专利名称：新型大酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及大酶(maxizyme)及其应用，更具体地说，涉及对目标RNA具有优异RNA切割活性的大酶及其应用。
背景技术：
二十世纪八十年代初，根据美国科罗拉多大学Cech等人发现的四膜虫的rRNA自剪接现象(K.Kruger，Cell，31，147-157(1982))、美国耶鲁大学Altman进行的对RNA与蛋白质的复合体酶—RNA酶P的分析结果(C.Guerrier-Takada，Cell，35，849-857(1983))，发现了具有催化剂机能的RNA—核酶(ribozyme核苷酸+酶)。
从那以后，发现了各种各样的核酶，其中锤头状核酶是被研究最多的核酶之一。锤头状核酶是在天然自切割反应(顺式)中发挥机能的核酶，Uhlenbeck等人和Hasehoff等人的研究小组将其分开成(转换成反式)两条RNA链(底物区和酶活性保持区)(O.C.Uhlenbeck，Nature，328，596(1987)；J.Hasehoff，W.L. Gerlach，Nature，334，585(1988))，从而显示出将核酶应用于基因治疗的可能性。
于是大量报道了以癌症、艾滋病为目标的各种应用研究(M，Cotton，M.L.Bimstlel，EMBOJ8，861(1989))，本发明人也开发了具有极高底物特异性，对正常mRNA完全没有影响，仅切割具有异常连接序列的mRNA的大酶(国际公开WO99/46388号公报)。
但是，由于目标mRNA具有二级结构或三级结构，当大酶的底物结合区被茎结构隐藏时，就会有大酶向目标位点的接近受阻，无法获得充分效果的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供无论目标mRNA的高级结构如何都可与其结合，进行有效切割的大酶。
本发明人为实现上述目的，进行了深入研究，结果发现通过使大酶与具有解旋酶活性的分子一起作用，可以获得优异的RNA切割活性，从而完成了本发明。
即，本发明涉及下述(1)-(19)。
(1)大酶，其特征在于与具有解旋酶活性的分子结合。
(2)大酶，所述大酶含有与具解旋酶活性的分子结合的区。
(3)大酶，所述大酶由含有下列核苷酸序列(a)的RNA分子和含有下列核苷酸序列(b)的RNA分子形成的二聚体结构构成。
5’X11…X1hY11…Y1iZ11…Z1jB11…B1p3’(a)5’Z21…Z2nY21…Y2mX21…X2kB21…B2q3’(b)(序列中，X11…X1h、X21…X2k、Y11…Y1i、Y21…Y2m、Z11…Z1j、Z21…Z2n、B11…B1p和B21…B2q各自独立为A、U、T、C或G，h和k为1以上的整数(例如1-100的整数))，i和m为1以上的整数(例如1-100的整数)，j和n为1以上的整数(例如l-100的整数)，p和q为1以上的整数(例如1-100的整数)，X11…X1h和X21…X2k是与目标RNA中的特异性序列互补的核苷酸序列，或者是含有与目标RNA的切割位点周围的序列互补的区和只在目标RNA存在下可形成捕捉Mg2+(镁离子)的孔穴的区的核苷酸序列；Y11…Y1I和Y21…Y2m是形成茎的核苷酸序列；Z1I…Z1j和Z21…Z2n是含有与目标RNA的切割位点周围的序列互补的区和只在目标RNA存在下可形成捕捉Mg2+的孔穴的区的核苷酸序列；B11…B1p和B21…B2q其中之一或者两者是含有与具有解旋酶活性的分子结合的区的核苷酸序列。
(4)(3)中记载的大酶，其中作为只在目标RNA存在下可形成捕捉Mg2+(镁离子)的孔穴的核苷酸序列，Z11…Z1j含有序列GAA，Z21…Z2n含有序列CUGAYZGA，YZ表示A、G、U、C任一种单核苷酸。
