专利名称：用于人HNF-1α基因扩增的多重PCR引物组的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于扩增人HNF-1α基因的引物库(primer pool)，更具体的，涉及通过多重PCR(multiplex PCR)用于扩增人HNF-1α基因中靶DNA序列的引物库。
背景技术：
用于杂交核酸检测的一类方法包括聚合酶链式反应(PCR)。PCR方法是本领域共知的(U.S.Pat.Nos.4,683,195，4,683,202和4,800,159)。在PCR中，核酸引物与扩增靶序列的相反链互补，核酸引物与变性样品退火。然后，DNA聚合酶(典型的是热稳定性的)从杂交的引物开始延伸DNA双链。这个过程不停的重复以扩增靶核酸。如果核酸引物不能杂交于样品，就不能形成相应的PCR扩增产物。在这种情况下，PCR引物就起到杂交探针的作用。
在PCR方法中，扩增的核酸产物可以用很多方法检测，例如，通过使用标记的引物向扩增链中混合入标记的核苷酸。用于PCR反应的引物包括但不限于放射性物质、荧光性染料、洋地黄毒苷(digoxygenin)、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、吖啶酯、生物素和刀豆脲酶。用未标记的引物产生的PCR产物可以用其它方法检测，例如凝胶电泳分离后基于染色观察。
基于PCR的方法在用于检测未知序列的核酸时受到限制。人类基因组由约3×109个核苷酸组成；因此，很难分离和分析特定的人类基因。然而，PCR可以通过使用一组引物，包括能和靶序列的两末端互补的引物，高速，特异性和敏感性地扩增靶序列(Saiki et al.Science 239487，1988)。
PCR可以广泛的用于疾病相关基因的分析。特别是，通过PCR扩增基因可以在药物领域用于分析疾病相关基因的各种遗传变异。一种特定的疾病相关基因可以使用PCR进行扩增，使用测序、杂交或者单链构象多态性进行分析。在分析基因遗传变异时，如果靶基因的大小很小，单PCR就足以扩增全长基因。然而，如果靶基因很大，例如，1Kb或者更大，单PCR就很难扩增出全长基因。因此，PCR可以在全部基因的几个部分进行几次反应，来扩增较大靶基因的全长基因。在分析疾病相关基因的遗传变异时，复合的PCR反应比单PCR反应更经常使用，因为大多数疾病相关基因的大小可达1.5Kb或更大。
多重PCR方法要求大量的样品，例如，病人的DNA或者血液。多重PCR也花费更多的成本、物力和时间。因此，多重PCR要被发展并解决上述问题。一多重PCR反应在一个反应中同时扩增较多数基因的靶序列。因此，单PCR使用扩增各种靶序列的引物库扩增了大多数靶序列。
多重PCR试验在本领域是公知的。例如，U.S.Pat.No.5,582,989公开了同时检测多数已知DNA序列的缺失。此技术公开了使用第一组探针来与靶杂交。如果靶存在，探针就会延伸。延伸的产物用PCR进行扩增。
多重PCR反应的一组引物可以特异的杂交于靶序列且为扩增靶序列使用的充分的量之间彼此不被干扰。多重PCR使用这样的一组引物可以使它比单PCR在扩增靶序列时节省时间、物力和成本。在使用DNA芯片分析基因的遗传变异时，多重PCR在一个反应中扩增多于一种DNA样品时是有用的。这样的DNA芯片可用于基因的遗传变异分析。
众所周知的，人HNF-1α(肝细胞核因子-α)基因的遗传变异，包括了点突变，导致青春晚期糖尿病(matvrity-onset diabetes in the young)(MODY3)(Matschinsky and Magnuson，in‘Molecular Pathogenesis of MODYs′，Karger，1998；US 5,541,060；WO9321343)。MODY 3，一种MODY疾病(MODY1，2，3，4，5)占II型糖尿病病例的大约10-30％。因此，在分析人HNF-1α基因遗传变异时，预料人的糖尿病倾向是可能的。因此，为了使用例如DNA芯片来快速分析人HNF-1α基因，一系列通过多重PCR扩增人HNF-1α基因的引物需要被改进。
发明内容
本发明的一个实施方案提供了引物库，包含了至少一组来扩增人HNF-1α基因的至少一个靶序列的引物，所述的至少一组引物选自a)一组包含具有SEQ ID NO 3所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 4所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸的引物；b)一组包含具有SEQ ID NO 5所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 6所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸的引物；c)一组包含具有SEQ ID NO 7所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 8所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸的引物；d)一组包含具有SEQ ID NO 9所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 10所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸的引物；e)一组包含具有SEQ ID NO 11所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 12所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸的引物；f)一组包含具有SEQ ID NO 13所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 14所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸的引物；g)一组包含具有SEQ ID NO 15所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 16所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸的引物；h)一组包含具有SEQ ID NO 17所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 18所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸的引物；i)一组包含具有SEQ ID NO 19所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 20所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸的引物；以及j)一组包含具有SEQ ID NO 21所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 22所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸的引物，其中所述的变体寡核苷酸是指从3′末端，5′末端或者在3′和5′末端有1到3个附加核苷酸加入或缺失的寡核苷酸。
