Ta-CM1基因编码区两侧合成引物，并分别引入XbaI及NotI酶切位点，其引物序列分别为5’-引物5’-GCTCTAGAATGGGGTCGATCGCCGCCGG-3’(SEQ IDNO7)；3’-引物5’-ATAAGAATGCGGCCGCCTACTTAGTGAACCCGATGG-3’(SEQ ID NO8)。
经过PCR扩增出Ta-CM1基因的全长编码区，以XbaI与NotI双酶切下，连接到表达载体pET-29b的相应酶切位点上(见
图1)，通过酶切和序列分析证明此表达载体的完整性和正确性。
将表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS菌株，经过IPTG诱导后，将大肠杆菌蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳分析，证明Ta-CM1基因已在大肠杆菌中翻译出正确的蛋白质。将上述大肠杆菌菌株经过37℃培养和IPTG诱导后，进行菌体裂解，分离菌体蛋白质，并对该蛋白质进行咖啡酸甲基转移酶活性分析，所用底物分别为咖啡酸(caffeic acid)和5-羟基阿魏酸(5-hydroxyferuric acid)，得到其酶活性分别为2.67和1.90pmol/sec/mg，证明此蛋白质具有咖啡酸甲基转移酶的催化活性。
分别从小麦的根、茎、叶组织中提取总RNA，经过电泳后用毛细管法转移到尼龙膜上，与小麦COMT基因探针杂交，放射自显影检测杂交结果，以rRNA探针为对照使杂交信号标准化。以此方法检测Ta-CM1基因在小麦不同部位的表达。得到的结果表明该基因在小麦营养生长组织中表达。
对易倒伏和抗倒伏小麦品种的不同发育时期的茎(从拔节期到乳熟期)中的Ta-CM1基因进行Northern杂交，以检测该基因在不同品种中的表达，结果表明该基因在抗倒伏品种中的表达量明显高于易倒伏品种，在茎的生长后期(既最容易发生倒伏的时期)差异更明显。此结果表明Ta-CM1基因不仅控制着小麦木质素的合成，而且与小麦茎的抗倒伏特性密切相关。
本发明提供了与小麦茎发育和抗倒伏相关的咖啡酸甲基转移酶基因和与其相关的蛋白质产物。应用该基因，可开发出转基因植物，以控制茎中的木质素合成，从而改变茎的机械支持能力和抵御外界不良环境的能力。例如，正如本发明的一个优选实施例所表明的那样，利用转基因小麦获得抗倒伏的高产品种，增加小麦的抗病和抵御外界不良环境的能力；当然，也可通过有性杂交方法将此基因转移到现有的小麦生产品种中。
附图简要说明图1表示Ta-CM1基因表达质粒。
实施例实施例一、小麦咖啡酸甲基转移酶基因探针的分离及序列分析将小麦种植于温室中，正常浇水和施肥，至生长到2-3个节间，采集根、茎、叶组织，用TRI试剂(Molecular Research Center，Inc，Cincinnati，USA)提取总RNA，用PolyAT tractmRNA Isolation试剂盒(Promega公司，Madison，USA)分离Poly(A)+RNA，用紫外分光光度计分析RNA的含量和纯度。
反转录合成cDNA第一条链的条件为Poly(A)+RNA 1ug，5μmol/L引物5’-GACTCGAGTCGACATCGA(T)17-3’(SEQ ID NO3)，0.5mmol/LdNTP，50单位RNasin，65℃保温10分钟，在冰上冷却后，加入200USuperScriptTMII RNase H-Reverse Transcriptase(Gibco)，42℃保温1小时，加EDTA至终浓度10mM，并于95℃保温10分钟，在冰上冷却。
第一轮PCR的引物为A25’-GACTCGAGTCGACATCG-3’(SEQ IDNO4)；A35’-yTsATGAAyCArGAyAArGT-3’(SEQ ID NO5，其中，r表示g或a，y表示t或c，s表示g或c，n表示a或t或g或c，下同)，条件为3μL cDNA反应液，1μmol/L引物，0.4mmol/L dNTP，2.5 U Taq DNA聚合酶(Gibco公司，Grand Island，NY，USA)，于95℃变性5分钟，50℃复性2分钟，72℃延伸40分钟，然后进行40个循环(95℃1分钟，55℃1分钟，72℃3分钟)，最后72℃延伸10分钟。
第二轮PCR引物为A35’-yTsATGAAyCArGAyAArGT-3’(SEQ IDNO5)，A45’-TCyTTnCCnCCnGGrTTrTG-3’(SEQ ID NO6)，条件为使用1μL第一轮PCR反应液，于95℃变性5分钟，其它反应同第一轮。PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳，采用GlassMAXDNA Isolation试剂盒(Gibco公司，Grand Island，NY，USA)。纯化后连接在pGEM-TEasy载体上(Promega公司，Madison，USA)。连接条件为16℃ 12小时。转化受体菌为E.coli DH5α，感受态细胞的制备采用CaCl2处理方法(Sambrook，J.等(eds)，Molecular cloningAlaboratory manual，2nded.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)。将连接产物加入到感受态细胞中，冰浴30分钟，42℃热激90秒，加入LB液体培养基，37℃保温45分钟，涂布在含氨苄青霉素(100ug/ml)和X-Gal(20ug/ml)的LB平板上，37℃培养过夜。白色克隆接种于LB液体培养基上(含氨苄青霉素100ug/ml)，37℃培养过夜，提取质粒，进行酶切分析后，以ABI 377 DNA序列分析仪进行序列分析，确定小麦的COMT探针。
