调节免疫应答的组合物和方法

专利名称：调节免疫应答的组合物和方法
技术领域：
本发明涉及用于调节哺乳动物受试对象免疫应答的新的组合物和方法。更具体的，本发明涉及通过HLA-E+结合肽引起CD94/NKG2受体的抑制或者抑制的缺乏调节上述受体的功能。
参照相关申请本申请要求2002年7月31日提交的美国临时申请No 60/308,598的优先权，在此引入作为参考。
背景技术：
自然杀伤(NK)细胞是参与抗特定微生物和寄生虫感染的天生免疫应答的淋巴细胞。最近的报道也提出NK细胞在实验性自身免疫模型中具有重要作用，但是对于NK细胞在人类自身免疫疾病过程中的功能依然知之甚少。在本专利申请中，我们已研究了杀伤细胞免疫球蛋白(Ig)类(KIR)和C型凝集素类(CD94/NKG2)受体的表达，所述受体特异于NK细胞以及abT细胞和gdT细胞上的MHC I型分子，这些细胞来自患有关节炎，主要是风湿性关节炎(RA)的病人的滑液(SF)和外周血(PB)。我们发现，关节炎患者的SF与成对的PB比较含有比例提高的NK细胞。与PB-NK细胞相反，SF-NK细胞群几乎一致性表达CD94/NKG2A细胞表面受体并且含有比例显著减少的KIR+NK细胞。功能性分析显示体外培养的来自病人的多克隆SF-NK细胞和PB-NK细胞两者都完全能够杀伤一个范围的靶细胞。但是，SF-NK细胞溶解被转染的靶细胞上存在的HLA-E抑制。当封闭SF-NK细胞上的CD94或者通过封闭自身细胞上的HLA时，SF-NK细胞能够进行自主式溶解。因此，HLA-E可能在调节发炎的关节中的主要NK细胞群中具有重要的作用。
MHC I型分子调节自然杀伤(NK)细胞的功能，诸如介导靶细胞的溶解的能力(Ljunggren等，Immunol.Today 11237-244，1990，在此引入作为参考)。这种调节由显示在NK细胞表面的MHC I型分子特异性受体的所有组成组分的复合体控制。这些受体监控MHC I型分子在相邻细胞上的表达并且传递抑制信号阻断表达MHC I型分子的正常细胞的NK细胞介导的细胞毒性(Lanier等，Immunity 6371-378，1997，在此引入作为参考)。
HLA-E是一种广泛分布的非典型的MHC I型分子，表达在与β2-微球蛋白相关的细胞表面。HLA-E虽然低水平但广泛的与细胞表面上的β2-微球蛋白和肽结合表达(Wei等，Hum.Immunol.29131，1990，在此引入作为参考)。装载HLA-E的肽相信是TAP-依赖性的，虽然存在TAP-非依赖性的报道。与典型的MHC I型分子相反，HLA-E表现出相当有限的多态性，并且其肽结合间隙主要被来自特定HLA-A，-B，-C，和-G分子的信号序列的九聚体肽占据(Lazetic等人，J.Immunol.1574741-4745，1996，在此引入作为参考)。这些肽通常具有共同的基元甲硫氨酸在2位，亮氨酸或者异亮氨酸在9位(Arnett等人，Arthritis Rheum.31315-324，1988，在此引入作为参考)。HLA-E晶体结构的分析已经证实这种分子的肽选择性(Sderstrm等人，J.Immunol.1591072-1075，1997，在此引入作为参考)。在2和9位具有类似的保守锚定残基，命名为Qa-1b的HLA-E的鼠源同源物也主要呈递来自一些小鼠MHC I型分子的信号序列的肽(Miller等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.70190-194，1973；Hendrich等，Arthritis Rheum.34423-431，1991，在此引入作为参考)。但是，最近证实HLA-E和Qa-1b均可结合不同阵列的来自于随机肽文库的肽(Fort等，J.Immunol.1613256-3261，1998；Phillips等，Immunity 5163-72，1996，每个在此处均引作参考)。此外，据报道，Qa-1b可以呈递来自小鼠和细菌热激蛋白60(hsp60)的肽，并且这些复合体可由T细胞，通过其抗原-特异性T细胞受体(TCR)进行检测(Litwin等，J.Exp.Med.180537-543，1994，在此引入作为参考)。
在一些MHC I型分子的信号序列中发现的保守锚定基元被认为对结合到HLA-E肽结合间隙中的口袋是非常重要的。当用这些HLA I型信号肽装载时，HLA-E分子被认为形成了在NK细胞上和T细胞亚群上表达的名称为CD94/NKG2A，-B，-C，-E的C-型凝集素类受体二聚体的功能性配体。
已经描述了人类的至少两种不同类型的抑制受体，杀伤免疫球蛋白(Ig)-类受体(KIR)和C-型凝集素类受体。有几种不同的KIR，其特征在于具有二个(2D)或者三个(3D)细胞外的Ig-类结构域，带有短(S)或者长(L)的胞质尾。基于它们的结构，KIR在族内被分成亚型，并且具有三个Ig-结构域(KIR3DL)的特定成员特异性识别HLA-B分子组，然而具有两个Ig-结构域(KIR2DL)的其他KIR识别HLA-C分子亚组。另外，据报道两种KIR3DL分子的同源二聚体识别HLA-A分子(Long等，http//www.ncbi.nlm.nih.gov/prow/guide/679664748_g.htm，1999，在此引入作为参考)。包括共价结合NKG2家族成员(NKG2A，-B，和-C)(Chang等，Eur.J.Immunol.252433-2437，1995；Lazetic等，J.Immunol.1574741-4745，1996，在此引入作为参考)的CD94的C-型凝集素-类受体特异性识别相对非-多态性的HLA-E分子(Braud等，Nature 391795-799，1991，在此引入作为参考)。CD94/NKG2A受体被认为通过装载有正确肽的HLA-E的细胞的识别，介导对NK细胞的抑制信号，所述正确肽由旁观者靶细胞表达。这种CD94/NKG2A介导的信号被认为在和正常自身细胞相遇期间阻止NK细胞的活化(例如，细胞毒性和细胞因子释放)。带有调节其自身耐受性的CD94/NKG2A受体的NK细胞能够杀伤已丧失了保护性HLA-E分子表达的细胞。保护性HLA-E分子是那些装载有来自其它特定MHC I型分子的信号序列的肽的HLA-E分子。
早期，人们认识到由嫁接到HLA-B*5801上的HLA-G前导序列组成的杂交体构建体转染到721.221细胞中，显著地上调该细胞系中保护性内源HLA-E的水平(Braud等，1991同上)。这些实验表明HLA I型分子前导序列必须存在用于稳定的成熟HLA-E蛋白的形成并且迁移到细胞表面被CD94/NKG2A抑制受体检测。
CD94/NKG2受体由人和小鼠的大部分NK细胞表达，并且分别与非典型MHC I型分子HLA-E和其鼠源同源物Qa-1b相互作用(Vance等，J.Exp.Med.1881841，1998；Braud等，Nature 3916669795，1998，每个在此处都引作参考)。NKG2A含有一个基于胞内免疫受体酪氨酸的抑制基元(ITIM)，介导抑制信号(Brooks等，J.Exp.Med.185795，1997，在此引入作为参考)，而NKG2C结合于含有接头分子DAP-12的基于免疫受体酪氨酸的激活基元(ITAM)，并且介导阳性信号(Lanier等，Immunity 8693，1998，在此引入作为参考)。据报道CD94/NKG2A/C受体可区分不同的HLA-E和Qa-1b结合肽(Kraft等人，J.Exp.Med.192613，2000；Llano等，Eur.J.Immunol.282854，1998；Vales-Gomez等，Embo J.184250，1999；Brooks等，J.Immunol.162305，1999，每个都在此处引作参考)，但是这种选择性的生理学重要性仍然不清楚。
为了避免由NK细胞介导的自身免疫攻击，已经有人提议一种自身-MHC I型分子的至少一种MHC I型特异性抑制受体应被每个单个NK细胞表达(Lanier等，Immunity 6371-378，1997，在此引入作为参考)。因为大多数正常细胞通常表达显著水平的所有MHC I型分子，从而防止被NK细胞介导的攻击。但是，一种或者几种MHC I型分子的缺失或者下调可以使这些细胞易受NK细胞(Id.)的破坏，所述MHC I型分子在特定病毒感染和致瘤性转化期间普遍存在。而且，来自患有自身免疫疾病，包括风湿性关节炎(RA)的病人的淋巴细胞表现出MHCI型分子的缺陷性表达(Fu等，J.Clin.Invest.912301-2307，1993，在此引入作为参考)。所述缺陷性表达对于NK细胞耐受性是否产生影响和对NK细胞是否具有作用还是未知的，通常，在RA中仍然是不清楚的。
但是在多种自身免疫性疾病的实验模型中，最新研究已经指出，NK细胞的调节功能似乎具有病理学意见。例如，NK细胞似乎通过以穿孔素依赖的方式控制效应子T细胞的应答在下调TH1-介导的大肠炎中具有重要的作用(Fort等，J.Immunol.1613256-3261，1998，在此引入作为参考)。在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型(一种人多发性硬化(MS)的模型中)，施用NK细胞刺激化合物三羧氨基喹啉可以保护小鼠免于疾病的发展，并且在同一模型中，NK细胞的缺失引起TH1细胞因子产量的增加以及疾病的恶化(Matsumoto等，Eur.J.Immunol.281681-1688，1998；Zhang等，J.Exp.Med.1861677-1687，1997，每个在此引入作为参考)。这些报道显示NK细胞的存在对于防止原型TH1-介导的疾病是有益的。相比之下，在鼠源哮喘模型(一种TH2-介导的疾病的原型中)，有人提出NK细胞的病理作用，其中NK细胞的缺失保护小鼠免于呼吸道上皮变应原-诱导的炎症的发展(Korsgren等，J.Exp.Med.189553-562，1999，在此引入作为参考)。
RA是一种自身免疫性疾病，其特征在于关节的慢性炎症引起软骨和骨的渐进性损伤。RA发作后，滑液区室不仅含有活化的T细胞，还含有粒酶-阳性的NK细胞(Tak等，Arthritis Rheum.371735-1743，1994，在此引入作为参考)。虽然有效的NK细胞刺激细胞因子，诸如IL-15，可以在关节中发现(Thurkow等，J.Pathol.181444-450，1997，在此引入作为参考)，但是新近分离的滑液NK细胞似乎细胞毒性较弱，并且与外周血(PB)来源的NK细胞相比更不可能产生IFN-γ(Lipsky，Clin.Exp.Rheumatol.4303-305，1986；Berg等，Clin.Exp.Immunol.1174-182，1999，每个都在此引入作为参考)。由于通过KIR-以及CD94/NKG2分子的信号传导已知调节NK细胞-介导的细胞毒性以及细胞因子的产生，所以研究炎症位点处NK细胞的受体用途是非常重要的。