(5)(3)或(4)中记载的大酶，其中作为只在目标RNA存在下可形成捕捉Mg2+的孔穴的核苷酸序列，包含X21…X2k的序列GAA、X11…X1h的序列CUGAYXGA，YX表示A、G、U、C任一种单核苷酸。
(6)(1)-(5)任一项中记载的大酶，其中具有解旋酶活性的分子为RNA解旋酶。
(7)(6)中记载的大酶，其中与具解旋酶活性的分子结合的区为SEQ ID NO.1(CTE)表示的核苷酸。
(8)(6)中记载的大酶，其中与具解旋酶活性的分子结合的区为SEQ ID NO.2(TAR)表示的核苷酸。
(9)(3)-(8)任一项中记载的大酶，其中在核苷酸序列(a)和(b)各自的上游添加了接头序列和tRANval启动序列。
(10)(9)中记载的大酶，其中添加到核苷酸序列(a)上游的接头序列含有下述核苷酸序列(e)，添加到核苷酸序列(b)上游的接头序列含有下述核苷酸序列(f)。
5’AAA 3’(e)5’UUU 3’(f)(11)(9)中记载的大酶，其中添加到核苷酸序列(a)和(b)各自上游的tRANval启动序列为SEQ ID NO.3。
(12)(9)中记载的大酶，其中在核苷酸序列(a)和(b)各自下游添加了附加序列和终止序列。
(13)(12)中记载的大酶，其中添加到核苷酸序列(a)下游的附加序列含有下述核苷酸序列(g)，添加到核苷酸序列(b)下游的附加序列含有下述核苷酸序列(h)，添加到核苷酸序列(a)和(b)各自下游的终止序列含有下述核苷酸序列(i)。
5’AAA 3’ (g)5’AACCGUA 3’ (h)5’UUUUU 3’(i)
(14)表达载体，该表达载体含有编码(1)-(13)中任一项记载的大酶的DNA。
(15)复合体，该复合体为(1)-(13)中任一项记载的大酶与具有解旋酶活性的分子的复合体。
(16)药物组合物，该组合物含有(1)-(13)中任一项记载的大酶、(14)中记载的表达载体或(15)中记载的复合体作为有效成分。
(17)切割目标核酸的方法，该方法使用(1)-(13)中任一项记载的大酶、(14)中记载的表达载体、(15)中记载的复合体进行。
(18)特异性阻碍或抑制目标核酸的生物学机能的方法，该方法使用(1)-(13)中任一项记载的大酶、(14)中记载的表达载体或(15)中记载的复合体进行。
(19)目标核酸的生物学机能的分析方法，该方法包括用(1)-(13)中任一项记载的大酶、(14)中记载的表达载体或(15)中记载的复合体特异性切割目标核酸或者特异性阻碍目标核酸的生物学机能，研究该切割或该阻碍对生物学活性的影响。
附图简述
图1表示CTE(组成型转运元件，constitutiVe transport element)的二级结构。
图2表示CTE-Mz的简图。
图3表示LTR-萤光素酶mRNA的二级结构。
图4表示Luc同型Mz与2个mRNA的Luc切割位点结合时的图。
图5表示Luc同型Mz与2个mRNA的TAR切割位点结合时的图。
图6表示Luc同型Mz与1个mRNA的Luc切割位点和TAR切割位点结合时的图。
图7表示大酶和CTE-大酶与1个LTR-萤光素酶mRNA结合的图(顺式大酶)。
图8表示大酶和CTE-大酶与2个LTR-萤光素酶mRNA结合的图(反式大酶)。
图9表示萤光素酶活性的结果(同二聚体型大酶)。
图10表示萤光素酶活性的结果(异二聚体型大酶)。
实施发明的最佳方案本发明的大酶的特征在于与具有解旋酶活性的分子结合。
本发明人当初推测大酶与具有解旋酶活性的分子结合时，由于空间位阻而不可能形成二聚体。特别是将pol III系统作为表达系统时，由于5’末端上添加了tRNAval，大酶的空间位阻变大更大。但是，令人吃惊的是大酶形成了二聚体，并证实其具有比现有大酶更优异的RNA切割活性。
下面详述本发明。
