专利名称：制备作为动物饲料添加剂的d-泛酸和/或其盐的方法
技术领域：
本发明涉及一种制备D-泛酸和/或其盐的改进方法以及所述物质作为动物饲料添加剂的用途。
作为生物合成辅酶A的原料，D-泛酸盐广泛分布于植物界和动物界中。与通过膳食消耗足量泛酸的人类不同，D-泛酸盐缺乏症状常常不仅见于植物，而且也见于动物。因此，D-泛酸盐的可利用性具有重大经济价值，特别是在动物饲料工业中。
传统上，D-泛酸盐通过化学合成由D-泛内酯和β-丙氨酸钙来制备(Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry(Ullmann工业化学大全)，第六版，1999，电子版，“维生素”一章)。D-泛内酯的制备需要经由非对映盐的复杂且经典的外消旋体拆分。由该化学合成得到的工业产物通常是D-泛酸的钙盐，即D-泛酸钙。
与化学合成相比，使用微生物的生物技术生产方法的优点在于选择性(对映体纯)生产可用于高级生物的D型泛酸。因此，如化学合成中所需的复杂的外消旋体拆分就不必要了。
已公开大量通过微生物来制备D-泛酸的发酵方法，包括EP-0 590 857、WO 96/33283、US 6,013,492、WO 97/10340、DE 198 46 499、EP 1 001 027、EP 1 006 189、EP 1 006 192和EP 1 006 193中所述的方法。
因此，EP 1 006 189和EP 1 001 027描述了制备泛酸盐的方法，其中在发酵溶液中达到的最大D-泛酸含量为1g/l。然而，对于经济地生产含有D-泛酸的动物饲料添加剂，发酵溶液中这样低的泛酸含量(即以固含量计不到10重量％)是不适用的。迄今所述方法的另一缺点在于产物从发酵培养基中的分离需要许多复杂的后处理步骤。尚未公开过在工业规模上经济的制备方法。
德国公开申请DE 100 16 321描述了一种制备含有D-泛酸的动物饲料添加剂的发酵方法。然而，与上述制备D-泛酸的发酵方法一样，该方法的一个重大缺点在于必须将该泛酸的前体-β-丙氨酸经由发酵培养基供入微生物中以得到所需产物的经济产率。
另外，US 6,013,492和WO 96/332839描述了通过从培养基中滤除不溶性成分(例如细胞物质)，将滤液吸附到活性炭上，随后用有机溶剂、优选甲醇洗脱D-泛酸，用氢氧化钙中和以及随后将D-泛酸钙结晶而从发酵溶液中对D-泛酸进行后处理。其重大缺点在于结晶过程中损失有价值的产物以及使用从产物中难以除去且需要复杂的溶剂回收步骤的有机溶剂。
EP 0 590 857描述了一种制备D-泛酸的发酵方法，其中培养微生物需要供入β-丙氨酸。将该发酵溶液过滤以分离除去生物质，然后使其通过阳离子交换剂并然后通过阴离子交换剂，之后用氢氧化钙中和，蒸发浓缩，加入活性炭，再次过滤以及加入甲醇和氯化钙以结晶。所得含有泛酸钙的产物除了含有钙盐形式的D-泛酸外，还含有摩尔比为1∶1的氯化钙。降低氯化钙含量需要电渗析和随后的喷雾干燥。该方法的缺点在于由于大量复杂的工艺步骤和有机溶剂的使用使得既不经济又不生态。
本发明的目的是提供一种含有D-泛酸和/或其盐的动物饲料添加剂以及通过没有上述缺点的制备D-泛酸和/或其盐的改进方法来制备它的方法。出于经济上的原因，在这种情况下理想的方法是，其中β-丙氨酸的供入大大降低或根本不需要。另外，制备其二价盐形式且尤其是碱土金属盐形式的D-泛酸是所需的，因为该泛酸的二价盐与其一价盐相比具有更低的吸湿性，因而对于进一步应用例如用作动物饲料添加剂具有不太显著的团聚趋势。
我们发现该目的通过本发明有利地实现。
本发明涉及一种制备D-泛酸和/或其盐的方法，其包括如下步骤a)使用至少一种产生D-泛酸的生物，在该生物中去调节泛酸(pan)和/或异亮氨酸/缬氨酸(ilv)的生物合成，并且该生物通过在培养基中发酵形成至少2g/l D-泛酸盐，其中该培养基中供入有0-20g/l游离β-丙氨酸和/或β-丙氨酸盐，b)将含有多价阳离子的盐供入所形成的D-泛酸盐中，其中形成D-泛酸的多价盐，c)将该含有D-泛酸的多价盐的溶液通过纳米过滤(nanofiltration)来后处理，其中该D-泛酸的多价盐富集，以及d)将含有D-泛酸的多价盐的纳米过滤保留物(retentate)进行干燥和/或配制。
在本发明方法的变体中，步骤c)的保留物为含有D-泛酸的多价盐的悬浮液。
另外，所述发酵可通过本身已知的程序以分批、补料分批或反复的补料分批方式或在连续工艺工序下进行。为了中和所得泛酸，在这种情况下使用常规缓冲体系如含有NaOH、KOH或氨的磷酸盐缓冲液。
在本发明方法的另一变体中，在步骤a)中，通过发酵在培养基中形成至少10g/l、优选至少20g/l、特别优选至少40g/l、非常特别优选至少60g/l、尤其至少70g/l D-泛酸盐。
对本发明而言，词语“产生”指所述生物可合成比其自身代谢需要所需量要大的D-泛酸和/或其盐。在本发明的有利变体中，所合成的D-泛酸和/或其盐的量不存在于细胞内部，但理想的是通过生物全部释放到培养基中。该释放通过本身公知的机理可以是主动的或被动的。
根据本发明，所用产生D-泛酸的生物是微生物。这些微生物根据本发明包括真菌、酵母和/或细菌。根据本发明，优选使用真菌如毛霉菌属(Mucor)或酵母如酵母属(Saccharomyces)或德巴利酵母属(Debaromyces)，在这当中优选酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。根据本发明，有利地使用棒状杆菌(coryneform bacteria)或芽孢杆菌科(Bacillaceae)。在本发明范围内优选的例如是棒状杆菌属(Corynebacterium)、埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、短杆菌属(Bevibacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、不动杆菌属(Acinetobacter)或根瘤菌属(Rhizobium)的细菌。此处特别优选的例如是谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、短杆菌(Brevibacterium breve)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、蜡状芽孢杆菌(B.cereus)、缓病芽孢杆菌(B.lentimorbus)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、坚强芽孢杆菌(B.firmus)、泛酸芽孢杆菌(B.pantothenticus)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)和一组以其16sRNA表征的其它芽孢杆菌种，或Actinum mycetalis。该列举目的在于解释，决不是对本发明的限制。
