用于测量哺乳动物组织丝氨酸棕榈酰转移酶的方法及其应用的制作方法

专利名称：用于测量哺乳动物组织丝氨酸棕榈酰转移酶的方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明提供一种用于测量哺乳动物细胞中丝氨酸棕榈酰转移酶表达水平的方法及其应用。更具体地讲，本发明提供一种用于比较性测量正常哺乳动物细胞和过度增殖性哺乳动物细胞中丝氨酸棕榈酰转移酶表达水平的方法及其应用。
背景技术：
膜脂组成是不同膜高度特异性的并且取决于细胞的生理状态，因此对了解这些现象的调节是重要的(Merrill，A.H.，Jr.，Characterization of serine palmitoyltransferase activity in Chinese hamsterovary cells(中国仓鼠卵巢细胞中丝氨酸棕榈酰转移酶活性的表征)，Biochimica et Biophysica Acta，1983；754，284-91)。鞘脂是真核细胞膜而不是原核细胞膜的遍在组分。除给细胞和细胞器膜提供结构完整性之外，越来越多的证据证明鞘脂参与调节各种细胞功能。鞘脂代谢中间体例如鞘氨醇、鞘氨醇-1-磷酸(S-1-P)和神经酰胺参与调节细胞生长和分化、衰老性细胞周期和增殖性细胞凋亡(D.K.Perry，J.Carton，A.K.Shah，F.Meredith，D.J.Jhlinger和Y.A.Hanrun，Serinepalmitoyltransferase regulates de novo ceramide generation duringetoposide-induced apoptosis(丝氨酸棕榈酰转移酶在依托泊苷诱导的细胞凋亡期间调节从头神经酰胺的产生)，J.Biol.Chem.，2000，275，9078-84)。其它信号转导功能包括抑制细胞内的DAG/PKC途径、Ca2+活动化和K+流入。鞘脂的这些功能和其它功能着重指出鞘脂代谢在生理上重要的现象例如肿瘤抑制、组织发育、损伤和萎缩中的潜在重要性(有关综述参见Y.A.Hannun，Sphingolipid second messengersTumor suppressor lipidsEicosanoids and Other Bioactive Lipids(鞘脂第二信使肿瘤抑制脂质类花生酸和其它生物活性脂质)，Cancer，Inflammation and Radiation Injury 1997，2；305-312)。
调节鞘脂代谢的酶在保持细胞稳态方面是关键性的，并且其活性的破坏可以引起疾病。由于污染串珠镰孢菌素真菌毒素而抑制神经酰胺合酶的动物饲料，引起马脑白质软化和猪肺水肿。通过HDL降低TNF-α诱导的内皮细胞中的S-1-P产生降低粘着蛋白的表达，因此增加抵抗动脉粥样硬化的保护作用。因此，调节鞘脂代谢的酶是控制细胞现象的鞘脂介导的调节中的关键因子。
各种鞘脂的骨架从长链碱基二氢鞘氨醇、鞘氨醇产生，而在酵母中从植物二氢鞘氨醇产生。长链碱基合成的第一个独特关键反应涉及通过丝氨酸棕榈酰转移酶(SPT；棕榈酰辅酶A；L-丝氨酸C-棕榈酰转移酶(脱羧作用))使L-丝氨酸与脂肪酸酰基辅酶A的缩合，产生3-酮二氢鞘氨醇(Merrill，1983)。微粒体膜内在蛋白SPT由至少两种亚基SPT1和SPT2组成。SPT的催化亚基被认为是SPT2，而调节活性被认为是SPT1亚基。在酵母中，LCB活性既需要LCB1亚基又需要LCB2亚基，而Tsc3p对最佳LCB功能是必不可少的。
由于SPT是从头鞘脂生物合成中的关键性调节酶，因此预期SPT活性的改变将会影响细胞功能的鞘脂介异的调节。在酵母中，SPT与热和高渗应激反应有关。培养的人角质细胞，当用UV照射时，正调节SPT活性并且显示SPT2 mRNA和蛋白质水平相应增加。SPT活性在细胞凋亡期间增加并且在用化疗药依托泊苷处理的细胞中控制从头神经酰胺合成(Perry，2000)。用多球壳菌素抑制SPT活性在猪肾细胞LLCK-1中逆转神经酰胺合酶抑制剂串珠镰孢菌素的细胞凋亡和抗增殖作用。
最近，SPT表达与病理生理病症密切相关。诸如血管成形术的手术导致血管损伤，并且起始对该损伤的应答—统称为再狭窄的事件的级联。据报道气囊损伤性大鼠颈动脉增生性血管平滑肌细胞和成纤维细胞中SPT1和SPT2两者的表达均增加(D.J.Uhlinger，J.M.Carton，D.C.Argentieri，B.P.Damiano和M.R.D′Andrea，IncreasedExpression of Serine Palmitoyltransferase(SPT)in Balloon-injured RatCarotid Artery(气囊损伤性大鼠颈动脉中丝氨酸棕榈酰转移酶(SPT)的表达增加)，THromb.Haem.，2001，86，1320-6)。
脂质代谢途径的变化属于正常细胞去分化重要过程。所进行的研究已经表明，与正常肝细胞相比，在肝细胞瘤的细胞膜中存在较高百分比的鞘脂(Williams RD，Nixon DW，Merrill AH，Jr.，Comparisonof serine palmitoyltransferase in Morris hepatoma 7777 and rat liver(丝氨酸棕榈酰转移酶在Morris肝细胞瘤7777和大鼠肝脏中的比较)，Cancer Research，1984，44(5)，1918-23)。
本发明的方法证明，SPT在某些肿瘤中恶性肿瘤细胞周围在培养的增殖性成纤维细胞和宿主“反应性”基质成纤维细胞中是高丰度表达的，这一现象在正常组织的周围基质成纤维细胞没有观察到。在许多侵袭性癌中见到突出的基质反应(结缔组织生成)，提示基质细胞在癌症发病机理方面起作用(M.Gregoire，B.Lieubeau，The role offibroblasts in tumor behavior(成纤维细胞在肿瘤行为中的作用)，Cancer Metastasis Rev.，1995，14(4)，339-50)。反应性成纤维细胞，也被称为肌成纤维细胞，通常与起源上皮的不同癌症相关并且影响癌细胞的侵入和转移潜力(M.Gregoire，1995)。本发明的方法还证明，SPT亚基在若干已建立的人类肿瘤细胞系和原位人类恶性肿瘤细胞中高度表达。另外，观察到在增殖性成纤维细胞和恶性肿瘤细胞中的SPT亚细胞定位变化。
目前，核脂质代谢在信号转导级联中的作用变得显而易见。已经表明二酰甘油激酶一一种参与磷脂代谢的酶定位于细胞核并且参与核信号转导。也已经表明鞘氨醇激酶(SPHK)在促细胞分裂刺激24小时内定位于3T3细胞的细胞核，并且在所述处理后核SPHK活性增加(Kleuser B.，Maceyka M.，Milstien S.和Spiegel S.，Stimulation ofnuclear sphingosine kinase activity by platelet-derived growth factor(用血小板衍生生长因子刺激核鞘氨醇激酶活性)，FEBS Lett.，2001，503(1)，85-90)。已经表明鞘脂代谢物存在于核制备物中并且在其中有活性，支持鞘脂在介导细胞核内的细胞活性中起调节作用的构思。我们的研究工作证明了SPT在增殖性成纤维细胞和恶性肿瘤细胞中的核相关性。这代表参与刺激时与细胞核相关的鞘脂代谢的第二种酶。这些数据表明，鞘脂作为除先前报道的、在胞质信号级联中的活性之外在细胞核内作为信号分子以及作为胞间信号分子的作用。
由于SPT活性随细胞生理状态的变化而改变，因此必须测定该酶在正常组织中的基础水平。SPT1亚基和SPT2亚基的分布可以用作细胞活性的潜在标记，其中高水平的所述酶可以反映出代谢活性(例如嗜中性粒细胞和/或巨噬细胞浸润、神经元传递、胞吐作用)或细胞增殖增加。在正常组织和细胞类型中测定的SPT1和SPT2水平可以随后用来分析异常状态下的细胞类型。病理生理状态下例如癌症、炎症(例如溃疡性结肠炎、炎性肠综合征、节段性回肠炎、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、中风、哮喘)和血管损伤(例如再狭窄)SPT表达增加的相关性，使其为激发性治疗靶。因此，SPT的调节可以广泛涉及细胞反应和病理学，因为其作为催化鞘脂代谢级联的关键步骤和限速步骤的酶的突出位置所致。
美国专利6,090,565描述了一种鉴定特殊鞘糖脂种类(准确的说是选自N-二十四酰(木素酰)一糖基神经酰胺、N-二十四酰(神经酰)一糖基神经酰胺、N-二十二酰一糖基神经酰胺和N-亚麻酰一糖基神经酰胺的糖基神经酰胺)及其导致增强的抗肿瘤药化学敏感性降低的方法，所述鞘糖脂种类为某些类型的癌细胞(选自淋巴瘤、黑素瘤、肉瘤、白血病、成视网膜细胞瘤、肝细胞瘤、骨髓瘤、神经胶质瘤、间皮瘤或癌)中多药耐药性的特征。鉴定方法包括色谱法；使癌细胞与在免疫学上与所述鞘糖脂种类的表位结合的抗体或含抗体组分的混合物接触；或者使癌细胞与与糖基神经酰胺有免疫反应的纯化抗体接触。
美国专利6,190,894描述了一种增强生理活性物质穿入用于经皮或透皮递药的方法和制剂，所述方法包括用上皮屏障破坏量的至少一种选自以下的药物破坏上皮屏障功能神经酰胺合成抑制剂、葡糖基神经酰胺合成抑制剂、酰基神经酰胺合成抑制剂、鞘磷脂合成抑制剂、脂肪酸合成抑制剂、胆固醇合成抑制剂、磷脂和鞘糖脂(包括葡糖基神经酰胺、酰基神经酰胺和鞘磷脂)降解的抑制剂、游离脂肪酸、神经酰胺、酰基神经酰胺、葡糖基神经酰胺和鞘磷脂)降解酶的抑制剂或者游离脂肪酸、神经酰胺和胆固醇代谢酶的抑制剂和/或刺激剂。