(大酶)本发明中大酶是指作为二聚体发挥作用的小型化锤头状核酶。该小型化通常通过以短链的接头置换由反义区(茎I和茎II)、活性中心区、茎-环II区构成的锤头状核酶的茎-环II区而得以构建。大酶的活性表达需要Mg2+(镁离子)，茎II部分的G-C碱基对对于形成二聚体很重要。锤头状核酶和大酶的序列设计在生物物理2000年第4卷第2期第99-104页上有记载，将该文献的内容全部引用结合进本文作为本说明书内容的一部分。
可形成捕捉镁离子的孔穴的位点即活性中心区相应于每1个大酶可以有1个，也可以有2个。有2个活性中心区的大酶如果是能够与1个底物同时在两个部位结合，并在该两个部位的NUX三联体(N为A、G、C或U，X为A、C或U)之后切割底物，则底物的切割效率将升高。
大酶因其二聚结构(二聚体)，与目标mRNA在两个部位结合。在形成二聚体时，可以设计为2个同一种类的单体结合形成的同二聚体型大酶(homodimer type maxizyme)(图4、图5)、两种不同种类的单体结合形成的异二聚体型大酶(hetero dimeric maxizyme)(图6)。同二聚体型大酶与具有设定的结合位点的mRNA在两个部位结合。此时2个mRNA与1个大酶在分子内结合(反式大酶，图7)。另一方面，异二聚体型大酶可以与2个不同的序列部分结合，有与1个mRNA内的不同部位同时结合的情况(顺式大酶，图8)和不同的序列部分个别地与1个大酶在分子间(2个mRNA)结合的情况(反式大酶)。
(具有解旋酶活性的分子)本发明中，具有解旋酶活性的分子是指通过作用于mRNA，使RNA的螺旋结构不稳定，从而具有打开包含双链RNA的高级结构的作用的分子，其具体例子有RNA解旋酶、核糖体、限制酶(EcoRI、EcoRV等)等。这类具有解旋酶活性的分子可以与大酶直接结合，也可以经由衔接分子结合。只要不损害大酶的切割活性，对具有解旋酶活性的分子与大酶的结合位点没有特别限制，优选在大酶的3’末端附近。
为了使具有解旋酶活性的分子与大酶结合，需要添加新结合区，以使具有解旋酶活性的分子或上述衔接分子与大酶稳定结合。与具有解旋酶活性的分子等结合的区随作为目标的具有解旋酶活性的分子或衔接分子不同而不同，但可以从具有解旋酶活性的分子与RNA两条链结合的结合区设计得到。例如，优选添加组成型转运元件(CTE、SEQ IDNO.1，图1)、HIV TAR RNA、POLY A RNA等作为具有解旋酶活性的分子的结合区。
CTE是指为了病毒结构蛋白的表达和包装，而将未剪接的基因组RNA转运到细胞质的顺式作用性病毒RNA。CTE是Mason-Pfizer猴病毒(MPLV)等猴D型反转录病毒本来具有的RNA，因为核外转运未剪接的RNA，所以认为这些病毒具有所述CTE这样的RNA基序(H.Tang等，(1997)Science 2761412-1415；J.Li等，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96709-714；H.Tang等，(1999)Mol.Cell Biol.193540-3550)。
在本发明的优选实施方案中，可以使用上述CTE、实质上与该CTE具有相同机能的RNA或者实质上与该CTE具有相同机能的CTE序列的突变体。这里“实质上与该CTE具有相同机能的RNA”是指除CTE以外与RNA解旋酶具有结合亲和性的分子，例如指经SELEX法人工制备的与解旋酶结合的衔接适体(aptamer)等分子。“突变体”是指一个或多个核苷酸的改变(置换、缺失、添加或插入)。这样的改变可通过J.Sambrook等人的Molecular Cloning A Laboratory Mannual，Cold SpringHarbor Laboratory Press(1989)等一般文献中记载的方法进行。