此外，本发明还包括使用基因修饰生物以用于本发明制备含有游离D-泛酸和/或其盐的动物饲料添加剂。这类基因修饰生物例如可通过化学诱变和随后使用合适的“筛选法”筛选来分离。根据本发明，称作“生产菌株”的也包括在内，它们适于制备本发明产物且在D-泛酸方向的代谢通量方面具有基因修饰，其中在D-泛酸和/或其盐经由细胞膜排出方面的修饰也包括在内。这例如可通过对所用生物的相关代谢生物合成途径中的关键位置的修饰来实现。
也可使用由必需的或可能需要的同源和/或异源核苷酸序列转移得到的转基因生物来合成所需产物。在这种情况下，单独和/或组合位于基因组中的和/或位于载体上的一个或多个基因可以超表达和/或去调节。
这类转基因生物可有利地含有额外的拷贝和/或基因修饰的基因，所述基因选自panB、panC、panD、panE和/或其组合和/或甚至是象panBCD操纵子那样的组织单元。另外，如EP 1 006 189、EP 1 006 192、EP 1 006 193或EP 1 001 027所述，可有利地在生物中操作其它代谢途径，例如异亮氨酸-缬氨酸生物合成途径。结果，泛酸生物合成的支化链前体物质越发可利用。合适的话，将用于该生物合成途径的基因，即ilvB、ilvN、ilvC和/或ilvD有利地超表达。
另外，本发明还包括在所用的产生D-泛酸的生物中对天冬氨酸α-脱羧酶(panD)例如通过超表达和/或去调节进行基因修饰。
对本发明而言，词语“去调节”指在生物合成代谢途径中改变或修饰至少一个编码一种酶的基因，使得改变或修饰该酶在该微生物中的活性。优选改变至少一个编码一种生物合成代谢途径的酶的基因，使得该基因产物以更大程度形成，或者具有增加的活性。术语“去调节的代谢途径”也包括其中改变或修饰一个以上编码一种以上酶的基因以改变或修饰该一种以上酶的活性的生物合成代谢途径。
改变或修饰可包括但不限于除去内源启动子或调节成分；同时引入强启动子、诱导型启动子或多个启动子；除去调节序列以改变该基因产物的表达；改变该基因的染色体位置；改变在该基因附近或该基因内的DNA序列，例如核糖体结合位点(RBS)；增加该基因组中该基因的拷贝数或引入数目不等的质粒拷贝；修饰蛋白(例如调节蛋白、抑制因子、增强子、转录激活因子等)，它们在基因转录和/或在翻译得到基因产物中起着作用。这也包括所有属于现有技术的其它去调节基因的表达的可能方式，例如使用反义寡核苷酸或阻断阻抑蛋白。去调节也可包括对例如导致除去基因产物中的反馈调节或导致基因产物的更大或更小比活性的基因的编码区的改变。
此外，对酶的基因修饰根据本发明是有利的，这些修饰影响泛酸前体的流出和/或泛酸流出产生辅酶A。编码这些酶的基因的实例是alsD、avtA、ilvE、ansB、coaA、coaX等。该列举目的在于解释，决不是对本发明的限制。
另外，基因修饰是有利的，这些修饰保证辅因子(例如亚甲四氢叶酸、氧化还原等同物等)以对于泛酸产生而言最优的量的细胞生产。
因此，β-丙氨酸有利地已经以与相应的非基因修饰生物相比增加的浓度存在于细胞中，因此不必将其作为前体加入培养基中，例如EP-A 0 590857中所要求的。其中去调节泛酸(pan)和/或异亮氨酸-缬氨酸(ilv)和/或天冬氨酸α-脱羧酶(panD)的生物合成的微生物是有利的。而且，微生物中酮泛解酸还原酶(panE)的额外超表达是有利的。
根据本发明，合适的话，若合成辅酶A所需的coaA基因的活性降低或者该基因被彻底切断(例如在芽孢杆菌属种中)，则将额外有利。这是因为芽孢杆菌属除含有coaA外还含有其它提供这种酶催功能的基因(＝coaX)。该coaX基因或相应酶的活性也可改变，优选降低，或者甚至消除，条件是coaA本身仍旧具有足够的酶活性，即使是降低的酶活性，也就是说coaA的酶活性没有彻底丧失。除各种基因的超表达之外，这些基因的启动区的基因操作也是有利的，条件是该操作导致该基因产物的超表达。
在本发明实施方案中，使用根据附件(PCT/US 0025993)描述的细菌菌株，例如枯草芽孢杆菌PA 824和/或其衍生物。在另一实施方案中，根据本发明在本发明方法中使用如附件(US 60/262,995)中所述的枯草芽孢杆菌PA 668微生物。这些枯草芽孢杆菌PA 824和PA 668菌株按如下方式生产从具有基因型trpC2(Trp-)的枯草芽孢杆菌168菌株(Marburg菌株ATCC 6051)开始，通过Trp+标记(来自枯草芽孢杆菌野生型W23)转导生产PY79菌株。经典的基因工程方法(例如Harwood，C.R.和Cutting，S.M.(编辑)在Molecular Biological Methods for Bacillus(芽孢杆菌属的分子生物学方法)(1990)(John Wiley & Sons，Ltd.，Chichester，英国)中所述)将ΔpanB和ΔpanE1突变引入PY79菌株中。
使用枯草芽孢杆菌菌株PA221(基因型P26panBCD，trpC2(Trp-))的基因组DNA和枯草芽孢杆菌菌株PA303(基因型P26panE1)的基因组DNA将所得菌株转化。所得菌株PA327具有基因型P26panBCD、P26panE1，且为色氨酸营养缺陷体(Trp-)。使用枯草芽孢杆菌菌株PA327，在10ml含有SVY培养基(将25g/l Difco Veal肉浸汁、5g/l Difco酵母提取物、5g/l谷氨酸钠、2.7g/l硫酸铵加入740ml水中，将该混合物高压灭菌，然后加入200ml1M磷酸钾(pH7.0)和60ml 50％无菌的葡萄糖溶液)的培养物中，得到不超过3.0g/l(24h)的泛酸滴定度，其中所述培养基补加有5g/lβ-丙氨酸和5g/lα-酮异戊酸。