发明概述在一个实施方案中，本发明提供一种用于测量哺乳动物细胞丝氨酸棕榈酰转移酶表达水平的方法，所述方法包括(a)使丝氨酸棕榈酰转移酶特异性化合物与一种哺乳动物细胞接触，以形成大量的化合物-丝氨酸棕榈酰转移酶复合物；且(b)通过检测存在的所述复合物，测量由所述细胞表达的丝氨酸棕榈酰转移酶水平。
在第二个实施方案中，本发明提供一种用于测量哺乳动物细胞丝氨酸棕榈酰转移酶表达的方法，所述方法包括(a)使丝氨酸棕榈酰转移酶特异性化合物与以基础水平表达丝氨酸棕榈酰转移酶的第一种哺乳动物细胞接触，以形成第一种大量的化合物-丝氨酸棕榈酰转移酶复合物；(b)使丝氨酸棕榈酰转移酶特异性化合物与过度增殖性地表达丝氨酸棕榈酰转移酶的第二种哺乳动物细胞接触，以形成第二种大量的化合物-丝氨酸棕榈酰转移酶复合物；(c)通过检测所述第一种和第二种大量复合物的存在，测定由所述第一种和第二种细胞表达的丝氨酸棕榈酰转移酶水平；且(d)测量所述第一种和第二种细胞表达的丝氨酸棕榈酰转移酶水平差异。
所测得的所述第一种和第二种细胞表达丝氨酸棕榈酰转移酶的水平差异用来例如检测或诊断癌症、诊断癌症的转移潜力、监测癌症的预后和进程、或者监测癌症治疗的治疗功效。所述癌症包括但不限于乳腺癌、结肠癌、类癌瘤、胃癌、神经胶质瘤、肝细胞瘤、平滑肌肉瘤、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑素瘤、间皮瘤、骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、甲状腺癌、肾细胞癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、未分化癌和白血病。
所测得的所述第一种和第二种细胞表达丝氨酸棕榈酰转移酶的水平差异也可以用来检测或诊断包括但不限于再狭窄在内的血管损伤的存在。
所测得的所述第一种和第二种细胞表达丝氨酸棕榈酰转移酶的水平差异还用来检测或诊断包括但不限于由以下疾病引起的炎症在内的炎症的存在溃疡性结肠炎、炎性肠综合征、节段性回肠炎、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、中风或哮喘。
在另一个实施方案中，本发明的方法提供一种用于对组织进行体内成象的方法，所述方法包括(a)给予哺乳动物一种丝氨酸棕榈酰转移酶特异性化合物，其中所述化合物包含一个可检测标记，并且其中所述化合物与过度增殖性地表达丝氨酸棕榈酰转移酶的哺乳动物细胞结合；且(b)通过对所述可检测标记进行成象，确定在所述哺乳动物组织内的细胞位置。
在再一个实施方案中，本发明提供一种用于筛选抑制丝氨酸棕榈酰转移酶的治疗上有效的化合物的方法，所述方法包括(a)使丝氨酸棕榈酰转移酶特异性化合物与过度增殖性地表达丝氨酸棕榈酰转移酶的第一种哺乳动物细胞接触，以形成第一种大量的化合物-丝氨酸棕榈酰转移酶复合物；(b)使一种潜在的丝氨酸棕榈酰转移酶抑制剂化合物与过度增殖性地表达丝氨酸棕榈酰转移酶的第二种哺乳动物细胞接触，以形成第二种大量的化合物-丝氨酸棕榈酰转移酶复合物；(c)通过检测所述第一种和第二种大量的化合物-丝氨酸棕榈酰转移酶复合物的存在，测定由所述第一种和第二种细胞表达的丝氨酸棕榈酰转移酶水平；且(d)测量所述第一种和第二种细胞表达的丝氨酸棕榈酰转移酶水平差异，以确定所述潜在抑制剂化合物是否抑制丝氨酸棕榈酰转移酶表达。
本发明包括的丝氨酸棕榈酰转移酶特异性化合物包括但不限于与丝氨酸棕榈酰转移酶结合的化合物、与丝氨酸棕榈酰转移酶结合的单特异性抗体或与丝氨酸棕榈酰转移酶mRNA杂交的核酸。
表达丝氨酸棕榈酰转移酶的哺乳动物细胞包括但不限于肾上腺细胞、脑细胞、乳腺细胞、结肠细胞、上皮细胞、内皮细胞、心脏细胞、免疫细胞、肾细胞、肝细胞、肺细胞、卵巢细胞、胰腺细胞、前列腺细胞、皮肤细胞、脾细胞、胃细胞、睾丸细胞、甲状腺细胞、子宫细胞或血管细胞。优选的表达丝氨酸棕榈酰转移酶的上皮细胞包括但不限于内皮细胞、非神经胶质神经元细胞、结肠细胞、乳腺细胞、肾近端小管细胞、前列腺平滑肌、子宫平滑肌或睾丸平滑肌。优选的表达丝氨酸棕榈酰转移酶的免疫细胞包括多形核白细胞(PMN)、单核细胞、巨噬细胞、上皮样细胞、巨细胞、小神经胶质细胞、枯否氏细胞或尘细胞。
以基础水平表达丝氨酸棕榈酰转移酶的哺乳动物细胞包括但不限于肾上腺细胞(皮质、髓质(嗜铬性))、脑细胞(神经元、星形胶质细胞、少突细胞或浦肯野细胞)、乳腺细胞(上皮)、结肠细胞(上皮、粘膜巨噬细胞或平滑肌)、上皮细胞、内皮细胞、心脏细胞(心肌细胞或肌内膜)、免疫细胞、肾细胞(肾小球内皮细胞或上皮(远端小管或近端小管))、肝细胞(肝细胞或内皮)、肺细胞(上皮、内皮或巨噬细胞(尘细胞))、卵巢细胞(上皮、皮层基质或肌成纤维细胞)、胰细胞(胰岛或腺泡细胞)、前列腺细胞(上皮或平滑肌)、皮肤细胞(表皮或真皮)、脾细胞(窦样内皮、淋巴细胞、巨噬细胞或PMN)、胃细胞(上皮、粘膜巨噬细胞或平滑肌)、睾丸细胞(生精上皮、支持细胞或莱迪希氏细胞)、甲状腺细胞(上皮)、子宫细胞(上皮或子宫肌膜)或血管细胞(内皮或平滑肌)。
过度增殖性地表达丝氨酸棕榈酰转移酶的哺乳动物细胞包括但不限于上皮细胞、内皮细胞、癌细胞(选自乳腺癌、结肠癌、类癌瘤、胃癌、神经胶质瘤、肝细胞瘤、平滑肌肉瘤、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑素瘤、间皮瘤、骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、甲状腺癌、肾细胞癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、未分化癌或白血病)、免疫细胞或肿瘤微环境内的细胞。
本发明方法的再一实施方案包括一种用于治疗其需要患者的丝氨酸棕榈酰转移酶介导性疾病的方法，所述方法包括将治疗有效量的一种丝氨酸棕榈酰转移酶抑制剂化合物的药用制剂给予所述患者；其中任选所述丝氨酸棕榈酰转移酶抑制剂化合物有细胞毒性。优选的丝氨酸棕榈酰转移酶抑制剂化合物包括但不限于丝氨酸棕榈酰转移酶特异性化合物。在本发明该方面的一个优选实施方案中，将所述药用制剂涂在气囊导管或支架上并让其以时间依赖性方式释放。
附图简述

图1显示免疫印迹分析的结果，用于评价针对人SPT1和SPT2产生的肽特异性多克隆抗体的特异性。
图2显示正常人脑组织中的SPT表达(放大600倍)。
图3显示正常人结肠组织中的SPT表达(放大600倍)。
图4显示正常人肾上腺组织中的SPT表达(放大600倍)。
图5显示正常人肾脏组织中的SPT表达(放大600倍)。
图6显示正常人子宫组织中的SPT表达(放大600倍)。
图7显示SPT1和SPT2分别与正常人结肠组织中的拓扑异构酶的共表达(放大600倍)。
图8显示分会合成纤维细胞中的SPT1和SPT2表达(放大300倍，图8A和图8B；放大600倍，图8C和图8D)。
图9显示休眠成纤维细胞和创伤成纤维细胞中的SPT1和SPT2表达(放大300倍，图9A-9F；放大600倍，图9G-9L)。
图10显示成纤维细胞的双重染色(IF:IF)(放大1500倍)。
图11显示人类肿瘤细胞系中的SPT表达(放大900倍)。
图12显示人类恶性结肠癌组织、未分化癌组织、甲状腺癌组织和肉瘤组织中的SPT表达(放大600倍)。
图13显示14天内的大鼠气囊血管成形术模型血管损伤的表征。
图14显示血管成形术后1天、3天、7天和3个月的血管损伤反应的时程。
图15显示肌成纤维细胞在对所述血管成形术应答时在血管外膜和基质重建模时的去分化和增殖。
图16显示炎性结肠中的活化巨噬细胞和嗜中性粒细胞浸润。
图17显示从头鞘脂合成途径。
发明详述如上所述，以基础水平表达丝氨酸棕榈酰转移酶的哺乳动物细胞包括但不限于肾上腺细胞(髓质(嗜铬性))、脑细胞(神经元或浦肯野细胞)、乳腺细胞(上皮)、结肠细胞(上皮、粘膜巨噬细胞或平滑肌)、上皮细胞、内皮细胞、心脏细胞(肌内膜)、免疫细胞、肾细胞(肾小球内皮细胞或上皮(近端小管))、肝细胞(内皮)、肺细胞(上皮、内皮或巨噬细胞(尘细胞))、卵巢细胞(皮层基质或肌成纤维细胞)、胰细胞(腺泡细胞)、前列腺细胞(上皮或平滑肌)、皮肤细胞(表皮)、脾细胞(窦样内皮、巨噬细胞或PMN)、胃细胞(上皮、粘膜巨噬细胞或平滑肌)、睾丸细胞(生精上皮、支持细胞或莱迪希氏细胞)、甲状腺细胞(上皮)、子宫细胞(上皮或子宫肌膜)或血管细胞(内皮或平滑肌)。
以基础水平表达丝氨酸棕榈酰转移酶的优选哺乳动物细胞包括肾上腺细胞(髓质(嗜铬性))、脑细胞(神经元或浦肯野细胞)、乳腺细胞(上皮)、结肠细胞(上皮、粘膜巨噬细胞或平滑肌)、上皮细胞、内皮细胞、免疫细胞、肾细胞(肾小球内皮细胞或上皮(近端小管))、肝细胞(内皮)、肺细胞(上皮、内皮或巨噬细胞(尘细胞))、卵巢细胞(皮层基质或肌成纤维细胞)、胰细胞(腺泡细胞)、前列腺细胞(上皮或平滑肌)、脾细胞(窦样内皮、巨噬细胞或PMN)、胃细胞(上皮、粘膜巨噬细胞或平滑肌)、睾丸细胞(莱迪希氏细胞)、甲状腺细胞(上皮)、子宫细胞(上皮或子宫肌膜)或血管细胞(内皮或平滑肌)。
以基础水平表达丝氨酸棕榈酰转移酶的更优选哺乳动物细胞包括肾上腺细胞(髓质(嗜铬性))、脑细胞(神经元)、结肠细胞(粘膜巨噬细胞)、上皮细胞、内皮细胞、免疫细胞、肾细胞(上皮(近端小管))、肺细胞(巨噬细胞(尘细胞))、卵巢细胞(皮层基质)、脾细胞(窦样内皮)或胃细胞(上皮或粘膜巨噬细胞)。
