一种流动生物芯片的制作方法

专利名称：一种流动生物芯片的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种生物芯片，特别是一种开放式流动生物芯片。
生物芯片的核心是其上的反应器。在本发明中，生物芯片的反应器的定义为生物芯片中固定有探针阵列，在检测时与目标物发生特异性反应的场所及与其连通的其它相关结构。
生物芯片可以有不同性质的反应器，按其所具有的特征反应器的性质分类，又可以将其定义为不同类型的生物芯片。在本发明中，按照检测过程中所加入的液相介质能否在反应器中定向流动，反应器被定义为流动和非流动反应器，以这两种反应器为特征的生物芯片被定义为流动生物芯片和非流动生物芯片；按照反应结果可否通过探针阵列上方的无覆盖开放结构被外部仪器或肉眼直接读取，反应器被分别定义为开放式和非开放式反应器，分别以这两种反应器为特征的生物芯片，被分别定义为开放式和非开放式生物芯片；按照探针阵列上方是否仅仅在读取阶断才具有无覆盖开放结构，反应器被定义为广义和非广义开放式反应器，分别以这两种反应器为特征的生物芯片被定义为广义和非广义开放式芯片。根据固定探针的固相载体的结构的不同，生物芯片还被分别定义为一维芯片、二维芯片和三维芯片。在本发明中，按照生物芯片上反应器的数目n，生物芯片被定义为单反应器生物芯片(n＝1)和多反应器生物芯片(n等于或大于2)。当要表明反应器性质时，又将反应器性质引入，例如，多开放式流动反应器芯片，其定义为一个包含有二个或二个以上的开放式流动反应器的生物芯片。
按照本实用新型的定义，生物芯片的现状如下1、非流动式生物芯片非流动式生物芯片包括非开放式非流动生物芯片和开放式非流动芯片，目前最广泛使用的是开放式非流动芯片。
目前使用最广的开放式非流动芯片是单反应器开放式非流动芯片，一个例子是以显微镜载玻片为基片制成、无结构改造的芯片。其优点是结构简单，点样和扫描操作均简便易行，部分操作还可在外力推动下的介质流动状态下进行(例如喷液清洗)。缺点是反应是在非流动状态下进行的。此外，当探针种类较少、探针阵列较小时，例如肽芯片或蛋白质芯片的情况，由于一个反应器只需固定数量不多的探针(例如几个至几百个)，单反应器芯片就显得效率太低，加大了生产和检测成本，这种情况下生物芯片的实际应用受到了很大限制。
为了提高效益，生产商和科技工作者对这类芯片进行了很多改进，例如把单开放式非流动反应器芯片发展为多开放式非流动反应器芯片。目前市场上的多开放式非流动反应器芯片的基本结构为在一块基片上以高度小于1.0mm的隔离区形成几到几十个圆形或方型的开放式反应器。此一开放式反应器有加液区和反应区，但无出液区。检测时，芯片平面基本上平行于水平面。由于无出液区，反应介质不可以被置于流动状态，因而不能进行连续操作，芯片效率仍待进一步提高。此外，也是由于无出液区，开放式反应器隔离区如太低会出现相邻反应器之间的交叉污染，如其太高又不能利用目前使用比较普遍的芯片扫描仪进行阅读。针对这一问题，我们发明了《一种可装拆使用的生物芯片》(专利申请号02113540.1)，在检测时，装上一足够高的反应器隔离装置以防交叉污染，扫描时拆掉隔离装置以适应扫描仪要求。
多开放式非流动反应器生物芯片的另一个例子是《多样品微阵列生物芯片》(专利申请号01112783.X)。其探针阵列固定在一个不反应时为开放式、反应时为没有进出口的密闭反应器中。这种芯片在加样后使用聚酯薄膜单面胶材密闭原来开放的反应器，出样、洗涤前需撕除密闭材料，然后加样、再密闭、反应、再去除密闭，如此反复至检测反应完成。
2、流动生物芯片流动生物芯片包括非开放式流动生物芯片和开放式流动生物芯片。