polyA RNA通过聚腺苷酸结合蛋白(PABP)和与PABP相互作用的蛋白质-1的相互作用而与RNA解旋酶相互作用。
与具有解旋酶活性的分子结合的区可以仅存在于大酶(同二聚体、异二聚体)的一个单体中，也可以存在于两个单体中(图7)。当存在于大酶的两个单体中时，虽然可以预见有极大的空间位阻，但即使是在这种情况下，也可确认有优异的mRNA切割活性。
(与具有解旋酶活性的分子结合的大酶)本发明的以与具解旋酶活性的分子结合为特征的大酶或者含有与具解旋酶活性的分子结合的区的大酶的具体例子有与解旋酶或与解旋酶形成复合体的分子具有结合亲和性的大酶，优选与RNA解旋酶或与RNA解旋酶形成复合体的分子(衔接分子)具有结合亲和性的大酶，例如含有与RNA解旋酶A结合的所谓CTE(组成型转运元件)的RNA序列、HIV TAR RNA或POLY ARNA序列的大酶，但并不仅限于此。
本发明的与具解旋酶活性的分子结合的大酶通常由与解旋酶或与解旋酶形成复合体的分子具有结合亲和性的核酸序列和大酶的核酸序列直接或间接结合而构成，例如可通过使用DNA/RNA合成仪(例如Applied Biosystems公司制造的394型等)进行化学合成。作为两个核酸序列的结合方式，与解旋酶或与解旋酶形成复合体的分子具有结合亲和性的核酸序列可以在大酶核酸序列的上游侧，也可以在大酶核酸序列的下游侧，优选与解旋酶或与解旋酶形成复合体的分子具有结合亲和性的核酸序列结合到大酶核酸序列的下游侧。由此可进一步提高大酶的活性效率。
(大酶的表达系统)为了使本发明的与具解旋酶活性的分子结合的大酶在细胞内高度表达，需要在大酶序列的上游有启动序列。当使用pol III表达系统时，可在该表达系统中添加tRNAval序列作为过度序列(excessive sequence)(大酶部分以外的启动序列)。实际上构建了该大酶的表达载体，但由该载体表达的结构是在tRNAval序列的下游通过短链接头与大酶的序列相连。
如图7和图8所示，可以预见到与3’末端结合的解旋酶和5’末端的tRNAval对于大酶来说是非常大的空间位阻。但是，添加了tRNAval序列的形式的大酶却被证实有明确的切割活性，由此表明本发明的大酶能有效地形成二聚体。
(表达载体)编码本发明的与具解旋酶活性的分子结合的大酶的表达载体例如可通过将启动序列、终止序列和编码前述大酶的DNA序列连接之后，将其导入适当的载体中而构建。
表达载体可以使用pUC19(宝酒造，京都)、pGREEN LANTERN(LifeTech Oriental，东京)、pHaMDR(HUMAN GENE THERAPY6905-915(1995年7月))等质粒载体，以及作为基因治疗用载体的腺病毒载体或反转录病毒载体等。
上述载体中，可以在编码大酶的DNA的上游含有启动序列。启动序列是调控该DNA表达的元件，可以包含病毒启动子(SV40启动子等)、噬菌体启动子(λPL启动子等)、pol III启动子(人tRNA启动子(例如tRNAval启动子)、腺病毒VA1启动子等)等。本发明优选使用pol III启动子，特别是tRNA启动子。
本发明的载体中，还可以在编码与具解旋酶活性的分子结合的大酶的DNA的下游含有终止序列。只要是使转录终结的序列的终止子，可以使用任何序列。根据需要，载体中可以包含抗抗生素基因(例如Ampr，Neor)、营养缺陷型互补基因等选择标记基因或者报道基因。
编码本发明的大酶的核酸可以通过DNA/RNA合成仪化学合成，或者可以将上述表达载体DNA作为模板，在依赖于DNA的RNA聚合酶存在下合成RNA，回收生成的RNA而获得。将本发明的表达载体导入细胞内时，可以通过同源重组整合到染色体上后，表达本发明的与具解旋酶活性的分子结合的大酶。为了引发同源重组，可以在与一部分宿主细胞基因组同源的序列内部插入编码本发明的能与具解旋酶活性的分子结合的大酶的DNA，再将其整合进载体DNA中。对染色体的整合不仅可以通过基因治疗法中所用的腺病毒载体或反转录病毒载体，还可以通过质粒载体进行。