再如上所述，过度增殖性地表达丝氨酸棕榈酰转移酶的哺乳动物细胞包括但不限于上皮细胞、内皮细胞、癌细胞(选自乳腺癌、结肠癌、类癌瘤、胃癌、平滑肌肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、甲状腺癌、肾细胞癌、肉瘤、未分化癌或白血病)、免疫细胞或肿瘤微环境内的细胞。
过度增殖性地表达丝氨酸棕榈酰转移酶的优选哺乳动物细胞包括上皮细胞、内皮细胞、癌细胞(选自乳腺癌、结肠癌、胃癌、平滑肌肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、甲状腺癌、肾细胞癌、肉瘤、未分化癌或白血病)、免疫细胞或肿瘤微环境内的细胞。
过度增殖性地表达丝氨酸棕榈酰转移酶的更优选哺乳动物细胞包括上皮细胞、内皮细胞、癌细胞(选自乳腺癌、结肠癌、平滑肌肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、甲状腺癌、肉瘤或未分化癌)、免疫细胞或肿瘤微环境内的细胞。
特别优选的过度增殖性地表达丝氨酸棕榈酰转移酶的上皮细胞包括内皮细胞、非神经胶质神经元细胞、结肠细胞、乳腺细胞、肾近端小管细胞、前列腺平滑肌、子宫平滑肌或睾丸平滑肌。
关于过度增殖性地表达丝氨酸棕榈酰转移酶的免疫细胞，优选的细胞包括PMN、单核细胞、巨噬细胞、上皮样细胞、巨细胞、小神经胶质细胞、枯否氏细胞或尘细胞。
优选的过度增殖性地表达丝氨酸棕榈酰转移酶的肿瘤微环境内的细胞包括基质成纤维细胞、基质单核细胞或肌成纤维细胞。
如上所述，优选的丝氨酸棕榈酰转移酶特异性化合物包括任选用细胞毒性剂标记的单特异性抗体或任选与丝氨酸棕榈酰转移酶mRNA杂交的核酸。
本发明首次提供所述丝氨酸棕榈酰转移酶在某些组织疾病状态下被正调节的证据。具体地说，构成SPT酶的SPT1(一种登记号为NP006406的多肽)和SPT2(或者称为ICB2，一种登记号为NP004854的多肽)两种蛋白亚基在发生细胞过度增殖的疾病状态下被正调节或者在非调节性过量表达SPT1或SPT2的细胞中被正调节(因而进一步使细胞过度增殖)。
因此，检测细胞中SPT1或SPT2的存在并测量SPT1或SPT2的量或者检测体内SPT1或SPT2的存在提供一种用于诊断或监测疾病状态的方法，所述疾病状态包括但不限于癌症和肿瘤转移、炎症或血管损伤(如再狭窄)。因此，抑制SPT1或SPT2的正调节或非调节性过量表达提供一种用于治疗由SPT1或SPT2表达介导的疾病状态的方法。
在所述癌症相关疾病中的许多疾病的特征为丝氨酸棕榈酰转移酶的过量表达，如在过度增殖性上皮细胞、过度增殖性间充质细胞、某些免疫细胞或肿瘤微环境细胞中。
其中SPT1和/或SPT2以高于正常细胞中的量表达的特定过度增殖性上皮细胞包括但不限于内皮细胞、非神经胶质神经元细胞、结肠细胞、乳腺细胞、肾近端小管或前列腺、子宫或睾丸的平滑肌。
其中SPT1和/或SPT2以高于正常细胞中的量表达的特定过度增殖性间充质细胞包括但不限于肉瘤癌细胞。
表达升高量的丝氨酸棕榈酰转移酶的特定免疫细胞包括但不限于PMN、单核细胞、巨噬细胞和特化巨噬细胞例如上皮样细胞、巨细胞、小神经胶质细胞、枯否氏细胞或尘细胞。
其它非常接近过度增殖性地表达丝氨酸棕榈酰转移酶的转移性肿瘤微环境内的细胞包括但不限于基质成纤维细胞、基质单核细胞或肌成纤维细胞。
使用本发明描述的方法或者通过本领域熟知的其它方法，可以检测其它过度增殖性地表达SPT1和/或SPT2的过度增殖性上皮细胞、间充质细胞(meschymal)或免疫细胞。
术语“细胞”是指适合于所述检测方法灵敏度的至少一种细胞，但包括多种细胞或某部分细胞。适合于本发明的细胞可以作为分离的、纯化的细胞群体存在或者作为机体构造组织活组织检查的一部分存在。细胞部分可以是独立部分，例如活组织检查的组织切片细胞部分。
本文所用的术语“正调节”或“过度增殖性地表达”是指，与参比样品相比，在靶组织中可以检测到较高量的SPT1或SPT2基因产物。本文所用的“参比样品”是指证明无可检测疾病的样品，可以包括例如得自组织档案的保藏的组织切片。具体地说，参比样品可以是档案样品，其中SPT的量用来确定疾病状态的进程。样品可以是含有丝氨酸棕榈酰转移酶的单个细胞或细胞碎片，或者样品可以是较大组成的组分，例如活组织检查的组织切片，其中目标细胞可能属于不同细胞类型视野中的一种或多种细胞亚型。
短语“丝氨酸棕榈酰转移酶特异性化合物”是指例如与丝氨酸棕榈酰转移酶结合的亲和力是与其它蛋白质或核酸结合的亲和力的20倍或20倍以上的合成或天然氨基酸多肽、蛋白质、合成有机小分子或脱氧核糖核酸或核糖核酸序列。例如但不限于针对所述丝氨酸棕榈酰转移酶蛋白或其肽片段产生的多克隆抗体或单克隆抗体(包括经典或噬菌体展示抗体)或者与丝氨酸棕榈酰转移酶mRNA杂交的核酸适合用于本发明。
对于本发明实施方案的蛋白质测量和体内成象，化合物可以是通过直接检测方法或者是通过间接检测方法例如通过第二标记化合物检测的标记化合物。对于涉及治疗SPT介导疾病的方法，所述SPT特异性化合物可以是抑制剂、反义核苷酸或用细胞毒性剂标记的化合物。小分子抑制剂是已知的并且一般基于与丝氨酸或鞘氨醇的结构同源性。
丝氨酸棕榈酰转移酶抑制剂化合物的实例包括但不限于多球壳菌素(CAS注册号为35891-70-4)、3-氯-D-丙氨酸(CAS注册号为39217-38-4)、L-环丝氨酸(CAS注册号为339-72-0)和D-丝氨酸(312-84-5)。用测量丝氨酸棕榈酰转移酶酶活性的方法发现了多种新型抑制剂。用细胞毒性剂标记的化合物包括例如用细胞毒性剂标记且与丝氨酸棕榈酰转移酶有免疫学反应的抗体。用细胞毒性剂标记抗体的方法是本领域众所周知的。
短语“标记化合物”是指能够测量的部分，包括放射性原子、酶、荧光分子或替代标记例如生物素。用本领域众所周知的技术，将蛋白质、肽、糖和核酸与可检测标记缀合，描述于例如G.T.Hermanson的Bioconjugate Techniques，Academic Press出版社，1996。在本发明中可用作标记的具体放射性同位素是3H、125I、131I、35S、32P、33P、212-Bi、90Y、88Y、99Tc、67Cu、18Re、186Re、66Ga、67Ga、111In、114mIn、115In或10B及本领域已知的其它放射性同位素。通过本领域技术人员已知的常规方法，例如酪氨酸残基的碘化、丝氨酸或苏氨酸残基的磷酸化或者利用放射性氨基酸前体加入氚、碳或硫，可以在多肽中引入放射性同位素。利用在多肽上交联金属螯合部分的双功能螯合剂引入其它放射性原子。适合用于本发明的酶的具体实例是辣根过氧化物酶、碱基磷酸酶或荧光素酶。可检测标记的优选实例是切割底物以产生显色产物或发光产物的酶。可用于本发明方法的荧光分子的具体实例包括但不限于香豆素、呫吨染料诸如荧光素、对甲氨基酚和罗丹明、试卤灵、花青染料bimanes、吖啶、异吲哚、丹酰染料、氨基邻苯二甲酰肼诸如鲁米诺和异鲁米诺衍生物、氨基邻苯二甲酰亚胺、氨基萘二甲酰亚胺、氨基苯并呋喃、氨基喹啉、dicanohydroquinones以及铕和铽络合物和相关化合物。通过观察放射性原子或荧光(flourogenic)分子的存在，或者通过观察显色底物或发光底物的酶活性，进行直接测量。通过将包括标记在内的额外化合物加入到试验样品中以便其可以与结合所述试验样品的化合物相互作用，进行间接测量。众所周知的实例是当所述标记化合物包含生物素而第二化合物包含抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白和可检测标记时。众所周知第二个实例是当第一抗体用来与所述丝氨酸棕榈酰转移酶蛋白结合并且用包含一种可检测标记的第二抗抗体进行检测。
本发明的一个实施方案涉及用于测量细胞过度增殖性地表达的SPT1或SPT2的方法，所述方法包括使所述细胞与一种丝氨酸棕榈酰转移酶特异性化合物接触，并且测量或检测作为所述SPT结合化合物的结果形成的丝氨酸棕榈酰转移酶-化合物复合物。通过将所述细胞中丝氨酸棕榈酰转移酶的量的变化与参比样品进行比较，可以进一步定义丝氨酸棕榈酰转移酶的检测方法。最好是采用本文描述的方法，SPT1或SPT2的表达可以用来确定组织是否含有在所述细胞中过度增殖性地表达SPT1或SPT2的细胞。在一个实施方案中，本发明的方法用来诊断癌症或转移性.肿瘤、监测肿瘤转移的预后和进程或者监测癌症或转移性肿瘤的任何干预或治疗的治疗功效。在其它实施方案中，本发明的方法用来诊断血管损伤(如再狭窄中)或炎症的存在或者监测再狭窄或炎症的任何干预或治疗的治疗功效。
本发明中描述的新方法描述了在各种病理生理状态下如何可以显现SPTI或SPT2蛋白的正调节。显现这种正调节的方法也可适用于SPT1或SPT2核酸，并且可以用本领域熟知的方法来进行，所述本领域熟知的方法包括但不限于标记核酸探针的杂交技术或定量RT-PCR。用本领域熟知的方法，包括但不限于亲和检测法、蛋白质印迹法、荧光流式细胞术方法或免疫组织学/免疫细胞学方法，可以进行显现SPT1或SPT2蛋白的其它方法。
一般而言，在这些技术中，目标蛋白用特异性探针进行标记并且通过在所述样品中掺入探针的程度进行检测。在流式细胞术中，分析溶液中的细胞，而在细胞成象技术中，比较细胞视野内的探针结合量。在一个总的来讲优选的实施方案中，将抗体作为探针使用并用可检测探针例如放射性原子或荧光分子进行标记。
本发明的另一个实施方案涉及通过体内成象检测SPT。因此，将一种经标记的丝氨酸棕榈酰转移酶特异性化合物给予哺乳动物，所述标记化合物与SPT1或SPT2结合并且测量所述标记化合物的位置，作为一种对过度增殖性细胞的位置进行成象的方法。