热激蛋白(hsp)，例如hsp60在人和细菌之间的进化高度保守。Hsp60在所有活细胞生物体中均存在(Lindquist等，Annu.Rev.Genet.22631，1988；Bukau等，Cell 92351，1998，每个在此引入作为参考)。在真核细胞中，热激蛋白作为线粒体伴侣蛋白具有重要功能，并且在细菌中作为细胞内蛋白参与多亚基蛋白复合体装配和分解(Fink，Physiol.Rev.79425，1999，在此引入作为参考)。hsp60水平的增加由响应于多种应激所诱导，例如由温度的增加，营养的贫瘠，暴露于毒性化合物，炎症反应和同种异体移植排斥所诱导(Lindquist，1988，同上；Anderton等，Eur.J.Immunol.2333，1993；Birk等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 965159，1999，每个在此引入作为参考)。据信Hsp60在保护细胞免于这些有害刺激的作用中具有重要功能。同时，有可能使这些细胞更易受到hsp60-指导的先天和适应性免疫反应的攻击，并且已知hsp60是高度免疫原性的。例如，在感染过程中抗细菌-hsp60引发的免疫反应可以与自身-hsp60交叉反应。
Hsp60是哺乳动物自身免疫中的主要自身抗原。内源性hsp60的表达在慢性炎症组织(诸如，例如在风湿性关节中的组织)中高度提高，这一事实在研究自身免疫机制和疾病的研究小组中引起很大的兴趣。hsp60水平的增加也发现在细胞应激过程中，例如在高热的过程中。全身极高热被用作抗癌的治疗手段。
基于这些和其它的一些报道，在本领域尚未出现清楚的教导或者建议使用普通试剂以调控HLA-E/CD94/NKG2细胞受体互作，或者控制与HLA-E/CD94/NKG2细胞受体互作的改变和/或与细胞应激因子和相关疾病状态，包括炎症和自身免疫相关的异常免疫应答。类似的，可能与HLA-E/CD94/NKG2细胞受体互作的调节以及免疫应答的异常调节相关的应激-诱导的蛋白和肽的作用尚未阐明，所述免疫应答参与诸如慢性炎症和自身免疫的条件。
如上所述，本领域迫切需要其它的手段和方法调节HLA-E/CD94/NKG2细胞受体互作以及控制异常免疫应答，尤其是那些与潜在由细胞应激因子介导的HLA-E/CD94/NKG2细胞受体互作变化相关的异常免疫应答。对有效的组合物和方法以缓解与疾病状态，包括炎症，自身免疫和癌症相关的症状存在有关需要。令人惊奇的是，本发明实现了这些目的并且满足了其它的目的和优点，所述目的和优点根据下列描述将变得一目了然。
发明概述本发明提供使用促炎或者抗炎结合肽的方法和组合物以调节哺乳动物受试对象的免疫应答。通常，结合肽结合主要组织相容性复合体I型(MHC I型)分子，例如在抗原呈递细胞(APC)上的HLA-E MHC I型分子和促炎或者抗炎结合肽与HLA-E的结合复合体与MHC I型分子特异性抑制受体的互作。MHC I型-特异性抑制受体通常为CD94/NKG2细胞受体。促炎或者抗炎结合肽与HLA-E结合肽之间的互作调节结合肽/HLA-E复合体与受体之间的互作以在表达抑制受体的细胞群中产生免疫应答的新的调节。
在本发明更详细的方面，促炎或者抗炎结合肽与HLA-E结合肽之间的互作加强了细胞群或者其他受试对象，例如哺乳动物受试对象的促炎或者抗炎应答，所述哺乳动物患有自身免疫性疾病，炎性疾病或者状态(例如，慢性炎症，或者手术或者创伤引起的炎症)，移植排斥，病毒感染，癌症，或者其他适合通过调节免疫反应进行治疗的疾病或者状态。
在本发明的特定实施方案中，抗炎结合肽与呈递结合到HLA-E的肽的细胞表面上的HLA-E分子互作，并且产生的肽-HLA-E复合体由MHC I型-特异性抑制受体所识别。这种识别引起保护性免疫应答，其特征在于携带CD94/NKG2细胞受体的细胞产生的细胞毒性活性降低和/或一种或者多种抗炎细胞因子诱导表达降低。
在其它方面，本发明的促炎或者抗炎结合肽可以表现出在体内或者体外暴露于肽的细胞上上调表达HLA-E分子的活性。
在本发明的其它实施方案中，促炎结合肽与呈递结合到HLA-E的肽的细胞表面上HLA-E分子结合，并且产生的肽-HLA-E复合体干扰由MHC I-型特异性抑制受体的保护性识别。即，肽的结合抑制由CD94/NKG2细胞受体介导的保护性免疫应答。CD94/NKG2受体-介导的保护的这种抑制包括在促炎结合肽和一种或者多种保护性(即，抗炎)肽之间结合HLA-E的竞争，所述保护性肽通过与促炎结合肽的结合竞争无效或者被损坏。在本发明中，促炎结合肽竞争性占据了HLA-E结合间隙，并且在促炎结合肽和HLA-E之间的复合体没有被CD94/NKG2细胞受体识别。CD94/NKG2细胞受体-介导的保护的抑制由携带CD94/NKG2细胞受体的细胞(例如NK或者T细胞)的细胞毒性活性增加和/或一种或者多种促炎细胞因子诱导的表达增加所反映。
在促炎结合肽的情况下，如果所述促炎结合肽与抗炎结合肽竞争结合MHC I型分子，和/或刺激表达CD94/NKG2细胞受体的细胞的细胞毒性和/或促炎细胞因子的诱导应答，那么所述促炎结合肽将具有生物活性。
术语“抗原呈递细胞”是指一类能够向免疫系统的细胞呈递抗原的细胞，当其与主要组织相容性复合体分子互作时能够识别抗原。抗原呈递细胞通常通过将抗原加工成能够与抗原呈递细胞表面上的主要组织相容性复合体分子结合的形式介导对特异性抗原的免疫应答。抗原呈递细胞包括诸如巨噬细胞，T细胞和合成(“人工”)细胞的不同细胞类型。
通常，通过本发明的方法和组合物调节的免疫应答包括在表达MHC I型-特异性抑制受体的细胞中细胞毒性应答和促炎以及抗炎细胞因子的诱导。在示范性实施方案中，这些细胞选自自然杀伤(NK)细胞和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。诱导的免疫应答可以抑制或者加强一种或者多种NK或者T细胞的活性，包括抑制或者加强细胞毒性活性，细胞因子的产生，增殖，趋化性等等。
本发明的方法一般包含将受试对象暴露于有效量的本发明的促炎或者抗炎结合肽，所述促炎或者抗炎结合肽将结合到受试对象表面上的HLA-E分子并且增加或者抑制CD94/NKG2细胞受体与肽/HLA-E复合体在表面的结合。在本发明的特定方法中，受试对象为分离的或者结合的CD94/NKG2细胞受体，包括受体的膜或者细胞制备物，表达受体的细胞群，组织或者器官，或者哺乳动物病体。在更加具体的实施方案中，受试对象包括选择用于体内或者离体处理或者诊断过程的细胞群，组织或者器官。或者，受试对象可以为易受炎症或者自身免疫性疾病或者病症，病毒感染，移植排斥或者癌症影响的哺乳动物病体。在这些病例中，促炎或者抗炎结合肽可以以预防或者治疗有效的剂量给药以预防或者抑制相关疾病状态或者症状。
在本发明的其它具体实施方案中，给受试对象施用的促炎或者抗炎结合肽的药量能够有效增加或者抑制一种或者多种生物活性，所述生物活性选自(a)通过CD94/NKG2细胞受体与细胞表面，HLA-E分子或者HLA-E/肽复合体的结合(b)APC(例如，NK细胞或者CTL)的细胞毒性或者细胞因子诱导活性，或者(c)与炎症或者自身免疫性失调，病毒感染，移植排斥或者癌症相关的疾病症状或者状态。
促炎结合肽或者抗炎结合肽可以是自然发生的或者合成的肽。通常，肽为在天然的促炎或者抗炎结合肽中发现的肽类似物或者模拟物，或者等位基因的变体。肽，肽类似物或者模拟肽可以通过多种方式进行修饰，例如，通过基本上不改变肽的生物活性(例如，HLA-E结合活性)的其它氨基酸，肽，蛋白，化学试剂或者部分的插入，混合，或者结合。
在其它方面，本发明涉及HLA-E结合肽或者类似物的分析方法，包括如下步骤a)提供一个肽文库；b)形成HLA-E/肽复合体；c)选择能够抑制或者激活NK和T细胞上CD94/NKG2受体的稳定复合体；和d)从上述复合体分离稳定的肽/肽类似物。
在其它方面，本发明涉及在可药用载体中包括本发明任一肽的药物组合物。在本发明的方法和组合物中，促炎或者抗炎结合肽可以与可药用载体，稀释剂，赋形剂，佐剂或者其它的活性或者无活性试剂的不同组合进行配制，使用的量或者剂量形式足以预防或者缓解下述鉴定的一种或者多种选择的疾病状态或者症状。
在本发明的其它方面，促炎或者抗炎结合肽根据上述方法以与一种或者多种其它的抗病毒，抗炎，抗癌或者抗移植排斥治疗活性剂组合的制剂或者同等的治疗操作流程进行给药。在相关的方法和组合物中，促炎或者抗炎结合肽与一种或者多种这些辅助治疗剂混合或者共给药(同时或者顺序)以预防或者缓解下述鉴定的一种或者多种选择的疾病状态或者症状。
本发明还包括含有促炎或者抗炎结合肽，任选和其它活性或者无活性成分一起的试剂盒，包装和多容器单元，和/或用于诊断，控制和/或预防和治疗下述鉴定的选择的疾病状况或者症状的给药方法。通常，这些试剂盒包括促炎或者抗炎结合肽的诊断或者药物组合物，通常与生物上合适的载体进行配制并且任选包含在大的分散容器或者单元中或者以多单位剂量的形式。任选的包装材料可以包括标签或者说明书，以显示如下所示的试剂盒所需要的使用方法。
本发明的其它方面包括编码本发明促炎或者抗炎结合肽的多核苷酸分子和载体构建物体，包括肽模拟物和类似物。
本发明还提供了引发参与产生针对本发明的一种或者多种促炎或者抗炎结合肽的抗体的免疫应答的疫苗和其它免疫原性组合物，可以如下的详细描述用于诊断和/或治疗的目的。本发明还提供了下述描述中所详细阐述的多种其它的诊断和治疗的手段和试剂。


图1提供人hsp60的蛋白序列。线粒体靶信号用黑体表示。框内是四个肽序列，显示甲硫氨酸之后接着七个氨基酸，C端为亮氨酸或者异亮氨酸，甲硫氨酸和亮氨酸或者异亮氨酸是结合到HLA-E口袋的两个重要残基。Hsp60sp对应于序列中的残基10-18(QMRPVSRVL)。
图2显示在用HLA-E*0101或者HLA-E*01033转染的K562细胞上由hsp60sp和B7sp对HLA-E的稳定。在26℃用300mM的hsp60sp(左图，粗线)或者B7sp(右图，粗线)的过夜培养后，HLA-E*0101(上图)和HLA-E*01033(下图)的细胞表面的表达。虚线表示用300mM的对照肽(P18I10)培养后HLA-E的表达。细胞用抗-MHC I型mAb DX17染色，然后用RPE-连接的山羊-抗-小鼠IgG进行染色。HLA-E的表达通过用抗-HLA-E mAb 3D12的染色进行证实。用同种型匹配的对照抗体的染色显示为阴影的灰色。图2显示多于10个试验中的一个代表性试验结果。
图3证明通过过表达全长hsp60信号肽使得HLA-E的上调被细胞应激增强。在以密度增加生长的细胞上监控HLA-E的表面表达。在第1天和第5天之间收集细胞并分析HLA-E的表达(如柱状图的上端所示)。每个柱状图右上角的数字分别表示分析时细胞的密度(细胞/ml)和存活百分比。(a)中每个柱状图右下角的数字表示HLA-E表达的MFI(上端，黑色)以及GFP的MFI(下端，灰色)。(b)中每个柱状图右下角的数字表示HLA-E表达的MFI。所有的细胞用HLA特异性抗体(DX17，虚线)或者用对照Ig(灰色柱状图)，接着用RPE-连接的山羊抗-小鼠IgG染色。(a)用HLA-E*01033和全长(残基1-26)野生型hsp60信号肽-GFP构建体(野生型hsp60L，上图)或者突变体hsp60信号肽-GFP(突变的hsp60L，下图)共转染的K562细胞培养在细胞密度增加的条件下。门控设定在GFP阳性细胞并且在这个门控内获得了10 000个结果。(b)K562细胞(上图)和用HLA-E*01033转染的K562(K562E*01033，下图)培养在细胞密度增加的条件下。值得注意的是在(b)中的K562-E*01033细胞系和图(a)中所示的共转染细胞系的产生和选择都是独立的，可以说明在第1天所观察到的较高的HLA-E背景水平。因此，不应该在图3a和3b之间直接比较HLA-E的绝对水平。