本发明的另一个实施方案提供了使用引物库对人HNF-1α基因进行测序的方法。
本发明的其它实施方案中提供了用于对人HNF-1α基因的靶序列的含有引物库的试剂盒。
本发明也提供了用于扩增本发明的人HNF-1α基因中靶序列的方法，包括将人HNF-1α基因的靶序列用于使用本发明引物库的PCR。
图1人HNF-1α基因的外显子1到10的单PCR产物和多重PCR产物电泳结果图。
图22A到2E描述了使用一组变体(variant)引物获得的多重PCR反应产物的电泳结果。
图3图示使用用于扩增每一外显子的每一引物组作为探针获得的单PCR和多重PCR的Southern印迹结果。
图4通过一组用于扩增启动子的引物获得的单PCR产物核苷酸序列(SEQ ID.31)和已知的人HNF-1α基因的核苷酸序列的比较。
图5多重PCR反应溶液稳定性试验的结果。
图6说明通过使用三种不同扩增装置获得的多重PCR产物电泳结果的照片。
具体实施例方式
为了使本发明更容易理解，下面定义一些术语。本文是“核酸”是指核苷酸共价连接的序列，其中一个核苷酸的戊糖的3′位置与下一个戊糖的5′位置通过磷酸二酯基团连接，其中的核苷酸残基(碱基)被连接在特定的序列，即线形顺序的核苷酸。
“多核苷酸”在这里是指包含在长度上大约大于100个核苷酸序列的核酸。
“寡核苷酸”在这里是指短的多核苷酸或者多核苷酸的一部分。寡核苷酸典型的包含大约2个到大约100个碱基的序列。术语“寡”有时替代术语“寡核苷酸”。
碱基“位置”是指给定的碱基或者核苷酸残基在核酸中的位置。
“目的核酸”是指在样品中待进行研究的特定核酸。
术语“分离”是用在与核酸或者蛋白相关时，是指核酸序列或者蛋白被从至少一种污染物(分别为核酸或者蛋白)中鉴定并分离，在其自然源中该污染物通常与其相关联。分离的核酸与从自然界中发现的不同。相反，非分离的核酸或蛋白被发现以其自然存在的状态存在。
术语“纯化的”或者“纯化”是指一些从目的化合物去除一些污染物的方法的结果，例如，蛋白或者核酸。纯化组分的百分比因此在样品中是增加的。
术语“野生型”是指具有在种群中最常观察到的基因或者基因产物特征的基因或基因产物，并由此特定命名为该基因的“正常的”和“野生型”形式。相反的，术语“修饰”或者“突变体”是指与野生型基因或者基因产物相比，表现出了序列上的修饰和/或功能性质的变化(即，改变的特性)的基因或者基因产物。
已知核酸可以包括不同类型的突变。在这里，“点”突变是指在核酸序列的单个碱基位置上发生改变。“损害(lesion)”是指在核酸的位点上有一个或多个碱基通过缺失或插入而突变，这样核酸序列就不同于野生型序列。“插入”或者“缺失”典型的是在1到5个核酸的范围。可以利用重组DNA技术在核酸分子上进行有系统地插入、缺失或取代就可以试验性决定所允许的变异并分析所得变体的活性。
此处的“单核苷酸多态性”或者SNP是指在特定的核酸位置上最大频率存在的碱基上发生的一种变异。
不同物种的同源基因或等位基因在序列上有所变化也是公知的。不同物种的同源基因或等位基因的区域在序列上可以基本一致。这种区域被称为“同一性区域”。值得注意的是这种“基本同一性区域”可以包括一些错配(mismatches)，在同一性区域上相同位置的碱基可以是不同的。这个碱基位置被称为“错配位置”。DNA分子之所以有5′末端和3′末端是因为核酸磷酸二酯键产生在取代基单核苷酸的戊糖环的5′碳和3′碳。在新键接5′碳的多核苷酸的末端的是其5′末端核苷酸，在新键接3′碳的多核苷酸的末端是其3′末端核苷酸。本文的末端核苷酸是3′-或5′-末端位置的核苷酸。在这里，核酸序列，即使大的寡核苷酸或者多核苷酸，也可以说有3′和5′末端。例如，位于较大染色体序列内的基因序列仍可以说有3′和5′末端。
在这里，核酸探针的3′末端区域是指包括从3′末端位置起大约10个残基核苷酸的探针区域。
无论是线形还是环状DNA分子，相对于连接或者能连接于那一元件5′末端的部分，游离的元件(discrete elements)被称为“5′”或者“上游”。相似的，相对于连接或者能连接于那元件3′末端的部分，游离的元件被称为3′或者下游。DNA上转录是沿DNA链5′-3′方向进行的。这意味着，RNA也是通过在伸长链的3′末端依次添加5′-三磷酸核糖核苷酸(随着焦磷酸的去除)来合成的。
术语“靶核酸”或者“核酸靶”在这里是指特定的目的核酸序列。因此，“靶”可以存在于其它核酸分子或者大的核酸分子中。
术语‘核酸探针′是指寡核苷酸或者多核苷酸，它能杂交于另一目的核酸。核酸探针可以在纯化的限制性消化中天然的存在或者合成产生、重组产生或者通过PCR扩增产生。术语“核酸探针”是指本发明所述方法中使用的寡核苷酸或多核苷酸。相同的寡核苷酸也可以被使用，例如，在PCR方法中作为引物聚合，但在这里，寡核苷酸是指“引物”。而且，寡核苷酸可以包含一些修饰的键，例如硫代磷酸键(phosphorothioate bond)。
术语“互补”和其衍生物在这里是指核酸(也就是核苷酸序列)相对于公知的碱基对规则，即A配T，C配G。例如，序列5′-AGT-3′互补于序列3′-TCA-5′。互补可以是“部分的”，也就是说只有一些核酸碱基符合了碱基配对规则。在另一方面，它们可以是完全的或者全部的在核酸链之间互补，它们所有的碱基都符合碱基配对规则。核酸链之间的互补程度非常影响核酸链间杂交的效率和强度，这是本领域公知的。这对依靠于核酸间配对的检测方法是特别重要的，例如，本发明的方法。术语“基本上互补”是指一些探针在以下描述的低严谨度条件下能和靶核酸序列的一个或两个链杂交，优选的，在聚合酶反应缓冲液(Promega M195A)中加热到95℃，冷却到室温，这时，认为核酸探针部分的或者完全的互补于靶核酸，这里指的是探针的3′末端区域(例如核苷酸3′末端的大约10个核苷酸)。
术语“同源性”在这里是指互补的程度。可以是部分同源或者完全同源(也就是同一性)。至少部分抑制同一序列与靶核酸杂交的部分互补序列被称为“基本上同源”。与靶序列完全互补序列的杂交的抑制作用可以在低严谨度下用杂交分析检测(Southern或northern印记或液体杂交等)。在低严谨度下，基本上同源序列或者杂交探针将竞争或抑制完全同源序列与靶序列的结合。这并不是说低严谨度的条件可允许非特异性结合，低严谨度条件要求两个序列与其它序列发生特定的(也就是选择)相互作用。非特异性结合不存在时可以通过没有部分互补的第二靶序列进行检测(例如低于约30％的同一性)。非特异性结合不存在时，探针不会与第二无互补性靶序列杂交。本发明揭示的这种序列杂交可以在严谨条件和降低的严谨度条件下实施(例如，标准的原位杂交方法中的DNA的严谨洗涤条件为0.3M NaCl，0.03M柠檬酸钠，0.1％SDS，60℃或甚至70℃，参见J.Sambrook等，分子克隆，实验室手册(第2版，1989)(冷泉港实验室))。一般情况下，这种序列与这里给出的序列至少有65％的相似，75％相似，80％相似，85％相似，90％相似，95％相似。