在本发明的一个具体实施方案中，用放射性原子标记抗体，用所述标记抗体测量体内SPT1或SPT2蛋白的存在，这是本领域众所周知的。采用该方法，通过自动放射技术或者采用将光子发射转换成听觉报告的装置通过听觉信号，对转移性肿瘤的存在和位置进行可视成象，如Martin等的美国专利4,782,840中所描述的。在另一个实施方案中，可以用吸收约300nm至约1300nm范围内的光的生色团标记探针(特别是抗体)，从而所述SPT1或SPT2可以用荧光检测进行成象。吸收300-1300nm范围内的光的生色团种类描述于Towler等的PCT申请PCT/GB98/02833。
本发明的另一方面涉及治疗因过度增殖性细胞中存在正调节的SPT而介导的疾病状态。疾病的治疗方法包括抑制SPT酶活性、降低所述细胞内SPT表达的量或者使所述过度增殖性细胞与一种细胞毒性丝氨酸棕榈酰转移酶化合物接触。在一个实施方案中，所述抑制剂是丝氨酸棕榈酰转移酶酶活性的一种小分子抑制剂。
在本发明的另一个实施方案中，限制或阻止转移性肿瘤的进程的方法包括给予一种降低丝氨酸棕榈酰转移酶表达的化合物。在一个具体实施方案中，用与或者SPT1 mRNA或者所述SPT2 mRNA杂交的反义核酸来降低所述丝氨酸棕榈酰转移酶的表达。
在另一个实施方案中，所述过度增殖性细胞用一种经标记的细胞毒性丝氨酸棕榈酰转移酶特异性化合物进行治疗。在一个具体实施方案中，用所述细胞毒性丝氨酸棕榈酰转移酶特异性化合物限制或阻止转移性肿瘤的进程。
最好将丝氨酸棕榈酰转移酶抑制剂和至少一种其它含有和不含铂的抗肿瘤药给予恶性肿瘤患者。例如但并不限制本发明，可以在一个给药方案中给予抗丝氨酸棕榈酰转移酶化合物和诸如DNA烷化剂的细胞毒性化合物或抗血管生成化合物。优选的抗肿瘤药选自克拉屈滨(2-氯-2′-脱氧-(β)-D-腺苷)、苯丁酸氮芥(4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸)、DTIC-Dome(5-(3，3-二甲基-1-三氮烯基)-咪唑-4-甲酰胺)、铂化疗药和非铂化疗药。含铂的抗肿瘤药包括但不限于顺铂(顺式-二氯双胺铂)。不含铂的抗肿瘤药包括但不限于环磷酰胺、氟尿嘧啶、表柔比星、甲氨蝶呤、长春新碱、多柔比星、博来霉素和依托泊苷。每种抗肿瘤药都以治疗有效量给予，这些是本领域众所周知的，并且根据所使用的药物、恶性肿瘤的类型和其它因素而变化。
在另一个实施方案中，将丝氨酸棕榈酰转移酶抑制剂涂在气囊导管或支架上致使其以定点和时间依赖性方式释放。这样的装置可用于通过抑制丝氨酸棕榈酰转移酶而防止再狭窄的出现，从而防止内皮的过度增殖。SPT介导的疾病的治疗方法包括将小分子治疗药或抑制剂化合物直接或间接传递或“接种”到其中细胞过度增殖出现时SPT表达被正调节的疾病状态的组织或非调节性过量表达SPT的细胞中。
本发明的药用组合物按照常规制药技术来制备。在本发明的组合物中可以使用药学上可接受的载体。所述组合物可以采用多种多样的形式，这取决于给药所需的制剂形式，包括但不限于静脉内(快速注射和输注)给药、口服给药、经鼻给药、透皮给药、闭合或不闭合的局部给药、腹膜内给药、皮下给药、肌内给药或胃肠外给药，所有使用形式是药学领域技术人员众所周知的。在制备口服给药形式的组合物时，可以使用常用的药用载体中的一种或多种，例如就口服液体制剂(例如混悬剂、酏剂和溶液剂)而言为水、二醇类、油、醇类、矫味剂、防腐剂、着色剂、糖浆等；或者例如就口服固体制剂(例如散剂、胶囊剂和片剂)而言为淀粉、糖、稀释剂、制粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等载体。
另一方面，所述丝氨酸棕榈酰转移酶抑制性化合物可以通过注射由溶于惰性液体载体中的有效成分组成的制剂而胃肠外给予。所述注射用制剂可以包括与合适的惰性液体载体混合的有效成分。可接受的液体载体包括植物油，例如花生油、棉籽油、芝麻油等；以及有机溶剂，例如solketal、甘油甲缩醛等。作为一个替代方案，也可以使用水性胃肠外制剂。例如，可接受的水性溶性包括水、Ringer氏溶液和等渗水性盐溶液。此外，通常可以使用无菌非挥发性油作为所述水性制剂中的溶剂或悬浮剂。所述制剂通过将所述有效成分溶于或悬浮于所述液体载体中来制备，使所述终制剂含有0.005-10％(重量)有效成分。适当时可以使用其它添加剂，包括防腐剂、等渗剂、增溶剂、稳定剂和镇痛剂。
本发明的方法中所使用的化合物也可以以脂质体递药系统的形式给予，所述脂质体递药系统例如小单层脂质体、大单层脂质体和多层脂质体。本领域众所周知的含脂质体的递药系统用各种各样的磷脂例如胆固醇、硬脂酰胺或磷脂酰胆碱来制备。
本文所用的本发明药用组合物或其中的化合物的“治疗有效量”，是指抑制所述丝氨酸棕榈酰转移酶活性的功能的量。本发明的药用组合物一般每剂量单位(例如一片、一粒胶囊、一包散剂、一个注射剂、一茶匙等)含有约0.001mg/kg至约100mg/kg。在一个实施方案中，本发明的药用组合物每剂量单位含有约0.01mg/kg至约50mg/kg化合物，优选含有约0.05mg/kg至约20mg/kg。用于确定本发明药用组合物的治疗有效量的方法是本领域已知的。将所述药用组合物给予人类的有效量例如可以根据动物研究的结果用数学方法确定。此外，可以通过局部应用合适的鼻内载体或者通过透皮途径，采用本领域技术人员熟知的那些透皮贴剂形式，以鼻内形式给予本发明的化合物。为了以透皮递药系统的形式给药，整个给药方案中，给药当然将是连续的而不是间歇性的。
生物学实施例以下实施例说明本发明，然而并不是用来限制本发明的范围。
实施例1细胞标识抗体抗体生产运用通过Hopp/Woods的算法预测的抗原肽序列，产生抗所述SPT亚基的兔多克隆抗体。针对人SPT1亚基(登记号为Y08685)的抗体生产所用的肽是SEQ.ID.NO.1(KLQERSDLTVKEKEEC，对应于残基45-59)；和SEQ.ID.NO.2(KEQEIEDQKNPRKARC，对应于残基222-236)。作为人SPT2亚基(登记号为Y08686)的抗原使用的肽是SEQ.ID.NO.3(CGKYSRHRLVPLLDRPF，对应于残基538-552)；和SEQ.ID.NO.4(CGDRPFDETTYEETED，对应于残基549-561)。
将一个半胱氨酸和一个甘氨酸加入到这些肽的氨基末端，可供用于KLH缀合并且减少进行偶联时的位阻。分别针对每种SPT亚基的肽产生兔多克隆抗体。合并所得的免疫血清，将混合的多克隆抗血清用作针对所述特异性SPT亚基的抗体源。使用2μg/mL IgG部分。
抗体表征通过免疫印迹分析，评价所述兔抗SPT1多克隆抗体或兔抗SPT2多克隆抗体的特异性。制备HEK 293细胞的微粒体膜。50微克微粒体膜蛋白在SDS-聚丙烯酰胺凝胶的4条泳道的每条泳道中进行分级分离。在转移到硝化纤维素膜后，所述膜用如上所述制备的以1∶1000稀释的肽特异性多克隆抗体探测。用碱性磷酸酶缀合的山羊抗兔IgG(Santa Cruz)检测结合的抗体。
图1表明所述抗体识别HEK293微粒体膜制备物中预测分子量的SPT1和SPT2蛋白并且不与所述制备物中所含有的其它蛋白反应。
在正常人体组织中使用表1中所示的抗波形蛋白的初次单克隆抗体和多克隆抗体，来证明组织的抗原性和试剂质量。阴性对照包括用同一种IgG同种型非免疫血清取代所述初次抗体。
表1名称 类型 效价 销售商非免疫血清多克隆抗体，IgG 2.0μg/mlVector Labs，CA非免疫血清单克隆抗体，IgM 2.5μg/mlVector Labs，CA免疫前血清多克隆抗体，IgG 2.0μg/mlRWJPRI，NJSPT1 多克隆抗体，IgG 2.0μg/mlRWJPRI，NJSPT2 多克隆抗体，IgG 2.0μg/mlRWJPRI，NJ平滑肌肌动蛋白单克隆抗体，IgM 2.0μg/mlDako，CA波形蛋白 单克隆抗体，IgM 2.0μg/mlDako，CA在过度增殖性人体组织中使用表2中所示的抗波形蛋白的初次单克隆抗体和多克隆抗体，来证明组织的抗原性和试剂质量。阴性对照包括用同一种IgG同种型非免疫血清取代所述初次抗体。另外，作为另一阴性对照，所述抗体用其10倍效价过量的抗原中的特异性抗原预吸附过夜。
表2名称 类型效价 销售商拓扑异构酶IIα单克隆抗体，IgM 1.0μg/mL Pharmingen，CA巨噬细胞(CD68) 单克隆抗体，IgM 1.0μg/mL Dako，CA免疫前血清(SPT-1)多克隆抗体，IgG 2.0μg/mL RWJPRI，NJ免疫前血清(SPT-2)单克隆抗体，IgM 1.0μg/mL RWJPRI，NJSPT-1多克隆抗体，IgG 2.0μg/mL RWJPRI，NJSPT-2多克隆抗体，IgG 1.0μg/mL RWJPRI，NJ平滑肌肌动蛋白 单克隆抗体，IgM 2.0μg/mL Dako，CA波形蛋白 单克隆抗体，IgM 2.0μg/mL Dako，CA实施例2正常人体组织的免疫组织化学(IHC)市售的人正常和肿瘤棋盘组织玻片(Dako，Carpenteria，CA；Biomeda，Foster City，CA)进行脱蜡、水合和加工，供常规IHC用。简而言之，玻片在Target(Dako)中经微波处理，冷却，先置于磷酸缓冲盐溶液(pH 7.4，PBS)中，然后置于3.0％H2O2中。通过抗生物素蛋白-生物素封闭系统，按照生产商的说明(Vector Labs，Burlingame，CA)，对玻片进行处理，然后将其置于PBS中。所有试剂的保温和洗涤都在室温下进行。让正常封闭血清(Vector Labs)在所有玻片上保留10分钟。在PBS中进行简单地冲洗后，让初次抗体(表1)在各玻片上保留30分钟。洗涤所述玻片，让生物素化第二抗体山羊抗兔(多克隆抗体)或马抗小鼠抗体(单克隆抗体)在所述组织切片上保留30分钟(Vector Labs)。在PBS中冲洗后，加入抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶-生物素复合物试剂(ABC，Vector Labs)达30分钟。洗涤玻片，用色素原3，3′-二氨基联苯胺(DAB，Biomeda)处理，在蒸馏水中冲洗，然后用苏木精进行复染。