枯草芽孢杆菌菌株PA221(基因型P26panBCD，trpC2(Trp-))的生产描述在下列部分借助E.Coli的panBCD操纵子的序列信息(见Merkel等人，FEMSMicrobiol.Lett.，143，1996247-252)，从枯草芽孢杆菌GP275质粒文库开始，使用经典的基因工程方法来克隆芽孢杆菌属的panBCD操纵子。为了进行克隆，使用E.coli菌株BM4062(birts)和该芽孢杆菌属操纵子靠近birA基因的信息。将该panBCD操纵子引入可在E.coli中复制的质粒中。为了改善该panBCD操纵子的表达，使用枯草芽孢杆菌噬菌体SP01(P26)的强组成型启动子，并将panB基因前面的核糖体结合位点(＝RBS)用人工RBS替换。在芽孢杆菌属中紧邻天然panB基因上游的DNA片段连接在质粒上的P26panBCD盒前面。将该质粒转化成枯草芽孢杆菌菌株RL-1(通过经典的诱变得到的枯草芽孢杆菌168的衍生物(Marburg菌株ATCC6051)，基因型trpC2(Trp-))，并且通过同源重组，用P26panBCD操纵子代替天然panBCD操纵子。所得菌株称作PA221，并且具有基因型P26panBCD，trpC2(Trp-)。
使用枯草芽孢杆菌菌株PA221，在10ml含有SVY培养基的培养物中，得到不超过0.92g/l(24h)的泛酸滴定度，其中所述培养基中补加有5g/lβ-丙氨酸和5g/lα-酮异戊酸。
枯草芽孢杆菌菌株PA303(基因型P26panE1)的生产描述在下列部分利用E.Coli panE基因序列，通过类似方法克隆芽孢杆菌属panE序列。发现在枯草芽孢杆菌中存在两种同源E.Coli panE基因，称作panE1和panE2。缺失分析发现panE1基因负责90％的泛酸产生，而缺失panE2基因对泛酸产生并无重大影响。此处与克隆panBCD操纵子相似，用强组成型启动子P26代替该启动子，并用人工结合位点代替panE1基因前面的核糖体结合位点。将P26panE1片段克隆到载体中，该载体的构建使得该P26panE1片段能整合至枯草芽孢杆菌基因组中的原始panE1基因座。转化和同源重组之后所得的菌株称作PA303，并且具有基因型P26panE1。
使用枯草芽孢杆菌菌株PA303，在10ml含有SVY培养基的培养物中，得到不超过1.66g/l(24h)的泛酸滴定度，其中所述培养基中补加有5g/lβ-丙氨酸和5g/lα-酮异戊酸。
通过用含有P26ilvBNC操纵子和壮观霉素的标记基因的质粒将PA327转化而进一步构建所述菌株。该P26ilvBNC操纵子整合入amyE基因座中，这通过PCR来显示。将一种转化体称作PA340(基因型P26panBCD、P26pan E1、P26ilvBNC、specR、trpC2(Trp-))。
使用枯草芽孢杆菌菌株PA340，在10ml含有仅补加有5g/lβ-丙氨酸的SVY培养基的培养物中，得到不超过3.6g/l(24h)的泛酸滴定度；在10ml含有补加有5g/lβ-丙氨酸和5g/lα-酮异戊酸的SVY培养基的培养物中，得到不超过4.1g/l(24h)的泛酸滴定度。
另外，将去调节的ilvD盒引入菌株PA340中。为此，将含有ilvD基因的质粒在控制含有人工RBS2的P26启动子的情况下转化入PA340。通过同源重组将P26ilvD基因整合入原始ilvD基因座中。所得菌株PA374具有基因型P26panBCD、P26panE1、P26ilvBNC、P26ilvD、specR和trpC2(Trp-)。
使用枯草芽孢杆菌菌株PA374，在10ml含有SVY培养基的培养物中，得到不超过2.99g/l(24h)的泛酸滴定度，其中所述培养基中仅补加有5g/lβ-丙氨酸。
为了在不供入β-丙氨酸的情况下使用菌株PA374来产生泛酸，将编码天冬氨酸α-脱羧酶的基因panD的附加拷贝引入菌株PA374中。为此，将菌株PA401的染色体DNA转化入PA374。通过在四环素上的选择得到菌株PA377。
所得菌株PA377具有基因型P26panBCD、P26panE1、P26ilvBNC、P26ilvD、specR、tetR和trpC2(Trp-)。
在不供入前体的情况下，使用枯草芽孢杆菌菌株PA377，在10ml含有SVY培养基的培养物中，得到不超过1.31g/l(24h)的泛酸滴定度。
枯草芽孢杆菌菌株PA401(基因型P26panD)的制备描述在下列部分由panBCD操纵子将枯草芽孢杆菌panD基因克隆入带有四环素标记基因的载体。将启动子P26和上述人工RBS克隆在panD基因前面。限制酶切消化产生含有四环素标记基因和panD基因的片段。将该片段重新连接，并转化入上述菌株PA221。将该片段整合入菌株PA211的基因组中。所得菌株PA401具有基因型P26panBCD、P26panD、tetR和trpC2(Trp-)。
使用枯草芽孢杆菌菌株PA401，在10ml含有已补加有5g/lα-酮异戊酸的SVY培养基的培养物中，得到不超过0.3g/l(24h)的泛酸滴定度。在10ml含有已补加有5g/lD-泛解酸和10g/l L-天冬氨酸的SVY培养基的培养物中，得到不超过2.2g/l(24h)的泛酸滴定度。
从菌株PA377开始，用菌株PY79的染色体DNA的转化来产生色氨酸-原养菌株。该菌株PA824具有基因型P26panBCD、P26panE1、P26ilvBNC、P26ilvD、specR、tetR和Trp+。
在不供入前体的情况下，使用枯草芽孢杆菌菌株PA824，在10ml含有SVY培养基的培养物中，得到不超过4.9g/l(48h)的泛酸滴定度(对照PA377不超过3.6g/l(48h))。所述菌株的确切构建参见PCT/US 0025993的附件。
PA668的制备描述在下列部分由野生型panBCD操纵子将芽孢杆菌属panB基因克隆并插入除含有氯霉素抗性基因外还含有vpr基因座的枯草芽孢杆菌序列的载体中。
在panD基因5’端之前引入强组成型启动子P26。通过限制酶切消化得到一个含有P26panB基因、氯霉素抗性的标记基因以及枯草芽孢杆菌vpr序列的片段。将分离出来的片段重新连接并用于转化菌株PA824。所得菌株称作PA668。PA668的基因型为P26panBCD、P26panE1、P26ilvBNC、P26ilvD、P26panB、specR、tetR、CmR和Trp+。
