专利名称：通过发酵棒状细菌生产l-氨基酸的方法
技术领域：
本发明提供了通过发酵棒状细菌(Coryneform bacteria)生产L-氨基酸，尤其L-赖氨酸的方法，其中所用棒状细菌中编码苹果酸醌氧化还原酶(malate quinone oxidoreductase)的mqo基因已经弱化。
现有技术L-氨基酸特别是L-赖氨酸用于人用药物和制药工业，食品工业，特别是动物饲养。
已知氨基酸可通过棒状细菌菌株，尤其谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的发酵而生产。由于生产方法具有的极其重要性，已持续进行改良生产方法的尝试。生产方法的改良可涉及发酵措施(如搅拌和供氧)，或营养培养基的组成(如发酵期间的糖浓度)，或产物形式的加工方法(例如通过离子交换层析)，或微生物本身的固有生产性质。
为改良这些微生物的生产性质，可使用诱变、选择及突变体选择等方法，以此方法所获得的菌株对抗代谢物例如赖氨酸类似物S-(2-氨乙基)-半胱氨酸有抗性，或者对具有重要调节作用的代谢物产生营养缺陷，且所述的菌株产生L-氨基酸。
多年以来，重组DNA技术的方法也用于对产生L-氨基酸的谷氨酸棒杆菌菌株的改良，通过扩增各个氨基酸生物合成基因和研究对L-氨基酸生产的作用而进行。
发明目的在EP-A-1038969中，阐述了通过mqo基因的增强、特别是过表达而增加通过发酵方法的L-氨基酸的产量。
本发明人的目的在于为用于通过发酵棒状细菌生产L-氨基酸尤其是L-赖氨酸的改良方法而提供新的基础。
发明阐述当下文提及L-氨基酸时，应理解是指选自以下的一或多种氨基酸，包括其盐L-天冬酰胺，L-苏氨酸，L-丝氨酸，L-谷氨酸，L-甘氨酸，L-丙氨酸，L-半胱氨酸，L-缬氨酸，L-甲硫氨酸，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-酪氨酸，L-苯丙氨酸，L-组氨酸，L-赖氨酸，L-色氨酸，和L-精氨酸。特别优选L-赖氨酸。
当下文提及L-赖氨酸或赖氨酸时，应理解不仅是指碱还指盐，例如赖氨酸盐酸盐或赖氨酸硫酸盐。
本发明提供了一种通过发酵棒状细菌生产L-赖氨酸的方法，其中至少编码苹果酸醌氧化还原酶的核苷酸序列(mqo基因)是弱化的，尤其是排除的(excluded)或在低水平表达。
本发明还提供了一种通过发酵生产L-氨基酸的方法，其中进行以下步骤a)发酵生产L-氨基酸的棒状细菌，所述棒状细菌中至少编码苹果酸醌氧化还原酶的核苷酸序列是弱化的，尤其是排除的或低水平表达的；b)浓缩培养基中或细菌细胞中的L-氨基酸；及c)分离所需的L-氨基酸，其中任选地在终产物中保留部分或全部发酵液成分和/或生物量。
所用菌株优选甚至在mqo基因弱化之前就产生L-氨基酸、尤其是产生L-赖氨酸。
优选的实施方案见于权利要求书。
文中术语“弱化”是指微生物中由相应DNA编码的一或多种酶(蛋白质)的胞内活性的降低或排除，例如通过用弱启动子或编码低水平活性的相应酶的基因或等位基因，或失活相应基因或酶(蛋白质)，及任选地组合使用这些方法。
本发明的微生物可从葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉、纤维素或从甘油和乙醇中生产氨基酸。此微生物可以是棒状细菌的代表菌，尤其是棒杆菌属。在棒杆菌属中尤其应提及的是谷氨酸棒杆菌，本领域技术人员已知其生产L-氨基酸的能力。
适当的棒杆菌菌株，尤其谷氨酸棒杆菌菌种，是例如已知的野生型菌株谷氨酸棒杆菌ATCC 13032醋谷棒杆菌ATCC 15806嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC 13870Corynebacterium melassecola ATCC 17965嗜热产氨棒杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)FERMBP-1539黄色短杆菌ATCC 14067乳发酵短杆菌ATCC 13869和扩展短杆菌ATCC 14020和从中获得的产生L-氨基酸的突变体或菌株如生产L-赖氨酸的菌株谷氨酸棒杆菌FERM-P 1709黄色短杆菌FERM-P 1708乳发酵短杆菌FERM-P 1712
谷氨酸棒杆菌FERM-P 6463谷氨酸棒杆菌FERM-P 6464谷氨酸棒杆菌ATCC 21513谷氨酸棒杆菌ATCC 21544谷氨酸棒杆菌ATCC 21543谷氨酸棒杆菌DSM 4697和谷氨酸棒杆菌DSM 5715。
与现有技术(EP-A-1038969)相反，发现在mqo基因弱化后可使棒状细菌的L-氨基酸产生增加。
谷氨酸棒杆菌的mqo基因的核苷酸序列已经由Molenar等公布(欧洲生物化学杂志254，395-403(1998))，也可以取自基因文库，登记号AJ22 4946。该核苷酸序列也示于SEQ ID NO1，蛋白质的氨基酸序列示于SEQ ID NO2。
根据本发明可以使用在提及的参考文献中所述的编码苹果酸醌氧化还原酶的序列。还可以使用苹果酸醌氧化还原酶的等位基因，其通过遗传密码的简并或通过中性功能的有义突变形成。
为获得弱化，可降低或排除mqo基因的表达或基因产物的催化性质。两种措施可任选地组合。
可通过以适当方式培养或遗传修饰(突变)用于基因表达的信号结构而降低基因表达。用于基因表达的信号结构例如是阻抑物(repressor)基因、激活子基因、操纵子、启动子、弱化子、核糖体结合位点、起始密码子和终止子。本领域技术人员可在如下文献中发现此方面的信息，例如专利申请WO96/15246，Boyd和Murphy(细菌学杂志1705949(1988))，Voskuil和Chambliss(核酸研究263548(1998))，Jensen和Hammer(生物技术和生物工程58191(1998))，Patek等(微生物学1421297(1996))以及已知的遗传学和分子生物学教科书如Knippers的教科书(分子遗传学，第6版，Georg ThiemeVerlag，德国斯图加特，1995)，或Winnacker的教科书(基因和克隆，VCH Verlagsgesellschaft，Weinheim，德国，1990)。
导致酶蛋白催化活性的变化或降低的突变是现有技术中已知的，可提及的例子如Qiu和Goodman的论文(生物化学杂志2728611-8617(1997))，Sugimoto等(生物科学生物技术和生物化学611760-1762(1997))以及Mockel(谷氨酸棒杆菌的苏氨酸脱水酶酶的变构调节和结构，Berichte des Forschungszentrums Julichs，Jul-2906，ISSN09442952，Julich，德国，1994)。综述可参见遗传学和分子生物学的已知教科书，如Hagemann的教科书(＂Allgemeine Genetik＂，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1996)。