本发明的多重方法可以用于确定大多数预测定的(已知的)核酸靶序列在核酸样品中是否存在。核酸靶是“预定的”，其序列必须知道以能设计探针能与之杂交。然而，应该注意到，用于本发明方法的核酸靶序列，可以能够作为想确定的核酸中不同核酸存在与否的信号报道基因(reporter)。其它目的核酸不是必须有预定的序列。更进一步的，本发明可以在已知足够的序列来设计在探针3′末端区域有部分互补的靶与探针杂交时，确定靶内碱基身份。这种方法利用了一种能够对杂交于核酸靶序列的寡核苷酸探针的3′-末端进行解聚的酶，释放一个或者多个识别的核苷酸，其存在与否可以用检测输出确定，从而确定靶序列的存在与否。
当提供了与核酸靶序列部分的或者完全互补的核酸探针时，核酸靶序列可以被预先确定。如果样品中存在靶序列，这种核酸靶序列是核酸样品与探针杂交的部分。
本发明也包括了将待分析的样品与多数核酸探针混合的方法。第一步的混合通常在低严谨度杂交条件下进行，以形成杂交组合物。在这种杂交组合物中，核酸探针的3′末端区域(i)与样品中可能存在的部分或者完全互补的核酸靶序列杂交；以及(ii)包括了3′末端区域的识别核苷酸(identifiernudeotide)。
核酸探针可以被设计为不与自身杂交形成发卡结构，这会干扰探针的3′-末端区域与靶核酸的杂交。探针的设计参数(parameters guilding probedesign)是本领域公知的。
杂交组合物可以在杂交条件下维持一段时间以充分形成包含了大量与其各自探针产生了杂交的预先确定核酸靶序列处理的样品。
在被分析的样品不含有杂交探针的靶序列的情况下，此探针不发生杂交。当本发明的方法用于确定特定靶序列是否在样品中存在时，所得处理的样品可能不含有本发明的酶的底物。结果，3′末端区域的识别核苷酸没有释放，分析输出结果(output)在背景或者接近背景的水平。
为制造用于使用多重PCR方法扩增人HNF-1α基因的引物库，下列因子应该被纳入考虑为扩增大量的靶序列，引物库的引物应该能够结合于人HNF-1α基因的靶序列并能互相不影响。引物库的每一个引物应该有相似的解链温度并优选不形成引物对二聚体(pair-dimer)。此外，引物库的每一个引物应该不能形成发卡结构或者引物自身二聚体。微卫星区域和重复区域应该排除在引物序列之外。
一个用来扩增人HNF-1α基因的引物库，包含了至少一组扩增人HNF-1α基因靶序列的引物，它选自下列物质组成的组a)一组包含具有SEQ ID NO 3所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 4所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸的引物；b)一组包含具有SEQ ID NO 5所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 6所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸的引物；c)一组包含具有SEQ ID NO 7所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 8所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸的引物；d)一组包含具有SEQ ID NO 9所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 10所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸的引物；e)一组包含具有SEQ ID NO 11所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 12所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸的引物；f)一组包含具有SEQ ID NO 13所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 14所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸的引物；g)一组包含具有SEQ ID NO 15所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 16所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸的引物；h)一组包含具有SEQ ID NO 17所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 18所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸的引物；i)一组包含具有SEQ ID NO 19所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 20所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸的引物；以及j)一组包含具有SEQ ID NO 21所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 22所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸的引物，其中，所述的变体寡核苷酸是指从3′或者5′末端或者在3′和5′末端有1到3个附加核苷酸加入或缺失的寡核苷酸。
因此，变体寡核苷酸具有与相应的寡核苷酸同样的核苷酸序列，除了其至少一个末端部分不同。
本发明也包括用于扩增HNF-1α基因的靶序列含有引物库的试剂盒。这个试剂盒可以包含常规的PCR试剂，如，dNTP溶液，DNA聚合酶和缓冲液等等。
此外，本发明还可以用于检测人HNF-1α基因的遗传变异。一种这样的变异包括MODY3，一种MODY疾病(MODY 1，2，3，4，5)，占大约10-30％的II型糖尿病疾病。因此，在分析人HNF-1α基因遗传变异时，来预测人的糖尿病倾向是可能的。因此，为了快速的分析人HNF-1α基因，可能开发使用，例如，DNA芯片，通过多重PCR扩增人HNF-1α基因的一系列引物。
本发明将通过以下实施例进行详细描述。下面的实施例用于解释本发明的目的，但不限制本发明的保护范围。
实施例1用于扩增人HNF-1α基因中10个靶序列的引物的制备引物被设计为能够使最终的每个PCR产物在大小上至少有5-10bp的差别。在设计一组用于多重PCR的引物时，前述的因子是需要被考虑的。进一步的，每个引物应该被设计为不包括4个或者更多个相同的连续的核苷酸。
引物分析使用HYBsimulaorTM(Advanced Gene Computing Technologies，Inc)。
为了提高PCR产物的扩增效率，T7启动子序列(SEQ ID NO.1)被加在正向引物5′末端，T3启动子序列(SEQ ID NO.2)被加在反向引物5′末端。