(本发明的大酶与具有解旋酶活性的分子的复合体)本发明还包括以与具解旋酶活性的分子结合为特征的大酶与具解旋酶活性的分子的复合体。具有解旋酶活性的分子的具体例子有RNA解旋酶、核糖体、限制酶(EcoRI、EcoRV等)等，优选RNA解旋酶。大酶与具有解旋酶活性的分子的结合只要不损害各成分机能，可以以共价键结合或者以非共价键结合。以非共价键结合时，可以通过与解旋酶特异性结合的连接物与CTE或聚腺苷酸序列结合。以共价键结合时，可以根据需要通过接头结合。
(药物组合物)本发明还包括以上述大酶、表达载体或复合体为有效成分的药物组合物。本发明的药物组合物可根据需要含有药学上可接受的载体(例如生理盐水、缓冲液等稀释剂)。本发明的药物组合物是否适用取决于大酶的机能种类。即，本发明的药物组合物可以用于预防或治疗由大酶的目标RNA引起的疾病。
本发明的药物组合物可用于预防或治疗例如艾滋病毒(HIV)、丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒等病毒引起的疾病、细胞凋亡相关疾病(例如阿尔茨海默病、帕金森氏病等)、癌症、自身免疫性疾病、炎症、基因疾病等疾病。
本发明所用的大酶通过切割疾病的病因物质核酸，或者与核酸互补结合从而产生机能阻碍，或者与病原蛋白质特异性结合而产生机能阻碍，可以破坏病因物质的正常机能。
将含有本发明大酶或编码该大酶的DNA的载体导入细胞的方法有磷酸钙法、电穿孔法、脂质转染法、显微注射法、使用基因枪的方法、使用脂质体的方法(例如中西守等，蛋白质核酸酶44卷，No.11，1590-1596(1999))等。在使用载体的情况下，可以将载体通过上述方法导入细胞。例如，可以取出一部分疾病部位的细胞，在体外进行基因导入后，再将该细胞移回到组织中；或者可以向疾病部位的组织直接导入载体。用病毒载体感染时的病毒滴度通常为107pfu/ml以上。
(本发明的大酶、表达载体或复合体的应用)本发明还提供用本发明的大酶、表达载体或复合体特异性切割目标核酸或者阻碍或抑制目标核酸的生物学机能的方法。该方法例如也可以用于阐明目标核酸的生物学机能。如果将大酶的目标结合位点(茎I和茎II)的序列随机分布，则可以阐明某种生物学机能所需的基因。
具体地说，就是向细胞导入上述具有随机分布的目标结合位点的大酶。例如，向正常细胞导入后可引起癌变，或者向异常癌细胞导入后可使其恢复成正常细胞时，由此可知与癌变相关的基因。根据需要，通过用Gene Bank等来研究其序列，可以阐明该基因的全序列和机能。当基因为未知时，可以在目标结合位点序列的基础上进行目标基因的克隆而确定全序列。即使上述随机序列与重要的基因互补，大多数也会由于对方的高级结构而无法与目标相互作用，结果不能对其进行切割。本发明中，通过使用能与具解旋酶活性的分子相结合的大酶，可以避免上述问题，使效率得到显著提高。
作为本申请的优先权基础的申请即特愿2001-134469号说明书的全部内容引用进本文，作为本说明书的一部分。
下面通过实施例对本发明作进一步的具体说明，但本发明并不限于这些实施例。
实施例本实施例中，评价具有与具解旋酶活性的分子结合的核苷酸序列的大酶对目标mRNA的细胞内活性。本实施例中，选择RNA解旋酶A作为具有解旋酶活性的分子，用使CTE RNA与大酶的下游连接的大酶(CTE-Mz)作为能与该分子结合的基序。
实施例1构建具有与具解旋酶活性的蛋白质结合的核苷酸序列的大酶表达载体(CTE-Mz表达载体)当制备本发明的大酶时，确定大酶的序列，使来源于HIV-1的长末端重复序列(LTR)基因内的TAR RAN区(证明具有牢固的二级结构)和萤光素酶mRNA(为了能进行定量评价)为目标位点。