1)非开放式流动生物芯片①一维非开放式流动芯片一维芯片是将探针固定在线型固相载体上形成的芯片。其例子包括毛细管生物芯片装置(公告号为CN 2483395Y)和微通道(microchannel)生物芯片。微通道芯片是在芯片片基上制成通常尺寸为宽度小于0.05mm，深度小于0.025mm的微通道，再将探针固定于微通道中，然后加入样品并使其流过微通道的探针区，最后采用相应的信号检测系统读取反应结果。微通道生物芯片的一个例子是Caliper Technologies Inc.公司的检测用生物芯片(www.caliper.com)，该芯片用玻片作基片，采用光刻和蚀刻技术在基片上刻蚀出微通道，将探针固定于微通道中。芯片上有多个开放的储液池，储液池由微通道进行连接。微通道芯片的优点是灵敏度高、速度快。其缺点是1)，生产过程中需先刻蚀出微通道，点上探针，然后再进行微通道密封制作，其构造复杂，工业化生产难度非常大；2)，检测时液体流速需用专门精密设备控制，例如电渗透装置等；3)，反应完成后，由于固定的探针分子在其内表面，对于某些检测例如荧光标记物检测，不能直接使用普通芯片扫描仪读取结果。
②二维非开放式流动芯片二维芯片，即探针阵列分布在平面固相载体上形成的芯片。二维非开放式流动芯片，可以举我们已申请的一项发明《一种包含有封闭式反应器的探针板及其应用》(专利申请号0211364.8)为例。这种二维封闭式流过芯片的基本特征是探针阵列被固定在一个有进、出口的封闭式反应器的平面上，反应等操作可以在介质流动的状态下连续地进行，直至反应全部完成。
2)，开放式流动生物芯片经过查新，液体介质能连续流动进行反应、清洗，反应结果能通过探针阵列上方无覆盖开放结构被外部设备直接读取的开放式流动生物芯片还未见到。有一些相似的有《病毒性肝炎鉴别诊断生物芯片》(专利公告号CN 2438121Y)，但该专利中的生物芯片的实质是多条带快速诊断试剂条，属于一种改进的诊断试剂条组合，其反应区均为吸水材料，例如醋酸纤维素膜或尼龙薄膜，与本发明中固定微探针阵列的典型生物芯片有所不同。
尽管上述各种生物芯片各有很多优点，但在生产和使用中仍然存在不同的问题。一个主要的共同问题仍然是，怎样在对芯片各功能区进行经济、技术优化的条件下，利用尽可能低成本的液体输运机理或装置，实现最为简单、可靠的片上操作(包括探针固定、加样、清洗、扫描等)。
本实用新型其基本特征为含有一种开放式流动反应器。在本发明的开放式流动反应器中，反应和操作液相介质可以定向流动，反应结果可以通过探针阵列上方的无覆盖开放结构被外部仪器或肉眼直接读取。
本实用新型的目的是通过实施下述技术方案实现的一种含有反应和操作液相介质可以定向流动、反应结果可以通过探针阵列上方的无覆盖开放结构被外部仪器或肉眼直接读取的开放式流动反应器的流动生物芯片，其特征在于所述生物芯片所含的开放式流动反应器的基本结构至少包括液相介质可以被连续加样的加液区(1)，液相介质可以在流动状态下与固定在不吸水但亲水的表面上的探针阵列作用的反应区(2)，液相介质可以流动通过而离开芯片的出液区(3)及限制液相介质自由流动的隔离区(4)，所述开放式流动反应器的加液区、反应区和出液区可以直接相连，也可以通过其它结构例如通道间接相连。本实用新型提供的开放式流动芯片，所含的开放式流动反应器的基本结构，至少包括加液区(1)、反应区(2)、出液区(3)和隔离区(4)(见


图1)。所述生物芯片中的开放式流动反应器的加液区的特征为可以将反应和操作介质以连续流动状态进行加样。所述生物芯片中的开放式流动反应器的反应区的特征为固定探针的表面不吸水但具有亲水性、反应和操作的液相介质可以在流动状态下与固定化探针阵列作用。所述生物芯片中的开放式流动反应器的出液区的特征为反应和操作介质可以流动通过而离开。所述生物芯片中的开放式流动反应器的隔离区的特征为限制流体自由流动。本发明的生物芯片中的开放式流动反应器的加液区、反应区和出液区可以直接相连，也可以通过其它结构例如通道间接相连。直接相连的例子如
图1所示。
本实用新型中的生物芯片，可以包含其探针阵列上方仅在读取反应结果阶段具有无覆盖开放结构的广义开放式流动反应器的生物芯片，还可以包含其探针阵列上方不仅在读取反应结果阶段具有无覆盖开放结构的非广义开放式流动反应器的生物芯片。广义开放式流动反应器的例子见例3。
本实用新型提供的开放式流动芯片，还可以具有如下特征开放式流动反应器可以是主要利用液相介质自重、材料表面的亲水性和/或出液区的毛细管现象使液相介质定向流动的自流反应器，还可以是主要利用其它外力产生液体定向流动的非自流反应器。可利用的外力的例子有机械压力，电渗装置提供的定向移动，微量泵提供的定向移动等等。