分离PA668的两种菌落并分别称作PA668-2A和PA668-24。
使用枯草芽孢杆菌菌株PA668-2A，在10ml含有没有供入前体的SVY培养基的培养物中，在48h内得到1.5g/l的泛酸滴定度。在10ml含有补加有10g/l天冬氨酸的SVY培养基的培养物中，得到不超过5g/l的滴定度。
使用枯草芽孢杆菌菌株PA668-24，在10ml含有没有供入前体的SVY培养基的培养物中，在48h内得到1.8g/l的泛酸滴定度。在10ml含有补加有10g/l L-天冬氨酸的SVY培养基的培养物中，得到不超过4.9g/l的滴定度。
所述菌株的确切构建参见PCT/US 0025993和US 60/262,995的附件。
使用上述菌株PA377，在SVY培养基(25g/l Difco Veal肉浸汁，5g/lDifco酵母提取物，5g/l色氨酸，5g/l谷氨酸钠，2g/l(NH4)2SO4，10g/lKH2PO4，20g/l K2HPO4，0.1g/l CaCl2，1g/l MgSO4，1g/l柠檬酸钠，0.01g/lFeSO4·7H2O和1ml/l组成如下的痕量盐溶液0.15g Na2MoO4·2H2O、2.5g H3BO3、0.7g CoCl2·6H2O、0.25g CuSO4·5H2O、1.6g MnCl2·4H2O、0.3g ZnSO4·7H2O与水共同构成1升)中以10升规模在连续供入葡萄糖溶液下的葡萄糖限制发酵中，在36h(48h)内在发酵液中得到的泛酸浓度为18-19(22-25g/l)。
在PA824(PA377的色氨酸-原养衍生物)的葡萄糖限制发酵的情况下，在酵母提取物培养基(10g/lDifco酵母提取物、5g/l谷氨酸钠、8g/l(NH4)2SO4、10g/l KH2PO4、20g/l K2HPO4、0.1g/l CaCl2、1g/l MgSO4、1g/l柠檬酸钠、0.01g/l FeSO4·7H2O和1ml/l上述痕量盐溶液)中以10升规模在连续供入葡萄糖溶液下，在36h、48h和72h内在发酵液中得到的泛酸浓度分别为20g/l、28g/l和36g/l。
通过培养基的进一步优化，使用菌株PA824，在由10g/lDifco酵母提取物、10g/lNZ胺A(Quest International GmbH，Erftstadt)、10g/l谷氨酸钠、4g/l(NH4)2SO4、10g/l KH2PO4、20g/l K2HPO4、0.1g/l CaCl2、1g/lMgSO4、1g/l柠檬酸钠、0.01g/l FeSO4·7H2O和1ml/l上述痕量盐溶液组成的培养基中以10升规模在连续供入葡萄糖溶液下的葡萄糖限制发酵中，在36h(48h)内在发酵液中得到的泛酸浓度为37g/l(48g/l)。
通过培养基的进一步优化、通过增加发酵时间、通过工艺和菌株改进以及通过各步骤的组合可以进一步提高发酵液中泛酸的浓度。因此，通过将为上述PA824的衍生物的菌株发酵也可得到上述泛酸浓度。衍生物可通过经典的菌株发育和通过其它基因工程操作来制备。通过培养基、菌株和发酵方法的发展，可将发酵液中泛酸滴定度增加到大于40、45、50、55、60、65、70、75、80、85和＞90g/l。
本发明方法的重要优点在于发酵在培养基中进行，该培养基除含有至少一种碳源和氮源之外就不再含有其它作为起始化合物的前体。也就是说，D-泛酸的生物合成与其它前体的供入没有关系。对本发明而言，这些前体是诸如β-丙氨酸和/或L-天冬氨酸和/或L-缬氨酸和/或α-酮异戊酸和/或其混合物的物质。
在本发明方法的优选变体中，产生D-泛酸的生物的发酵在培养基中进行，该培养基含有碳源和氮源，但在发酵过程中不向其中加入或供入游离β-丙氨酸和/或β-丙氨酸盐。也就是说，为了产生至少10g/l培养基、优选至少20g/l、特别优选至少40g/l、非常特别优选至少60g/l、尤其至少70g/l的D-泛酸，根据本发明不需要供入游离β-丙氨酸和/或β-丙氨酸盐。
与前体的供入无关这一点尤其是本发明方法与已知方法相比的重大经济优点，因为许多前体是非常昂贵的。
然而，本发明不排除加入β-丙氨酸和/或β-丙氨酸盐，因此使得通过加入β-丙氨酸和/或β-丙氨酸盐可进一步提高D-泛酸的产率。若例如假定泛酸所有的所需前体都以足量存在，则只有panD基因的活性限制泛酸产生的进一步增加，因此例如可通过加入游离β-丙氨酸和/或β-丙氨酸盐将泛酸的产率再提高50％。
在本发明的有利变体中，可向培养基中加入不超过20g/l游离β-丙氨酸和/或β-丙氨酸盐，以将泛酸的产率额外提高50％以上。优选向培养基中加入约15g/l游离β-丙氨酸和/或β-丙氨酸盐。
根据本发明，适合用于培养基中以将上述生物发酵的碳源的实例是糖类如淀粉水解产物(单-、二-、低聚糖)，优选葡萄糖或蔗糖，以及甜菜或甘蔗糖蜜，蛋白质，蛋白质水解产物，大豆粉，玉米浆，脂肪，游离脂肪酸，从前面的发酵再循环的细胞或其水解产物，以及酵母提取物。该列举不是对本发明的限制。
另外，本发明方法有利的特征在于到发酵结束时总的糖含量降至最低，因为否则的话这将由于粘连使随后发酵溶液的干燥和/或配制变得困难。根据本发明，这可通过在碳源被消耗后(在分批培养的情况下)或在碳进料(在以补料分批或反复的补料分批方式的工艺工序的情况下)被中断和/或被调节以使该碳源的浓度基本为零(在补料分批、反复的补料分批或连续工艺工序的情况下)之后继续发酵一段时间而实现。
根据本发明，这通过在中断加入碳源(例如糖溶液)之后，继续发酵直到在该发酵溶液中溶解氧浓度(pO2)为其饱和值的至少80％，优选90％，特别优选95％而达到。
根据本发明，合适的氮源的实例是氨、硫酸铵、尿素、蛋白质、蛋白质水解产物或酵母提取物。该列举不是对本发明的限制。
另外，发酵培养基含有无机盐和/或微量元素，例如氨基酸和维生素。合适的发酵培养基的确切组成大量公知，并且对本领域熟练技术人员而言是可得的。
在用适合的产生D-泛酸的生物对发酵培养基进行接种(以本领域熟练技术人员公知的细胞密度)之后，合适的话加入消泡剂，培育该生物。培养基pH的任何必要调节都可使用各种无机或有机碱或酸如NaOH、KOH、氨、磷酸、硫酸、盐酸、甲酸、琥珀酸、柠檬酸或类似物质来实现。