图4显示可溶性HLA-E四聚体分子和CD94/NKG2受体的结合。(a)用CD94和NKG2A转染的Ba/F3细胞与HLA-E/B7sp四聚体-(粗线)，HLA-E/hsp60sp-四聚体(细线)，或者对照H-2Db/gp33-四聚体(虚线)一起培养。(b)用CD94，NKG2C和DAP-12转染的Ba/F3细胞与HLA-E/B7sp-四聚体(粗线)，HLA-E/hsp60sp-四聚体(细线)，或者对照H-2Db/gp33-四聚体(虚线)一起培养。(c)NK细胞系NKL与HLA-E/B7sp-四聚体(粗线)，HLA-E/hsp60sp-四聚体(细线)，或者对照H-2Db/gp33-四聚体(虚线)一起培养。(d)HB120 B-细胞杂交瘤(抗-MHC I型)与HLA-E/B7sp-四聚体(粗线)，HLA-E/hsp60sp-四聚体(细线，)或者对照H-2Db/gp33-四聚体(虚线)一起培养。所有培养均在4℃在添加有1％FCS的PBS中培养45分钟。HLA-E/hsp60sp-四聚体在HLA-E/hsp60sp-四聚体的浓度范围下不能既与CD94/NKG2A+又与CD94/NKG2C+细胞结合。这是所进行的多于5个实验中的一个代表性试验。
图5显示hsp60sp没能保护K562-E*01033细胞免遭NK细胞的杀伤。K562-E*01033与不同的肽在26℃培养15-20小时，然后用2小时51Cr释放试验进行检测。为了确保HLA-E和保护性肽的水平，并且不是如此的HLA-E水平，为了提供保护能力，在试验过程中我们保留了非保护性肽，但是忽略了B7sp。(a)在与300mM的P18I10对照肽，300mM的hsp60sp，或者30mM的B7sp培养后由NKL(左侧)或者Nishi(右侧)杀伤K562-E*01033细胞。50mM的P18I10对照肽和hsp60sp也包括在试验过程中。显示了E∶T比值为30∶1的数据。所示图代表了至少三个实验的平均值。误差棒显示平均值的标准误差。(b)在与30mM的B7sp，300mM的P18I10(pCtrl)，300mM的B7R5V，300mM的hsp60sp，或者300mM的hsp60V5R过夜培养后由NKL(左侧)或者Nishi(右侧)杀伤K562-E*01033细胞。在试验中包括50mM除了B7sp的所有肽。根据图5c选择肽的浓度。所示图代表至少三个试验的平均值。误差棒显示平均值的标准误差。(c)试验后K562-E*01033的HLA-E细胞表面表达。如(a)和(b)中所示平行制备冷靶制备物，然后用DX17 mAb(抗-HLA I型)，随后用RPE-连接的山羊-抗-小鼠IgG染色。显示了多于5个实验中的一个代表性试验。值得注意的是，如(a)和(b)中所示，在实验期间存在50mM除B7sp以外的所有肽，解释了用B7sp相比于用Hsp60sp，Hsp60V5R和B7R5V的HLA-E的低水平表达。(d)在室温下与0.1mM的B7sp和增加量的竞争肽(hsp60sp，hsp60.4，B7R5V和P18I10)培养30分钟后，由Nishi杀伤K562-E*01033细胞。在整个试验中保存所有的肽。
图6显示细胞应激后在K562-E*01033上HLA-E细胞表面水平的增加并不保护K562-E*01033细胞免于NK细胞介导的杀伤。(a)在2小时51Cr释放试验中由NKL杀伤K562-E*01033细胞(如图3b所示生长在细胞密度增加的条件下)。(b)在存在100mM B7sp的条件下进行如上所述的相同试验。闭合圈-高密度；正方形框-中等密度；闭合三角-低密度。(c)在细胞密度增加的条件下培养后HLA-E在K562-E*01033细胞上的表达。
图7显示在患有风湿性关节炎(RA)的病人滑液(SF)中存在的NK细胞比例的增加。从RA病人的SF和PB以及健康对照的PB中新近分离的单核细胞用抗CD56(PE-连接的)和CD3(Cychrome-连接的)mAb染色。门控设定在淋巴细胞群并且需要大约10,000个结果并通过流式细胞仪进行分析。在淋巴细胞门控内结果显示为CD56+CD3-细胞百分比的平均值±SEM。与病人的PB(9.4±1.3％；p＜0.05)相比，在SF(14.1±2.2％)的淋巴细胞中有CD56+CD3-细胞比例的增加。
图8A-8C显示SF-NK细胞为CD94亮和NKG2A+，表型类似于CD56亮PB-NK细胞的最少亚型。图8A从来自代表性RA病人的右和左膝(分别为中间和底端的柱状图行)的PB(上端的柱状图)和SF新近分离的单核细胞用抗CD94(DX22；粗线，中间柱状图柱)，NKG2A(Z199；粗线，右侧柱状图柱)或者cIg(点状线)然后用FITC-连接的山羊抗-小鼠Ig和抗CD3(Cychrome连接的)和抗CD56(PE连接的；粗线，左侧柱状图柱)的抗体进行三重染色。门控设定在淋巴细胞门控内的CD56+CD3-NK细胞群。值得注意的是，在PB-NK细胞中CD94染色有显著双相性(被分成CD94暗和CD94亮亚型)，并且大多数SF-NK细胞属于CD94亮NKG2A+亚型，而只有部分PB-NK细胞为NKG2A+。图8B计算在CD56+CD3-门控的淋巴细胞群内CD94暗，CD94亮和NKG2A表达细胞的百分比(在这个NK细胞门控内需要5000-10000个结果)。当与大多数为CD94暗(69.2±4.9％，n＝15)的PB-NK细胞(黑柱)相比时，明显增加的部分SF-NK细胞(白柱)属于CD94亮(78.5±3.0％，n＝17，p＜0.001)亚型。CD94亮SF-NK细胞增加的部分伴随着NKG2A+细胞的增加(93.6％，n＝6，p＜0.001)。图8CCD56亮PB-NK细胞的小亚型在表型上类似于SF-NK细胞大亚型。收集来自7个健康血液捐赠者的新近分离的相等数目的PB单核细胞并用下列抗体立即进行三重染色对照Ig(Y-轴，左上)，抗-KIR mAb(在Y-轴上的DX9，DX27和DX31，右上)，抗-CD94(在Y-轴上的DX22，左上)，和抗-NKG2A(在Y-轴上的Z199，右下)的混合物接着用PE-连接的山羊抗-小鼠抗体和抗-CD3(Cychrome连接的)以及抗-CD56(FITC连接的，X-轴)。在淋巴细胞门控内需要大约105个结果以获得在CD56亮细胞群内至少103个结果，并且分析门控设定在CD3-细胞。值得注意的是，KIR表达限定到CD56暗NK细胞群，而CD56亮细胞群为KIR-并且表达高水平的CD94和NKG2A。
图9A-9C显示SF-NK细胞功能性识别HLA-E。图9A体外培养的来自两个病人的多克隆SF-NK细胞系用作Alamar-蓝细胞毒性试验的效应物抗未转染的721.221细胞(HLA I型，黑柱)，GL-B*5801转染的细胞(表达嵌合蛋白的721.221细胞，其中HLA-G前导肽被移植到HLA-B*5801蛋白上，阴影柱)和野生型HLA-B*5801转染的721.221细胞(白柱)。E/T的比值为1∶1。图9B用图8A使用的相同两种多克隆SF-NK细胞系作为Alamar-蓝细胞毒性试验中(E/T的比值为1∶1)的效应物抗未转染的721.221细胞(HLA I型，白柱)和GL-B*5801转染的细胞(黑柱)进行试验。用特异性mAb阻断MHC I型分子或者CD94逆转由GL-B*5801转染的细胞上HLA-E表达所赋予的保护。抗-CD94(DX22)，抗-HLA I型分子(w6/32)或者cIg在细胞毒性实验期间以1μg/ml的浓度存在。图9C四聚体HLA-E分子亮染大多数SF-NK细胞。从代表性RA病人的PB(左侧)和SF(右侧)新近分离的细胞用对照四聚体(连接到链霉亲和素-PE的小鼠H2-Kb分子，上轮廓图的Y-轴)和HLA-E四聚体分子(在Y-轴上连接到链霉亲和素-PE的HLA-B*0701九聚体肽存在的条件下重新折叠，下轮廓图)和CD56-FITC(X-轴)进行染色。门控设定在CD3-Cycrome-淋巴细胞。
图10显示结合自身-HLA I型分子的CD94/NKG2A为主要的受体/配体互作，保护自身细胞免遭SF-NK细胞的溶解。在图9A和9B(病人2)中分析的多克隆SF-NK和PB-NK细胞系以E/T为4∶1的比率被用于4小时51Cr-释放细胞毒性试验抗EBV-转化的自身细胞。用特异性mAb阻断MHC I型分子(阴影柱)或者CD94/NKG2A(黑柱)诱导自身细胞的杀伤，但是cIg(白柱)没有效果。当使用SF-NK细胞作为效应物时，在抗-MHC I型或者抗-CD94 mAb存在的条件下观察到相似的杀伤水平，表明大多数自身保护来源于自身细胞上CD94/NKG2A和HLAI型分子的互作。抗-CD94(DX22)或者抗-HLA I型分子(w6/32)，或者cIg在细胞毒性实验期间以1μ/ml的浓度存在。
图11显示SF-NK细胞结合到带有示范性VMAPRTVLL肽的复合体的HLA-E。四聚体HLA-E/B7sp分子亮染大多数SF-NK细胞。从代表性RA病人的PB(左侧)和SF(右侧)新近分离的细胞用对照四聚体(连接到链霉亲和素-PE的小鼠H2-Kb分子，上轮廓图的Y-轴)和HLA-E四聚体分子(在Y-轴上连接到链霉亲和素-PE的VMAPRTVLL肽存在的条件下重新折叠，下轮廓图)和CD56-FITC(X-轴)进行染色。门控设定在CD3-Cycrome-阴性淋巴细胞。
图12显示SF-NK细胞结合到带有VMAPRTVLL(B7sp)肽的复合体的HLA-E而非结合到带有QMRPVRSVL(hsp60sp)肽的复合体的HLA-E。四聚体HLA-E/B7sp分子亮染大多数SF-NK细胞(上排，中间轮廓图)和部分SF-T细胞(下排，中间轮廓图)。没有观察到用HLA-E/hsp60sp染色的SF-NK细胞或SF-T细胞(分别在上排，右侧轮廓图和下排，右侧轮廓图)。对照四聚体染色(结合到链霉亲和素-PE的小鼠H2-Kb分子)显示在左侧。
图13显示通过用LPS刺激与RA病人或者健康个体的PB-NK细胞相比，SF-NK细胞更易于产生IFN-γ和TNF-α。在GolgiStopTM存在的条件下用LPS(10mg/ml)过夜刺激PB和SF单核细胞(MC)，或者用K562(1∶1细胞比率)刺激4小时。细胞表面染色CD3和CD56并且然后细胞内染色IFN-γ或TNF-α。用流式细胞仪进行分析。
图14显示在用IL-2刺激后，与PB-NK细胞相比SF-NK细胞更易于产生IFN-γ。用IL-2(200U/ml)过夜刺激PB和SF单核细胞(MC)。细胞表面染色CD3和CD56并且然后细胞内染色IFN-γ或TNF-α。用流式细胞仪进行分析。
图15显示呈递B7信号肽(VMAPRTVLL)的HLA-E足以抑制NK细胞IFN-γ和TNF-α细胞因子的产生。在用HLA-E*01033转染的K562细胞上HLA-E的表达通过和不同剂量的来自肽(VMAPRTVLL)的HLA-B7信号序列一起培养进行稳定。在GolgoStopTM存在的条件下RA病人的PB和SF单核细胞(MC)和肽稳定的K562细胞(1∶1的细胞比率)一起培养4小时。细胞表面染色CD3和CD56并且然后细胞内染色IFN-γ或TNF-α。用流式细胞仪进行分析。
具体实施方案的描述本发明通过提供用于诊断和治疗炎性疾病和状态，自身免疫失调，病毒感染，移植排斥和癌症等疾病和状态的新的方法和组合物满足了上述需要并且实现了其它的目的和优点。这些组合物和方法使用促炎或者抗炎结合肽以调节受试对象，通常是患有能够根据本发明的方法和组合物进行治疗的疾病和状态的哺乳动物受试对象的免疫应答。
本发明使用的肽表现出与主要组织相容性复合体I型(MHC I型)分子的特异性结合互作，例如与HLA-E MHC I型分子的特异性结合互作。通常，这些MHC I型分子存在于抗原呈递细胞(APC)上。MHC I型分子和结合在MHC I型分子的结合间隙中的肽之间通过细胞暴露于肽形成复合体。产生的结合复合体与MHC I型分子特异性抑制受体，通常是CD94/NKG2细胞受体(包括与NKG2A或者其剪接变体NKG2B成对的CD94)互作。促炎或者抗炎结合肽和HLA-E结合肽(任选包括其它的结合肽)之间的互作调节结合肽/HLA-E复合体和受体之间的互作，以在表达抑制受体的细胞群中产生新的调控免疫应答。