利用液相介质自重、材料表面的亲水性和/或出液区的毛细管现象等设计在芯片内的性质来作为推动液相介质在反应器内的定向流动是本发明中生物芯片独具的特点。在这种情况下，根据生物芯片检测项目的要求，可以预先优化液相介质加入量及自重、材料亲水性的选择和/或出液区毛细管现象的选择等设计参数，以达到有效控制流速的目的。例如，在适当的条件下(例如加液区和反应区材料是亲水的，出液区的亲水性不低于加液区和反应区)，选择适当的上述角度，液相介质可以主要依靠其自重，由高向低地从加液区流入反应区，反应后再通过出液区流出芯片。如此，便可使得反应和操作介质依次流动通过加液区、反应区和出液区。
本实用新型的开放式流动生物芯片中，反应和操作介质的定向流动，既可以是每个步骤连续地进行，也可以只是在个别步骤中进行。例如，当反应速度较低或/和加入的反应介质量很少时，相应的反应步骤(例如检测样品与探针的反应或/和含有标记物的试剂与目标物的反应等)可以通过非流动的方式进行孵育，而其它反应步骤(例如清洗)则以流动的方式进行。在此例子中，非流动方式可被视作流动方式的一个特例，即流速为零。例如，在流出区的亲水/吸水性不是太高的情况下，减小液体流动合力中有利于流动分力的作用或/和增大液体流动合力中不利于流动的分力的作用，例如使芯片平面与水平面的夹角趋于0度，即可实现。从而上述夹角又成为操作过程中赋予不同操作步骤以不同流速的一个重要参数。
本实用新型提供的开放式流动芯片，可以含有一个以上所述开放式流动反应器，也可以含有二个或二个以上所述开放式流动反应器，还可以含有一个或一个以上的所述开放式流动反应器与一个或一个以上的其它类型反应器。当芯片含有二个或二个以上的所述开放式流动反应器时，其结构可以是固定结构的多反应器芯片，也可以由楔头、榫头、扣件、挂件、插件等联接结构的一种或几种将多个单反应器连接在一起，形成组合式芯片。例如图5中所示。
所述的生物芯片，其固定探针的固相载体的亲水材料包括玻璃、硅等无机亲水材料，聚丙烯、聚氯乙烯、硝酸纤维素膜片等有机亲水材料；反应区中固定探针的固相材料不可以为吸水材料，吸水材料包括硝酸纤维膜、醋酸纤维膜类、天然纤维膜(纸)等。其它功能区的材料，根据功能-成本关系可以使用相同材料制成，也可以使用不同的材料制成以减小价格较贵的固相材料耗量，这些材料可以是金属、玻璃、硅片、高分子材料之一种或其组合。例如，当以预活化的玻片为固定探针的固相体时，其单位面积成本远远高于通用塑料，则在满足功能的前提下，可以尽可能减小反应区活化玻片面积，以减小单位反应器的材料成本。
本实用新型的开放式流动生物芯片中，有隔离区以限制流体自由运动流动、防止交叉污染，在上述情况下，还可以减少单位反应器成本。隔离区高度相对反应区平面在-10mm至10mm之间。隔离区高度为负值的含意是，反应器反应区的一部或全部高于隔离区，例如图5A所示。隔离区高度为正值的含意是，反应器反应区的一部或全部低于隔离区，例如图5B所示。隔离区高度的优选方案在-3.0mm至3.0mm之间。隔离区上可以有增强隔离效果的结构，例如，几何花纹、沟槽、孔洞、疏水带等等。例如，万一有液体到达隔离区顶部，隔离区顶部或底部隔离区上有顺加液区、反应区和出液区方向的导流的花纹、沟槽、孔洞、以及吸水材料等可以增强隔离效果，使液体可以很快排走，不会进入相邻的反应器。所以本发明的芯片有很好的保证定向流动和避免反应器之间交叉污染的功能结构。
当隔离区高度为负值时，在加液区和反应区与隔离区形成的交角处，加液区和反应区的亲水表面出现中断，液相介质的表面张力使液体在此边缘处形成具有一定高度和角度的弧形，有利于限制液相介质的自由流动。如此时芯片处于一个倾角或/和出液区有更大的亲水/吸水性，则可保持液相介质在反应器中沿加液区、反应区和出液区的定向流动。