考虑到发酵过程中所用的缓冲体系(该缓冲体系如上所述例如可以是NaOH、KOH、氨、磷酸、硫酸、盐酸、甲酸、琥珀酸、柠檬酸或类似物质)，所形成的D-泛酸取决于所用的缓冲体系而以各自的盐的形式存在于发酵溶液中。由于在这种情况下，尤其是D-泛酸的一价阳离子形式的盐是不利的，因此根据本发明通过纳米过滤来后处理发酵溶液。
为此，首先根据本发明将含有多价阳离子的盐供入所形成的D-泛酸盐中，这样形成D-泛酸的多价盐。根据本发明，可将含有多价阳离子的盐以固体或水溶液形式在步骤a)的发酵过程中、优选发酵结束时或发酵之后加入。例如可将含有多价阳离子的水溶液连续供入。
另外，在纳米过滤的上游阶段，即在本发明方法步骤c)的纳米过滤之前，可将溶液中的细胞物质或沉淀的成分分离除去。在这种情况下，所述分离可通过倾析或膜式过滤，优选超滤来进行。在本发明方法的变体中，膜式过滤以渗滤(diafiltration)进行。此处，根据本发明，也可将含有多价阳离子的盐以固体或水溶液形式在含有D-泛酸盐的溶液的膜式过滤过程中或之后加入。例如，此处可将含有多价阳离子的水溶液连续供入。
在分离溶液中的细胞物质和/或沉淀出来的成分例如微溶或不溶性磷酸盐或硫酸盐、酶、激素、蛋白质、抗生素、致热原、病毒、多糖、胶体、表面活性剂、杀虫剂或其它无机物质的过程中，该分离基于重力、离心力、压力或真空的使用。示例性方法尤其是倾析、淘析、筛分、风力分级、分粒、过滤、透析、沉降、微滤、超滤、浮选、泡沫分级分离、沉浮分离、澄清、离心分离或分离。由进料侧和渗透物侧的压力差操作的膜式分离法如微滤或超滤归纳为膜式过滤。这些方法例如通过它们的分离极限来区分。因此，在超滤的情况下，截止极限不是以粒度为基础的(例如微滤的情况下)，而是以摩尔质量为基础，该摩尔质量范围为约103至2×106Da。在超滤中，除了滤液(渗透物)外，还得到公知为浓缩物(保留物)的部分。
为了分离除去固体物质，或者富集或者贫化，使用溶解的中等分子量和高分子量物质，有利的是使用具有不对称结构的多孔性膜。
在有利的变体中，本发明使用的膜可由分离层(其进行实际分离)和一层或多层支撑层(它携带分离层且具有比分离层要粗大的孔)构成。分离层和支撑层可由有机或无机聚合物、陶瓷、金属或碳组成，并且必须在反应介质中和工艺温度下是稳定的。其实例描述在表1中，但本发明不限于此。
膜可以以位于本身公知的扁平状、管状、多通道元件、毛细管或盘绕组件中的挠性管路或管、毛细管、中空纤维或平膜形式使用。
保留物和渗透物之间的最佳可透膜压取决于膜孔的直径或截止极限(以分子量单位表示)、膜的机械稳定性和膜的类型，基本为1-40巴。较高可透膜压一般导致较高的渗透物流量。在其中将进料(待处理溶液)以过压供入的情况下，可透膜压可通过增加渗透物压力来调节。
操作温度取决于产物稳定性和膜稳定性。它为约20-90℃，优选约40-70℃。较高的温度导致较高的渗透物流量。例如可使用根据表2的膜，但本发明不限于此。
根据本发明，细胞分离也可有利地通过特定类型的膜式过滤，即渗滤来进行。
渗滤可通过使含有D-泛酸的多价盐的溶液通过包括容器、泵和一个或多个膜组件的回路，并设定该膜组件中的压力以得到渗透物而分批进行。连续或以一定次数加入不含待除去产物或含有待除去产物但其浓度低于加入该分离回路的时间点时的浓度的水或水溶液。根据本发明，该水溶液可含有多价阳离子的盐，例如钙或镁的卤化物或其混合物，优选氯化钙和/或氯化镁。
根据本发明，利用渗滤的细胞除去也可优选用多个串联连接的膜组件或在每种情况下用一个或多个串联连接的含有膜组件的泵回路来连续进行。在膜组件或泵回路的上游、中间或下游，可加入不含待除去产物或含有待除去产物但其浓度低于进料点的浓度的水或水溶液，在这种情况下，如在分批变体中，该水溶液可含有多价金属的盐，例如钙或镁的卤化物或其混合物，优选氯化钙和/或氯化镁。
根据本发明，超滤或渗滤可使用发酵排出物直接进行或在发酵排出物例如通过离心分离、倾析或类似工序处理之后而进行。
若根据本发明除去溶液中的细胞物质或沉淀出来的成分，则根据本发明方法步骤b)的含有多价阳离子的盐可在超滤或渗滤的过程中或之后加入。在本发明方法的变体中，加入的多价阳离子例如是氯化钙和/或镁、硝酸钙和/或镁、氢氧化钙和/或镁、甲酸钙和/或镁、乙酸钙和/或镁、丙酸钙和/或镁、氨基乙酸钙和/或镁和/或乳酸钙和/或镁。在这种情况下，可将多价阳离子例如Ca2+以0.05-50mol Ca2+/mol D-泛酸盐，优选0.2-2mol Ca2+/molD-泛酸盐的浓度供入。
在本发明方法步骤c)中，然后将含有D-泛酸的多价盐的溶液通过纳米过滤来后处理，其中D-泛酸的多价盐富集，并且不需要的一价离子，优选一价阳离子例如铵离子、钠离子或钾离子同时贫化。在本发明方法中，一价阳离子，优选铵离子、钾离子和/或钠离子的含量降至≤5g/kg溶液的浓度。
本发明包括所有市购纳米过滤体系。分离有利地在具有不对称结构的多孔性膜上进行。在本发明方法的优选变体中，将由分离层(它进行真正的分离)和单层或多层支撑层(它携带分离层且具有比分离层要粗大的孔)构成的膜用于此。分离层和支撑层可由有机聚合物、陶瓷、金属或碳组成，并且必须在反应介质中和工艺温度下是稳定的。优选的分离层材料是聚酰胺、聚酰亚胺或聚哌嗪。分离层也可带有正或负表面电荷。阴离子官能化的纳米过滤膜的实例是DESAL 5 DK膜，但本发明不限于仅使用该膜。
膜可以以位于本身公知的扁平状、管状、多通道元件、毛细管或盘绕组件中的挠性管路或管、毛细管、中空纤维或平膜形式使用。
在本发明方法的有利变体中，在步骤c)的纳米过滤中，建立5-100巴，优选20-80巴，特别优选40-70巴的跨膜压力差。
本发明方法的温度有利地为20-80℃，优选30-60℃。另外，纳米过滤可以分一个或多个步骤以本领域熟练技术人员公知的方式连续或分批进行。
在优选的变体中，每种情况下在一个或多个纳米过滤步骤之前，将含有多价阳离子的盐以固体或水溶液形式加入。根据本发明，将多价阳离子以氯化钙和/或镁、硝酸钙和/或镁、氢氧化钙和/或镁、甲酸钙和/或镁、乙酸钙和/或镁、丙酸钙和/或镁、氨基乙酸钙和/或镁和/或乳酸钙和/或镁加入。在这种情况下，可将作为多价阳离子的Ca2+以0.05-50mol Ca2+/mol D-泛酸盐，优选0.2-2mol Ca2+/mol D-泛酸盐的浓度(基于混合后的状态)供入。