术语“主要组织相容性复合体分子”是指在抗原呈递细胞上能够与抗原结合形成抗原相关的抗原呈递细胞的分子。由NK细胞和T细胞识别抗原相关的呈递细胞由CD94/NKG2细胞受体介导。
由重链和非共价连接的β-2-微球蛋白分子组成的I型分子包括接受促炎或者抗炎结合肽的间隙或者裂隙。因此，肽具有使肽进入裂隙的大小和尺度。裂隙的大小和尺度是本领域技术人员所公知的(F.Latron Science 257964-967，在此引入作为参考)。优选的，虽然肽基本上适合存在于裂隙中，但是当与I型分子结合时依然易接近能够识别抗原的NK或者T细胞。通常，肽长度为大约4-24个氨基酸，常常长度为大约6-15个氨基酸，更经常长度为大约8-10个氨基酸。在典型的实施方案中，肽为九聚体。通常，肽的两个氨基酸为疏水残基，用于将肽保持在裂隙中。肽可来自于，例如肿瘤组织，病毒蛋白或者细菌蛋白。
在本发明的相关实施方案中，促炎或者抗炎结合肽在与正常或者异常(例如，癌化或者病毒感染的)细胞相遇过程中阻止或者诱导NK细胞激活(例如，细胞毒性和细胞因子释放)。携带调节自身耐受性的CD94/NKG2受体的NK细胞能够杀伤已丧失保护性HLA-E分子表达的细胞。
在本发明更详细的方面，促炎结合肽为来自另一种MHC I型分子的信号序列的肽。抗炎肽通常为来自应激诱导的或者应激相关的蛋白，或者热激蛋白(hsp)，例如hsp60的肽。和经典的MHC I型分子相反，HLA-E表现相当有限的多态性，并且其肽结合间隙主要被来自特定HLA-A，-B，-C和-G分子的信号序列的九聚体肽所占据(Lazetic等，J.Immunol.1574741-4745，1996，在此引入作为参考)。这些肽通常具有相同的基元甲硫氨酸在2位，亮氨酸或者异亮氨酸在9位(Arnett等，Arthritis Rheum.31315-324，1988，在此引入作为参考)。此外，这些肽也表现出第三个共同的基元元件，就是在4位的脯氨酸残基。共有这种结构域或类似结构的肽用作候选肽在本发明中进行筛选以鉴定可操作的促炎和抗炎结合肽，所述促炎和抗炎结合肽能够结合HLA-E并且通过调节与CD94/NKG2细胞受体的互作介导免疫应答的调节。
在本发明的特定实施方案中，HLA-E结合肽来自应激诱导的蛋白的信号序列。例如，示范性肽可以选自应激诱导的肽hsp60。在本发明的一个实施方案中，hsp60为九聚体。优选肽的例子为(标准的单字母代码)VMAPVTVLL和QMRPRSRVL。
为了鉴定来自人hsp60的肽结合HLA-E的潜力，扫描hsp60的全长氨基酸序列寻找显示HLA-E允许的基元的肽(在C-末端2位的甲硫氨酸，随后是在C端9位的亮氨酸或者异亮氨酸)。在所鉴定的四种这样的肽中(图1；表1)，一种肽(QMRPVSRVL，命名为hsp60sp)的最初选择是基于其在hsp60前导序列中的位置。另外，hsp60不仅在2位含有甲硫氨酸，在9位含有亮氨酸，而且和一些已知能够有效结合到HLA-E的肽一样在4和8位具有相同的氨基酸(表1)。尤其是，在hsp60的九个氨基酸中有4个与在HLA I前导序列中发现的一些肽相同(例如，HLA-A*0201和-A*3401，表1)。
表1.HLA I型分子和hsp60之间肽序列的比较蛋白 (残基) 肽序列 信号肽(SP)成熟蛋白(P)HLA-A*0201 (3-11) VMAPRTLVL SPHLA-A*0301 (3-11) VMAPRTLLL SPHLA-A*3401 (3-11) IMAPRTLVL SPHLA-B*0701 (3-11) VMAPRTVLL SPHLA-Cw*0102 (3-11) VMAPRTLIL SPHLA-G*0101 (3-11) VMAPRTLFL SPhsp60sp (10-18) QMRPVSRVL SPhsp60.2 (39-47) LMLQGVDLL Phsp60.3 (144-152)VMLAVDAVI Phsp60.4 (216-224)GMKFDRGYI P根据本发明的组合物和方法可治疗和诊断的疾病和状态包括，但不限于风湿性关节炎，幼年关节炎，Chron氏病以及溃疡性结肠炎，急性髓细胞白血病，多发性硬化，胰鸟素依赖型糖尿病，全身性红斑狼疮，SjUgren综合症，Basedow病，Hashimoto病，自身免疫性溶血性贫血，癌症(例如，卵巢癌)，心肌病，早期心血管疾病，动脉粥样硬化，高血压，Hodgkin氏病，移植或者移植排斥。在支持这种广泛性应用本发明的示范性报道中，NK细胞在通过以穿孔素依赖的方式控制效应T细胞的应答在下调TH1-介导的大肠炎中具有重要作用(Fort等，J.Immunol.1613256-3261，1998，此处引入作为参考)。在实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)模型(一种人多发性硬化症(MS)的模型)中，给药NK细胞刺激的化合物三羧氨基喹啉可以保护小鼠免于疾病的发展，并且在相同的模型中，NK细胞的缺失能够引起TH1细胞因子产量的提高以及疾病的恶化(Matsumoto等，Eur.J.Immunol.281681-1688，1998；Zhang等，J.Exp.Med.1861677-1687，1997，每个在此引入作为参考)。这些报道显示NK细胞的存在对于防止原型TH1-介导的疾病是有益的。相比之下，有人提出了NK细胞在鼠源哮喘模型(一种原型TH2-介导的疾病模型)中的病理作用，其中NK细胞的缺失保护小鼠免遭呼吸道上皮中变应原-诱导的炎症的发展。
为了鉴定其它源于热激蛋白(hsp)的肽以及其它的蛋白，采用如上用于hsp60的类似的合理设计和筛选方法。可能结合HLA-E的候选hsps可基于此处描述的结构因素，以及在介导疾病状态的发作或恶化的已知活性进行鉴定。如下表2和3所示，下列的很多hsp参与适用根据本发明的方法和组合物进行治疗的严重疾病和状态。为了鉴定来自这些受试对象具有与疾病相关的已知损伤活性的蛋白的候选促炎或者抗炎结合肽，扫描蛋白的全长氨基酸序列寻找显示HLA-E允许的基元的肽(例如2位的甲硫氨酸之后是在C-末端的9位的亮氨酸或者异亮氨酸)。这样鉴定的候选肽根据这里阐述的方法进行评价和筛选。
表2.与疾病有关的hsp60水平增加的报道

表3.疾病中涉及的热激蛋白(hsp)

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此外，也已经分析了多种其它的蛋白以确定用于本发明范围内的候选促炎或者抗炎结合肽。在这种示范性分析中，进行BLAST搜索以鉴定智人β防卫素2(HBD2)基因中的一段与人hsp60前导序列表现85％氨基酸同一性的核苷酸。阅读框架从位点HBD2718到659开始(-2)反向，并且表现出与hsp60-前导肽85％的同源性。
BLAST搜索的结果gi|3818536|gb|AF071216.1|AF071216，完全cds分数＝37.0比特(84)，期望值＝0.34同一性＝17/20(85％)，阳性率＝18/20(90％)读框＝-2查询人hsp60sp1 MLRLPTVFRQMRPVSRVLAP 20同一性 ML LPTVF QMRPVSR+LAPHBD2718 MLPLPTVFHQMRPVSRLLAP 659从这些和其它实验蛋白和肽序列，扫描氨基酸序列寻找显示HLA-E允许的基元的肽。根据此处阐述的方法评估和筛选这样鉴定的候选肽。表4列举了大量本发明使用的候选HLA-E结合肽。
表4推测的来自携带POS.2M，POS.4.P和POS.9I或L的非MHC人蛋白的HLA-E结合肽




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通过使用具有结合HLA-E的强大能力并且可能与HLA-E间隙中的保护性MHC I-类分子竞争的hsp60信号肽或者其它的促炎HLA-E结合肽(例如，来自应激蛋白，热激蛋白或者处公开的其它蛋白)，及其类似物，可以发展一种新的治疗手段以诱导NK细胞的激活并且降低激活表达能抗肿瘤细胞的CTL的CD94-NKG2A的阙值，所述肿瘤细胞基于保留的保护性HLAE表达已经逃避了免疫检测。这些组合物和方法包括将病人的肿瘤细胞或者癌组织暴露于治疗有效量的促炎结合肽，由此将阻止或者抑制肿瘤细胞或者癌组织的生长。
相关方法应用于病毒感染细胞的治疗。将这种感染的细胞暴露于治疗有效量的促炎结合肽产生与HLA-E间隙中的保护性MHC I-类分子竞争的肽以诱导NK细胞的激活并且降低激活表达抗病毒感染的细胞的CTL的CD94-NKG2A的阙值，否则所述病毒感染的细胞可能逃避免疫检测。
肽类似物和模拟物包括用于本发明的在定义范围内的生物活性肽为天然或者合成的治疗用或者预防用活性肽(包括两个或者多个共价连接的氨基酸)，肽类似物和化学修饰的活性肽的衍生物或者盐。通常，肽为突变蛋白，可以通过部分取代，插入，或者缺失天然存在的或者原始(例如，野生型，自然发生的突变体，或者等位变异体)的肽序列很容易的获得。此外，还包括天然肽的生物活性片段。这种突变衍生物和片段基本上保留了天然肽所需要的生物活性。在肽具有碳水化合物链的情况下，由这些碳水化合物种类中的生物活性改变所引起的变异体也包括在本发明的范围内。
在其它的实施方案中，本发明所使用的肽可通过插入或者结合合成的聚合物，诸如聚乙二醇，一种天然聚合物，诸如透明质酸，或者任选的糖(例如，半乳糖，甘露糖)，糖链或者非肽类化合物进行修饰。通过这类修饰添加到肽上的物质可以指定或者加强肽结合到特定受体或者抗体，或者增强粘膜递送，活性，半衰期，细胞-或者组织-特异性靶向，或者肽的其它有益特性。例如，这类修饰可以使肽更加亲脂，例如诸如可通过插入或者连接磷脂或者脂肪酸得以实现。在本发明的方法和组合物范围内还包括通过连接(例如化学键)两种或者多种肽，蛋白片段或者功能结构域(例如，细胞外，跨膜和胞质结构域，配体-结合区，活性位点结构域，免疫原性抗原决定簇等)而制备的肽--例如重组产生的融合肽，以将多种不同肽的功能元件整合到单个编码的分子中。
因此，用于本发明方法和组合物中的生物活性肽包括天然或者“野生型”肽和这些分子天然发生的变异体，例如，天然发生的等位基因变异体和突变蛋白。还包括合成的，例如化学或者重组工程的肽，以及肽和蛋白“类似物”和天然发生的肽的化学修饰衍生物，片段，结合物和聚合物。此处所用的术语肽“类似物”是指包括与所选择的肽的天然氨基酸序列相比整合了一个或者多个氨基酸取代，插入，重排或者缺失的修饰肽。这样修饰的肽和蛋白类似物与相应的天然肽相比表现出基本上保守的生物活性，意味着相比于相应的天然蛋白或者肽的活性水平至少50％，通常至少75％，常常85％-95％或者更高的活性(例如，特异性结合到HLA-E分子，或者结合到表达HLA-E的细胞，肽/HLA-E复合体与CD94/NKG2细胞受体的互作等)水平。