序列分析的结果表明，所分离的探针具有604个核苷酸，与桉树(Eucalyptus gunnii)、杨树(Populus tremuloid)、烟草(Nicotiana tabacum)、玉米(Zea mays)、苜蓿(Medicago sativa)、百日草(Zinnia elegans)和黑麦草(Lolium perenne)中分离出的咖啡酸甲基转移酶基因的同源性在60％以上。
实施例二、小麦咖啡酸甲基转移酶基因的筛选和序列分析以小麦茎Poly(A)+RNA为模板，以ZAP载体(Stratagene公司，LaJolla，CA，USA)合成cDNA，经过体外包装，构建成小麦茎的cDNA文库。取50ng探针DNA，加50uCi32P-dCTP进行标记，37℃保温1小时，加EDTA至终浓度10mM终止反应。探针通过Sephadex G-50柱后，于100℃煮沸10分钟，立即在冰上冷却，进行杂交。
取50000pfu铺平板，并将其转移到硝酸纤维素膜上，于0.5M NaOH加1.5M NaCl变性2分钟，1.5M NaCl加0.5M Tris-HCl(pH8.0)复性5分钟，0.2M Tris-HCl(pH7.5)加2×SSC漂洗30秒，将膜夹在两层Whatman滤纸中，80℃真空烘烤2小时，之后加入杂交液(6×SSC，5×Denhardt，0.5％SDS，100μg/mL鱼精DNA，50％甲酰胺)，42℃保温2小时，加入标记的探针，42℃杂交过夜，经过6×SSC加0.1％SDS室温下洗两次，每次30分钟，再用0.1×SSC加0.1％SDS于65℃洗两次，每次20分钟，之后于-80℃下放射自显影，确定阳性克隆后，将噬菌斑取下，于SM溶液中4℃提取过夜，再按同样的程序进行两轮筛选。
对于获得的阳性噬菌斑，按Stratagene公司提供的方法将其转化为质粒DNA，经过酶切分析后，采用ABI 377 DNA序列分析仪进行序列分析。
测得的DNA序列如SEQ ID NO 1所示，将其命名为Ta-CM1。它是小麦咖啡酸甲基转移酶基因，是迄今尚未报道的新基因。
实施例三、小麦咖啡酸甲基转移酶基因编码蛋白质的翻译人工合成一对引物5’-引物5’-GCTCTAGAATGGGGTCGATCGCCGCCGG-3’(SEQ IDNO7)；3’-引物5’-ATAAGAATGCGGCCGCCTACTTAGTGAACCCGATGG-3’(SEQ ID NO8)在引物两端分别引入XbaI及NotI酶切位点，以Ta-CM1基因为模板，进行PCR扩增，扩增条件10ng DNA，1μmol/L引物，0.4mmol/LdNTP，2.5 U Taq DNA聚合酶(Gibco公司，Grand Island，NY，USA)。于95℃变性5分钟，然后进行30个循环(95℃1分钟，55℃1分钟，72℃1.5分钟)，最后72℃延伸10分钟。
PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳，采用GlassMAXDNA Isolation试剂盒(Gibco公司，Grand Island，NY，USA)。纯化后，用XbaI及NotI双酶切后，连接在载体pET-29b(Novagen Company，USA；Cat No.69872-3)上，转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞，转化细胞冰浴30分钟后，42℃热激50秒，加入LB液体培养基，37℃保温45分钟，涂布在含卡那霉素(50ug/ml)的LB平板上。将抗性菌落于LB液体培养基(含卡那霉素50ug/ml)中37℃震荡培养过夜，再进行1/100稀释后，37℃震荡培养2小时，加入IPTG至终浓度1mM，继续培养3小时，12000g离心10分钟，收集菌体，菌体加入100 ul裂解液(50mM Tris-HCl pH6.8，100mM二硫苏糖醇，2％SDS，0.1％溴酚蓝，10％甘油)，100℃煮沸5分钟，菌体蛋白按常规方法进行SDS-PAGE电泳(凝胶浓度12％)，结果显示在细菌中有咖啡酸甲基转移酶蛋白质的表达，其结构如SEQ ID NO 2所示。