每个引物的序列编号和特性在表1中给出。
表1
F正向R反向实施例2使用单PCR扩增人HNF-1α基因使用实施例1的每一组引物通过单PCR扩增人HNF-1α基因的每一个靶序列。PCR是下列条件完成的，预变性(95℃5分钟)，30个循环变性(95℃30秒)，退火(64℃15秒)，聚合作用(72℃30秒)，最后延伸(72℃3分钟)PCR反应组合物如下无菌的不含DNA酶RNA酶的水12.8μldNTP混合液(各核苷酸各2.5mM) 2μl10×Taq聚合酶缓冲液 2μl一组引物(各10pmol) 2μl基因组DNA(200-1.0μg) 1μlTaq聚合酶(5单位/μl)0.2μlPCR产物在1.8％的琼脂糖凝胶上电泳分析(图1)。在图1中，泳道1和13表示分子标记，50bpDNA梯(ladder)。泳道2是相应于启动子的PCR产物，泳道3-11是相应外显子1，2，3，4，5，6，7，8&9和10的PCR产物。泳道12是使用实施例3的多重PCR得到的产物。
如图1，人HNF-1α基因的靶序列使用实施例1的引物组，使用单PCR方法进行了扩增。
实施例3通过多重PCR扩增人HNF-1α基因使用实施例1的一组引物进行多重PCR。PCR是下列条件完成的，预变性(95℃5分钟)。30个循环，变性(30秒95℃)，退火(15秒64℃)，聚合作用(30秒72℃)，最后延伸(3分钟72℃)，所有的引物加在一个反应管中，反应组分如下无菌的不含DNA酶和RNA酶的水18.4μl
dNTP混合液(核苷酸各2.5mM)5μl10×Taq聚合酶缓冲液 5μl引物(各10pmol) 20μl基因组DNA(200-1.0μg)1μlTaq聚合酶(5单位/μl) 0.6μ1PCR产物在1.8％的琼脂糖凝胶上电泳分析(图1，泳道12)。在图1中，使用实施例1的引物组进行多重PCR结果，人HNF-1α基因的所有的10个靶序列(579，459，365，308，332，241，286，230，414和171bp)被扩增。
实施例4使用变体引物通过多重PCR扩增人HNF-1α基因通过在4组引物(扩增启动子，外显子1，2，8 的引物组)的一个末端附加能与模板互补的3个核苷酸并在每一引物另一端缺失3个核苷酸而合成变体引物(表2)。使用实施例3的多重PCR方法进行扩增，只是采用上述4组引物中的一组和表1的另外3对应组引物。(图2)表2 F正向R反向 表1中相应的引物中缺失的核苷酸×××表1中相应的引物中附加的核苷酸图2A到2E是PCR产物电泳结果的照片。图2A、2B、2C和2D是PCR产物电泳结果，所述产物是利用包含启动子，外显子1，2，8的变体引物的引物库得到的。图2E是使用了包含有表2中所示的启动子，外显子1，2，8的所有变体引物的引物库进行反应得到的多重PCR产物的电泳结果。在图2A到2E，泳道1是50bp的DNA梯的分子标记。泳道2是使用表1给出的引物组进行多重PCR反应获得的结果，泳道3是使用引物库得到的PCR产物结果，所述引物库包含有表2中所示的启动子，外显子1，2，8的变体引物组和表1中所列一组引物，没有对应的变体引物组。泳道4是包括表1所列的引物组的引物库，但不包含有扩增启动子，外显子1，2，8的引物组(图2A、2B、2C、2D)或不包含有扩增启动子，外显子1，2，8(图2E)的引物组的引物库进行多重PCR反应得到的PCR产物结果。
在图2中，基因相应的靶序列使用变体引物的多重PCR扩增。
实施例5通过Southern印迹分析鉴定多重PCR产物通过实施例2、3扩增的PCR产物在1.8％的琼脂糖凝胶上电泳(图1)。凝胶被加入变性溶液(0.5N NaOH+1.5M NaCl)并伴随搅拌15分钟，以变性双链DNA。在进行变性处理两次后重复两次，然后使用蒸馏水清洗，在放入中和溶液中(3M NaCl包含了0.5M Tris-HCl，pH7.5)15分钟并轻轻晃动中和凝胶。在中和过程进行两次后，通过凝胶与尼龙膜在20×SSC溶液中反应12.5小时，将凝胶中的DNA转移到尼龙膜上。通过在120℃反应30分钟，使DNA交联于尼龙膜上，尼龙膜清洗1到2分钟并晾干。
获得的DNA结合的尼龙膜放入20ml杂交液中，于62℃保持约2小时以预杂交并丢弃杂交液。将DNA结合的尼龙膜和5pmol/ml的DIG(洋地黄毒苷(digoxigenin))标记探针放入10ml新鲜的杂交溶液袋中在62℃反应约12小时。在反应时，DIG标记的探针杂交于基因的互补区。在杂交后，使用2×的清洗液(2×SSC+0.1％SDS)在室温条件下清洗5分钟，进行两次，用0.5×清洗液(0.5×SSC+0.1％SDS)在62℃清洗15分钟，进行两次。
膜被放入20ml封闭液中约30-60分钟，在包含1μl碱性磷酸酶耦合的山羊抗DIG抗体(Roche)的20ml封闭液(blocking solution)中，膜与抗DIG抗体反应约30分钟。膜再用清洗液(100mM马来酸，150mM NaCl，室温条件下Ph7.5，0.3％吐温-20)清洗两遍，约15分钟。为确定膜上的DNA与探针杂交，碱性磷酸酶底物，CDP-Star被以1∶100的比例混合到检测缓冲溶液中，并用该溶液对尼龙膜处理约5分钟，进行X放射自显影。显影胶片可以用来确定探针的位置(图3)。如图3所示，泳道13是用DIG标记的分子标记。泳道2至11每一个代表图3中单个，泳道13是用IG标记的分子标记。图3中泳道2到11是启动子或者外显子1，2，3，4，5，6，7，8 & 9，10的单PCR产物各自的信号。泳道12是显示多重PCR产物。
如图3所示，探针在相同的位置与单PCR产物和多重PCR产物杂交，这意味着，扩增产物基本上是相同的。
实施例6通过测序分析鉴定多重PCR产物通过实施例3扩增的多重PCR产物在1.8％的琼脂糖凝胶上电泳。单DNA带被分离，使用凝胶提取试剂盒纯化。对纯化的DNA序列使用ABI3700进行序列鉴定，对比于相应的已知人HNF-1α基因序列(图4)。
图4给出PCR产物相应与通过一组引物扩增启动子获得的PCR产物的图解图。PCR产物相应与使用一组引物SEQ ID NOS.3和4通过多重PCR进行反应的PCR产物被分离并用自动测序方法测序后的图解图。所得的核酸序列(SEQ ID NO.31)(表示为“Query”)与已知的人HNF-1α基因启动子序列(表示为“启动子”)通过称为Lagergene(DNAs tar Inc.)的程序进行对比(图4)。如图4所示，PCR产物与已知人HNF-1α启动子表现出100％的序列同源性。比对中使用的缺口频率为0％。除了启动子以外，其它外显子的单PCR产物使用上面描述的方法进行了测序和分析，每个PCR产物都与已知的相应的外显子序列表现出95％的甚至更高的同源性。
实施例7多重PCR反应液的稳定性测试实施例3中使用的多重PCR反应液被大量制备，但不包含基因组DNA，以测试稳定性。一个PCR反应需要49μl反应液，被均分入大量的0.2ml的PCR反应管中。含反应液的一些反应管保存在-20℃，另一些保存在-70℃，保存3个月。在反应管保存了1天，3天，4天，1周，2周，3周和12周后，分别进行多重PCR反应。图5表示多重PCR产物的电泳结果。在图5中，左边第一泳道为分子标记，泳道2是使用在-20℃保存的反应液进行多重PCR的产物结果，泳道3是使用在-70℃保存的反应液进行多重PCR的产物结果。如图5所示，用于本发明的多重PCR反应液在-20℃和-70℃下稳定，在保存3个月后仍不影响PCR产物结果。