双重免疫组织化学标记(IHC:IHC)同时双重免疫组织化学标记(IHC:IHC)方案先前已经发表并且与单免疫组织化学标记所述的方案相似，只是玻片在第一抗原检测方案的第二个色素原步骤之后不进行复染。而是将玻片置于PBS中。
通过碱性磷酸酶-固红(Vector Labs，CA；Dako，CA)系统检测第二抗原。将初次抗体在室温下在所述玻片上保留30分钟。在简单洗涤后，在室温下加入第二生物素化抗体达30分钟。然后将所述玻片在PBS中洗涤，然后将所述链霉抗生物素蛋白-碱性磷酸酶(Vector Labs，CA)试剂在室温下在所述玻片上保留30分钟。洗涤后，将所述固红色素原(Dako，CA)在所述玻片上保留2次5分钟。接下来，所述玻片在苏木精中进行常规复染，洗涤，然后在基于水的封固剂(Dako，CA)中覆盖，以便在BX-50 Olympus光学显微镜下观测。
进行多个对照，以确保所述玻片上的标记得到恰当解释。初次抗体用正确种同种型取代，以控制所述检测系统。就另一组对照而言，省去第一初次抗体而对第二初次抗体进行加工，反之亦然。
SPT1抗体和SPT2抗体的特异性产生对两种人SPT亚基特异性的兔多克隆抗体，并且在图1所示的免疫印迹中证明所述抗体的特异性。
50微克HEK 293微粒体膜蛋白在SDS-聚丙烯酰胺凝胶的4条泳道上进行分级分离。在将所述蛋白转移到硝化纤维素膜后，切下这4条泳道，分别用以1∶1000稀释的来自以下的G蛋白纯化抗体探测SPT1免疫前血清(Pre SPT1)、SPT1抗血清(SPT1)、SPT2免疫前血清(Pre SPT2)或SPT2抗血清(SPT2)。用1∶2000稀释的碱性磷酸酶缀合的山羊抗兔IgG检测结合的抗体。图1显示一条预期分子量的SPT1(55kD)和SPT2(65kD)条带。
从野生型HEK细胞获得的微粒体膜部分通过SDS-PAGE分离，蛋白质印迹或者用免疫前血清或者用SPT特异性多克隆抗体探测。观察到预期分子量的单免疫反应性条带，准确地说，对于SPT1而言Mr～55kDa(第3泳道)，而对于SPT2而言Mr～65kDa(第5泳道)；用免疫前血清没有观察到非特异性结合(第2泳道和第4泳道)。
SPT1和SPT2的组织分布用IHC获得正常人体组织中SPT1和SPT2蛋白表达的分析，SPT1和SPT2在人体组织中的分布示于表3中。表3没有反映出SPT1和SPT2免疫标记之间观察到的差异。
福尔马林固定的、石蜡包埋的组织以多组织形式使用，以消除潜在的染色人为因素，例如玻片间及操作间的变异性。表1列举了除实验抗体以外的阳性对照和阴性对照。阳性标记由褐色染色强度限定，并且依照以下标准评价1)无免疫反应性评价为阴性(N)；2)浅褐色免疫反应性评价为弱(W)；3)褐色免疫反应性评价为中度(M)；而4)深褐色免疫反应性评价为强(S)。阴性对照不产生可观察标记。正常人体组织中100倍视野内SPT1和SPT2的标记细胞数为n＝2-10)；阴性(N)没有标记细胞；弱(W)有1-10个标记细胞；中度(M)有11-20个标记细胞；强(S)有大于20个标记细胞。
表3组织 细胞类型SPT1 SPT2肾上腺皮质NN髓质(嗜铬性细胞)SS脑神经元 SS星形胶质细胞NN
少突细胞NN浦肯野细胞 MM乳腺 上皮MM结肠 上皮MM粘膜巨噬细胞SS平滑肌 MM心脏 心肌细胞NN肌内膜 WW肾脏 肾小球内皮细胞 MM上皮远端小管 NN上皮近端小管 SS肝脏 肝细胞 NN内皮MM肺上皮MM内皮MM巨噬细胞(尘细胞)SS卵巢 上皮NN皮层基质SS肌成纤维细胞MM胰腺 胰岛NN腺泡细胞MM前列腺上皮MM平滑肌 MM皮肤 表皮WW真皮NN脾脏 窦样内皮SS淋巴细胞NN巨噬细胞、PMN MM
胃上皮SS粘膜巨噬细胞SS平滑肌 MM睾丸 生精上皮WW支持细胞WW莱迪希氏细胞MM甲状腺上皮MM子宫 上皮MM子宫肌膜MM血管 内皮MM平滑肌 MM一般而言，位于人体组织中的血管内皮细胞和平滑肌细胞对SPT1和SPT2的免疫阳性为中度。除所述卵巢上皮之外，所有被测组织中的上皮细胞对SPT1和SPT2的免疫阳性为中度至强。另外，来自结肠、肺和胃的粘膜巨噬细胞对SPT1和SPT2的免疫阳性为强。在脾脏中，除所述巨噬细胞外，观察到所述淋巴细胞中的多形核细胞(PMN)对SPT1和SPT2的染色均为阳性，便没有观察到反应性。结肠、肺、前列腺、胃、甲状腺、子宫和血管组织对SPT1和SPT2的免疫阳性为中度至强。然而，在皮肤和心脏组织中，SPT1和SPT2弱存在或者完全不可检测。
图2-7表示通过免疫组织化学测试SPT1和SPT2表达的某些正常人体组织。
图2显示分别用免疫前血清(图2A)、SPT1特异性抗体(图2B)和SPT2特异性抗体(图2C)免疫标记的正常大脑。在大脑皮质中，锥形神经元对于SPT1和SPT2显示阳性胞内免疫反应性。SPT1和SPT2均位于神经元胞质内并且两个亚基的表达水平似乎相似。人小脑中发现的浦肯野细胞对SPT1和SPT2的免疫阳性为中度(数据未显示)。相反，SPT1和SPT2在其它神经元细胞类型例如星形胶质细胞、小神经胶质和少突胶质细胞中不可检测。
图3显示分别用免疫前血清(图3A)、SPT1抗体(图3B)和SPT2抗体(图3C)免疫标记的正常人大肠。上皮细胞(小箭头)和巨噬细胞(大箭头)对SPT1(图3B)和SPT2(图3C)的胞内免疫反应性为阳性。同在神经元中一样，SPT1和SPT2的表达主要为胞质性的。与SPT2在上皮细胞中的中度表达相比，粘膜巨噬细胞表现出对SPT2的免疫反应性强得多。在用免疫前血清染色时在任何细胞类型中都没有观察到免疫反应性(3A)。SPT在结肠(图3A和图3B)和胃的粘膜巨噬细胞及尘细胞(肺泡巨噬细胞)中的高表达(表3)可能是由于这些巨噬细胞与易暴露于环境并因此可能被激活的组织相关的事实。
图4显示分别用免疫前血清(图4A)或者SPT1特异性抗体(图4B)和SPT2特异性抗体(图4C)免疫标记的正常人肾上腺。肾上腺髓质的嗜铬性细胞(大箭头)、血管平滑肌细胞(箭头)和内皮(小箭头)对SPT1和SPT2显示强阳性胞质免疫反应性。SPT1和SPT2表达在肾上腺皮质中不可检测。内皮和嗜铬性细胞中的SPT2表达比SPT1的表达高。另外，除胞质外，在嗜铬性细胞核中还可以清楚地观察到SPT2表达。可检测的SPT1或SPT2免疫标记在支持基质成纤维细胞中不存在。
图5显示用免疫前血清(图5A)、SPT1特异性抗体(图5B)和SPT2特异性抗体(图5C)免疫标记正常人肾。近端小管(箭头)对SPT1和SPT2显示阳性免疫反应性。SPT1代表不同于SPT2在相同细胞类型中的点状标记模式的近端小管上皮细胞中的弥散性胞内标记模式。SPT1表达在胞质中是弥散性的，而SPT2免疫染色点状更多，但总体较SPT1弱。用免疫前血清没有观察到免疫反应性。图5C显示位于内质网细胞溶胶一侧的SPT活性及SPT2表达在肾近端小管上皮中的点状出现，因此提示SPT2表达与内质网相关，图6显示分别用免疫前血清(图6A)或者SPT1特异性抗体(图6B)和SPT2特异性抗体(图6C)免疫标记的几种正常人子宫组织样品。子宫基质性平滑肌细胞(大箭头)和内皮(小箭头)对SPT1和SPT2显示阳性免疫反应性，在内皮细胞中SPT2表达较高(与SPT1相比)。用免疫前血清没有观察到免疫反应性。
本发明的方法表明SPT1和SPT2在下述细胞中被表达代谢活性细胞(例如在自主神经刺激时分泌肾上腺素和去甲肾上腺素的肾上腺嗜铬性细胞)和神经元和卵巢皮层基质细胞。由于在增殖性细胞类型例如胃、肺(数据未显示)、肾近端小管和结肠腔上皮中观察到SPT1和SPT2阳性标记，因此对人大肠进行双重免疫组织化学标记。
图7显示用抗拓扑异构酶IIα的抗体(红色)(一种细胞增殖和SPT1的标记)(图7A)和SPT2特异性抗体(褐色)(图7B)双重免疫组织化学标记人大肠。箭头显示红色和褐色标记细胞的共定位，表明SPT1和SPT2在增殖性上皮细胞(大箭头)中被表达。小箭头显示在巨噬细胞中存在SPT1(图7A)和SPT2(图7B)。
结果本发明的方法表征了丝氨酸棕榈酰转移酶亚基SPT1和SPT2在正常人体组织中的分布并且深入了解了SPT1和SPT2的相似性和可能的功能。在SPT1和SPT2表达时观察到的差异表明，SPT的定位和表达水平可能与细胞的生理状态相关。
代谢活性细胞和增殖性细胞表达高水平的SPT。同一组织内的相同细胞类型在SPT1和SPT2表达之间的差异提示，每个亚基一定有特异性、可能独立的功能，实现SPT活性。与酵母不同，鼠SPT2仅在人HEK293细胞中的过量表达导致SPT活性的相应增加，而仅SPT1不增加SPT活性(Weiss和Stofiel，1997)。除SPT1和SPT2外，人SPT也可能具有额外的组分，如酵母中的Tsc3p蛋白。另外，SPT2在细胞核中的定位可能表明，SPT2与其它核蛋白相关或者被修饰并且被转运到细胞核。因此，分析SPT1和SPT2表达的动力学差异将有助于阐明SPT活性。