在本发明方法中，将含有多价阳离子的盐以固体或水溶液在步骤a)的发酵过程中、优选结束时或之后或在细胞分离过程中或之后加入。
而且根据本发明，在纳米过滤步骤中加入含有多价阳离子的盐是有利的。另外，可将含有多价阳离子的水溶液连续供入。
在本发明方法的另一变体中，可在一个或多个纳米过滤的上游工艺步骤中产生不同产物浓度的溶液。所述溶液可通过纳米过滤进一步加工，使得在顺序的纳米过滤步骤中所述溶液以渐升的产物浓度提供。
根据本发明，作为上述本发明方法的结果，主要是泛酸的多价盐富集在纳米过滤的保留物中。在渗透物溶液中，主要是一价离子富集，而当使用阴离子官能化的纳米过滤膜时，一价阳离子富集。保留物中一价阳离子，优选铵离子、钾离子和/或钠离子的含量在这种情况下可降至≤5g/kg溶液的浓度。
根据本发明，纳米过滤的保留物或其一部分可再循环到本发明方法步骤a)的发酵中。渗透物或其一部分的再循环可连续进行。上述进行的工艺步骤除纳米过滤外，用于预浓缩或进一步浓缩多价盐形式的D-泛酸盐。
本发明使用的纳米过滤的另一优点在于在减少一价阳离子(在保留物溶液中)的同时可降低保留物的体积。因此，该含有D-泛酸盐的发酵溶液通过纳米过滤的后处理可根据本发明用作制备D-泛酸盐的离子交换和浓缩法。
这有利地导致随后的工艺步骤的简化和同时增加的效率。例如，由于浓缩，干燥中的能量消耗显著减少。
在本发明的优选实施方案中，通过离心分离和/或倾析和/或超滤从发酵溶液中除去细胞物质。在添加0.05-50mol(Ca2+)离子/mol泛酸根离子，优选0.2-2mol Ca2+离子/mol泛酸根离子之后(它们优选以含有0.01-10molCa2+/l的稀溶液形式加入)，将所得溶液引入纳米过滤组件中。跨膜压力差为约5-100巴，优选约20-80巴，特别优选约40-70巴。在这种情况下在纳米过滤之前或之中，可将含有Ca2+离子的水溶液加入流过在进料侧上的膜的溶液中。保留物的体积为起始溶液的30-200％。另外，除去约5-99％、优选30-80％所存在的一价阳离子。
然后，将优选含有D-泛酸钙、D-泛酸镁或其混合物的保留物进行干燥和/或配制。该含有D-泛酸钙和/或D-泛酸镁的溶液的干燥和/或配制通过本身已知的方法例如喷雾干燥、喷雾粒化、流化床干燥、流化床粒化、转鼓式干燥或旋转急骤干燥(Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry，第六版，1999，电子版，“固体材料的干燥”一章)来进行。对流干燥中气体入口温度为100-280℃，优选120-210℃。气体出口温度为50-180℃，优选60-150℃。为了建立所需粒度分布和有关的产物性能，可分离出细颗粒并再循环。另外，可将粗材料在磨中研磨，并且然后同样再循环。
本发明方法的优点在于不需要的阳离子被有效且基本完全除去，而同时体积减小，使得随后的工艺步骤，尤其干燥和/或配制得以简化或更有效。另外，没有发生产物分解，或仅发生极低的产物分解，而同时具有高产物产率。通过在发酵过程中或发酵结束时或在超滤或渗滤过程中或结束时或在纳米过滤步骤过程中供入多价阳离子的盐溶液和/或通过将渗透物再循环到发酵溶液中，可进一步提高多价、优选二价离子如钙离子或镁离子形式的D-泛酸盐的产率。
另外根据本发明，在上述方法中，在产生具有良好生物价值的所需产物的同时，减少复杂的后处理步骤是有利的，尤其是省略使用有机溶剂。另外，根据本发明，所产生的废水量显著减少。因此这导致进一步节省复杂的后处理和处理车间。因此，本发明方法的优点在于与传统方法相比它更简单、不易出错、耗时更少、显著便宜并因而更经济。
然而，这并不排除本发明方法可以变化。本文开头提及的本发明方法可通过一个或多个本领域熟练技术人员熟悉的下列工艺步骤来补充。在这种情况下，本发明包括下列工艺步骤与至今已知的工艺步骤的所有可能组合。
因此，例如可通过加热(灭菌)或其它方法如巴氏消毒法或无菌过滤将来自本发明方法的溶液消毒。
在本发明方法的其它变体中，在干燥和/或配制保留物之前，可进行至少一个下列步骤和/或这些步骤的组合生物质的溶菌和/或灭菌和/或该生物质从发酵溶液中的分离和/或加入其它添加剂和/或优选通过除去水将该发酵溶液浓缩。
因此，本发明还涉及一种其中在发酵溶液中仍旧进行生物质的溶菌和/或灭菌或直到从该发酵溶液中分离除去该生物质之后才进行前述步骤的方法。这例如可通过优选80-200℃下的温度处理和/或优选用硫酸或盐酸的酸处理和/或优选用溶菌酶的酶催方法来进行。
也可直接通过纳米过滤将所存在的细胞物质除去，即同时进行一价阳离子的交换，而多价阳离子保留。
可将通过纳米过滤后处理所得的溶液在干燥和/或配制之前通过适合的蒸发器如降膜式蒸发器、薄膜式蒸发器或旋转式蒸发器浓缩。这些蒸发器例如由GIG(4800 Attnang Puchheim，奥地利)、GEA Canzler(52303Düren，德国)、Diessel(31103 Hildesheim，德国)和Pitton(35274 Kirchhain，德国)制造。
为了改善终产物的颜色性能，可进行其中将少量活性炭加入该工艺过程中所得的溶液中的额外过滤步骤，并然后将该悬浮液过滤。或者，可使发酵过程中所得的溶液通过小活性炭床。为此所需的活性炭用量为该溶液重量的百分之几，并且该量凭借本领域熟练技术人员的知识和判断是已知的。
这些过滤可通过在过滤之前向各溶液中加入工业上传统的助凝剂(例如Sedipur CF 902或Sedipur CL 930，产自BASF AG，Ludwigshafen)而得以简化。
在本发明的有利实施方案中，发酵排出物(发酵液)通过加热来灭菌，然后通过离心分离、过滤、超滤或倾析除去细胞物质。在基于发酵排出物加入50-1000mg/kg、优选100-200mg/kg工业上传统的助凝剂之后，将该悬浮液过滤通过活性炭与砂子的短床以得到具有高D-泛酸含量的不含生物质的溶液。然后将该处理后的溶液通过纳米过滤进行处理。
然后将该溶液例如通过喷雾干燥而干燥。这可以并流、逆流或混合流进行。为了雾化，可使用所有已知的雾化器，尤其是离心雾化器(雾化盘)、单流喷嘴或双流喷嘴。优选的干燥温度条件是150-250℃的塔入口温度和70-130℃的塔出口温度。然而，干燥也可在更高或更低的温度水平下进行。为了得到非常低的残留湿气，可以在流化床下游提供另一干燥步骤。