实施例8使用不同PCR装置进行的基因扩增使用不同PCR装置，根据实施例3的方法进行多重PCR。多重PCR产物在1.8％的琼脂糖凝胶上电泳，以检验PCR产物对PCR装置的依赖性(图6A到C)。
图6A表现了使用PTC-100(MJ Research Co.)扩增的多重PCR产物。图6B表现了使用GeneAmp 9700(Applied Biosystems Co.)进行扩增的多重PCR产物。图6C表现了使用Multi-Block系统(ThermoHybaid Co.)扩增多重PCR产物。
在图6A到6C，泳道1是50bp DNA梯的分子标记，泳道2是使用表1所示的引物组进行扩增的多重PCR结果。箭头所指的分别是350和50bp。
如图6所示，不同PCR装置获得相似的PCR产物模式，这表明，通过使用本发明引物组获得PCR的产物是稳定的，经济的。
用于扩增本发明的人HNF-1α基因的引物库对于通过多重PCR来扩增相应的基因是有效地。特别是，通过多重PCR扩增基因的引物库在使用DNA芯片分析疾病相关基因时是有用的，因为多重PCR可以相对的减少样品数量的使用。
本发明的用于人HNF-1α基因扩增的引物库可以用于试剂盒来扩增或测序人HNF-1α基因。
在说明书中，公开了本发明的典型的优选的实施方案，尽管说明书使用了特定的术语，其可以被用于一般描述但并不限制本发明权利要求描述的保护范围。
序列表<110>李娟受(LEE，Yeon Su)金美卿(KIM，Mi Kyung)李贞男(LEE，Jung Nam)<120>用于人HNF-1α基因扩增的多重PCR引物组<160>31<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>20<212>DNA<213>噬菌体T7<400>1taatacgact cactataggg 20<210>2<211>19<212>DNA<213>噬菌体T3<400>2gtaaccctca ctaaaggga19<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于扩增MODY3基因启动子的正向引物<400>3tggccgtgag catcctctgc c 21<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于扩增MODY3基因启动子的反向引物<400>4gcgtgggttg cgtttgcctg c 21<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于扩增MODY3基因外显子1的正向引物<400>5cgtggccctg tggcagccga 20<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于扩增MODY3基因外显子1的反向引物<400>6gggctcgtta ggagctgagg g 21<210>7<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于扩增MODY3基因外显子2的正向引物<400>7cccttgctga gcagatcccg tc22<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于扩增MODY3基因外显子2的反向引物<400>8gggatggtga agcttccagc c 21<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于扩增MODY3基因外显子3的正向引物<400>9gcaaggtcag gggaatggac 20<210>10<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于扩增MODY3基因外显子3的反向引物<400>10cgccgttgta cctattgcac tcc 23<210>11<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于扩增MODY3基因外显子4的正向引物<400>11ggctcatggg tggctatttc tgc 23<210>12<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于扩增MODY3基因外显子4的反向引物<400>12cgtgtccctt gtccccacat acc 23<210>13<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于扩增MODY3基因外显子5的正向引物<400>13tgctgaggca ggacactgct tc 22<210>14<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于扩增MODY3基因外显子5的反向引物<400>14tacaagcaag gacactcacc agc 23<210>15<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于扩增MODY3基因外显子6的正向引物<400>15cccggacaca gcttggcttc c 21<210>16<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于扩增MODY3基因外显子6的反向引物<400>16atccccacca gcttaccgat gac 23<210>17<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于扩增MODY3基因外显子7的正向引物<400>17caggcctggc ctccacgcag 20<210>18<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于扩增MODY3基因外显子7的反向引物<400>18ggggctctgc agctgagcca t 21<210>19<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于扩增MODY3基因外显子8和9的正向引物<400>19ggcccagtac acccacacgg g 21<210>20<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于扩增MODY3基因外显子8和9的反向引物<400>20gggcagggac agtaagggag g 21<210>21<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于扩增MODY3基因外显子10的正向引物<400>21gccttgtttg cctctgcagt g 