本实用新型的生物芯片中的开放式流动反应器的加液区、反应区和出液区，可以分别由各种结构来形成，这些结构可以是矩形、圆形、椭圆形、菱形等几何体及其组合。本发明的生物芯片中的开放式流动反应器的加液区、反应区和出液区，可以与反应区在同一平面，也可以与反应区不在同一平面而与其相交成一角度，以满足各种检测中对控制流速、防交叉污染等要求。在图4E的例子中，出液区底面与反应区底面形成一大于90度、小于180度的夹角。这样当反应区平面保持水平时，液体可不流动进行孵育；当反应区平面在出口与水平面成一大于0度夹角和出液区平面在出口与水平面成一大于0度夹角时，液体流出，易于进行流动操作。
本实用新型的生物芯片中，所述开放式流动反应器中可以有控制液相介质自身重力、材料表面的亲水性和/或出液区的毛细管现象的结构，包括加液区、出液区的有利于液体定向流动的结构(导流层、导流条、导流棒、导流杆、导流针、导流的沟、槽、斜面、流出孔等结构等)和材料(例如吸水材料)，芯片上各通道中流速的控制通道的动力学尺寸，和反应器中各功能区表面亲水性的选择。例如，当加液区，反应区和出液区的表面，越来越有利液相介质表面张力的减小时，就有利于液相介质沿加液区、反应区和出液区的定向流动。本实用新型的生物芯片，其开放式流动反应器的动态形态可以是通过成型或其它不可逆联结工艺形成的永久性结构，也可以是通过物理和/或化学方法得到的非不可逆联结形成的可拆装结构。这些结构元件的材料可以是塑料、橡胶等各种有机材料和玻璃、硅片等无机材料或其它材料制成的板、片、膜、块的一种或其组合。可拆装结构中形成非不可逆联结的物理和/或化学方法包括机械锁紧装置、电磁锁紧装置、可逆粘结的粘合剂、弹性嵌合等等。
弹性嵌合的一个例子是将反应器嵌入由弹性材料或弹簧片或弹簧制成的芯片成型孔板中，靠弹力将二者紧密地压合在一起。可逆粘结的粘合剂的一个例子是将已成型的、含有加液区、出液区和隔离区结构的塑料板，通过不干胶与含有作反应区用的玻片粘合在一起，形成有多个独立反应器的开放式流动芯片。机械锁紧装置、电磁锁紧装置的例子见我们的专利《一种可装拆使用的生物芯片》(专利申请号02113540.1)。
本实用新型的优点在于1)同现在的非开放式流动生物芯片比较，本发明中的生物芯片构造简单，制造容易，使用方便，对扫描仪没有特殊要求。
2)同现在的非开放式非流动生物芯片比较，本发明中的生物芯片可根据反应需要控制样品注入量和可连续操作、因而具有检测灵敏度更高和速度更快的优点，3)同现在的单反应器开放式生物芯片比较，本发明中的生物芯片由于可以有多个反应器，及芯片上各功能区在选材及制作上可进行相对独立的成本控制并实现优化组合，因而在探针阵列不很大时，例如探针阵列分布面积小于8平方厘米时，生产成本和使用成本都更低。
图2为本实用新型另一种单开放式自流反应器俯视图图3为本实用新型另一种单开放式自流反应器俯视图图4为本实用新型
图1和图2的侧视图图5为本实用新型图3的侧视图图6为本实用新型一种单开放式自流反应器的加液区俯视图图7为本实用新型另一种单开放式自流反应器的加液区俯视图图8为本实用新型另一种单开放式自流反应器的加液区俯视图图9为本实用新型另一种单开放式自流反应器的加液区俯视图
图10为本实用新型一种单开放式自流反应器的加液区侧视图
图11为本实用新型另一种单开放式自流反应器的加液区侧视图
图12为本实用新型另一种单开放式自流反应器的加液区侧视图
图13为本实用新型另一种单开放式自流反应器的加液区侧视图
图14为本实用新型一种单开放式自流反应器的出液区俯视图
图15为本实用新型另一种单开放式自流反应器的出液区俯视图
图16为本实用新型一种单开放式自流反应器的出液区侧视图
图17为本实用新型另一种单开放式自流反应器的出液区侧视图
图18为本实用新型另一种单开放式自流反应器的出液区侧视图
图19为本实用新型另一种单开放式自流反应器的出液区侧视图图20为本实用新型另一种单开放式自流反应器的出液区侧视图图21为本实用新型高度为负数隔离区开放式反应器示意图图22为本实用新型高度为正数隔离区开放式反应器示意图图23为本实用新型一种嵌合式多反应器生物芯片示意图图24为本实用新型另一种嵌合式多反应器生物芯片的一个反应器的示意图图25为本实用新型图24的侧视图图26为本实用新型另一种多反应器生物芯片示意图图中标记1为加液区 2为反应区 3为出液区 4为出液孔5为加液孔 6为隔离区 7为高度为负数的隔离区 8为高度为正数的隔离区 9为定位槽 10为排液槽