喷雾干燥也可在FSD或SBD干燥器中进行(FSD流化床喷雾干燥器；SBD喷雾床干燥器)，如由Niro(丹麦哥本哈根)和APV-Anhydro(丹麦哥本哈根)制造的，它们是喷雾干燥器与流化床的组合。
在喷雾干燥过程中，可添加助流剂。这可减少干燥器壁上的沉积并改善流动特性，特别是在细粒粉末的情况下。可使用的助流剂尤其是硅酸盐、硬脂酸盐、磷酸盐和玉米淀粉。
原则上，干燥也可在喷雾的流化床中进行，在这种情况下这不仅可连续进行，还可分批进行。可将溶液不仅从顶部(顶部喷雾)和从底部(底部喷雾)喷雾，而且还可从侧面(侧面喷雾)进行喷雾。
本发明还涉及一种用作动物饲料添加剂和/或动物饲料添加物的组合物，其中它可通过如下步骤制备a)使用至少一种产生D-泛酸的生物，在该生物中去调节泛酸(pan)和/或异亮氨酸/缬氨酸(ilv)的生物合成，并且该生物通过在培养基中发酵形成至少2g/l D-泛酸盐，其中该培养基中供入有0-20g/l、优选0g/l游离β-丙氨酸和/或β-丙氨酸盐，b)将含有多价阳离子的盐供入所形成的D-泛酸盐中，其中得到D-泛酸的多价盐，c)将该含有D-泛酸盐的发酵溶液通过纳米过滤后处理，其中该D-泛酸的多价盐富集，以及d)将含有D-泛酸的多价盐的纳米过滤保留物进行干燥和/或配制。
在本发明的变体中，包括一种组合物，该组合物通过在步骤c)的纳米过滤之前优选通过膜式过滤、特别优选通过超滤、非常特别优选通过渗滤将溶液中的细胞物质或沉淀出来的成分除去来制备。本发明还涉及一种组合物，该组合物可通过将含有多价阳离子的盐(以固体或水溶液形式)在除去溶液中的细胞物质或沉淀出来的成分的过程中或之后供入来制备。根据本发明，在另一变体中，也可将这些盐在纳米过滤过程中供入。
根据本发明，所述组合物的进一步特征在于它包含浓度为至少1-100重量％、优选至少20-100重量％、特别优选至少50重量％的D-泛酸盐。本发明涉及一种包含D-泛酸的二价阳离子形式的盐、优选D-泛酸钙和/或D-泛酸镁的组合物。根据本发明，优选D-泛酸的一价阳离子形式的盐的含量≤5g/lg的组合物。
根据本发明，通过上述方法，得到满足饲料添加剂要求的D-泛酸钙或D-泛酸镁。这些要求例如是较高含量的D-泛酸盐和与目标生物的高相容性以及高的表示本发明产物的“维生素活性”的生物价值。
本发明将通过下列实施例更详细地描述，然而这些实施例不是对本发明的限制。
实施例1在容量为14升的装有搅拌器和气体引入装置的实验室发酵罐中加入具有下列组成的含水发酵培养基
灭菌后，加入下列无菌培养基成分
所述痕量盐溶液具有下列组成0.15g Na2MoO4·2H2O、2.5g H3BO3、0.7g CoCl2·6H2O、0.25gCuSO4·5H2O、1.6g MnCl2·4H2O、0.3g ZnSO4·7H2O与水共同构成1升。该痕量盐溶液通过无菌过滤加入。初始液体体积为5升。上面所给含量以该值为基础。
向该溶液中，加入100ml枯草芽孢杆菌PA668的接种培养物(OD＝10)，并将该接种的培养物于43℃和剧烈搅拌下在12L/min的气体引入速率下发酵。该菌株按照US 262,995中的附件进行描述。
在47h内，加入2.1升无菌水溶液，其组成如下
在发酵过程中，通过加入25％浓度的氨溶液或20％浓度的磷酸将pH保持为7.2。氨同时还起发酵用氮源的作用。控制搅拌器元件的转速，以将溶解的氧气含量保持为其饱和值的30％。在停止加入碳源之后，继续发酵直到溶解的氧气含量(pO2)达到其饱和值的95％。D-泛酸盐的浓度在48h后停止时为22.8g/l。
按相似方法，也可生产未供入β-丙氨酸且泛酸滴定度大于20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85和＞90g/l的发酵液。
实施例2将7000ml根据实施例1制备的发酵排出物进行超离心，其中使用陶瓷单通道管式组件(来自Atech，Gladbeck，德国)。在这种情况下，首先使用孔宽度为20kD(10nm)的膜，然后使用孔宽度为50nm的膜。
实验温度为40℃，溢流速率为4m/s，除非另有说明，可透膜压(TMP＝[p(进料)+p(保留物)]/2-p(渗透物))为1巴。
在
图1中，将可透膜流量(渗透物流量)对浓集因素MK(MK(t)＝m进料/m保留物(t))作图。
显而易见的是，具有较低孔宽度(20kD)的膜比具有较大孔宽度(50nm)的膜具有显著更高的流量。
实施例3在与实施例2相似的条件下，将7000ml如实施例1制备的发酵排出物进行超滤，其中所用膜的孔宽度为20kD。
图2表明，使用已经离心分离的发酵排出物得到的浓度显著高于实施例2中的浓度。
实施例4将1000ml含有泛酸钙的水溶液(根据表3，保留物进料一栏)置于最大操作容量约1.5升的搅拌器压力池中。通过氮气过压在该池子中产生“进料”压力，并通过使用由电磁连轴节驱动的锚式搅拌器的搅拌来保证膜的溢流。
使用从在Moers的Osmonics Deutschland GmbH得到的纳米过滤膜DESAL 5DK。
在用上述溶液的实验之前、之中或之后，为了试验膜的完整性，用MgSO4溶液(2000ppm(重量))进行舍弃试验。
舍弃率Ri列于表3右边的两栏中。此处，舍弃率定义如下Ri＝1-Ci， 渗透物/Ci，保留物；其中Ri＝组分i的舍弃率，Ci，渗透物＝渗透物中组分i的浓度，Ci， 保留物＝保留物中组分i的浓度。
各浓度指在限定时间点下在非稳态实验中即刻建立的浓度，但不是试验结束后得到的级分中的浓度。在理想情况下，舍弃率Ri与浓度无关，它也用作由各级分中的浓度来计算报导值的基础。
由表3可见，Ca2+和泛酸根的舍弃率分别为84％和99％，也就是说它们存在保留物中。
实施例5在泛酸钠水溶液(0.2mol/l)的后处理过程中，在与实施例4相似的条件下通过纳米过滤进行浓缩。表4表明，泛酸根的舍弃率为80％。
实施例6在与实施例4相似的条件下的NaCl/CaCl2等摩尔溶液的浓缩总结在表5中。由该表可见，该膜对Ca2+的舍弃率为41％或42％，与钙和泛酸根组合的情形下的高舍弃率(实施例5)相比，该舍弃率较低。