也提供了促炎或者抗炎结合肽与其它同源或者异源肽之间的融合多肽。很多生长因子和细胞因子也是同源二聚体，并且连接形成“簇肽”的肽重复构建体具有多种优点，包括减低对蛋白酶解降解的易感性。也提供了多种多样的其它包括本发明的肽的多聚体构建体。在一个实施方案中，提供了多种多肽融合体，如美国专利No.6,018,026和5,843,725所述，通过将本发明的一种或者多种促炎或者抗炎结合肽与异源的多聚体多肽，例如免疫球蛋白重链恒定区，或者免疫球蛋白轻链恒定区相连制备。这样构建的生物活性多聚体多肽融合体可以是异源-或者同源-多聚体，例如异源二聚体或者同源二聚体，每个可以包括一个或者多个本发明不同的促炎或者抗炎结合肽。其它的异源多肽也可以与肽结合产生包括，例如表现异源(例如，CD4)受体结合特异性的杂合蛋白的融合体。类似的，异源融合体可被构建成显示衍生蛋白的特性或者活性的组合。其它典型的例子为报告多肽的融合体，例如，CAT或者荧光素酶与本发明肽的融合体，以促进融合蛋白的定位(例如，参见Dull等人的美国专利4,859,609，在此引入作为参考)。本发明中有用的其他基因/蛋白融合伴侣包括细菌β-半乳糖苷酶，trpE，蛋白A，β-内酰胺酶，α-淀粉酶，乙醇脱氢酶和酵母α-交配因子(例如，参见Godowski等，Science 241812-816，1988，在此引入作为参考)。
本发明也设想使用通过与化学部分共价或者聚集结合所修饰的促炎或者抗炎结合肽。这些衍生物通常分为三类(1)盐，(2)侧链和末端残基共价修饰，和(3)例如和细胞膜的吸附复合体。这种共价或者聚集的衍生物可用于多种目的，例如作为免疫原，作为免疫分析的试剂或者在诸如用于配体或者其它结合配体亲和纯化的纯化方法中。例如，促炎或者抗炎结合肽可通过本领域技术人员公知的方法共价结合到诸如溴化氰激活的琼脂糖的固相支持物上，或者使用或者不使同戊二醛交联吸附到聚烯烃表面上进行固定，用于特异性结合促炎或者抗炎结合肽的抗体的分析或者纯化中。促炎或者抗炎结合肽也可用可检测的基团进行标记，例如通过氯胺T的放射性碘标记程序共价连接到稀土元素螯合物，或者连接到另一荧光部分用于诊断分析。
为了本发明的目的，术语生物活性肽“类似物”进一步包括天然肽的衍生物或者合成变异体，诸如氨基和/或羧基末端缺失和融合，以及序列内插入，取代或者缺失单个或者多个氨基酸。插入氨基酸序列的变异体为其中一个或者多个氨基酸残基被导入蛋白预定位点的那些变异体。利用合适的筛选所产生的产物使得随机插入也是可能的。缺失变异体的特征在于从序列去除一个或者多个氨基酸。取代的氨基酸变异体为那些序列中至少一个残基已被去除并且不同的残基插入该位点的氨基酸变异体。
当天然肽用氨基酸取代修饰时，通常氨基酸被其它具有类似的保守的相关化学特征诸如疏水，亲水，带负电，小的或者大侧链等的氨基酸取代。因此，与天然肽序列不相同的残基位置被具有类似化学特征，诸如电荷或者极性的氨基酸替代，其中这些改变基本上不可能影响肽类似物的特征。这些和其它微小的改变通常基本上保持了修饰肽的生物特征，包括生物活性(例如，结合到吸附分子，或者其它的配体或者受体)，免疫同一性(例如，被识别天然肽的一种或者多种单克隆抗体识别)，和其它的相应的天然肽的生物学特征。
此处所有的术语“保守的氨基酸取代”通常是指具有类似侧链的氨基酸残基的可交换性。例如，具有脂肪族侧链的通用可交换氨基酸组为丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的氨基酸组为丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的氨基酸组为天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的氨基酸组为苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的氨基酸组为赖氨酸，精氨酸和组氨酸；以及具有含硫侧链的氨基酸组为半胱氨酸和甲硫氨酸。保守取代的例子包括非极性(疏水)残基，诸如异亮氨酸，缬氨酸，亮氨酸或者甲硫氨酸取代另一个氨基酸。类似的，本发明也提议了极性(亲水)残基的取代，诸如精氨酸和赖氨酸之间，谷氨酰胺和天冬酰胺之间，以及苏氨酸和丝氨酸之间。另外，诸如赖氨酸，精氨酸或者组氨酸的碱性残基取代另一个氨基酸或者诸如天冬氨酸或者谷氨酸的酸性残基取代另一个氨基酸也被考虑在内。示范性保守氨基酸取代基为缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，赖氨酸-精氨酸，丙氨酸-缬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
术语生物活性肽类似物进一步包括整合了20个常规氨基酸，或者非自然氨基酸，诸如，α，α-二取代氨基酸，N-烷基氨基酸，乳酸的立体异构体(例如，D-氨基酸)的修饰形式的天然肽。这些和其它非常规氨基酸也可被取代或者插入本发明有用的天然肽中。非常规氨基酸的例子包括4-羟基脯氨酸，γ-羧基谷氨酸，ε-N，N，N-三甲基赖氨酸，ε-N-乙酰赖氨酸，O-磷酸丝氨酸，N-乙酰丝氨酸，N-甲酰甲硫氨酸，3-甲基组氨酸，5-羟基赖氨酸，ω-N-甲基精氨酸，和其它的类似氨基酸和亚氨酸(例如，4-羟基脯氨酸)。此外，生物活性肽类似物包括单个或者多个取代，缺失和/或添加天然发生或者人工合成的碳水化合物，脂质和/或类蛋白质(proteinaceous)部分作为实验肽结构组分，或者结合到肽或者与肽结合。
为了促进本发明的肽和蛋白类似物的产生和应用，可以参考分子系统发生学的研究，表征不同的种，属，族或者其它分类组的成员之间(例如，不同的应激诱导的或者热激蛋白，家族成员，等位基因变异体，和/或自然发生的突变体之间，包括在诸如人，鼠，大鼠和/或牛的不同种类中发现的同源蛋白之间)的保守和不同的蛋白结构和功能元件。在此方面，有用的研究将在精细分子水平上提供结构-功能关系的详细评价用于修饰此处公开的大多数肽以促进可操作肽和蛋白类似物的产生和选择。这些研究包括，例如，在例如实验促炎或者抗炎结合肽的多种同种型或者物种或者等位基因变异体之间鉴定保守和不同结构元件的详细序列比较。这些保守和不同的结构元件分别通过指出用于修饰天然肽以赋予所需要的结构和/或功能改变的有用的靶点，从而有助于实施本发明。
在本发明中，可以分析现有的序列比对并且可以采用常规的序列比对方法以产生用于分析的序列对比，从而例如在物种内蛋白家族成员之间，以及在目的蛋白的物种变异体之间鉴定相应的蛋白区和氨基酸位置。这些比较可用于鉴定保守的和不同的目的结构元件，而后者常常用于整合到生物活性肽中产生其功能类似物。通常，在不同的参考肽序列中，一个或者多个标记不同目的结构元件的氨基酸残基被整合到功能性肽类似物中。例如，编码天然促炎或者抗炎结合肽的cDNA可以在一个或者多个相应的氨基酸位点(即，在异源参考肽序列中，根据可接受的比对方法匹配或者跨越类似比对的序列元件到标记目的结构元件的残基的相应位点，所述异源参考肽序列诸如实验促炎或者抗炎结合肽的同种型，物种或者等位变异体，或者合成的突变体)进行重组修饰以编码在天然肽中改变相应残基的氨基酸缺失，取代或者插入以产生本发明的可操作肽类似物-具有和参考肽类似的结构和/或功能元件。
在该构建生物活性肽类似物的合理设计方法中，在相应于异源参考肽的目的结构元件的氨基酸位点残基的天然或者野生型同一性可被改变成与参考肽中相应的氨基酸残基的相同的，或者保守相关的残基同一性。但是，通常可以根据相应的参考蛋白残基非保守性地改变天然氨基酸残基。尤其是，很多非保守氨基酸取代，尤其是在更易被修饰的不同位点，可以产生与天然肽的功能相比中等受损或者中性效果，或者甚至增强了所选择的生物活性。
预测有用肽和蛋白类似物以及模拟物的序列比对和比较可以通过天然生物活性肽的晶体结构分析，连同本领域公知的计算机模型方法进一步加以改进(例如，参考，Lebermann等，J.Molec.Biol.177531-556，1984；Huber等，Biochemistry 288951-8966，1989；Stein等，Nature 34799-102，1990；Wei等，Structural Biology 1251-255，1994，每个都在此引入作为参考)。这些分析可以进行更详细的结构-功能作图以鉴定所需要的结构元件和修饰，用于整合到肽和蛋白类似物以及模拟物中，与用于本发明方法和组合物中的天然肽相比表现大体上相同的活性。
本发明的生物活性肽和蛋白类似物通常显示与相应的天然肽序列大体上的序列同一性。术语“大体上的序列同一性”是指两个实验氨基酸序列，当任选比对时，诸如通过利用缺省缺口罚分的GAP或者BESTFIT程序，具有至少65％的序列同一性，通常80-85％的序列同一性，常常至少90-95％或者更高的序列同一性。“氨基酸序列同一性百分比”是指两个肽当任选比对比较氨基酸序列时具有相同氨基酸的大约指定的百分比。序列比较通常通过至少10个残基位点的比较窗，常常是通过至少15-20个氨基酸的比较窗，与参考序列进行比较，其中通过将参考序列与第二个序列的比较计算序列同一性的百分比，后者可以代表，例如包括一个或者多个缺失，取代或者添加的肽类似物序列，其总共占20％，通常低于比较窗参考序列的5-10％。参考序列可以是较大序列的子集，例如来自hsp60前导序列残基的子集。用于比对比较窗的序列的最佳比对可以根据Smith和Waterman的局部同源性运算法则(Adv.Appl.Math.2482，1981)，根据Needleman和Wunsch的同源性运算法则(J.Mol.Biol.48443，1970)，通过Pearson和Lipman类似性方法检索(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444，1988)，或者通过这些算法的计算机操作(GAP，BESTFIT，FASTA，和/或TFASTA，例如，提供在Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0，GeneticsComputer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)进行。
通过将肽类似物最佳与相应的天然肽进行比对，并且通过使用合适的分析，例如粘附蛋白或者受体结合分析以确定所选择的生物活性，人们可以很容易的鉴定用于本发明方法和组合物的可操作肽和蛋白类似物。可操作肽和蛋白类似物通常与针对相应的天然肽的抗体发生特异性免疫反应。同样，编码可操作肽和蛋白类似物的核酸如上所述与编码相应天然肽的核酸具有大体上的序列同一性，并且通常在可接受的温和或者高度严格的杂交条件下选择性杂交于编码相应天然肽或者其片段的部分或者全部核酸序列(参见，例如Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual，第三版，Cold Spring HarborLaboratories，Cold Spring Harbor，N.Y.，2001，在此引入作为参考)。术语“选择性杂交于”是指杂交双链或者优选结合于特定靶DNA或者RNA序列的核酸探针之间的选择性互作，例如当靶序列存在于异源制备物中，诸如总细胞DNA或者RNA。通常，编码生物活性肽和蛋白类似物或者其片段的核酸序列将在严格条件(例如，选择比在确定离子强度和pH下实验序列的热解链温度(Tm)低约5℃，其中Tm为在确定离子强度和pH条件下有50％的互补或者靶序列杂交于完全匹配的探针时的温度)下杂交于编码相应天然肽的核酸序列。为了讨论核酸探针设计和退火条件，例如参见，Sambrook等，分子克隆实验室手册(Molecular CloningA Laboratory Manual)，第三版，第1-3卷，ColdSpring Harbor Laboratory，2001或者当代分子生物学操作流程(CurrentProtocols in Molecular Biology)，F.Ausubel等编辑，Greene Publishing和Wiley-Interscience，New York，1987，其中每个都在此引入作为参考。通常，严格或者选择性条件将是那些盐浓度在pH7时为至少大约0.02摩尔，并且温度为至少大约60℃。也可以选择较不严格的选择性杂交条件。因为其它因素也可显著影响杂交的严格性，其中包括互补链的碱基组成和大小，有机溶剂的存在和碱基错配的程度，所以组合的参数比任何一个具体的测定值都重要。