正常细胞中SPT表达的知识可以用于测量增生性疾病例如癌症的异常细胞活性。SPT表达的绝对水平和酶活性的定位可能为细胞生理学发生改变的特征。在病理生理病症例如血管增生(D.J.Uhlinger、J.M.Carton、D.C.Argentieri、B.P.Damiano和M.R.D′Andrea，Increased Expression of Serine Palmitoyltransferase(SPT)in Balloon-injured Rat Carotid Artery(气囊损伤性大鼠颈动脉中丝氨酸棕榈酰转移酶(SPT)的表达增加)，Thromb.Haem.，2001，86，1320-6)、伤口愈合和肿瘤中观察到的SPT活性增加提示针对SPT的治疗潜力。在这些病症中抑制或降低SPT活性可能影响与所述病症相关的症状。在猪上皮肾细胞LLC-PK1中，串珠镰孢菌素诱导的细胞毒性和抗增殖效应在用SPT1特异性抑制剂如多球壳菌素治疗所述细胞后被降低。在同一研究中，将多球壳菌素腹膜内给予BALB/C小鼠，降低游离鞘氨醇累积，在肾脏中降低60％而没有明显的临床副作用。因此，SPT抑制剂例如多球壳菌素在治疗增生性疾病例如癌症中可能具有重要的治疗潜力并且可能影响与诸如炎症和血管损伤的病症相关的各种病理生理。
本发明的方法提供SPT1和SPT2表达在正常人体组织中的首次直接免疫定位和比较并且是针对阐明SPT活性在所述细胞中的复杂性的关键性步骤。了解这些组分在SPT活性中的作用在确定在各种疾病状态例如癌症和再狭窄中调节多种关键性的鞘脂介导的细胞功能和应答是必不可少的。
实施例3过度增殖性人体组织的免疫组织化学采用实施例2的IHC程序，利用IHC在福尔马林固定的、石蜡包埋的组织上定位SPT1和SPT2蛋白。正常人体组织和恶性人体组织同时以多组织形式进行分析，以消除染色人为因素，例如玻片间及操作间的易变性。
细胞培养人类新生儿皮肤成纤维细胞及其培养基得自Clonetics/Bio Whittaker(Walkersville，MD)。将细胞悬浮液(5×104/mL)接种到4孔分室玻片(NUNC，Naperville，IL)中，供免疫细胞化学用。为了模拟体外经分化的休眠成纤维细胞的体内活化，使用刮伤模型。简而言之，将细胞孵育2天(接近会合，增殖状态)、9天(过度会合，休眠状态)，或者将第9天休眠培养物用移液管管尖机械刮伤。为了评价创伤反应时的表达，将所述细胞在创伤后再培养5天。
免疫细胞化学(ICC)4室培养玻片用10％中性缓冲福尔马林在室温下固定10分钟，在PBS中冲洗，然后分析ICC。用含有tween-20(Research Genetics，Huntsville，AL)的自动装置缓冲液，进行所有洗涤步骤。
双重免疫组织化学(IHC:IHC)为了测定SPT是否在增殖性细胞中共定位，使用IHC:IHC同时检测SPT1或SPT2表达并且检测增殖标记即增殖性细胞核抗原(PCNA)。简而言之，如上所述，将玻片根据单IHC标记方案首先处理，以检测SPT-1或SPT-2。不用苏木精处理所述玻片，而将PCNA抗体(Pharminigen，San Diego，CA)在组织上保留30分钟。在用PBS洗涤数次后，将生物素化马抗小鼠第抗体(Vector Labs)进行相似地保温。用碱性磷酸酶检测系统，通过与碱性磷酸酶缀合的ABC(VectorLabs)一起保温，然后用固红色素原(Sigma)显色，显现PCNA阳性细胞的存在。然后玻片进行常规复染和固定。
表4表示SPT1和SPT2在各种各样的人恶性肿瘤组织中的免疫定位。阳性标记由呈现褐色染色限定，并且在18种不同人类肿瘤中、在放大100倍的视野中根据SPT1和SPT2的标记细胞数评价。5种癌(结肠癌、卵巢癌、胰腺癌、甲状腺癌、未分化癌)和2种肉瘤都证明这两种SPT亚基的强过量表达。阴性对照不产生可观察标记。在恶性人体组织中、在放大100倍的视野中SPT1和SPT2的标记细胞数为n＝2-10)；阴性(N)没有标记细胞；弱(W)有1-10个标记细胞；中度(M)有11-20个标记细胞；强(S)有大于20个标记细胞。
表4组织 SPT-1SPT-2乳腺癌NN结肠癌SS类癌瘤WW胃癌 MM平滑肌肉瘤SS肝癌 NN肺癌 NN淋巴瘤NN黑素瘤NN间皮瘤NN卵巢癌SS胰腺癌SS前列腺癌 NN甲状腺癌 SS肾细胞癌 NN横纹肌肉瘤NN肉瘤 SS未分化癌 SS图8-12表示通过免疫组织化学测试SPT1和SPT2表达的某些过度增殖性人体组织。
图8显示通过ICC免疫标记分会合人皮肤成纤维细胞，以观察SPT1和SPT2的细胞表达和定位。分别与阴性对照标记细胞(图8A)和PCNA标记细胞(图8B)相比，SPT1标记细胞(图8C)和SPT2标记细胞(图8D)的结果表明，SPT1和SPT2过量表达与增殖性成纤维细胞的细胞核相关。
图9显示分化的休眠成纤维细胞体外创伤模型的结果。用所述模型模拟体内组织活化，以进一步表征SPT在增殖性细胞中的表达。将休眠成纤维细胞培养物与经过机械刮伤并让其恢复5天(创伤状态)的汇合培养物进行比较。图9显示在第9天或第14天用阴性对照(图9A和图9B)和PCNA(图9D和图9E)抗体免疫标记的休眠培养物中通过ICC没有SPT标记。用SPT1抗体(图9G和图9H)和SPT2抗体(图9J和图9K)观察到浅弥散性标记。受伤14天的成纤维细胞(图9C、9F、9I和9L)对PCNA(图9F)、SPT1(图9I)和SPT2(图9L)显示强免疫标记。在SPT1和SPT2免疫标记细胞中最突出的观察结果是受伤14天的成纤维细胞(图9I和图9L)中致密核相关标记，这在第9天休眠细胞(图9G和图9J)和第14天休眠细胞(图9H和图9K)中却不存在。
图10显示用来显示PCNA(图10B和图10D)与增加的SPT1(图10A)和SPT2(图10C)表达相符的核双重染色(IF:IF)。箭头指示检测到PCNA的细胞。表达SPT的标记细胞与细胞核相关并且显示强SPT表达。箭头指示缺乏PCNA标记、具有弥散性SPT标记、显示与细胞核没有特异性关系的细胞。根据在核双重染色和体外创伤模型中观察到的表达模式，SPT表达似乎在增殖性细胞中增加，并且SPT1和SPT2的表达与细胞核相关。SPT1和SPT2在气囊损伤性大鼠颈动脉的去分化成纤维细胞和增殖性血管平滑肌细胞中的表达增加最近也有报道(Uhlinger DJ、Carton JM、Argentieri DC和Damiano BP，R.DAM Increased Expression of Serine Palmitoyltransferase(SPT)inBalloon-injured Rat Carotid Artery(气囊损伤性大鼠颈动脉中丝氨酸棕榈酰转移酶(SPT)的表达增加)，Thrombosis and Haemostasis，2001，861220-6)。
图11显示3个很好建立的癌细胞系Jurkat(图11A、图11B和图11C)、HT-29(图11D、图11E和图11F)和SH-SY 5Y(图11G、图11H和图11I)中的致密SPT免疫标记。在体外和体内创伤修复模型中观察到的SPT1和SPT2表达增加证明，创伤修复反应和肿瘤形成之间的平行关系。对于用ICC根据SPT1和SPT2的过量表达筛选的几种癌细胞系，表4所示的5种癌(结肠癌、卵巢癌、胰腺癌、甲状腺癌和未分化癌)和2种肉瘤的结果都证明这两种SPT亚基的强过量表达；其它肿瘤几乎不表达SPT1或SPT2或者SPT1或SPT2的水平不可检测。
图12显示用IHC和抗免疫前血清(图12A)、SPT1(图12B)和SPT2(图12C)的抗体处理的人恶性结肠癌组织。在所述恶性肿瘤细胞中观察到SPT1(小箭头)和SPT2(小箭头)的强胞内标记。另外，在靠近所述肿瘤的基质成纤维细胞(大箭头)中观察到免疫染色。人恶性未分化癌组织(图12D、图13E和图12F)用IHC和抗免疫前血清(图12D)、SPT1(图12E)和SPT2(图12F)的抗体进行处理。在与更弱的SPT2信号(图12F)相比，在未分化的人癌组织中似乎是一种强SPT1信号(箭头，图12E)。组织样品中信号强度的比较可能是相关的。由于通过两种SPT亚基(或者是催化亚基或者是调节亚基)发挥的酶活性作用仍不清楚，因此没有证据证明无论是增强的SPT1表达还是SPT1表达与SPT2表达之比对于细胞反应是关键性的。图12G、图12H和图12I显示用抗免疫前血清(图12G)、SPT1(图12H)和SPT2(图12I)的抗体处理的人恶性甲状腺癌组织。SPT特异性染色在大多数肿瘤细胞中出现。SPT1和SPT2信号(箭头)的强度在细胞间有所变化。某些恶性肿瘤细胞表达非常高水平的SPT亚基，表明在肿瘤细胞中可能需要所述亚基的各种表达水平。图12J、图12K和图12L显示人恶性肉瘤组织。SPT1和SPT2(箭头)在该恶性肿瘤中高丰度地表达。
这些结果表明，SPT在癌细胞中的过量表达并不限于来源于上皮细胞的那些癌细胞例如癌。来源于间充质细胞、诸如肉瘤的癌症也似乎增加SPT亚基的表达。
结果本发明研制的抗人SPT1和SPT2的抗体涉及一种用来观察这些酶亚基在正常人体组织中表达以及在气囊损伤性大鼠颈动脉血管平滑肌细胞和活化成纤维细胞和证明SPT1和SPT2在体外创伤模型中的表达增加的受伤的人皮肤成纤维细胞的增殖性细胞中升高的表达水平的方法，表明这两种SPT亚基的不同细胞正调节和强免疫染色标记。休眠非增殖性成纤维细胞仅显示全部细胞为浅的弥散性SPT1和SPT2染色。另外，显然显著量的增加的SPT1和SPT2免疫标记与细胞核相关。SPT的核定位涉及鞘脂核信号转导(例如对于有丝分裂发生而言)也是可能的。观察到鞘氨醇激酶转运到用PDGF处理的成纤维细胞的细胞核，支持鞘脂参与增殖细胞和转化细胞核信号转导的假说。
本发明的方法涉及一种用于比较正常人体组织和过度增殖性人体组织中的SPT表达的方法并且支持越来越多的报道，即参与细胞创伤修复反应的某些关键分子也参与肿瘤的生长和转移。