权利要求1.一种含有反应和操作液相介质可以定向流动、反应结果可以通过探针阵列上方的无覆盖开放结构被外部仪器或肉眼直接读取的开放式流动反应器的流动生物芯片，其特征在于所述生物芯片所含的开放式流动反应器的基本结构至少包括液相介质可以被连续加样的加液区(1)，液相介质可以在流动状态下与固定在不吸水但亲水的表面上的探针阵列作用的反应区(2)，液相介质可以流动通过而离开芯片的出液区(3)及限制液相介质自由流动的隔离区(4)，所述开放式流动反应器的加液区、反应区和出液区可以直接相连，也可以通过其它结构例如通道间接相连。
2.根据权利要求1所述的流动生物芯片，其特征在于是含有其探针阵列上方仅在读取反应结果阶断具有无覆盖开放结构的广义开放式流动反应器的生物芯片，或者是含有其探针阵列上方不仅在读取反应结果阶断具有无覆盖开放结构的非广义开放式流动反应器的生物芯片。
3.根据权利要求1所述的流动生物芯片，其特征在于是含有主要利用液相介质自重、材料表面的亲水性和/或出液区的毛细管现象使液相介质定向流动的开放式自流反应器的生物芯片，或者是含有主要利用其它外力产生液体定向流动的开放式非自流反应器的生物芯片。
4.根据权利要求1所述的流动生物芯片，其特征在于是含有一个所述开放式流动反应器的单反应器生物芯片，或者是含有二个或二个以上所述开放式流动反应器的多开放式流动反应器生物芯片，或者是含有一个或一个以上的所述开放式流动反应器与一个或一个以上的其它类型反应器的多反应器生物芯片，上述多开放式流动反应器生物芯片为固定结构的多反应器芯片，或者是由楔头、榫头、扣件、挂件或插件逆联接形成的组合式芯片。
5.根据权利要求1、2、3或4任一所述的流动生物芯片，其特征在于所含的开放式反应器的反应区用以固定探针的不吸水但亲水固相载体包括玻璃、硅等无机亲水材料，聚丙烯、聚氯乙烯、硝酸纤维素膜片等有机亲水材料；其它功能区的材料使用相同材料制成，或者使用金属、玻璃、硅片、高分子材料之一种或其组合。
6.根据权利要求1、2、3或4任一所述的流动生物芯片，其特征在于所含的开放式流动反应器的隔离区，相对于反应区平面，高度为-10mm至10mm，隔离区上有增强隔离效果的几何花纹、沟、槽、孔、洞或疏水带结构。
7.根据权利要求6所述的流动生物芯片，其特征在于所含的开放式流动反应器的隔离区，相对于反应区平面，高度在-3.0mm至3.0mm。
8.根据权利要求1、2、3或4任一所述的流动生物芯片，其特征在于所含的开放式流动反应器的加液区、反应区和出液区，可以分别由各种结构来形成，这些结构可为矩形、圆形、椭圆形、菱形或其他几何体及其组合。
9.根据权利要求8所述的流动生物芯片，其特征在于所述利于液体定向流动的结构包括导流层、导流条、导流棒、导流杆、导流针、导流的沟、槽、斜面、流出孔，所述材料为吸水材料。
10.根据权利要求1、2、3或4任一所述的流动生物芯片，其特征在于其反应器的动态形态是通过成型或其它不可逆联结工艺形成的永久性结构；或者是通过物理和/或化学方法得到的非不可逆联结形成的可拆装结构；所述可拆装结构包括机械锁紧装置、或电磁锁紧装置、或可解粘结的粘合结构、或弹性嵌合结构。
专利摘要本实用新型公开了一种流动生物芯片。目前，所有以非开放式反应器为特征的流动生物芯片，生产过程都比较复杂，操作和扫描条件比较苛刻，使其应用受到很大限制。而目前所有以开放式反应器为特征的生物芯片，在检测过程中液体介质不能定向流动，使用效率不高。本实用新型中的生物芯片，其特征为含有一种反应和操作液相介质可以定向流动、反应结果可以通过探针阵列上方的无覆盖开放结构被外部仪器或肉眼直接读取的开放式流动反应器。本实用新型提供的这种生物芯片，具有结构简单、功能－材料组合优化、单位反应器成本低、操作快捷和容易扫描的优点。
文档编号C12Q1/68GK2596360SQ022761
公开日2003年12月31日 申请日期2002年8月19日 优先权日2002年8月19日
发明者邹方霖, 陈春生, 王建霞, 胡劲梅 申请人:成都夸常科技有限公司