本发明的其它方面提供了肽模拟物，包括模拟所选择的天然肽功能结构域(例如，结合基元和活性位点)的三级结合结构和活性的肽或非肽分子。这些肽模拟物包括重组或者化学修饰的肽，以及诸如下述的小分子药物模拟物的非肽试剂。
在一个方面，本发明所使用的肽(包括多肽)通过用其它的侧链代替20个基因编码的氨基酸(或者D氨基酸)的一个或者多个天然发生的侧链进行修饰产生肽模拟物，例如用诸如烷基，低级烷基，环4-，5-，6-，到7-员烷基，酰胺，酰胺低级烷基，酰胺二(低级烷基)，低级烷氧基，羟基，羧基和其低级酯衍生物，以及用4-，5-，6-，到7-员杂环代替。例如，脯氨酸类似物可被制成脯氨酸残基的环的大小从5员变到4，6或者7员。环基团可以为饱和或者不饱和的，并且如果是不饱和的，可以是芳香族或者非芳香族的。杂环基团可以含有一个或者多个氮，氧和/或硫杂原子。这种基团的例子包括呋咱基，呋喃基，咪唑烷基，咪唑基，咪唑啉基，异噻唑基，异噁唑基，吗啉基(例如，吗啉代)，噁唑基，哌嗪基(例如，1-哌嗪基)，哌啶基(例如，1-哌啶基，哌啶子基)，吡喃基，吡嗪基，吡唑烷基，吡唑啉基，吡唑基，哒嗪基，吡啶基，嘧啶基，吡咯烷基(例如，1-吡咯烷基)，吡咯啉基，吡咯基，噻二唑基(thiadiazolyl)，噻唑基，噻吩基，硫代吗啉基(例如，硫代吗啉代)和三唑基。这些杂环基可被取代或者不取代。当基团被取代时，取代基可以为烷基，烷氧基，卤素，氧或者取代的或者未取代的苯基。
肽，以及肽和蛋白类似物和模拟物也可以根据描述于美国专利No.4,640,835；美国专利No.4,496,689；美国专利No.4,301,144；美国专利No.4,670,417；美国专利No.4,791,192；或者美国专利No.4,179,337的方式共价结合到一个或者多个不同的非类蛋白聚合物，例如聚乙二醇，聚丙二醇或者聚氧化烯，上述所有专利以其全文在此引入作为参考。
本发明范围的其它肽和蛋白类似物和模拟物包括糖基化变异体，以及与其它化学部分的共价或者聚集结合体。共价衍生物可以通过本领域公知的方式将官能团连接到在氨基酸侧链或者在N-或C-末端发现的基团上进行制备。这些衍生物包括但不限于羧基末端，或者含有羧基侧链的残基的脂肪族酯或者酰胺，含羟基残基的O-酰基衍生物，以及氨基末端氨基酸或者含氨基残基，例如赖氨酸或者精氨酸的N-酰基衍生物。酰基基团选自烷基部分，含有C3到C18个标准烷基的基团，从而形成烷酰基芳酰基物种。也可以采用共价结合到载体蛋白，例如免疫原性部分。
除了这些修饰，也可以，例如通过在其合成和加工过程中，或者进一步的加工过程中修饰肽的糖基化谱从而进行生物活性肽的糖基化改造。尤其优选的完成这个过程的方式为将肽暴露于来自正常提供这种加工的细胞的糖基化酶，例如哺乳动物糖基化酶。在本发明的范围内，去糖基化酶也被成功地用于产生有益的修饰肽。还包括不同版本的具有其他微小修饰的天然一级氨基酸序列，包括磷酸化氨基酸残基，例如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸或者磷酸苏氨酸或者其它部分，包括核糖基或者交联试剂。
肽模拟物也可以具有通过磷酸化，磺化，生物素酰化或者加成或者去除其它部分进行化学修饰的氨基酸残基，尤其是那些具有类似于磷酸基团的分子形状的氨基酸残基。在一些实施方案中，修饰可以是有用的标记试剂，或者作为纯化靶，例如亲和配体。
本发明的范围内主要组的肽模拟物包括天然肽或者其片段与其它蛋白或者肽的共价结合物。这些衍生物可以合成在诸如N-或者C-末端融合体的重组培养物中或者通过使用本领域公知的通过活性侧基交联蛋白的试剂进行合成。优选的通过交联剂靶向的肽和蛋白衍生位点为游离氨基，碳水化合物部分以及半胱氨酸残基。
本发明也提供了生物活性肽和其它同源或者异源肽之间的融合多肽。很多生长因子和细胞因子为同源二聚体实体，并且这些分子或者其活性片段的重复结构具有多种优点，包括降低对于蛋白酶降解的敏感性。在本发明的方法和组合物的范围内，促炎或者抗炎结合肽的重复以及其它融合结构具有类似的优点。本发明还提供了包括本发明有用的肽的多种其它的多聚体结构。在特定的实施方案中，生物活性肽融合体例如，通过将本发明的一种或者多种生物活性肽与异源，多聚体多肽，例如免疫球蛋白重链恒定区，或者免疫球蛋白轻链恒定区连接而提供，如在美国专利No.6,018,026，5,843,725，6,291,646，6,300,099和6,323,323(其中每个都在此引入作为参考)中所述。如此构建的生物活性的多聚体多肽融合体可以为异源或者同源多聚体，例如包括一种或者多种促炎或者抗炎结合肽元件的异源二聚体或者同源二聚体，其中每个包括一种或者多种在本发明所范围内可操作的不同生物活性肽。其它的异源多肽也可以与活性肽结合产生表现出衍生蛋白组合特性或者活性的融合体。其它的典型例子为报告多肽的融合体，例如CAT或者荧光素酶与此处描述的肽的融合体以促进融合肽的定位(例如，参见Dull等的美国专利No.4,859,609，在此引入作为参考)。在本发明中使用的其它融合体伴侣包括细菌β-半乳糖苷酶，trpE，蛋白A，β-内酰胺酶，α-淀粉酶，乙醇脱氢酶和酵母α-交配因子(例如，参见Godowski等，Science 241812-816，1988，在此引入作为参考)。
本发明也设想使用通过与化学部分共价或者聚集结合所修饰的生物活性肽。这些衍生物通常分为三类(1)盐，(2)侧链和末端残基共价修饰，和(3)例如与细胞膜的吸附复合体。这种共价或者聚集的衍生物可用于多种目的，例如作为免疫原，作为免疫分析的试剂或者在诸如用于配体或者其它结合配体亲和纯化的纯化方法中阻断一种或者多种促炎或者抗炎结合肽之间同源或者异源的结合。例如，活性肽可通过本领域技术人员公知的方法共价结合到诸如溴化氰活化的琼脂糖的固相支持物上，或者使用或者不使同戊二醛交联吸附到聚烯烃表面上进行固定，用于特异性结合活性肽的抗体的分析或者纯化中。活性肽也可用可检测的基团进行标记，例如通过氯胺T的放射性碘标记过程共价连接到稀土元素螯合物，或者连接到另一发荧光的部分用于诊断分析，包括涉及标记肽鼻内给药的分析。
本领域的技术人员认识到多种技术适用于构建具有与相应的天然肽相同或者类似的需要的生物活性，而且具有比天然肽更好的活性的肽和蛋白模拟物，所述更好的活性为例如，改良的溶解性，稳定性和/或对于水解或者蛋白酶解的敏感性的特性(例如，参见Morgan和Gainor，Ann.Rep.Med.Chem.24243-252，1989，在此引入作为参考)。特定的肽模拟物化合物是基于在本发明使用的此处所描述的蛋白和肽的氨基酸序列。通常，肽模拟物化合物是具有三维结构(至少部分模拟化合物的三维结构)的合成化合物，模拟例如所选择的肽或者结构域，活性位点或者结合区(例如同源或者异源结合位点，催化活性位点或者结构域，受体或者配体结合界面或者结构域等)的一级，二级和/或三级结构，和/或电化学特性。肽模拟物结构或者部分结构(也指肽模拟物化合物的肽模拟物“基元”)与天然肽共享需要的生物活性，例如结合HLA-E或者阻断保护性HLA-E结合或者被MHC前导序列肽/HLA-E复合体的CD94/NKG2细胞受体识别的活性。通常，模拟物化合物的实验生物活性与模拟所基于的天然肽的生物活性相比基本上没有降低，通常相同或者更高。此外，肽模拟物化合物可能具有增强其治疗应用的其它特征，诸如细胞通透性的提高，更强的亲和性和/或亲合力，以及生物半衰期的延长。本发明的肽模拟物有时具有部分或者完全非肽但是其侧基与模拟形成所基于的肽上存在的氨基酸残基的侧基相同的骨架。几种类型的化学键，例如酯，硫酯，硫代酰胺，逆酰胺，还原羰基，二亚甲基，酮亚甲基键是本领域公知的，通常用作蛋白酶抗性肽模拟物结构中肽键的取代基。
下列描述用于制备在N-末端氨基和C-末端羧基修饰的肽和蛋白模拟物，和/或用于将肽中的一个或多个酰氨基键改变为非酰氨基键的方法。应该理解两种或者多种这样的修饰可以偶合到一个肽模拟结构中(例如，在C-末端羧基的修饰以及在肽的两个氨基酸之间加入--CH2-氨基甲酸酯连接)。对于N-末端修饰而言，肽通常被合成为如上所述的游离酸，但是可以很容易制备为酰胺或者酯。人们也可修饰肽化合物的氨基和/或羧基末端产生用于本发明范围内的其它化合物。氨基末端修饰包括甲基化(即，--NHCH3或者--NH(CH3)2)，乙酰化，添加羧苯甲酰基，或者用含有定义为RCOO--的羧酸酯官能团的任一阻断基阻断氨基末端，其中RCOO-中的R选自萘基，吖啶基，甾基和类似的基团。羧基末端修饰包括用甲酰胺基替换游离酸或者在羧基末端形成环内酰胺以引入结构限制。如上所述进行氨基末端修饰并且包括烷基化，乙酰化，添加羧苯甲酰基，形成琥珀酰亚氨基，等。N-末端氨基也可进行如下反应
(a)形成式RC(O)NH--的酰氨基，其中R如上所述通过与酸卤化物[例如，RC(O)Cl]或者酸酐反应。通常，反应可以通过将大约相等克分子数或者过量(例如，大约5当量)的酸卤化物与肽在优选含有过量(例如，大约10当量)的叔胺，诸如二异丙基乙胺的惰性稀释剂(例如，二氯甲烷)中接触而进行，以清除反应过程中产生的酸。反应条件是常规的条件(例如，室温下30分钟)。末端氨基的烷基化提供低级烷基的N-取代，随后如上所述与酸卤化物反应提供式RC(O)NR--的N-烷基酰胺基；(b)通过与琥珀酐反应形成琥珀酰亚氨基。如上所述，使用大约等克分子数量或者过量(例如，大约5当量)的琥珀酐并且通过本领域公知的方法，包括在合适的惰性溶剂(例如，二氯甲烷)中使用过量(例如，10当量)的叔胺，诸如二异丙基乙胺将氨基转化为琥珀酰亚氨基(参见，例如Wollenberg等，美国专利No.4,612,132，在此引入作为参考)。应该理解琥珀基可以用，例如C2-C6烷基或者--SR取代基取代以在肽的N-末端提供取代的琥珀酰亚胺，所述C2-C6烷基或者--SR取代基是以常规方式制备而来的。这种烷基取代基是通过将低级石蜡(C2-C6)与马来酐以Wollenberg等(美国专利4,612,132)所述的方式进行制备的，并且--SR取代基通过将RSH与马来酐反应进行制备，其中R的定义如上；(c)通过与大约等量或者过量的CBZ-Cl(即，苄氧基羰基氯)或者取代的CBZ-Cl在优选含有叔胺的合适的惰性稀释剂(例如，二氯甲烷)中反应形成苄氧基羰基--NH--或者取代的苄氧基羰基--NH--基团，以清除反应过程中产生的酸；(d)通过与大约等量或者过量(例如，5当量)的R-S(O)2Cl在合适的惰性稀释剂(二氯甲烷)中反应将末端氨基转化为磺酰胺而形成氨磺酰基，其中R如上所述。优选的，惰性稀释剂含有过量的叔胺(例如，10当量)，诸如二异丙基乙基胺以清除反应中产生的酸。反应条件为常规条件(例如，室温下30分钟)；(e)通过与等量或者过量(例如，5当量)的R-OC(O)Cl或者R-OC(O)OC6H4-p-NO2在合适的惰性稀释剂(例如，二氯甲烷)中反应将末端氨基转化为氨基甲酸酯而形成氨基甲酸酯基，其中R如上所述。优选的，惰性稀释剂含有过量(例如，10当量)的叔胺，诸如二异丙基乙基胺以清除反应中产生的任一酸。反应条件为常规条件(例如，室温下30分钟)；(f)通过与等量或者过量(例如，5当量)的R--N＝C＝O在合适的惰性稀释剂(例如，二氯甲烷)中反应将末端氨基转化为尿素(即，RNHC(O)NH--)基而形成尿素基，其中R如上所述。优选的，惰性稀释剂含有过量(例如，10当量)的叔胺，诸如二异丙基乙基胺。反应条件为常规条件(例如，室温下约30分钟)。