可根据文献(J.Virol.73，1868-1877(1999)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA96，1886-1891(1999))记载的方法构建CTE-Mz表达载体。化学合成单链的寡核苷酸，该寡核苷酸在5’和3’末端分别具有限制位点Csp45I和SalI，从上游依次具有编码大酶(SEQ ID NO.4、5、6、7)的DNA序列、限制位点KpnI和EcoRV，3’末端具有终止序列(TTTTT)，通过以其为模板的聚合酶链反应，合成双链寡核苷酸。将该双链寡核苷酸用限制酶Csp45I和SalI处理后，插入到同样用限制酶Csp45I和SalI处理过的质粒pUC-dt的tRNAval的下游。将其用限制酶KpnI和EcoRV处理后，插入编码来自猿猴D型反转录病毒(SRV)基因的组成型转运元件(CTE，图1)的DNA序列，得到CTE-Mz表达载体(图2)。
实施例2通过萤光素酶活性评价Mz活性本评价使用可使连接长末端重复序列(LTR)基因与萤光素酶(Luc)基因的嵌合基因(SEQ ID NO.8)稳定表达的HeLa细胞(LTR-Luc HeLa)。将1×105个LTR-Luc HeLa接种到12孔板上，于37℃、5％二氧化碳气体培养箱中培养过夜。将实施例1所得CTE-Mz表达载体MzL和MzR各2μg(同源大酶的情况下含有4μg单体大酶)、100ng来自HIV-1的Tat基因表达质粒(LTR-Luc的表达需要Tat蛋白)、50ng pSVβ-半乳糖苷酶(Promega)加入到含有4μl脂质转染试剂(GIBCO/BRL，Rockville，MD)的Optimen I培养基(GIBCO/BRL)中，在室温下温育30分钟以上，然后滴加到12孔板上的细胞中，进行转染。于37℃、二氧化碳气体培养箱中培养24小时后，回收细胞，用PicaGene试剂盒(东京油墨，日本东京)测定萤光素酶活性。将细胞用150μl细胞溶解液(100mM K2HPO4，100mMKH2PO4，0.2％Triton X-100，1mM DTT；pH7.8)溶解，在4℃以10,000xg离心1分钟。将10μl该上清液添加到100μl萤光素酶活性测定试剂(20mM Tricine，1.07mM(MgCO3)4Mg(OH)2，2 67mM MgSO4，0.1mM EDTA，33.3mM DTT，270μM辅酶A，470μM萤光素，530μM ATP)中，3秒后开始用萤光光度计测定萤光强度10秒钟(Lumant LB 9501，Borthold，Bad Wildbad，Germany)。转染效率对萤光素酶活性的影响通过同时转染的来自pSV β-半乳糖苷酶的β-半乳糖苷酶活性进行修正。
本实施例结果如图9和图10所示。将作为对照(pCD-SRα/tat)的萤光素酶活性作为100％，给出了与其的相对活性。
使CTE-Mz与LTR-萤光素酶mRNA作用时，与使通常的Mz作用的情况相比，显示出显著低的萤光素酶活性。即，可知CTE-Mz对通常Mz难以切割的TAR和Luc具有优异的切割活性。
产业上的可利用性本发明可提供无论目标mRNA的高级结构如何都可与其结合进行有效切割的大酶。本发明的大酶可用作药物，还可用于特异性切割目标核酸的方法和阻碍或抑制目标核酸的生物学机能的方法，通过应用该方法，可阐明目标核酸的生物学机能。