实施例四、咖啡酸甲基转移酶活性的测定将IPTG诱导后的大肠杆菌50ml于4000g离心10分钟，加入4ml菌体裂解液(20mMTris-HCl pH7.5，1mM PMSF，2mM二硫苏糖醇，100ug/ml溶菌酶)，30℃保温15分钟，用超声波处理20次，4000g离心10分钟，取上清液进行酶活测定。酶活测定反应液包括30ul反应缓冲液(0.13M Tris-HCl pH7.5，13.3％甘油，0.26 mM MgCl2)，5ul 0.6mM[14C]S腺苷蛋氨酸(7.8uCi/mL，13 Ci/mol)，5ul底物(1mM)，10ul酶蛋白溶液，在30℃下反应30分钟，之后加入50ul 0.2N HCl，混匀后，加入200ul乙酸乙酯/正己烷(1∶1)，Vortex 10秒，10,000g离心2分钟，取150ul上层有机相加入4ml液闪液，利用液闪仪测定放射性，并计算咖啡酸甲基转移酶的活性。蛋白质含量按Bio-Rad公司的方法(Bradford，M.M，1976，Anal.Biochem.，72248-254)测定。
结果显示，以咖啡酸为底物，其酶活性为2.67pmol/sec/mg，以5-羟基阿魏酸为底物，其酶活性为1.90pmol/sec/mg。表明Ta-CM1基因所编码的蛋白质具有催化合成阿魏酸和丁香酸的功能，因而能够控制小麦中木质素合成。
实施例五、小麦组织中Ta-CM1基因表达产物的检测采用Northern blot杂交检测小麦不同组织中的Ta-CM1基因的表达产物，从不同小麦组织中分离的总RNA样品，按常规方法在1.4％琼脂糖/甲醛变性凝胶电泳上分离，以20×SSC按毛细管法转移到尼龙膜上(转移时间12小时)，尼龙膜夹在两层Whatman滤纸中，80℃真空烘烤2小时，将膜放在杂交瓶中，之后加入杂交液(6×SSC，5×Denhardt，0.5％SDS，100μg/mL鱼精DNA，50％甲酰胺)10ml，42℃预杂交2小时，加入标记的咖啡酸甲基转移酶基因探针，42℃杂交过夜，经过6×SSC加0.1％SDS室温下洗两次，每次30分钟，再用0.1×SSC加0.1％SDS于65℃洗两次，每次10分钟，于-80℃下放射自显影一周。显影后的膜加入0.1×SSC加0.1％SDS于95℃洗两次，每次15分钟，之后加入含有18SrRNA探针的杂交液，42℃杂交过夜。将膜取出，按相同的程序洗膜，于-80℃下放射自显影1小时。
杂交结果如表1所示。表1.小麦不同组织中Ta-CM1基因的表达量(以茎为100)
结果表明，小麦咖啡酸甲基转移酶基因Ta-CM1在营养生长具有木质化功能的组织中均有明显的表达。
比较两个不同品种(抗倒伏品种H4564和易倒伏品种C6001)在不同生长时期茎中Ta-CM1的表达，结果见表2。
表2.小麦茎不同发育时期Ta-CM1基因的表达量(以C6001的拔节期为100)
由结果可以看出，在抗倒伏品种(H4564)中，Ta-CM1的表达量在生长发育的早期与易倒伏品种(C6001)相差无几，但在生长发育后期抗倒伏品种(H4564)茎中Ta-CM1的表达量明显高于易倒伏品种(C6001)，而这一生长发育时期是小麦对茎的机械支持能力要求最为关键的时期。这表明Ta-CM1基因与小麦的抗倒伏特性密切相关。因此，控制Ta-CM1基因的表达就能控制小麦的抗倒伏性状。
序列表<110> 中国科学院植物研究所<120> 与小麦茎抗倒伏相关的咖啡酸甲基转移酶、编码该酶的基因和含有该基因的表达载体<130> 1020433<160> 8<170> PatentIn version 3.1<210> 1<211> 1344<212> DNA<213> 小麦<220>
<221> CDS<222> (76)..(1146)<223>
<400> 1catcgctcag tcgctcgctc acactcaacg ccacgtagca gcagctcggc tccggcgggg 60cagaagcaag cagag atg ggg tcg atc gcc gcc ggc gcc gac gag gat gcg 111Met Gly Ser Ile Ala Ala Gly Ala Asp Glu Asp Ala1 5 10tgc atg tac gct ctc cag ctc gtc tcg tcg tcg atc ctc ccg atg acg 159Cys Met Tyr Ala Leu Gln Leu Val Ser Ser Ser Ile Leu Pro Met Thr15 20 25ctg aag aac gcc atc gag ctg ggg ctc ctc gag acc ctg atg gcc gcc 207Leu Lys Asn Ala Ile Glu Leu Gly Leu Leu Glu Thr Leu Met Ala Ala30 35 40ggc ggc aag ttc ttg act ccc gct gag gtg gca gcc aag ctc ccg tcc 255Gly Gly Lys Phe Leu Thr Pro Ala Glu Val Ala Ala Lys Leu Pro Ser45 50 55 60gcg gcg aat ccg gaa gcg ccg gac atg gtg gac cgt atg ctc cgt ctg 303Ala Ala Asn Pro Glu Ala Pro Asp Met Val Asp Arg Met Leu Arg Leu65 70 75ttg gcc tcg tac aac gtg gtg tcg tgc agg acg gag gag ggc aag gac 351Leu Ala Ser Tyr Asn Val Val Ser Cys Arg Thr Glu Glu Gly Lys Asp