在制备C-末端羧基被酯(即，--C(O)OR，其中R如上所述)取代的肽模拟物的过程中，通常使用用于制备肽酸的树脂，并且用碱和合适的醇，例如甲醇，剪切侧链保护的肽。然后用常规的方式通过氟化氢处理去除侧链保护基获得所需要的酯。
在制备C-末端羧基被酰胺--C(O)NR3R4替代的肽模拟物的过程中，二苯甲基胺树脂用作肽合成的固相载体。合成结束后，氟化氢处理从载体释放肽直接产生游离肽酰胺(即，C-末端为--C(O)NH2)。或者，在与氨反应偶合的肽合成过程中使用氯甲基化树脂将侧链保护的肽从载体上切割下来产生游离肽酰胺，并且与烷基胺或者二烷基胺反应产生侧链保护的烷基酰胺或者二烷基酰胺(即，C-末端为C(O)NRR1，其中R和R1如上所述)。通过用氟化氢处理的常规方式去除侧链保护产生游离的酰胺，烷基酰胺或者二烷基酰胺。
在本发明的其它实施方案中，生物活性肽的C-末端羧基或者C-末端酯可以通过用N-末端氨基分别内取代羧基或者酯中的--OH或者酯(--OR)形成环肽而加以环化。例如，合成并切割产生肽酸以后，在例如二氯甲烷(CH2Cl2)，二甲基亚砜(DMF)混合物的溶液中通过适当的诸如二环己基碳二亚胺(DCC)的羧基激活剂转化成活化酯。然后通过用N-末端氨基内取代活化酯形成环肽。通过使用非常稀的溶液，与聚合相反的内环化可被加强。这些方法是本领域公知的。
人们可以环化用于本发明范围的活性肽，或者在肽的末端掺入脱氨基或者脱羧基残基使得无末端氨基或者羧基以降低对蛋白酶的敏感性，或者限制肽的构象。本发明的肽类似物和模拟物中的C-末端官能团包括酰胺，酰胺低级烷基，酰胺二(低级烷基)，低级烷氧基，羟基和羧基，及其低级酯衍生物，和其药学上可接受的盐。
其他制造用于本发明的方法和组合物的肽和蛋白衍生物以及模拟物的方法描述于Hruby等中(Bioehem J.268(2)249-262，1990，在此引入作为参考)。根据这些方法，生物活性肽作为与天然肽具有类似生物活性的非肽模拟物化合物的结构模型。本领域技术人员认识到，多种技术适于构建与前导肽化合物具有相同或者类似的所需生物活性，或者比前导肽诸如溶解性，稳定性和对于水解和蛋白酶解敏感性的所需特性具有更有益的活性的化合物(参见，例如Morgan和Gainor，Ann.Rep.Med.Chem.24243-252，1989，在此引入作为参考)。这些技术例如，包括用由膦酸酯，酰胺化物，氨基甲酸酯，氨磺酰，二级胺和/或N-甲基氨基酸组成的主链置换肽的主链。
其中一个或者多个肽基键[--C(O)NH--]已经被诸如--CH2-氨基甲酸酯键，膦酸酯键，--CH2-氨磺酰键，脲键，二级胺(--CH2NH--)键，以及烷基化肽基键[--C(O)NR6--，其中R6为低级烷基]置换的肽和蛋白模拟物，例如通过在合成过程中的合适点仅仅用合适保护的氨基酸类似物取代氨基酸试剂的传统肽合成过程中进行制备。合适的试剂包括，例如氨基酸类似物，其中氨基酸的羧基已经用适合形成一种上述键的部分取代。例如，如果人们需要用--CH2-氨基甲酸酯键(--CH2OC(O)NR--)取代肽中的--C(O)NR--键，那么合适保护的氨基酸的羧基(--COOH)被首先还原为--CH2OH基，然后所述--CH2OH基通过传统方法被转化为--OC(O)Cl官能团或者对-硝基碳酸酯--OC(O)O-C6H4-p-NO2官能团。任一这些官能团与游离胺或者烷基化胺反应导致--CH2OC(O)NR--键的形成，所述游离胺或烷基化胺位于固相载体上发现的部分制备的肽的N-端上。对于形成诸如--CH2-氨基甲酸酯键的更详细的描述，参见，例如Cho等(Science 2611303-1305，1993，在此引入作为参考)。
用--CH2-氨磺酰键取代活性肽中的酰胺键可以通过将被合适保护的氨基酸的羧基(--COOH)还原为--CH2OH基得以实现，然后通过传统的方法将羟基转化为合适的诸如甲苯磺酰基的离去基团。衍生物与例如硫代乙酸反应然后进行水解和氧氯化作用将产生--CH2--S(O)2Cl官能团代替被合适保护的氨基酸的羧基。在肽合成中使用这种被合适保护的氨基酸类似物提供了包括取代肽中酰胺键的-CH2S(O)2NR--键从而提供肽模拟物。对于氨基酸的羧基转化为--CH2S(O)2Cl基的更全面描述，参见，例如Weinstein和Boris(Chemistry & Biochemistry of AminoAcids，Peptides，Vol.7，pp.267-357，Marcel Dekker，Inc.，New York，1983，在此引入作为参考)。例如以美国专利申请No.08/147,805(在此引入作为参考)中所描述的方式可以实现用脲键取代活性肽中的酰胺键。
其中--CH2NH--取代肽中酰胺键的二级胺键可以通过使用，例如合适保护的二肽类似物进行制备，其中酰胺键的羰基键通过传统方法已被还原为CH2基。例如，在二甘氨酸的情况下，在去保护H2NCH2CH2NHCH2COOH后将使酰胺还原成胺，所述H2NCH2CH2NHCH2COOH在随后的偶合反应中以N-保护的形式使用。通过还原二肽中酰胺键的羧基制备这些类似物是本领域公知的。
本发明的生物活性肽和蛋白剂可以单体的形式存在，没有在实验肽中可能存在的半胱氨酸的巯基形成的二硫键。或者，在两个或者多个肽上的半胱氨酸的巯基之间的分子间二硫键可被产生以生成多聚体(例如，二聚体，四聚体或者更高的寡聚体)化合物。这些特定的肽可通过用半胱氨酸或者高胱氨酸残基的硫取代离去基团进行环化或者二聚化(参见，例如Barker等，J.Med.Chem.352040-2048，1992；以及Or等，J.Org.Chem.563146-3149，1991，其中每个都在此引入作为参考)。因此，一个或者多个天然半胱氨酸残基可以被高半胱氨酸取代。活性肽的分子内或者分子间二硫化物衍生物提供了其中一个硫已经被CH2基或者其它硫的电子等排物取代的类似物。这些类似物可利用本领域公知的方法通过分子间和分子内取代进行制备。
所有鉴定成本发明范围内使用的试剂的自然发生的，重组的和合成的肽，以及肽和蛋白类似物以及模拟物可被用于筛选(例如，在试剂盒和/或筛选分析方法中)以鉴定其它的化合物，包括在本发明方法和组合物的范围内具有功能的其它的肽，蛋白，类似物和模拟体，包括作为膜粘着蛋白之间的同种型和异种型结合的抑制剂以增强上皮渗透性。近年来已经发展了若干种自动分析的方法使得在短期内筛选成千上万的化合物成为可能(参见，例如，Fodor等人，Science 251767-773，1991，和授权给Fodor等人的美国专利No.5,677,195；5,885,837；5,902,723；6,027,880；6,040,193；和6,124,102，其中每个都在此引入作为参考)。可由描述于例如，WO 95/12608，WO 93/06121，WO94/08051，WO 95/35503，和WO 95/30642(每个都在此引入作为参考)的编码的合成文库(ESL)构建大的化合物的组合文库。肽文库也可通过噬菌体展示方法生成肽文库(参见，例如，Devlin，WO 91/18980，此处引入作为参考)。很多描述化学多样性文库和筛选方法的其它公开物也被认为反映了与本发明的这些方面相关的技术状态并且通常在此引入作为参考。
筛选用于本发明范围内的新的生物活性剂(例如，小分子药物肽模拟物)的一种方法，利用以表达活性肽的重组DNA分子稳定转化的原核或者真核宿主细胞。这种以活的或者固定形式存在的细胞可被用于常规分析中，例如配体/受体结合分析(参见，例如Parce等，Science246243-247，1989；和Owicki等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA874007-4011，1990，每个都在此引入作为参考)。竞争性分析尤其有用，例如在细胞与对肽配体具有已知结合亲和性的标记受体或者抗体以及其结合亲和性正被测定的试验化合物或样品接触和培养的分析中。然后分离结合的和游离的标记结合组分以评估配体结合的程度。结合的试验化合物的量与结合到已知来源的标记受体的量成反比。多种技术中的任何一种均可用于从游离配体分离结合的组分以评估配体结合的程度。这种分离步骤包括诸如粘附过滤器然后清洗，粘附塑料然后清洗，或者离心细胞膜的传统操作程序。
本发明范围内用于药物筛选的另一技术包括一种方法，所述方法提供对于与靶分子，例如HLA-E分子，HLA-E肽复合体，或者HLA-E/肽/CD94/NKG2细胞受体复合体具有合适的结合亲和性的化合物的高通量筛选，并且详细描述于Geysen，欧洲专利申请84/03564，1984年9月13日公布(在此引入作为参考)。首先，大量的不同试验化合物例如小肽合成在例如塑料针或者一些其他合适表面的固相底物上(参见，例如，Fodor等，Science 251767-773，1991，和授权给Fodor等人的美国专利5,677,195；5,885,837；5,902,723；6,027,880；6,040,193；和6,124,102，每个都在此引入作为参考)。然后将所有的针与本发明的溶解的肽剂反应，并清洗。下一个步骤包括检测结合的肽。
合理的药物设计也应基于确定在本发明方法范围内操作的生物活性肽的分子形状的结构研究。用于鉴定，作图，翻译和再生肽的结构特征以指导生产和选择新的肽模拟物的肽的多种方法都是可获得的并且是本领域所公知的，包括例如X-射线结晶和两维NMR技术。这些方法和其他方法，例如可以合理预测在所选择的肽中存在的哪些氨基酸残基形成对于特异性和活性所必须的分子接触区域(参见，例如Blundell和Johnson，Protein Crystallography，Academic Press，N.Y.，1976，在此引入作为参考)。
此处公开的促炎或者抗炎结合肽的可操作类似物和模拟物与天然肽相比保持了部分，完全或者增强的活性。基于这方面的考虑，用于本发明的可操作的类似物和模拟物与所选择的天然肽或者未修饰化合物所观察的一种或者多种所选择的活性相比保持至少50％，常常75％，以及高达95-100％或者更高水平的同一活性。变更的肽或者非肽模拟物的这些生物特征可以根据此处公开的和引用的任一合适的分析方法进行确定。
根据此处公开的说明书，本发明的化合物可作为独特的手段体外用于分析促炎或者抗炎结合肽，HLA-E分子，和CD94/NKG2细胞受体的性质和功能，因此也可作为用于设计其它肽和非肽(例如，小分子药物)剂的多种程序中的前导肽以增强粘膜上皮的通透性和促进粘膜药物的递送。
此外，此处公开的促炎或者抗炎结合肽，类似物和模拟物也作为免疫原，或者免疫原的组分，用于产生抗体和相关的介质，例如通过促炎结合肽阻断HLA-E结合以缓解自身免疫或者炎症的症状，或者针对肿瘤细胞或者病毒感染细胞靶击或者激发NK和CTL的应答。在下文中，抗体在肿瘤或者病毒感染细胞或者组织中的定位可通过将抗体偶合到肿瘤或者病毒靶因子，例如结合肿瘤相关或者病毒相关抗原的抗体或者抗体片段得以促进。
因此，本发明的肽可作为免疫原，通常以结合物(例如，多聚体肽，或者肽/载体或者肽/半抗原结合物)的形式给药以产生结合具有高亲和性或者亲和力的免疫肽或者肽结合物，但是并不同样识别不相关肽的抗体。