21<210>22<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于扩增MODY3基因外显子10的正向引物<400>22ggccatctgg gtggagatga ag 22<210>23<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于扩增MODY3基因启动子的修饰的正向引物<400>23ccgtgagcat cctctgccct t 21<210>24<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于扩增MODY3基因启动子的修饰的反向引物<400>24accgcgtggg ttgcgtttgc c 21<210>25<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于扩增MODY3基因外显子1的修饰的正向引物<400>25ccgcgtggcc ctgtggcagc 20<210>26<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于扩增MODY3基因外显子1的修饰的反向引物<400>26ctcgttagga gctgaggggg g 21<210>27<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于扩增MODY3基因外显子2的修饰的正向引物<400>27ttgctgagca gatcccgtcc tt 22<210>28<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于扩增MODY3基因外显子2的修饰的反向引物<400>28atggggatgg tgaagcttcc a 21<210>29<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于扩增MODY3基因外显子8的修饰的正向引物<400>29ggtggcccag tacacccaca c 21<210>30<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于扩增MODY3基因外显子8的修饰的反向引物<400>30cagggacagt aagggagggg g 21<210>31<211>434<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>31ctcctgtctc agcatgatgc ccctacaagg ttctttcggg ggtgggaccc aacgctgctc 60tcctgatggc ctccctggct cccagcacct tccatcccag ctgctcaggg cccctcacct120gcgcctcccc caccctcccc tctgcccact cccatcgcag gccatagctc cctgtccctc180tccgctgcca tgaggcctgc actttgcagg gctgaagtcc aaagttcagt cccttcgcta240agcacacgga taaatatgaa ccttggagaa tttccccagc tccaatgtaa acagaacagg300caggggccct gattcacggg ccgctggggc cagggttggg ggttgggggt gcccacaggg360cttggctagt ggggttttgg gggggcagtg ggtgcaagga gtttggtttg tgtctgccgg420ccggcaggca aacg 43权利要求
1.引物库，其包含了至少一组引物，所述引物用于扩增人HNF-1α基因的至少一个靶序列，所述的至少一组引物选自a)一组包含具有SEQ ID NO.3所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸以及具有SEQ ID NO.4所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸的引物；b)一组包含具有SEQ ID NO.5所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸以及具有SEQ ID NO.6所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸的引物；c)一组包含具有SEQ ID NO.7所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸以及具有SEQ ID NO.8所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸的引物；d)一组包含具有SEQ ID NO.9所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸以及具有SEQ ID NO.10所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸的引物；e)一组包含具有SEQ ID NO.11所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸以及具有SEQ ID NO.12所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸的引物；f)一组包含具有SEQ ID NO.13所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸以及具有SEQ ID NO 14所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸的引物；g)一组包含具有SEQ ID NO.15所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸以及具有SEQ ID NO.16所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸的引物；h)一组包含具有SEQ ID NO.17所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸以及具有SEQ ID NO.18所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸的引物；i)一组包含具有SEQ ID NO.19所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸以及具有SEQ ID NO.20所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸的引物；和j)一组包含具有SEQ ID NO.21所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸以及具有SEQ ID NO.22所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸的引物，其中所述的变体寡核苷酸是指在相应寡核苷酸上从3′末端，从5′末端或者从3′和5′末端有1到3个附加核苷酸加入或缺失的寡核苷酸。