附图和附表说明图1超滤过程中发酵排出物的可透膜流量(渗透物流量)作为使用孔宽度为50nm和20kD的膜的浓集因素MK的函数的图解表示。
图2超滤过程中经离心的发酵排出物的可透膜流量(渗透物流量)作为使用孔宽度为20kD的膜的浓集因素MK的函数的图解表示。
表1将溶液中的细胞物质或沉淀出来的成分分离除去的具有不对称结构的膜的概要。
表2将溶液中的细胞物质或沉淀出来的成分分离除去的膜及其性能的概要。
表3纳米过滤的分析值、尤其是有关含有0.1mol/kg泛酸钙和0.2mol/kg NaCl的水溶液中钙离子和泛酸根的舍弃率的概要。
表4纳米过滤的分析值、尤其是有关含有0.2mol/l泛酸钠和0.1mol/lCaCl2的水溶液中钙离子和泛酸根的舍弃率的概要。
表5纳米过滤的分析值、尤其是有关含有等摩尔量NaCl和CaCl2的水溶液中钙离子的舍弃率的概要。
权利要求
1.一种制备D-泛酸和/或其盐的方法，其包括如下步骤a)使用至少一种产生D-泛酸的生物，在该生物中去调节泛酸(pan)和/或异亮氨酸/缬氨酸(ilv)的生物合成，并且该生物通过在培养基中发酵形成至少2g/l D-泛酸盐，其中该培养基中供入有0-20g/l游离β-丙氨酸和/或β-丙氨酸盐，b)将含有多价阳离子的盐供入所形成的D-泛酸盐中，其中形成D-泛酸的多价盐，c)将该含有D-泛酸的多价盐的溶液通过纳米过滤来后处理，其中该D-泛酸的多价盐富集，以及d)将含有D-泛酸的多价盐的纳米过滤保留物进行干燥和/或配制。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述培养基中没有供入游离β-丙氨酸和/或β-丙氨酸盐。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所用的产生D-泛酸的生物是细菌、酵母或真菌。
4.如权利要求1-3任一项所述的方法，其中所用微生物是来自芽孢杆菌科的细菌。
5.如权利要求1-4任一项所述的方法，其中使用芽孢杆菌属的细菌，优选枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌种。
6.如权利要求1-5任一项所述的方法，其中在步骤a)中，形成D-泛酸和/或其盐，含量为至少10g/l培养基，优选至少20g/l，特别优选至少40g/l，非常高度优选至少60g/l培养基。
7.如权利要求1-6任一项所述的方法，其中在步骤c)中的纳米过滤之前将溶液中的细胞物质或沉淀出来的成分分离除去。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述分离通过倾析或膜式过滤、优选超滤来进行。
9.如权利要求7或8所述的方法，其中所述膜式过滤以渗滤进行。
10.如权利要求1-9任一项所述的方法，其中将所述含有多价阳离子的盐以固体或水溶液形式在步骤a)的发酵过程中、优选结束时或之后或含有D-泛酸盐的溶液的膜式过滤过程中或之后加入。
11.如权利要求1-10任一项所述的方法，其中将含有多价阳离子的盐以固体或水溶液形式在纳米过滤过程中加入。
12.如权利要求1-11任一项所述的方法，其中将含有多价阳离子的水溶液连续供入。
13.如权利要求1-12任一项所述的方法，其中所述多价阳离子以氯化钙和/或镁、硝酸钙和/或镁、氢氧化钙和/或镁、甲酸钙和/或镁、乙酸钙和/或镁、丙酸钙和/或镁、氨基乙酸钙和/或镁和/或乳酸钙和/或镁加入。
14.如权利要求1-13任一项所述的方法，其中所供入的多价阳离子是浓度为0.05-50mol Ca2+/mol D-泛酸盐、优选0.2-2mol Ca2+/mol D-泛酸盐的Ca2+。
15.如权利要求1-14任一项所述的方法，其中在步骤c)中的纳米过滤中，建立5-100巴，优选20-80巴，特别优选40-70巴的跨膜压力差。
16.如权利要求1-15任一项所述的方法，其中步骤c)中的纳米过滤使一价阳离子，优选铵离子、钾离子和/或钠离子的含量降至≤5g/kg溶液的浓度。
17.如权利要求1-16任一项所述的方法，其中将来自步骤c)的渗透物或其一部分再循环到步骤a)的发酵中。
18.如权利要求1-17任一项所述的方法，其中将所述渗透物或其一部分连续再循环。
19.如权利要求1-18任一项所述的方法，其中来自步骤c)的保留物是含有D-泛酸的多价盐的悬浮液。
20.一种用作动物饲料添加剂和/或动物饲料添加物的组合物，其可通过如下步骤制备a)使用至少一种产生D-泛酸的生物，在该生物中去调节泛酸(pan)和/或异亮氨酸/缬氨酸(ilv)的生物合成，并且该生物通过在培养基中发酵形成至少2g/l D-泛酸盐，其中该培养基中供入有0-20g/l、优选0g/l游离β-丙氨酸和/或β-丙氨酸盐，b)将含有多价阳离子的盐供入所形成的D-泛酸盐中，其中得到D-泛酸的多价盐，c)将该含有D-泛酸的多价盐的溶液通过纳米过滤来后处理，其中该D-泛酸的多价盐富集，以及d)将含有D-泛酸的多价盐的纳米过滤保留物进行干燥和/或配制。
21.如权利要求20所述的组合物，其可通过在步骤c)之前优选通过膜式过滤、特别优选通过超滤、非常特别优选通过渗滤将溶液中的细胞物质或沉淀出来的成分除去来制备。
22.如权利要求20或21所述的组合物，其中将含有多价阳离子的盐在分离溶液中的细胞物质或沉淀出来的成分的过程中或之后供入。
23.如权利要求20-22任一项所述的组合物，其中将含有多价阳离子的盐在纳米过滤之前或之中供入。
24.如权利要求20-23任一项所述的组合物，含有D-泛酸的二价阳离子形式的盐，优选D-泛酸钙和/或D-泛酸镁。
25.如权利要求20-24任一项所述的组合物，含有浓度为1-100重量％、优选20-100重量％、特别优选至少50重量％的D-泛酸盐。
26.如权利要求20-25任一项所述的组合物，其中D-泛酸的一价阳离子形式的盐的含量≤5g/kg。
全文摘要
本发明涉及一种制备D－泛酸和/或其盐的改进方法以及所述物质作为动物饲料添加剂的用途。
文档编号C12R1/125GK1492933SQ02805274
公开日2004年4月28日 申请日期2002年2月20日 优先权日2001年2月21日
发明者C·贝克, H-P·哈尔茨, D·克莱因, M·莱曼, M·洛沙德伊特, S·比特利希, H·福斯, C 贝克, 乩, 车乱撂, 骋 申请人:巴斯福股份公司