序列表<110>独立行政法人产业技术综合研究所(NATIONAL INSTITUTE OF ADVANCED INDUSTRIALSCIENCE AND TECHNOLOGY)<110>大正制药株式会社(TAISHO PHARMACEUTICAL CO.，LTD.)<110>株式会社基因功能(GENOFUNCTION INC.)<120>新型大酶<130>A21216A<160>8<210>1<211>173<212>RNA<213>人(Homo Sapiens)<400>1agaccaccuc cccugcgagc uaagcuggac agccaaugac ggguaagaga gugacauugu 60ucacuaaccu aagacaggag ggccgucaga gcuacugccu aauccaaaga cggguaaaag 120ugauaaaaau guaucacucc aaccuaagac aggcgcagcu uccgagggat ttg 173<210>2<211>60<212>RNA<213>人(Homo Sapiens)<400>2gggucucucu gguuagacca gaucugagcc ugggagcucu cuggcuaacu agggaaccca 60<210>3<211>87<212>RNA
<213>人(Homo Sapiens)<400>3accguugguu uccguagugu agugguuauc acguucgccu aacacgcgaa agguccccgg 60uucgaaaccg ggcacuacaa aaaccaac<210>4<211>30<212>RNA<213>人工序列<400>4aucuggucuc ugaugagcga aaccagagag 30<210>5<211>30<212>RNA<213>人工序列<400>5uauuccgcgc ugaugagcga aaccagagag 30<210>6<211>30<212>RNA<213>人工序列<400>6aucuggucuc ugaugagcga aacuugaugu 30<210>7<211>30<212>RNA<213>人工序列<400>7uauuccgcgc ugaugagcga aacuugaugu 30
<210>8<211>30<212>RNA<213>人工序列<400>8gggucucucu gguuagacca gaucugagcc ugggagcucu cuggcuaacu agggaaccca 60cugcuuaagc cucaauaaag cuuggcauuc cgguacuguu gguaaaaugg aagacgccaa 120aaacauaaag aaaggcccgg cgccauucua uccucuagag gauggaaccg cuggagagca 180acugcauaag gcuaugaaga gauacgcccu gguuccugga acaauugcuu uuacagaugc 240acauaucgag gugaacauca cguacgcgga auacuucgaa auguccguuc gguuggcaga 300
权利要求
1.大酶，其特征在于与具有解旋酶活性的分子结合。
2.大酶，所述大酶含有与具解旋酶活性的分子结合的区。
3.大酶，所述大酶由含有下列核苷酸序列(a)的RNA分子和含有下列核苷酸序列(b)的RNA分子形成的二聚体结构构成，5’X11…X1hY11…Y1iZ11…Z1jB11…B1p3’(a)5’Z21…Z2nY21…Y2mX21…X2kB21…B2q3’(b)序列中，X11…X1h、X21…X2k、Y11…Y1i、Y21…Y2m、Z11…Z1j、Z21…Z2n、B11…B1p和B21…B2q各自独立为A、U、T、C或G，h和k为1以上的整数(例如1-100的整数)，i和m为1以上的整数(例如1-100的整数)，j和n为1以上的整数(例如1-100的整数)，p和q为1以上的整数(例如1-100的整数)；X11…X1h和X21…X2k是与目标RNA中的特异性序列互补的核苷酸序列，或者是含有与目标RNA的切割位点周围的序列互补的区和只在目标RNA存在下可形成捕捉Mg2+(镁离子)的孔穴的区的核苷酸序列；Y11…Y1I和Y21…Y2m是形成茎的核苷酸序列；Z11…Z1j和Z21…Z2n是含有与目标RNA的切割位点周围的序列互补的区和只在目标RNA存在下可形成捕捉Mg2+的孔穴的区的核苷酸序列；B11…B1p和B21…B2q其中之一或者两者是含有与具有解旋酶活性的分子结合的区的核苷酸序列。