SPT亚基在几个已很好建立的人肿瘤细胞系(包括淋巴瘤、腺癌和成神经细胞瘤)中高丰度地表达。本发明的方法提供了SPT1和SPT2在恶性癌细胞以及形成肿瘤微环境的细胞类型例如反应性基质成纤维细胞和局限性巨噬细胞中表达增加的形态学证据。在相似的正常组织的基质成纤维细胞没有检测到SPT1和SPT2。SPT亚基在这些细胞类型中升高的水平提示SPT在细胞转移活性和增殖中的作用。
也观察到SPT在参与炎症反应的活化白细胞中表达增加(2)。已经证明SPT在人巨噬细胞中的正调节增加通过鞘脂生物合成途径的流入。SPT在人恶性肿瘤中的表达增加可以为通过在经历肿瘤转化的细胞和周围微环境的细胞中发生的鞘脂生物合成途径调节流入的特征。鞘脂涉及增殖和转移过程。细胞表面各种鞘糖脂表达的变化与获得并保持癌症表型、肿瘤进程和转移相关。
本发明的方法也首次提供SPT1和SPT2蛋白在人恶性肿瘤细胞、局限性巨噬细胞和肿瘤细胞周围的“反应性”基质成纤维细胞中表达的原位组织学比较。升高的SPT水平提示，肿瘤以及形成肿瘤微环境(TME)的细胞类型内某些异常细胞活性的可能机制。SPT亚基在增殖性成纤维细胞的亚细胞定位从弥散性胞质质至核相关性所观察到的变化提示该酶的功能作用。另外，SPT水平和细胞定位可能与特殊的肿瘤类型相关，并且SPT1和SPT2在肿瘤细胞和基质成纤维细胞中的相对量可能是临床相关的。TME细胞中的SPT1和SPT2可以是转移活动的一种有效预测指征，从而具有诊断和预后价值。更为重要的是，这些数据表明，本发明的方法可以进一步作为筛选方法使用，以鉴定针对某些肿瘤具有治疗用途的新型SPT抑制剂化合物。
实施例4检测内皮组织中的SPTI和SPT2气囊血管成形术大鼠模型采用前述方法，通过大鼠颈总动脉的气囊导管吹胀法诱导血管损伤。重350-450gm的雄性Sprague Dawley大鼠用氯胺酮/赛拉嗪(75/5mg/kg，i.m.)麻醉。采用无菌技术，将2F栓子切除术导管(BaxterHealthcare，Irvine，CA)通过外颈动脉插入左颈总动脉中。气囊尖后接主动脉，充气至30p.s.i，然后用扭曲运动缓慢抽出。该步骤总共重复3次。取出导管，牢固地结扎外颈动脉。损伤后1天、3天、7天和14天，大鼠用氯胺酮/赛拉嗪(75/5mg/kg，i.m.)麻醉。静脉内给予1ml含有1000U肝素的5％Evan氏蓝溶液。10分种后，通过主动脉给大鼠输注100mmHg盐水达10分钟，然后输注含4％低聚甲醛的磷酸缓冲盐溶液(PBS)。取出左右颈总动脉，并且进行制备，供石蜡包埋法用。完全血栓性闭塞的颈动脉以及在受伤区段未被染成蓝色的颈动脉不进行分析。
组织制备将组织切片(5μM)固定在玻片上，得自颈动脉中部的代表性切片用苏木精和伊红染色。靠近或几乎靠近的切片用改良的elastin-vanGieson染色(Sigma，St.Louis，MO)对弹性蛋白和胶原蛋白进行组织化学染色。其它靠近或几乎靠近的切片用来进行免疫组织化学分析。
双重免疫组织化学标记受伤的和正常的颈动脉的切片用针对人SPT1产生的肽特异性多克隆抗体进行免疫组织化学标记，在独立的实验中，如实施例2中所述的方法，用针对人SPT2的抗肽抗体进行免疫组织化学标记。各切片也用抗因子VIII相关抗原、平滑肌肌动蛋白和PCNA的抗体标记。进行一系列的对照，以确保对标记的适当解释。初次抗体用适当种的同种型取代，以控制检测系统。在另一组对照中，省去第一初次抗体而对第二初次抗体进行加工，反之亦然。
对于同时双重免疫组织化学标记(IHC:IHC)，每种免疫组织化学标记方法在同一切片上顺序进行，然后复染。第二抗原通过碱性磷酸酶-FAST RED(Dako)系统来检测。在初次免疫组织化学标记后，将针对第二标记的初次抗体在室温下在所述玻片上保留30分钟。简单地洗涤之后，在室温下加入第二生物素化抗体达30分钟。然后将玻片在PBS中洗涤，在室温下将链霉抗生物素蛋白-碱性磷酸酶试剂(Vector Labs)在所述玻片上保留30分钟。洗涤后，将玻片暴露于FASTRED CHROMOGEN(Dako)。然后所述玻片用苏木精复染，洗涤，然后在基于水的封固剂(Dako)中覆盖，以便在光学显微镜下观测。
在正常血管中，SPT标记在内侧平滑肌和内皮中是弥散不规则的。损伤后1天和3天，在出现新内膜之前，SPT1和SPT2标记在靠近损害或坏死的平滑肌细胞的细胞中增加。另外，增殖性外膜肌成纤维细胞强标记SPT1和SPT2。损伤后7天和14天，受伤血管的基质和新内膜增加了所述新内膜腔边最致密的SPT标记。这种腔边已有描述并且显示包括活动性增殖平滑肌细胞。双重免疫组织化学标记证实，SPT在密度最高的PCNA阳性细胞的区内表达最高。
图13显示在气囊血管成形术后14天在大鼠模型中观察到的典型病斑。与未受伤的动脉(右图)相比，观察到明显的基质增厚以及在气囊损伤的动脉中存在突出的新内膜(左图)。在受伤动脉的基质和新内膜以及未受伤的动脉的基质中都存在平滑肌肌动蛋白标记(图13C)。在腔边标记最大的受伤血管的基质和新内膜中观察到PCNA阳性细胞(图13E，箭头)。未受伤血管不表达多种PCNA阳性细胞(图13F)。未受伤颈动脉中的SPT标记仅沿完整内皮层显而易见(箭头，图13H和图13J)。动脉损伤后14天，SPT1和SPT2标记从腔细胞向下延伸通过所述新内膜。SPT2标记似乎更加致密，尤其是在腔边。这些数据证明，在对血管损伤应答时存在SPT1和SPT2的特异性正调节。在与下述细胞相关的细胞中观察到SPT1和SPT2的正调节基质平滑肌损害、增殖性外膜肌成纤维细胞和新内膜的平滑肌细胞、特别在所述新内膜的增殖性腔边的那些平滑肌细胞。
图14通过检查血管成形术后第1天、第3天、第7天和3个月PCNA、SPT1和SPT2表达显示血管损伤的时程。在第3天，PCNA标记在受伤基质的平滑肌细胞(参见箭头)中显而易见(图14D)。在基质(大箭头)以及沿腔边沉积的血小板(小箭头)中观察到SPT1阳性免疫反应性(图14E)和SPT2阳性免疫反应性(图14F)。在第7天，PCNA标记变得明显得多。标记在早期新内膜中最致密，但也存在于受伤血管的基质中(图14G)。与第7天在所述基质的浅SPT1和SPT2免疫标记相比，致密SPT1(图14H)和SPT2(图14I)免疫标记位于所述受伤血管的新内膜中。因此，SPT的表达与似乎活动性增殖平滑肌细胞相一致。损伤后3个月，对PCNA、SPT1和SPT2的标记限于所述新内膜腔边的倒数第二层。
图15显示肌成纤维细胞在对血管成形术应答时外膜和基质重建模中的去分化和增殖。在未受伤颈动脉(图15A)和受伤第3天的血管(图15B)的苏木精和伊红染色后，受伤血管的外膜比对照血管外膜更厚且细胞更多。免疫组织化学特征用来显示受伤血管和抗体对SMA(图15C)、PCNA(图15D)、SPT1(图15E)和SPT2(图15F)的应答。SMA阳性免疫标记指示在所述外膜中存在去分化反应性肌成纤维细胞，而在对照血管中没有观察到这一现象。在所述外膜中也观察到明显的PCNA阳性免疫标记(箭头)(图15D)，证明存在反应性成纤维细胞。在所述外膜(箭头)内的肌成纤维细胞中也观察到明显的SPT1免疫标记(图15E)和SPT2免疫标记(图15F)。这些特征性创伤应答变化与在各种各样的癌中观察到的结果相似，并且表明SPT可能参与成纤维细胞的增生和瘤形成所共有的信号途径。
实施例5体内再狭窄模型重350-450gm的雄性Sprague Dawley大鼠用氯胺酮/赛拉嗪(75/5mg/kg，i.m.)麻醉。采用前述方法(Damiano等，1999)，通过大鼠颈总动脉的气囊导管吹胀法诱导血管损伤。一组大鼠用在第0天、第2天、第5天和第10天腹膜内注射的0.5mg/kg丝氨酸棕榈酰转移酶抑制剂多球壳菌素治疗。在第1天、第3天、第7天和第14天处死动物，以评价颈动脉再狭窄损伤的组织病理学并且用免疫组织化学法检查所述丝氨酸棕榈酰转移酶亚基在受伤切片和对照切片中的表达。在经治疗的动物中再狭窄损伤(即血管变窄)程度的降低是SPT抑制剂功效的指标。
实施例6B16肺转移模型让B16-F10小鼠黑素瘤细胞(ICLC目录编号ATL99010)在标准条件下生长，作为单层组织培养物。将大约2×106细胞静脉内注射到4-8周龄C57BL/6小鼠的尾静脉中。在一组小鼠中，在第0天、第2天和第5天，同时腹膜内给予约0.5mg/kg浓度的丝氨酸棕榈酰转移酶抑制剂例如多球壳菌素。对照组注射溶剂溶媒。肿瘤注射后让小鼠生存9天，以让所述肿瘤建立，然后使小鼠安乐死。取出肺，在Bouin氏溶液中固定，使用解剖显微镜对肺转移肿瘤数计数。肺转移肿瘤数减少表示SPT抑制剂阻止B16-F10肿瘤在小鼠中的建立。
实施例7检测炎性结肠-大鼠结肠炎模型中的SPT2所述动物用氟烷麻醉，其结肠用乙醇(30％，1ml，约30秒)洗涤，以破坏粘膜屏障，然且用盐水冲洗(1ml)。然后或者将酵母聚糖(1ml，25mg/ml，Sigma，St.Louis，MO)或者将等体积的溶媒(盐水)通过肛门内插入深约7-8cm的管饲法针滴注到结肠中。结肠内滴注后20小时处死所述酵母聚糖动物。给所述动物经贲门灌注固定剂。取出结肠并在同一溶液中进行后固定。
组织制备从该模型的结肠远端即已知有结肠炎反应的部位，切取大约3个连续的1cm切片，在每种动物一种石蜡封闭剂中包埋，同时进行观察。从每种石蜡封闭剂中切取组织切片(5μM)。将各切片固定在玻片上并用SPT1和SPT2特异性抗体处理，供免疫组织化学分析用。用髓过氧化物酶和巨噬细胞特异性抗体，用巨噬细胞特异性抗体MAC-1，用另外的免疫组织化学标记证实多形核白细胞(PMN)的存在。