可以考虑的突变是转换(transition)、颠换(transversion)、插入和缺失。氨基酸取代对酶活性的影响，突变已知为错义突变或无义突变。在基因中插入或缺失至少一个碱基对导致移码突变，其结果是插入不正确的氨基酸或者翻译过早终止。如果终止密码子由于突变而在编码区内形成，则很可能通常导致翻译的过早终止。
缺失一些密码子典型地导致酶活性完全丧失。产生此类突变的指导属于现有技术并可在遗传学和分子生物学的已知教科书中找到，如Knippers的教科书(分子遗传学，第6版，Georg Thieme Verlag，德国斯图加特，1995)，Winnacker的教科书(基因和克隆，VCHVerlagsgesellschaft，Weinheim，德国，1990)或Hagemann的教科书(＂Allgemeine Genetik＂，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1986)。
本发明提供了mqo基因的等位基因672，示于SEQ ID NO3，该等位基因在DNA序列(见SEQ ID NO1)的第672位是腺嘌呤代替鸟嘌呤，其导致编码色氨酸-224(见SEQ ID NO2)的TGG密码子由乳白(TGA)终止密码子取代。
本发明还提供了mqo基因的等位基因1230，示于SEQ ID NO4，该等位基因在DNA序列(见SEQ ID NO1)的第672位是腺嘌呤代替鸟嘌呤，其导致编码色氨酸-224(见 SEQ ID NO2)的tgg密码子由乳白终止密码子取代，该等位基因另外在第1230位的胞嘧啶由胸腺嘧啶取代。
对谷氨酸棒杆菌基因进行诱变的一种常用方法是基因破坏和基因置换方法，如Schwarzer和Puhler所述(生物/技术学9，84-87(1991))。
在基因破坏方法中，将所述基因编码区的中心部分克隆入一个质粒载体中，该载体在宿主(典型为大肠杆菌)中能复制，但在谷氨酸棒杆菌中不能复制。适当的载体例如是pSUP301(Simon等，生物/技术学1，784-791(1983))，pK18mob或pK19mob(Schafer等，基因145，69-73(1994))，pK18mobsacB或pK19mobsacB(Jager等，细菌学杂志1745462-5465(1992))，pGEM-T(Promega公司，Madison，WI，美国)，pCR2.1-TOPO(Shuman(1994)，生物化学杂志26932678-32684；美国专利5487993)，pCRBlunt(Invitrogen，Groningen，Netherlands；Bernard等，分子生物学杂志234534-541(1993))或pEM1(Schrumpf等，1991，细菌学杂志1734510-4516)。然后将含有所述基因编码区中心部分的质粒载体通过缀合或转化移至所需的谷氨酸棒杆菌菌株中。缀合方法例如Schafer等所述(应用和环境微生物学60，756-759(1994))。转化方法例如Thierbach等所述(应用微生物和生物技术学29，356-362(1988))，Dunican和Shivnan(生物/技术学7，1067-1070(1989))和Tauch等(FEMS微生物学通讯123，343-347(1994))。在通过交叉同源重组后，所述基因的编码区被载体序列终端，获得分别缺失3’和5’末端的两个不完整的等位基因。这种方法例如由Fitzpatrick等使用(应用微生物学和生物技术学42，575-580(1994)，以排除谷氨酸棒杆菌的recA基因。
在基因置换方法中，在体外在所述基因中产生突变，例如缺失，插入或碱基取代。将产生的等位基因依次克隆入在谷氨酸棒杆菌中不复制的载体中，然后将该载体通过转化或接合移至所需谷氨酸棒杆菌宿主中。在通过首次实现整合的交换和实现靶基因或靶序列切除的第二次交换同源重组后，实现掺入突变或等位基因。
这种方法例如由Peters-Wendisch等使用(微生物学144，915-927(1998))，以通过缺失排除谷氨酸棒杆菌的pyc基因。这种方法由Schafer等使用(基因14569-73(1994))，以在hom-thrB基因区域中掺入缺失。同样，Schafer等(细菌学杂志1767309-7319(1994))在谷氨酸棒杆菌的cgl基因区域中导入一个缺失。
因此在mqo基因中可掺入缺失、插入或碱基取代。
另外，除了mqo基因的弱化之外，特定生物合成途径、糖酵解、回补代谢、柠檬酸循环、戊糖磷酸循环、氨基酸输出的一或多种酶，及任选调节蛋白的增强尤其过表达，对L-氨基酸的生产可以是有益的。
文中术语“增加”或“增强”是指微生物中由相应的DNA编码的一或多种酶的胞内活性的提高，例如通过提高基因的拷贝数，或用强启动子或编码高活性相应酶的基因，及任选地组合使用这些方法因此，例如为生产L-赖氨酸，除了弱化mqo基因之外，可以(同时)增强、尤其是过表达选自以下一组的一或多个基因·编码反馈抗性天冬氨酸激酶的lysC基因(登记号No.p26512，EP-B-0387527；EP-A-0699759；WO00/63388)·编码二氢-2，6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因(EP-B-0197335)
·编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的gap基因(Eikmanns(1992)，细菌学杂志1746076-6086)·编码丙酮酸羧化酶的pyc基因(DE-A-19831609)(同时)·编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的zwf基因(JP-A-09224661)·编码赖氨酸输出蛋白的lysE基因(DE-A-19548222)(同时)·编码Zwa1蛋白的zwa1基因(DE19959328.0，DSM 13115)·编码丙糖磷酸异构酶的tpi基因(Eikmanns(1992)，细菌学杂志1746076-6086)，及·编码3-磷酸甘油酸激酶的pgk基因(Eikmanns(1992)，细菌学杂志1746076-6086)。
除了弱化mqo基因之外，同时弱化选自以下一组的一或多个基因、尤其减少其表达对氨基酸的生产也是有益的·编码烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的pck基因(DE19950409.1，DSM13047)·编码葡糖6-磷酸异构酶的pgi基因(U.S.Ser.No.09/396478；DSM12969)，·编码编码丙酮酸氧化酶的poxB基因(DE19951975.7；DSM13114)，·编码Zwa2蛋白的zwa2基因(DE19959327.2；DSM13113)。