2.权利要求1所述的引物库，其中至少一引物的5′末端包含了T7启动子序列或者T3启动子序列。
3.权利要求1所述的引物库，其中至少一由SEQ ID NOS.3，5，7，9，11，13，15，17，19和21鉴定的引物，在其5′末端包含了T7启动子序列，和至少一由SEQ ID NOS.4，6，8，10，12，14，16，18，20和22鉴定的引物，在其5′末端包含了T3启动子序列。
4.一种用来扩增人HNF-1α基因中至少一个靶序列的方法，包含了使用至少一组引物对人HNF-1α基因至少一个靶序列进行PCR，使用的引物选自a)一组包含具有SEQ ID NO 3所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 4所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸的引物；b)一组包含具有SEQ ID NO 5所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 6所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸的引物；c)一组包含具有SEQ ID NO 7所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 8所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸的引物；d)一组包含具有SEQ ID NO 9所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 10所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸的引物；e)一组包含具有SEQ ID NO 11所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 12所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸的引物；f)一组包含具有SEQ ID NO 13所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 14所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸的引物；g)一组包含具有SEQ ID NO 15所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 16所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸的引物；h)一组包含具有SEQ ID NO 17所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 18所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸的引物；i)一组包含具有SEQ ID NO 19所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 20所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸的引物；以及j)一组包含具有SEQ ID NO 21所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 22所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸的引物，其中所述的变体寡核苷酸是指在相应的寡核苷酸上从3′末端，从5′末端或者从3′和5′末端有1到3个附加核苷酸加入或缺失的寡核苷酸。
5.权利要求4所述的方法，其中至少一个引物的5′末端包含了T7启动子序列或者T3启动子序列。
6.权利要求4所述的方法，其中至少一个由SEQ ID NOS.3，5，7，9，11，13，15，17，19和21鉴定的引物，在其5′末端包含了T7启动子序列，和至少一个由SEQ ID NOS.4，6，8，10，12，14，16，18，20和22鉴定的引物，在其5′末端包含了T3启动子序列。
7.权利要求4所述的方法，进一步包括将0.1μM-1μM每一所选引物与100ng-1μg的模板DNA混合。
8.权利要求4所述的方法，PCR是在以下条件进行的90℃-98℃预变性1-5分钟，90℃-98℃变性10秒到1分钟，60℃到65℃退火5秒到3分钟，70℃到75℃聚合5秒到5分钟，最后70℃到75℃延伸1分钟到10分钟。
9.一种使用至少一组引物对人HNF-1α基因至少一个靶核苷酸序列进行测序的方法，使用的引物选自a)一组包含具有SEQ ID NO 3所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 4所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸的引物；b)一组包含具有SEQ ID NO 5所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 6所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸的引物；c)一组包含具有SEQ ID NO 7所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 8所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸的引物；d)一组包含具有SEQ ID NO 9所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 10所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸的引物；e)一组包含具有SEQ ID NO 11所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 12所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸的引物；f)一组包含具有SEQ ID NO 13所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 14所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸的引物；g)一组包含具有SEQ ID NO 