4.权利要求3的大酶，其中作为只在目标RNA存在下可形成捕捉Mg2+(镁离子)的孔穴的核苷酸序列，Z11…Z1j含有序列GAA，Z21…Z2n含有序列CUGAYZGA，YZ表示A、G、U、C任一种单核苷酸。
5.权利要求3或4的大酶，其中作为只在目标RNA存在下可形成捕捉Mg2+的孔穴的核苷酸序列，是包含X21…X2k的序列GAA，包含X11…X1h的序列CUGA(YXGA，YX表示A、G、U、C任一种单核苷酸)的序列。
6.权利要求1-5中任一项的大酶，其中具有解旋酶活性的分子为RNA解旋酶。
7.权利要求6的大酶，其中与具解旋酶活性的分子结合的区为SEQID NO.1(CTE)表示的核苷酸。
8.权利要求6的大酶，其中与具解旋酶活性的分子结合的区为SEQID NO.2(TAR)表示的核苷酸。
9.权利要求3-8中任一项的大酶，其中在核苷酸序列(a)和(b)各自上游添加了接头序列和tRANval启动序列。
10.权利要求9的大酶，其中添加到核苷酸序列(a)上游的接头序列含有下述核苷酸序列(e)，添加到核苷酸序列(b)上游的接头序列含有下述核苷酸序列(f)，5’AAA 3’(e)5’UUU 3’(f)。
11.权利要求9的大酶，其中添加到核苷酸序列(a)和(b)各自上游的tRANval启动序列为SEQ ID NO.3。
12.权利要求9的大酶，其中在核苷酸序列(a)和(b)各自的下游添加了附加序列和终止序列。
13.权利要求12的大酶，其中添加到核苷酸序列(a)下游的附加序列含有下述核苷酸序列(g)，添加到核苷酸序列(b)下游的附加序列含有下述核苷酸序列(h)，添加到核苷酸序列(a)和(b)各自下游的终止序列含有下述核苷酸序列(i)，5’AAA 3’(g)5’AACCGUA 3’(h)5’UUUUU 3’ (i)。
14.表达载体，该表达载体含有编码权利要求1-13中任一项的大酶的DNA。
15.复合体，该复合体为权利要求1-13中任一项的大酶与具有解旋酶活性的分子的复合体。
16.药物组合物，该组合物含有权利要求1-13中任一项的大酶、权利要求14的表达载体或权利要求15的复合体作为有效成分。
17.切割目标核酸的方法，该方法使用权利要求1-13中任一项的大酶、权利要求14的表达载体、权利要求15的复合体进行。
18.特异性阻碍或抑制目标核酸的生物学机能的方法，该方法使用权利要求1-13中任一项的大酶、权利要求14的表达载体或权利要求15的复合体进行。
19.目标核酸的生物学机能的分析方法，该方法包括用权利要求1-13中任一项的大酶、权利要求14的表达载体或权利要求15的复合体特异性切割目标核酸或者特异性阻碍目标核酸的生物学机能，研究该切割或该阻碍对生物学活性的影响。
全文摘要
本发明的目的在于提供无论目标mRNA的高级结构如何都可与其结合进行有效切割的大酶。本发明可提供以与具解旋酶活性的分子结合为特征的大酶。
文档编号C12N15/55GK1522300SQ02813198
公开日2004年8月18日 申请日期2002年4月30日 优先权日2001年5月1日
发明者多比良和诚, 藳科知子, 藳科雅岐, 川崎广明, 原寿史, 野泽严, 子, 岐, 明 申请人:独立行政法人产业技术综合研究所, 大正制药株式会社, 株式会社基因功能