最后，除mqo基因的弱化之外，排除非所需的二级反应对氨基酸的生产也是有益的(Nakayama“生产氨基酸的微生物的育种”，微生物产物的过量产生，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(编辑)，学术出版社，英国伦敦，1982)。
根据本发明产生的微生物也形成了本发明的一部分，并为了生产L-氨基酸可以连续或不连续地通过分批培养，或者通过补料分批法或重复补料分批法培养。已知的培养法见Chmiel(Bioprozesstechnik1.Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991)所著教材，或由Storhas(Bioreaktoren und periphereEinrichtungen(Vieweg Verlag，Brunswick/Wiesbaden，1994))所著教材中提供。
所用培养基必须以适当方式符合各菌株的需求，关于各种微生物培养基的阐述见于，美国细菌学会的“细菌学通用方法手册”(华盛顿D.C.，USA，1981)。
可使用的碳源包括糖及碳水化合物例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素，油和脂肪如豆油、葵花油、落花生油和椰子油，脂肪酸如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸，醇如甘油和乙醇，及有机酸如乙酸。这些物质可单独或混合使用。
可使用的氮源包括含氮的有机化合物如胨、酵母膏、肉膏、麦芽提取物、玉米浸液、大豆粉和尿素，或无机化合物如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。氮源可单独或混合使用。
可使用的磷源包括磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾、或相应钠盐。培养基另外还必须含有为生长所需的金属盐如硫酸镁或硫酸铁。最后，除了上述物质之外，可使用生长必需物质如氨基酸和维生素。也可以将适当前体加入培养基中。上述物质可以单批形式或在培养期间以适当方式加入培养物中。
为调节培养物的pH值，可以适当加入碱性化合物如NaOH、KOH、氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸。抗泡沫剂例如脂肪酸聚乙二醇酯可用于控制泡沫产生。适当的选择性作用物质例如抗生素，可加入培养基中以保持质粒的稳定性。氧气或含氧混合气，例如空气，可充入培养物中以保持有氧条件。培养温度通常在20℃～45℃，优选25℃～40℃，持续培养直至所需产物形成最大量。此目的通常在10～160小时范围达到。
现有技术已知测定L-氨基酸的方法。分析可以如Speckman等(分析化学，30，(1958)，1190)所述，通过阴离子交换层析，随后经茚三酮衍生化作用进行，或通过反相HPLC进行，如Lindroth等(分析化学(1979)511167-1174)所述。
本发明借助于以下提供的实施例得以更详述阐述。
实施例1制备用于在谷氨酸棒杆菌中IPTG诱导的mqo基因表达的表达载体pxk99Emobmqo1.1克隆mqo基因用Eikmanns等所述方法(微生物学1401817-1828(1994))从菌株ATCC 13032中分离染色体DNA。基于已知的谷氨酸棒杆菌的mqo基因的序列，选择如下寡核苷酸进行聚合酶链反应(见SEQ IDNO5和SEQ ID NO6)mqo-oPl5′-GAGGA TCCGCA GAG AAC TCG CGG AGA TA-3′mqo-hind5′-CTAAG CTTCGT AGC GAG CCT TGA TGT AT-3′。
对引物加以选择以便扩增的片段含有从不具有启动子区域的天然核糖体结合位点开始的不完整基因，和mqo基因的前方区域。另外引物mqo-oP1含有限制性内切酶BamHI的切割位点序列，引物mqo-hind含有限制性内切酶HindIII的切割位点序列，在上述核苷酸序列中下划线处所示。
所述引物由MWG生物技术公司(Ebersberg，德国)合成，根据Innis等的标准PCR方法(PCR方案，方法和应用指南，1990，学术出版社)用来自Roche Diagnostics GmbH(德国曼海姆)的Pwo聚合酶进行PCR反应。借助于聚合酶链反应，该引物可以扩增大小为468bp的一个DNA片段，其携带不完整的mqo基因，包括天然核糖体结合位点。
将大小为468bp的mqo片段用限制性内切酶BamHI和HindIII切割，然后用QiaExII凝胶提取试剂盒(产品号No.20021，Qiagen，Hilden，德国)从琼脂糖凝胶中分离。
1.2构建表达载体pXK99Emob根据现有技术构建IPTG可诱导的表达载体pXK99Emob。该载体基于大肠杆菌表达载体pTRC99A(Amann等，基因69301-315(1988))，并含有可以通过加入乳糖衍生的IPTG(异丙基β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)而诱导trc启动子，终止区域T1和T2，大肠杆菌的复制起点ColE1，lacIq基因(大肠杆菌lac操纵子阻抑基因)，多克隆位点(mcs)(Norrander，J.M.等，基因26，101-106(1983))，大肠杆菌卡那霉素抗性基因aph(3’)-Iia(Beck等(1982)，基因19327-336)和克隆载体pK18mobsacB的RP4-活动位点(Schaefer等，基因1469-73(1994))。
已经发现载体pXK99Emob非常特异性适于调节基因的表达，尤其在棒状细菌中产生弱化表达。载体pXK99Emob是一种大肠杆菌表达载体，而且可以用于大肠杆菌中以增强基因的表达。
由于该载体不能在棒状细菌中独立复制，只有在将其整合入染色体中才可以保留在细胞中。该载体的这种特性在此用于调节基因的表达，在从载体中的相应基因的前方区域中克隆一个含有起始密码子和天然核糖体结合位点的基因节段后，随后将载体整合入棒状细菌中，尤其是谷氨酸棒杆菌中。基因表达通过在营养培养基中加入计量的IPTG而调节。0.5μM直至10μM数量的IPTG使相应基因非常弱地表达，10μM直至100μM使相应基因的正常表达略减弱。
将构建的大肠杆菌表达载体pXK99Emob通过电穿孔(Tauch等，1994，FEMS微生物学通讯123343-347)移至大肠杆菌DH5αmcr中(Grant，1990，美国科学院院报874645-4649)。在补加50mg/ml卡那霉素的LB琼脂上(Sambrook等，分子克隆实验指导，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，N.Y.，1989)选择转化体。