15所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 16所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸的引物；h)一组包含具有SEQ ID NO 17所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 18所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸的引物；i)一组包含具有SEQ ID NO 19所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 20所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸的引物；以及j)一组包含具有SEQ ID NO 21所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 22所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸的引物，其中所述的变体寡核苷酸是指在相应的寡核苷酸上从3′末端，从5′末端或者从3′和5′末端有1到3个附加核苷酸加入或缺失的寡核苷酸。
10.权利要求9所述的方法，其中至少一个引物的5′末端包含了T7启动子序列或者T3启动子序列。
11.权利要求9所述的方法，其中至少一个由SEQ ID NOS.3，5，7，9，11，13，15，17，19和21鉴定的引物，在其5′末端包含了T7启动子序列，和至少一个由SEQ ID NOS.4，6，8，10，12，14，16，18，20和22鉴定的引物，在其5′末端包含了T3启动子序列。
12.一种包含了权利要求1所述引物库的用于扩增人HNF-1α基因靶序列的试剂盒。
13.权利要求12所述的试剂盒，其中至少一个引物的5′末端包含了T7启动子序列或者T3启动子序列。
14.权利要求12所述的试剂盒，其中至少一个由SEQ ID NOS.3，5，7，9，11，13，15，17，19和21鉴定的引物，在其5′末端包含了T7启动子序列，并且至少一由SEQ ID NOS.4，6，8，10，12，14，16，18，20和22鉴定的引物，在其5′末端包含了T3启动子序列。
15.一种测定样品来检测糖尿病的方法，包括对人HNF-1α基因至少一个靶序列进行扩增，其中至少一组引物选自a)一组包含具有SEQ ID NO 3所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 4所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸的引物；b)一组包含具有SEQ ID NO 5所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 6所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸的引物；c)一组包含具有SEQ ID NO 7所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 8所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸的引物；d)一组包含具有SEQ ID NO 9所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 10所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸的引物；e)一组包含具有SEQ ID NO 11所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 12所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸的引物；f)一组包含具有SEQ ID NO 13所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 14所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸的引物；g)一组包含具有SEQ ID NO 15所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 16所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸的引物；h)一组包含具有SEQ ID NO 17所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 18所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸的引物；i)一组包含具有SEQ ID NO 19所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 20所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸的引物；以及j)一组包含具有SEQ ID NO 21所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸以及包含具有SEQ ID NO 22所示序列的寡核苷酸或其变体寡核苷酸的引物，其中所述的变体寡核苷酸是指在相应的寡核苷酸上从3′末端或者从5′末端或者从3′和5′末端有1到3个附加核苷酸加入或缺失的寡核苷酸。
16.权利要求15所述的方法，包括在微芯片上与寡核苷酸杂交前向所述样品的核酸序列中进一步添加标记。
17.权利要求15所述的方法，其中所述的糖尿病是MODY 3。
18.权利要求15所述的方法，其中所述试验样品测定包括测定缺失、突变和多态性。
19.权利要求15所述的方法，其中至少一个引物的5′末端包含了T7启动子序列或者T3启动子序列。
20.权利要求15所述的方法，其中至少一个由SEQ ID NOS.3，5，7，9，11，13，15，17，19和21鉴定的引物，在其5′末端包含了T7启动子序列，和至少一个由SEQ ID NOS.4，6，8，10，12，14，16，18，20和22鉴定的引物，在其5′末端包含了T3启动子序列。
全文摘要
本发明提供了用于扩增人HNF－1α基因的靶序列的包含了至少一组引物或者其变体引物的引物库，每一组引物都通过两个连续的SEQ ID NOS进行鉴定，SEQ ID NOS开始于本发明的SEQ ID NO.3，结束于SEQ ID NO.22。靶序列如人HNF－1α基因，可以通过多重PCR从而高特异性、高速度、高灵敏度，低成本的扩增来检测青春晚期糖尿病(MODY)3相关基因。
文档编号C12Q1/68GK1473943SQ0216112
公开日2004年2月11日 申请日期2002年12月18日 优先权日2001年12月18日
发明者李娟受, 金美卿, 李贞男 申请人:三星电子株式会社