图16说明炎性结肠中的白细胞浸润。上图(图16A)的箭头指示具有增强水平的SPT2的活化巨噬细胞。下图(图16B)显示炎性结肠腔面上的嗜中性粒细胞浸润。箭头指示表现出增强的SPT2表达的视野多种活化嗜中性粒细胞中的三种嗜中性粒细胞。根据SPT1免疫标记获得相似的结果(数据未显示)。除明显存在SPT1和SPT2免疫阳性PMN和巨噬细胞外，还观察到迁移性上皮舌上的阳性免疫标记，似乎从正常上皮迁移而来(数据未显示)，提示SPT1和SPT2不仅存在于炎性细胞中，而且也存在于增殖性上皮细胞(也许作用在于使伤口愈合)中。
虽然先前的说明书叙述了本发明的原理、提供用于说明的实施例，但是人们将会理解，就本说明书而论，对本发明各个方面的进一步修改是本领域技术人员显而易见的，并且本发明的实施包括以下权利要求书范围内进行的所有通常的变化、替代实施方案、改进和/或修改及其解释为包括所有这样的变化的等同实施方案。
权利要求
1.一种用于测量哺乳动物细胞丝氨酸棕榈酰转移酶表达水平的方法，所述方法包括(a)使丝氨酸棕榈酰转移酶特异性化合物与一种哺乳动物细胞接触，形成大量的化合物-丝氨酸棕榈酰转移酶复合物；(b)通过检测存在的所述复合物，测量由所述细胞表达的丝氨酸棕榈酰转移酶水平。
2.一种用于测量哺乳动物细胞丝氨酸棕榈酰转移酶表达的方法，所述方法包括(a)使丝氨酸棕榈酰转移酶特异性化合物与以基础水平表达丝氨酸棕榈酰转移酶的第一种哺乳动物细胞接触，形成第一种大量的化合物-丝氨酸棕榈酰转移酶复合物；(b)使丝氨酸棕榈酰转移酶特异性化合物与过度增殖性地表达丝氨酸棕榈酰转移酶的第二种哺乳动物细胞接触，形成第二种大量的化合物-丝氨酸棕榈酰转移酶复合物；(c)通过检测存在的所述第一种和第二种大量复合物，测定所述第一种和第二种细胞表达的丝氨酸棕榈酰转移酶水平；(d)测量所述第一种和第二种细胞表达的丝氨酸棕榈酰转移酶水平差异。
3.一种用于组织体内成象的方法，所述方法包括(a)给予哺乳动物一种丝氨酸棕榈酰转移酶特异性化合物，其中所述化合物包含一个可检测标记，并且其中所述化合物与过度增殖性地表达丝氨酸棕榈酰转移酶的哺乳动物细胞结合；(b)通过对所述可检测标记成象，确定在哺乳动物组织内的细胞定位。
4.权利要求2的方法，所述方法还包括下述步骤应用所测得的所述第一种和第二种细胞表达丝氨酸棕榈酰转移酶的水平差异检测、诊断癌症，诊断癌症的转移潜力，监测癌症的预后和进程，或者监测癌症治疗的治疗功效。
5.权利要求4的方法，其中所述癌症选自乳腺癌、结肠癌、类癌瘤、胃癌、神经胶质瘤、肝细胞瘤、平滑肌肉瘤、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑素瘤、间皮瘤、骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、甲状腺癌、肾细胞癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、未分化癌和白血病。
6.权利要求2的方法，所述方法还包括下述步骤应用所测得的所述第一种和第二种细胞表达丝氨酸棕榈酰转移酶的水平差异检测或诊断是否存在血管损伤。
7.权利要求6的方法，其中所述血管损伤为再狭窄。
8.权利要求2的方法，所述方法还包括下述步骤应用所测得的所述第一种和第二种细胞表达丝氨酸棕榈酰转移酶的水平差异检测或诊断是否存在炎症。
9.权利要求8的方法，其中所述炎症为以下疾病的炎症溃疡性结肠炎、炎性肠综合征、节段性回肠炎、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、中风或哮喘。
10.一种用于筛选抑制丝氨酸棕榈酰转移酶的治疗上有效的化合物的方法，所述方法包括(a)使丝氨酸棕榈酰转移酶特异性化合物与过度增殖性地表达丝氨酸棕榈酰转移酶的第一种哺乳动物细胞接触，形成第一种大量的化合物-丝氨酸棕榈酰转移酶复合物；(b)使一种潜在的丝氨酸棕榈酰转移酶抑制剂化合物与过度增殖性地表达丝氨酸棕榈酰转移酶的第二种哺乳动物细胞接触，形成第二种大量的化合物-丝氨酸棕榈酰转移酶复合物；(c)通过检测存在的所述第一种和第二种大量的化合物-丝氨酸棕榈酰转移酶复合物，测定所述第一种和第二种细胞表达的丝氨酸棕榈酰转移酶水平；(d)测量所述第一种和第二种细胞表达的丝氨酸棕榈酰转移酶水平差异，以确定所述潜在抑制剂化合物是否抑制丝氨酸棕榈酰转移酶表达。
11.权利要求1的方法，其中所述丝氨酸棕榈酰转移酶特异性化合物选自与丝氨酸棕榈酰转移酶结合的化合物、与丝氨酸棕榈酰转移酶结合的单特异性抗体和与丝氨酸棕榈酰转移酶mRNA杂交的核酸。
12.权利要求2的方法，其中所述丝氨酸棕榈酰转移酶特异性化合物选自与丝氨酸棕榈酰转移酶结合的化合物、与丝氨酸棕榈酰转移酶结合的单特异性抗体和与丝氨酸棕榈酰转移酶mRNA杂交的核酸。
13.权利要求3的方法，其中所述丝氨酸棕榈酰转移酶特异性化合物选自与丝氨酸棕榈酰转移酶结合的化合物、与丝氨酸棕榈酰转移酶结合的单特异性抗体和与丝氨酸棕榈酰转移酶mRNA杂交的核酸。
14.权利要求10的方法，其中所述丝氨酸棕榈酰转移酶特异性化合物选自与丝氨酸棕榈酰转移酶结合的化合物、与丝氨酸棕榈酰转移酶结合的单特异性抗体和与丝氨酸棕榈酰转移酶mRNA杂交的核酸。
15.权利要求1的方法，其中所述表达丝氨酸棕榈酰转移酶的哺乳动物细胞选自肾上腺细胞、脑细胞、乳腺细胞、结肠细胞、上皮细胞、内皮细胞、心脏细胞、免疫细胞、肾细胞、肝细胞、肺细胞、卵巢细胞、胰腺细胞、前列腺细胞、皮肤细胞、脾细胞、胃细胞、睾丸细胞、甲状腺细胞、子宫细胞和血管细胞。
16.权利要求15的方法，其中所述上皮细胞选自内皮细胞、非神经胶质神经元细胞、结肠细胞、乳腺细胞、肾近端小管细胞、前列腺平滑肌细胞、子宫平滑肌细胞和睾丸平滑肌细胞。
17.权利要求15的方法，其中所述免疫细胞选自多形核白细胞、单核细胞、巨噬细胞、上皮样细胞、巨细胞、小神经胶质细胞、枯否氏细胞和肺泡巨噬细胞。
18.权利要求2的方法，其中所述以基础水平表达丝氨酸棕榈酰转移酶的哺乳动物细胞选自肾上腺细胞、脑细胞、乳腺细胞、结肠细胞、上皮细胞、内皮细胞、心脏细胞、免疫细胞、肾细胞、肝细胞、肺细胞、卵巢细胞、胰腺细胞、前列腺细胞、皮肤细胞、脾细胞、胃细胞、睾丸细胞、甲状腺细胞、子宫细胞和血管细胞。
19.权利要求2的方法，其中所述过度增殖性地表达丝氨酸棕榈酰转移酶的哺乳动物细胞选自上皮细胞、内皮细胞、癌细胞、免疫细胞和肿瘤微环境内的细胞。
20.权利要求19的方法，其中所述癌细胞选自乳腺癌、结肠癌、类癌瘤、胃癌、神经胶质瘤、肝细胞瘤、平滑肌肉瘤、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑素瘤、间皮瘤、骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、甲状腺癌、肾细胞癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、未分化癌和白血病。
21.权利要求19的方法，其中所述上皮细胞选自内皮细胞、非神经胶质神经元细胞、结肠细胞、乳腺细胞、肾近端小管细胞、前列腺平滑肌细胞、子宫平滑肌细胞和睾丸平滑肌细胞。
22.权利要求19的方法，其中所述免疫细胞选自多形核白细胞、单核细胞、巨噬细胞、上皮样细胞、巨细胞、小神经胶质细胞、枯否氏细胞和肺泡巨噬细胞。
23.权利要求19的方法，其中所述肿瘤微环境内的细胞选自基质成纤维细胞、基质单核细胞和肌成纤维细胞。
24.一种用于治疗其需要患者丝氨酸棕榈酰转移酶介导性疾病的方法，所述方法包括将治疗有效量的丝氨酸棕榈酰转移酶抑制剂化合物药用制剂给予所述患者；其中任选的是，所述丝氨酸棕榈酰转移酶抑制剂化合物具有细胞毒性。
25.权利要求24的方法，其中所述丝氨酸棕榈酰转移酶抑制剂化合物是一种丝氨酸棕榈酰转移酶特异性化合物。
26.权利要求24的方法，其中所述丝氨酸棕榈酰转移酶介导性疾病选自癌症、炎症和血管损伤。
27.权利要求26的方法，其中所述癌症选自乳腺癌、结肠癌、类癌瘤、胃癌、神经胶质瘤、肝细胞瘤、平滑肌肉瘤、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑素瘤、间皮瘤、骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、甲状腺癌、肾细胞癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、未分化癌和白血病。
28.权利要求26的方法，其中所述炎症是以下疾病的炎症溃疡性结肠炎、炎性肠综合征、节段性回肠炎、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、中风或哮喘。
29.权利要求26的方法，其中所述血管损伤是再狭窄性血管损伤。
30.权利要求25的方法，其中所述丝氨酸棕榈酰转移酶特异性化合物选自任选用细胞毒性剂标记的单特异性抗体和与丝氨酸棕榈酰转移酶mRNA任选杂交的核酸。
31.权利要求24的方法，其中将所述药用制剂涂被在气囊导管或支架上并且以时间依赖性方式释放。
全文摘要
本发明涉及一种用于比较性测量哺乳动物组织中正常与过度增殖性丝氨酸棕榈酰转移酶表达水平的方法及其应用。
文档编号C12N9/10GK1610751SQ02810014
公开日2005年4月27日 申请日期2002年3月19日 优先权日2001年3月20日
发明者J·M·卡顿, M·R·德安德雷, D·J·厄林格 申请人:奥索·麦克尼尔药品公司