质粒DNA通过常规方法从转化体中分离(Peters-Wendisch等，1998，微生物学144，915-927)，用限制性内切酶NcoI切割，并随后通过琼脂糖凝胶电泳检测质粒。
以此方式获得的质粒构建体称为pXK99Emob(
图1)。通过将质粒pXK99Emob电穿孔入大肠杆菌菌株DH5αmcr中获得的菌株称为大肠杆菌DH5alphamcr/pXK99Emob。
1.3在大肠杆菌表达载体pXK99Emob中克隆mqo片段实施例1.2中阐述的大肠杆菌表达载体pXK99Emob用作载体。将这个质粒的DNA用限制性内切酶BamHI和HindIII完全切割，然后用虾碱性磷酸酶去磷酸化(Roche Diagnostics GmbH，德国曼海姆，产品描述SAP，产品号No.1758250)。
将通过PCR及用限制性内切酶BamHI和HindIII切割获得的实施例1.1所述大小为大约458bp的mqo片段与制备的载体pXK99Emob混合，然后将此混合物用T4 DNA连接酶处理(AmershamPharmacia，Freiburg，德国，T4-DNA-连接酶产品说明书，编码号No.27-0870-04)。然后将连接混合物转化入大肠杆菌菌株DH5αmcr中(Hanahan，DNA克隆实用方案，第1卷，IRL出版社，Oxford，美国华盛顿)。将转化混合物铺板于含有50mg/l卡那霉素的LB琼脂(Lennox，1955，病毒学，1190)上选择携带质粒的细胞。在37℃温育过夜后，选择重组的各个克隆。用Qiaprep Spin Miniprep试剂盒(产品号No.27106，Qiagen，Hilden，德国)根据厂商说明书从转化体中分离质粒DNA，并用限制性内切酶BamHI和HindIII切割，以通过随后的琼脂糖凝胶电泳检测该质粒。所得质粒称为pXK99Emobmqo。示于图2。
以下微生物根据布达佩斯条约以纯培养物形式于2002年2月15日保藏在德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ)(Braunschweig，德国)大肠杆菌DH5alphamcr/pXK99Emobmqo(＝DH5αmcr/pXK99Emobmqo)，保藏号DSM14815。
实施例2将载体pXK99Emobmqo整合入谷氨酸棒杆菌菌株DSM5715的基因组中将实施例1所述载体pXK99Emobmqo通过Tauch等所述电穿孔方法(1989，FEMS微生物学通讯123343-347)电穿孔入谷氨酸棒杆菌菌株DSM5715中。该载体在谷氨酸棒杆菌中不能独立复制，而且只有在整合入染色体中才能在细胞中保留。将电穿孔混合物铺板于补加了15mg/l卡那霉素和IPTG(1mM)的LB琼脂(Sambrook等，分子克隆实验指导，第二版，冷泉港，纽约，1989)上，选择具有整合的pXK99Emobmqo的克隆。
一种选择的卡那霉素抗性克隆，其中实施例1所述质粒pXK99Emobmqo插入DSM5715的染色体mqo基因中，将其称为DSM5715∷pXK99Emobmqo。
实施例3赖氨酸的制备将实施例2中获得的谷氨酸棒杆菌菌株DSM5715∷pXK99Emobmqo在适于生产赖氨酸的营养培养基中培养，并确定培养物上清液中的赖氨酸含量。加入IPTG，通过trc启动子的调节，mqo基因表达弱化。
为此，首先在33℃在具有合适抗生素的琼脂板(具有卡那霉素(25mg/l)和IPTG(10μM)的脑心琼脂)上培养菌株24小时。从这些琼脂板培养物开始，接种预培养物(10ml培养基于100ml锥形瓶)。用于预培养的培养基是完全培养基CgIII。
培养基Cg IIINaCl2.5g/lBacto-蛋白胨10g/lBacto-酵母膏10g/l葡萄糖(单独高压灭菌)2％(w/v)将pH调节为7.4。
向此培养基中加入卡那霉素(25mg/l)和IPTG(10μM)。在摇床上于33℃以240rpm振荡培养预培养物16小时。该预培养物的光密度(OD，660nm)是0.5。将500μl该预培养物接种主培养物。通过从预培养物中转移含有IPTG的培养基，主培养物中IPTG的浓度为大约0.5μM。培养基MM用作主培养基。
培养基MMCSL(玉米浆) 5g/lMOPS(吗啉代丙烷磺酸) 20g/l葡萄糖(单独高压灭菌) 50g/l盐(NH4)2SO425g/lKH2PO40.1g/lMgSO4·7H2O 1.0g/lCaCl2·2H2O 10mg/lFeSO4·7H2O 10mg/lMnSO4·H2O5.0mg/l生物素(过滤灭菌) 0.3mg/l硫胺素·HCl(过滤灭菌)0.2mg/l亮氨酸(过滤灭菌) 0.1g/lCaCO325g/l用氨水将CSL，MOPS和盐溶液调至pH7并高压灭菌。然后加入无菌的底物和维生素溶液，并加入干态高压灭菌的CaCO3。
以在具有档板的100ml锥形瓶中的10ml体积进行培养，加入卡那霉素(25mg/l)。在33℃和80％大气湿度下进行培养。
72小时后，用Biomek1000(Beckmann仪器有限公司，慕尼黑)确定在660nm测量波长的OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析仪(汉堡，德国)经离子交换层析和用茚三酮检测柱后衍生化而确定形成的赖氨酸的量。
所得结果示于表1。
表1
附图简述图1质粒pXK99Emob图。
图2质粒pXK99Emobmqo图。
图中所采用的缩写和符号有如下含义Kan大肠杆菌的卡那霉素抗性基因aph(3’)-IIaBamHI限制酶BamHI的切割位点HindIII限制酶HindIII的切割位点NcoI限制酶NcoI的切割位点Ptrctrc启动子T1终止区域T1T2终止区域T2LacIq大肠杆菌lac操纵子的lacIq阻抑基因oriV大肠杆菌ColE1的复制源点mobRP4-活动位点mqomqo基因的克隆区域序列表<110>德古萨股份公司<120>通过发酵棒状细菌生产L-氨基酸的方法<130>010145 BT<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1503<212>DNA<213>谷氨酸棒杆菌<220>