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Glu Ala Pro Asp Met Val Asp Arg Met Leu Arg Leu Leu Ala Ser Tyr65 70 75 80Asn Val Val Ser Cys Arg Thr Glu Glu Gly Lys Asp Gly Arg Leu Ser85 90 95Arg Arg Tyr Gly Ala Ala Pro Val Cys Lys Tyr Leu Thr Pro Asn Glu100 105 110Asp Gly Val Ser Met Ser Ala Leu Ala Leu Met Asn Gln Asp Lys Val115 120 125Leu Met Glu Ser Trp Tyr Tyr Leu Lys Asp Ala Val Leu Asp Gly Gly130 135 140Ile Pro Phe Asn Lys Ala Tyr Gly Met Ser Ala Phe Glu Tyr His Gly145 150 155 160Thr Asp Pro Arg Phe Asn Arg Val Phe Asn Glu Gly Met Lys Asn His165 170 175Ser Ile Ile Ile Thr Lys Lys Leu Leu Glu Ser Tyr Lys Gly Phe Glu180 185 190Gly Leu Gly Thr Leu Val Asp Val Gly Gly Gly Val Gly Ala Thr Val195 200 205Ala Ala Ile Thr Ala His Tyr Pro Thr Ile Lys Gly Ile Asn Phe Asp210 215 220Leu Pro His Val Ile Ser Glu Ala Pro Pro Phe Pro Gly Val Thr His225 230 235 240Val Gly Gly Asp Met Phe Gln Lys Val Pro Ser Ala Asp Ala Ile Leu245 250 255
Met Lys Trp Ile Leu His Asp Trp Ser Asp Glu His Cys Ala Thr Leu260 265 270Leu Lys Asn Cys Tyr Asp Ala Leu Pro Ala His Gly Lys Val Val Leu275 280 285Val Glu Cys Ile Leu Pro Val Asn Pro Glu Ala Thr Pro Lys Ala Gln290 295 300Gly Val Phe His Val Asp Met Ile Met Leu Ala His Asn Pro Gly Gly305 310 315 320Arg Glu Arg Tyr Glu Arg Glu Phe Glu Ala Leu Ala Lys Gly Ala Gly325 330 335Phe Ala Ala Met Lys Thr Thr Tyr Ile Tyr Ala Asn Ala Trp Ala Ile340 345 350Glu Phe Thr Lys355<210> 3<211> 35<212> DNA<213> 人工序列<400> 3gactcgagtc gacatcgatt tttttttttt ttttt 35<210> 4<211> 17<212> DNA<213> 人工序列<400> 4gactcgagtc gacatcg17<210> 5<211> 20
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ataagaatgc ggccgcctac ttagtgaacc cgatgg3权利要求
1.一种咖啡酸甲基转移酶，它具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
2.一种编码权利要求1所述的咖啡酸甲基转移酶的DNA序列。
3.按照权利要求2所述的DNA序列，它具有SEQ ID NO1所示的序列。
4.一种含有权利要求2或3所述的DNA序列的表达载体。
5.按照权利要求4所述的表达载体，它是含有权利要求2或3所述的DNA序列的表达载体pET-29b。
6.按照权利要求4所述的表达载体，它是一种植物表达载体。
全文摘要
本发明提供了一种与小麦茎发育和抗倒伏相关的咖啡酸甲基转移酶，编码该酶的基因和含有该基因的表达载体。
文档编号C12N9/10GK1493689SQ0215032
公开日2004年5月5日 申请日期2002年11月1日 优先权日2002年11月1日
发明者马庆虎 申请人:中国科学院植物研究所