<221>CDS<222>(1)..(1500)<223>mqo-基因<400>1atg tca gat tcc ccg aag aac gca ccg agg att acc gat gag gca gat 48Met Ser Asp Ser Pro Lys Asn Ala Pro Arg Ile Thr Asp Glu Ala Asp1 5 10 15gta gtt ctc att ggt gcc ggt atc atg agc tcc acg ctg ggt gca atg 96Val Val Leu Ile Gly Ala Gly Ile Met Ser Ser Thr Leu Gly Ala Met20 25 30ctg cgt cag ctg gag cca agc tgg act cag atc gtc ttc gag cgt ttg144Leu Arg Gln Leu Glu Pro Ser Trp Thr Gln Ile Val Phe Glu Arg Leu35 40 45gat gga ccg gca caa gag tcg tcc tcc ccg tgg aac aat gca gga acc192Asp Gly Pro Ala Gln Glu Ser Ser Ser Pro Trp Asn Asn Ala Gly Thr50 55 60ggc cac tct gct cta tgc gag ctg aac tac acc cca gag gtt aag ggc240Gly His Ser Ala Leu Cys Glu Leu Asn Tyr Thr Pro Glu Val Lys Gly65 70 75 80aag gtt gaa att gcc aag gct gta gga atc aac gag aag ttc cag gtt288Lys Val Glu Ile Ala Lys Ala Val Gly Ile Asn Glu Lys Phe Gln Val85 90 95tcc cgt cag ttc tgg tct cac ctc gtt gaa gag gga gtg ctg tct gat336Ser Arg Gln Phe Trp Ser His Leu Val Glu Glu Gly Val Leu Ser Asp100 105 110cct aag gaa ttc atc aac cct gtt cct cac gta tct ttc ggc cag ggc384Pro Lys Glu Phe Ile Asn Pro Val Pro His Val Ser Phe Gly Gln Gly115 120 125gca gat cag gtt gca tac atc aag gct cgc tac gaa gct ttg aag gat432Ala Asp Gln Val Ala Tyr Ile Lys Ala Arg Tyr Glu Ala Leu Lys Asp130 135 140cac cca ctc ttc cag ggc atg acc tac gct gac gat gaa gct acc ttc480His Pro Leu Phe Gln Gly Met Thr Tyr Ala Asp Asp Glu Ala Thr Phe145 150 155 160
acc gag aag ctg cct ttg atg gca aag ggc cgt gac ttc tct gat cca528Thr Glu Lys Leu Pro Leu Met Ala Lys Gly Arg Asp Phe Ser Asp Pro165 170 175gta gca atc tct tgg atc gat gaa ggc acc gac atc aac tac ggt gct576Val Ala Ile Ser Trp Ile Asp Glu Gly Thr Asp Ile Asn Tyr Gly Ala180 185 190cag acc aag cag tac ctg gat gca gct gaa gtt gaa ggc act gaa atc624Gln Thr Lys Gln Tyr Leu Asp Ala Ala Glu Val Glu Gly Thr Glu Ile195 200 205cgc tat ggc cac gaa gtc aag agc atc aag gct gat ggc gca aag tgg672Arg Tyr Gly His Glu Val Lys Ser Ile Lys Ala Asp Gly Ala Lys Trp210 215 220atc gtg acc gtc aag aac gta cac act ggc gac acc aag acc atc aag720Ile Val Thr Val Lys Asn Val His Thr Gly Asp Thr Lys Thr Ile Lys225 230 235 240gca aac ttc gtg ttc gtc ggc gca ggc gga tac gca ctg gat ctg ctt768Ala Asn Phe Val Phe Val Gly Ala Gly Gly Tyr Ala Leu Asp Leu Leu245 250 255cgc agc gca ggc atc cca cag gtc aag ggc ttc gct gga ttc cca gta816Arg Ser Ala Gly Ile Pro Gln Val Lys Gly Phe Ala Gly Phe Pro Val260 265 270tcc ggc ctg tgg ctt cgt tgc acc aac gag gaa ctg atc gag cag cac864Ser Gly Leu Trp Leu Arg Cys Thr Asn Glu Glu Leu Ile Glu Gln His275 280 285gca gcc aag gta tat ggc aag gca tct gtt ggc gct cct cca atg tct912Ala Ala Lys Val Tyr Gly Lys Ala Ser Val Gly Ala Pro Pro Met Ser290 295 300gtt cct cac ctt gac acc cgc gtt atc gag ggt gaa aag ggt ctg ctc960Val Pro His Leu Asp Thr Arg Val Ile Glu Gly Glu Lys Gly Leu Leu305 310 315 320ttt gga cct tac ggt ggc tgg acc cct aag ttc ttg aag gaa ggc tcc1008Phe Gly Pro Tyr Gly Gly Trp Thr Pro Lys Phe Leu Lys Glu Gly Ser325 330 335tac ctg gac ctg ttc aag tcc atc cgc cca gac aac att cct tcc tac1056Tyr Leu Asp Leu Phe Lys Ser Ile Arg Pro Asp Asn Ile Pro Ser Tyr340 345 350ctt ggc gtt gct gct cag gaa ttt gat ctg acc aag tac ctt gtc act1104Leu Gly Val Ala Ala Gln Glu Phe Asp Leu Thr Lys Tyr Leu Val Thr355 360 365gaa gtt ctc aag gac cag gac aag cgt atg gat gct ctt cgc gag tac1152Glu Val Leu Lys Asp Gln Asp Lys Arg Met Asp Ala Leu Arg Glu Tyr370 375 380atg cca gag gca caa aac ggc gat tgg gag acc atc gtt gcc gga cag1200Met Pro Glu Ala Gln Asn Gly Asp Trp Glu Thr Ile Val Ala Gly Gln385 390 395 400cgt gtt cag gtt att aag cct gca gga ttc cct aag ttc ggt tcc ctg1248Arg Val Gln Val Ile Lys Pro Ala Gly Phe Pro Lys Phe Gly Ser Leu405 410 415
gaa ttc ggc acc acc ttg atc aac aac tcc gaa ggc acc atc gcc gga1296Glu Phe Gly Thr Thr Leu Ile Asn Asn Ser Glu Gly Thr Ile Ala Gly420 425 430ttg ctc ggt gct tcc cct gga gca tcc atc gca cct tcc gca atg atc1344Leu Leu Gly Ala Ser Pro Gly Ala Ser Ile Ala Pro Ser Ala Met Ile435 440 445gag ctg ctt gag cgt tgc ttc ggt gac cgc atg atc gag tgg ggc gac1392Glu Leu Leu Glu Arg Cys Phe Gly Asp Arg Met Ile Glu Trp Gly Asp450 455 460aag ctg aag gac atg atc cct tcc tac ggc aag aag ctt gct tcc gag1440Lys Leu Lys Asp Met Ile Pro Ser Tyr Gly Lys Lys Leu Ala Ser Glu465 470 475 480cca gca ctg ttt gag cag cag tgg gca cgc acc cag aag acc ctg aag1488Pro Ala Leu Phe Glu Gln Gln Trp Ala Arg Thr Gln Lys Thr Leu Lys485 490 495ctt gag gaa gcc taa1503Leu Glu Glu Ala500<210>2<211>500<212>PRT<213>谷氨酸棒杆菌<400>2Met Ser Asp Ser Pro Lys Asn Ala Pro Arg Ile Thr Asp Glu Ala Asp1 5 10 15Val Val Leu Ile Gly Ala Gly Ile Met Ser Ser Thr Leu Gly Ala Met20 25 30Leu Arg Gln Leu Glu Pro Ser Trp Thr Gln Ile Val Phe Glu Arg Leu35 40 45Asp Gly Pro Ala Gln Glu Ser Ser Ser Pro Trp Asn Asn Ala Gly Thr50 55 60Gly His Ser Ala Leu Cys Glu Leu Asn Tyr Thr Pro Glu Val Lys Gly65 70 75 80Lys Val Glu Ile Ala Lys Ala Val Gly Ile Asn Glu Lys Phe Gln Val85 90 95Ser Arg Gln Phe Trp Ser His Leu Val Glu Glu Gly Val Leu Ser Asp100 105 110Pro Lys Glu Phe Ile Asn Pro Val Pro His Val Ser Phe Gly Gln Gly115 120 125Ala Asp Gln Val Ala Tyr Ile Lys Ala Arg Tyr Glu Ala Leu Lys Asp130 135 140His Pro Leu Phe Gln Gly Met Thr Tyr Ala Asp Asp Glu Ala Thr Phe145 150 155 160Thr Glu Lys Leu Pro Leu Met Ala Lys Gly Arg Asp Phe Ser Asp Pro165 170 175Val Ala Ile Ser Trp Ile Asp Glu Gly Thr Asp Ile Asn Tyr Gly Ala180 185 190
Gln Thr Lys Gln Tyr Leu Asp Ala Ala Glu Val Glu Gly Thr Glu Ile195 200 205Arg Tyr Gly His Glu Val Lys Ser Ile Lys Ala Asp Gly Ala Lys Trp210 215 220Ile Val Thr Val Lys Asn Val His Thr Gly Asp Thr Lys Thr Ile Lys225 230 235 240Ala Asn Phe Val Phe Val Gly Ala Gly Gly Tyr Ala Leu Asp Leu Leu245 250 255Arg Ser Ala Gly Ile Pro Gln Val Lys Gly Phe Ala Gly Phe Pro Val260 265 270Ser Gly Leu Trp Leu Arg Cys Thr Asn Glu Glu Leu Ile Glu Gln His275 280 285Ala Ala Lys Val Tyr Gly Lys Ala Ser Val Gly Ala Pro Pro Met Ser290 295 300Val Pro His Leu Asp Thr Arg Val Ile Glu Gly Glu Lys Gly Leu Leu305 310 315 320Phe Gly Pro Tyr Gly Gly Trp Thr Pro Lys Phe Leu Lys Glu Gly Ser325 330 335Tyr Leu Asp Leu Phe Lys Ser Ile Arg Pro Asp Asn Ile Pro Ser Tyr340 345 350Leu Gly Val Ala Ala Gln Glu Phe Asp Leu Thr Lys Tyr Leu Val Thr355 360 365Glu Val Leu Lys Asp Gln Asp Lys Arg Met Asp Ala Leu Arg Glu Tyr370 375 380Met Pro Glu Ala Gln Asn Gly Asp Trp Glu Thr Ile Val Ala Gly Gln385 390 395 400Arg Val Gln Val Ile Lys Pro Ala Gly Phe Pro Lys Phe Gly Ser Leu405 410 415Glu Phe Gly Thr Thr Leu Ile Asn Asn Ser Glu Gly Thr Ile Ala Gly420 425 430Leu Leu Gly Ala Ser Pro Gly Ala Ser Ile Ala Pro Ser Ala Met Ile435 440 445Glu Leu Leu Glu Arg Cys Phe Gly Asp Arg Met Ile Glu Trp Gly Asp450 455 460Lys Leu Lys Asp Met Ile Pro Ser Tyr Gly Lys Lys Leu Ala Ser Glu465 470 475 480Pro Ala Leu Phe Glu Gln Gln Trp Ala Arg Thr Gln Lys Thr Leu Lys485 490 495Leu Glu Glu Ala500<210>3<211>1503<212>DNA<213>谷氨酸棒杆菌
<220>
<221>-<222>(1)..(1500)<223>mqo-等位基因672<220>
<221>其他特征<222>(1)..(3)<223>起始密码子<220>
<221>其他特征<222>(670)..(672)<223>opal终止密码子<400>3atgtcagatt ccccgaagaa cgcaccgagg attaccgatg aggcagatgt agttctcatt 60ggtgccggta tcatgagctc cacgctgggt gcaatgctgc gtcagctgga gccaagctgg 120actcagatcg tcttcgagcg tttggatgga ccggcacaag agtcgtcctc cccgtggaac 180aatgcaggaa ccggccactc tgctctatgc gagctgaact acaccccaga ggttaagggc 240aaggttgaaa ttgccaaggc tgtaggaatc aacgagaagt tccaggtttc ccgtcagttc 300tggtctcacc tcgttgaaga gggagtgctg tctgatccta aggaattcat caaccctgtt 360cctcacgtat ctttcggcca gggcgcagat caggttgcat acatcaaggc tcgctacgaa 420gctttgaagg atcacccact cttccagggc atgacctacg ctgacgatga agctaccttc 480accgagaagc tgcctttgat ggcaaagggc cgtgacttct ctgatccagt agcaatctct 540tggatcgatg aaggcaccga catcaactac ggtgctcaga ccaagcagta cctggatgca 600gctgaagttg aaggcactga aatccgctat ggccacgaag tcaagagcat caaggctgat 660ggcgcaaagt gaatcgtgac cgtcaagaac gtacacactg gcgacaccaa gaccatcaag 720gcaaacttcg tgttcgtcgg cgcaggcgga tacgcactgg atctgcttcg cagcgcaggc 780atcccacagg tcaagggctt cgctggattc ccagtatccg gcctgtggct tcgttgcacc 840aacgaggaac tgatcgagca gcacgcagcc aaggtatatg gcaaggcatc tgttggcgct 900cctccaatgt ctgttcctca ccttgacacc cgcgttatcg agggtgaaaa gggtctgctc 960tttggacctt acggtggctg gacccctaag ttcttgaagg aaggctccta cctggacctg1020ttcaagtcca tccgcccaga caacattcct tcctaccttg gcgttgctgc tcaggaattt1080gatctgacca agtaccttgt cactgaagtt ctcaaggacc aggacaagcg tatggatgct1140cttcgcgagt acatgccaga ggcacaaaac ggcgattggg agaccatcgt tgccggacag1200cgtgttcagg ttattaagcc tgcaggattc cctaagttcg gttccctgga attcggcacc1260accttgatca acaactccga aggcaccatc gccggattgc tcggtgcttc ccctggagca1320tccatcgcac cttccgcaat gatcgagctg cttgagcgtt gcttcggtga ccgcatgatc1380gagtggggcg acaagctgaa ggacatgatc ccttcctacg gcaagaagct tgcttccgag1440
ccagcactgt ttgagcagca gtgggcacgc acccagaaga ccctgaagct tgaggaagcc1500taa 1503<210>4<211>1503<212>DNA<213>谷氨酸棒杆菌<220>
<221>-<222>(1)..(1500)<223>mqo-等位基因1230<220>
<221>其他特征<222>(1)..(3)<223>起始密码子<220>
<221>其他特征<222>(670)..(672)<223>opal终止密码子<220>
<221>其他特征<222>(1230)..(672)<223>C-T转换<400>4atgtcagatt ccccgaagaa cgcaccgagg attaccgatg aggcagatgt agttctcatt 60ggtgccggta tcatgagctc cacgctgggt gcaatgctgc gtcagctgga gccaagctgg 120actcagatcg tcttcgagcg tttggatgga ccggcacaag agtcgtcctc cccgtggaac 180aatgcaggaa ccggccactc tgctctatgc gagctgaact acaccccaga ggttaagggc 240aaggttgaaa ttgccaaggc tgtaggaatc aacgagaagt tccaggtttc ccgtcagttc 300tggtctcacc tcgttgaaga gggagtgctg tctgatccta aggaattcat caaccctgtt 360cctcacgtat ctttcggcca gggcgcagat caggttgcat acatcaaggc tcgctacgaa 420gctttgaagg atcacccact cttccagggc atgacctacg ctgacgatga agctaccttc 480accgagaagc tgcctttgat ggcaaagggc cgtgacttct ctgatccagt agcaatctct 540tggatcgatg aaggcaccga catcaactac ggtgctcaga ccaagcagta cctggatgca 600gctgaagttg aaggcactga aatccgctat ggccacgaag tcaagagcat caaggctgat 660ggcgcaaagt gaatcgtgac cgtcaagaac gtacacactg gcgacaccaa gaccatcaag 720gcaaacttcg tgttcgtcgg cgcaggcgga tacgcactgg atctgcttcg cagcgcaggc 780atcccacagg tcaagggctt cgctggattc ccagtatccg gcctgtggct tcgttgcacc 840aacgaggaac tgatcgagca gcacgcagcc aaggtatatg gcaaggcatc tgttggcgct 900cctccaatgt ctgttcctca ccttgacacc cgcgttatcg agggtgaaaa gggtctgctc 960tttggacctt acggtggctg gacccctaag ttcttgaagg aaggctccta cctggacctg1020ttcaagtcca tccgcccaga caacattcct tcctaccttg gcgttgctgc tcaggaattt1080
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<223>含有限制性酶切位点的引物<220>
<221>其他特征<222>(1)..(28)<223>引物mqo_oP1<400>5gaggatccgc agagaactcg cggagata 28<210>6<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>含有限制性酶切位点的引物<220>
<221>其他特征<222>(1)..(28)<223>引物mqo_hind<400>6ctaagcttcg tagcgagcct tgatgtat 28
权利要求
1.通过发酵生产L-氨基酸特别是L-赖氨酸的方法，所述方法包括进行以下步骤(a)发酵生产所需L-氨基酸的棒状细菌，该细菌中至少mqo基因是弱化的，(b)富集培养基或细菌细胞中的所需产物，及(c)分离所需L-氨基酸，其中任选地在终产物中保留部分或全部发酵液和/或生物量。
2.权利要求1的方法，其中所用的细菌中所需L-氨基酸生物合成途径的其它基因额外被扩增。
3.权利要求1的方法，其中所用的细菌中减少所需L-氨基酸生成的至少一些代谢途径被排除。
4.权利要求1的方法，其中编码mqo基因的多核苷酸的表达被降低。
5.权利要求1的方法，其中多核苷酸mqo编码的多肽(酶蛋白)的催化活性被降低。
6.权利要求1的方法，其中为生产L-赖氨酸，所发酵的棒状微生物中选自以下一组的一或多种基因同时被增强、尤其是被过表达6.1编码反馈抗性天冬氨酸激酶的lysC基因，6.2编码二氢-2，6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因，6.3编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的gap基因，6.4编码丙酮酸羧化酶的pyc基因，6.5编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的zwf基因，6.6编码赖氨酸输出的lysE基因(同时)6.7编码Zwa1蛋白的zwa1基因，6.8编码丙糖磷酸异构酶的tpi基因，及6.9编码3-磷酸甘油酸激酶的pgk基因。
7.权利要求1的方法，其中为生产L-氨基酸，所发酵的棒状微生物中选自以下一组的一或多种基因同时被弱化7.1编码烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的pck基因，7.2编码葡糖6-磷酸异构酶的pgi基因，7.3编码丙酮酸氧化酶的poxB基因，或7.4编码Zwa2蛋白的zwa2基因。
8.前述权利要求中任一项的方法，其中使用谷氨酸棒杆菌菌种的微生物。
9.棒状细菌，其中至少mqo基因以弱化形式存在。
10.权利要求9的棒状细菌，其中弱化通过缺失、插入、转换、或颠换突变而实现。
11.权利要求9或10的棒状细菌，其中mqo基因含有一个终止密码子。
12.权利要求11的棒状细菌，其中终止密码子、尤其是乳白密码子，位于SEQ ID NO2的氨基酸序列的第224位。
13.权利要求9-12中任一项的棒状细菌，其含有SEQ ID NO3的mqo等位基因。
14.权利要求9-12中任一项的棒状细菌，其含有SEQ ID NO4的mqo等位基因。
15.大肠杆菌菌株DH5alphamcr/pXK99Emobmqo(＝DH5αmcr/pXK99Emobmqo)，保藏在德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ，Brunswick，德国)，保藏号DSM14815。
全文摘要
本发明涉及一种生产L－氨基酸的方法，其中进行以下步骤(a)发酵生产所需L－氨基酸的棒状细菌，该细菌中至少mqo基因是弱化的，(b)富集培养基或细菌细胞中的所需产物，及(c)分离所需L－氨基酸，及任选地，所用细菌中所需L－氨基酸生物合成途径的其它基因被额外增强，或者所用细菌中降低所需L－氨基酸形成的至少一些代谢途径被排除。
文档编号C12N1/21GK1501979SQ02808104
公开日2004年6月2日 申请日期2002年4月4日 优先权日2001年4月10日
发明者迈克·法尔维克, 布丽吉特·巴特, 托马斯·赫尔曼, 阿西姆·马克思, 瓦尔特·普费弗勒, 普费弗勒, 赫尔曼, 马克思, 特 巴特, 迈克 法尔维克 申请人:德古萨股份公司