在上下文中，本发明还提供了诊断和治疗抗体，包括单克隆抗体，针对促炎或者抗炎结合肽。抗体也特异性识别参与肽和例如HLA-E分子之间互作的肽的功能性部分。这些免疫治疗剂可以包括人源化抗体，并且可以与此处公开的其它的活性和惰性成分在例如传统上可药用载体或者稀释剂，例如免疫原性佐剂中结合，以及任选与辅助或者结合活性剂诸如抗逆转录病毒的药物结合用于治疗的应用。产生功能性抗体，包括人源化抗体，抗体片段的以及其它相关试剂的方法是本领域熟知的(参见，例如Harlow & Lane，Antibodies，A LaboratoryManual，CSHP，NY，1988；Queen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA8610029-10033，1989和WO 90/07861，每个都在此引入作为参考)。
小鼠抗体的人源化形式可通过利用重组DNA技术将非人源抗体的CDR区连接到人抗体的恒定区产生(参见，例如Queen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8610029-10033，1989和WO 90/07861，每个都在此引入作为参考)。人源抗体可利用噬菌体展示方法获得(例如，参见Dower等，WO 91/17271；McCafferty等，WO 92/01047，每个都在此引入作为参考)。在这些方法中，产生噬菌体文库，其中的成员在其外表面展示不同的抗体。抗体通常显示为Fv或者Fab片段。显示具有所需特异性的抗体的噬菌体通过亲和性富集到人色素细胞P450或者其片段进行选择。人抗体通过竞争性结合实验进行选择，或者选择与特定的小鼠抗体具有相同的表位特异性。
本发明进一步提供了上述完整抗体的片段。通常，这些片段与它们所来源的完整抗体竞争特异性结合HLA。抗体片段包括单独的重链，轻链Fab，Fab′F(ab’)2，Fv和单链抗体。片段可通过酶或者化学分离完整的免疫球蛋白产生。例如，F(ab’)2片段可通过用胃蛋白酶在pH3.0-3.5，利用诸如描述于Harlow和Lane同上的常规方法进行蛋白酶消化从IgG分子获得。Fab片段可通过限制还原获得自F(ab’)2片段，或者在还原剂的存在下通过用木瓜蛋白酶的降解从全抗体获得。片段也可通过重组DNA技术产生。编码选择的片段的核酸片段通过用限制酶降解全长编码序列，或者通过从头合成产生。通常片段以噬菌体-包被融合蛋白的形式表达。这种表达方式对于抗体亲和性的灵敏化是有益的。
为了重组产生本发明的抗体，编码任选连接到恒定区的轻链和重链可变区的核酸被插入表达载体中。这种轻链和重链可被克隆到相同或者不同的表达载体中。编码抗体链的DNA区段可操作性连接到表达载体的控制序列保证抗体链的表达。这些控制序列包括信号序列，启动子，增强子，转录终止序列。表达载体通常作为游离体或者作为宿主染色体的整合部分在宿主生物体内是可复制的。E.coli是一种特别用于表达本发明的抗体的原核宿主。其它适合应用的微生物宿主包括，杆菌，诸如枯草芽孢杆菌，和其它的肠细菌，诸如沙门氏菌，沙雷氏菌和多种假单胞菌种。在这些原核宿主中，也可以制备表达载体，所述载体通常含有与宿主细胞相容的表达控制序列(例如，复制起点)和调节序列，诸如乳糖启动子系统，色氨酸(trp)启动子系统，β-内酰胺酶启动子系统，或者来自λ噬菌体的启动子系统。其它的微生物，诸如酵母也可用于表达。糖酵母(Saccharomyces)是优选的宿主，合适载体具有所需的表达控制序列，诸如启动子，包括3-三磷酸甘油酯激酶或者其它糖酵解酶，以及复制起点，终止序列等。
哺乳动物组织细胞培养也可用于表达和产生本发明的抗体(参见，例如，Winnacker，从基因到克隆(From Genes to Clones)，VCHPublishers，N.Y.，1987，在此引入作为参考)。真核细胞是优选的，因为已经发展了多种能够分泌完整抗体的合适的宿主细胞系。用于表达编码本发明免疫球蛋白的核酸的优选合适宿主细胞包括由SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7，ATCC CRL1651)；人胚肾细胞系(293)(Graham等，J.Gen.Virol.3659，1977，在此引入作为参考)；仔仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL10)；中国仓鼠卵巢细胞-DHFR(CHO，Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 774216，1980，在此引入作为参考)；小鼠支持细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23243-251，1980，在此引入作为参考)；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL 1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法罗(buffalo)大鼠肝细胞(BRL3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(HepG2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT060562，ATCC CCL51)和TRI细胞(Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.38344-46，1982，在此引入作为参考)；以及杆状病毒细胞。
含有目的多核苷酸序列(例如，重链和轻链编码序列和表达控制序列)的载体可被转化到宿主细胞中。氯化钙转染被普遍用于原核细胞，而磷酸钙处理或者电穿孔可被用于其它细胞宿主(参见，例如Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Press，第二版，1989，在此引入作为参考)。当把重链和轻链克隆到不同的表达载体中时，载体被共转染以获得表达并装配成完整的免疫球蛋白。导入重组DNA以后，表达免疫球蛋白产物的细胞系为所选择的细胞。能够稳定表达的细胞系是优选的(即，50代以后细胞系的表达水平未降低)。
一旦表达，本发明的全抗体，其二聚体，单独的轻链和重链或者其它免疫球蛋白形式可以根据本领域的常规操作程序进行纯化，包括硫酸铵沉淀，亲和柱，柱层析，凝胶电泳等(参见，例如Scopes，ProteinPurification，Springer-Verlag，N.Y.，1982，在此引入作为参考)。至少约90到95％同质性的基本上纯的免疫球蛋白是优选的，98到99％或更多的同质性是最优选的。
本发明的促炎或者抗炎结合肽也通常用于如上所述的药物筛选组合物和程序中，例如以鉴定与HLA-E，HLA-E/肽复合体，或者HLA-E/肽/CD94/NKG2细胞受体复合体具有结合亲和性的其它化合物，和/或用作激动剂或者拮抗剂，针对与CD94/NKG2细胞受体的HLA-E介导的保护性互作，从而发挥此处描述的作为免疫调节剂的功能。多种筛选方法和形式是可获得的并且是本领域公知的。随后的生物分析可被用于确定筛选的化合物是否具有本发明内应用的内部结合或者其它所需的活性。在这种分析中，本发明的化合物可以不修饰的使用或者可以多种方式进行修饰；例如通过诸如共价或者非共价连接直接或者间接提供可检测信号的部分进行标记。用于直接标记可能的例子包括诸如放射性标记，诸如过氧化物酶和碱性磷酸酶的酶酶标记(参见，例如美国专利3,645,090；和美国专利No.3,940,475，每个都在此引入作为参考)和荧光标记的标记基团。用于间接标记可能的例子包括一种组分的生物素酰化，接着结合到偶合了一种上述标记基团的抗生物素蛋白上。在化合物吸附到固相载体的情况下，化合物也可以包括间隔区或者接头。
本发明的促炎或者抗炎结合肽也可基于其结合HLA-E和与CD94/NKG2细胞受体的复合体的能力被采用，作为在活细胞上，固定细胞上，生物流体中，组织匀浆中，纯化的天然生物材料中等检测和/或定量测定HLA-E分子的试剂。例如，通过标记这样的肽，人们可以鉴定和/或定量测定在其表面具有HLA-E的细胞。此外，基于他们更加具体的活性，促炎或者抗炎结合肽可被用于定量测定其它HLA-E结合肽和CD94/NKG2细胞受体的存在和活性。本发明的肽可被用于原位染色，FACS(荧光-活化的细胞分类)，Western印迹，ELISA等。此外，本发明的肽可被用于HLA-E和CD94/NKG2细胞受体纯化，或者纯化表达HLA-E的细胞。
本发明的促炎或者抗炎结合肽也可用作各种不同医学研究和诊断应用的市售试剂。这种应用包括但不限于(1)用作定量测定HLA-E，其它HLA-E结合肽，和/或CD94/NKG2细胞受体的存在或者活性的校正标准；(2)通过共结晶用于HLA-E和CD94/NKG2细胞结合受体的结构分析；和(3)用于研究HLA-E/肽/CD94/NKG2细胞结合和活化机制。
在本发明的其它方面，实验肽的免疫调节活性可以通过连接到含有能够诱导NK，CTL，或者T辅助细胞应答的至少一种表位的序列得以增强。例如，本发明的结合体可以限制促炎结合肽以及一种或者多种不同的或者重叠的CTL表位。或者，这种组合活性肽/表位可以组合在“混合物”中以提供NK或者CTL应答增强的免疫原性。肽也可以与具有不同MHC限制元件的肽结合。这些组合物可被用于有效拓宽在不同类群中由本发明的治疗，疫苗或者诊断方法以及组合物所提供的免疫覆盖。
本发明的肽可通过连接组合形成聚合物(多聚体)，或者可以不用连接，作为混合物配制在组合物中。当相同的肽自身连接时，那么就形成具有多个重复表位单元的同聚物。用于同-或者异-聚合物或者偶合到载体的连接可以以多种形式提供。例如，半胱氨酸残基可以添加在氨基和羧基末端，其中肽通过受控的半胱氨酸残基氧化进行共价连接。其它有用的是大量的异双官能试剂，其在一个官能团的末端产生二硫键，而在另一端产生肽键，包括3-(2-吡啶二巯基)丙酸-N-琥珀酰亚胺酯(SPDP)。这种试剂在其自身和一个蛋白质中的半胱氨酸残基之间形成二硫键以及通过在赖氨酸上的氨基或者另一个赖氨酸上的其它游离氨基形成酰胺键。各种这样的二硫键/酰胺形成试剂是已知的。参见，例如Immun.Rev.62185(1982)。其它的双功能偶联剂形成硫醚而非二硫键。很多这些硫醚形成试剂是市售的并且包括6-马来酰亚氨基己酸，2溴乙酸，2-碘乙酸，4-(N-马来酰亚氨基-甲基)环己烷-1-羧酸等。羧基可以通过将它们与琥珀酰亚胺或者1-羟基-2-硝基-4-磺酸，钠盐结合被活化。尤其优选的偶联剂为琥珀酰亚氨基4-(N-马来酰亚氨基-甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)。当然，可以理解连接基本上不应干扰任一连接基团的功能。
在优选实施方案中，本发明的促炎或者抗炎结合肽通过间隔分子与其它的肽结合。间隔分子通常包括相对小的中性分子，诸如氨基酸或者氨基酸模拟物，在生理条件下基本上不带电并且可能具有线性或者分枝侧链。间隔通常选自，例如Ala，Gly或者其它的非极性氨基酸或者中性极性氨基酸的中性间隔。在特定的优选实施方案中，这里的中性间隔为Ala。应该理解任选存在的间隔不需要包括相同的残基并且因此可以是异源或者同源寡聚体。优选的示范性间隔为Ala的同源-寡聚体。当间隔存在时，常常为至少一个或者两个残基，更经常为三到六个残基。
递送介质和方法在本发明的特定方面，促炎或者抗炎结合肽以制剂的形式进行给药，所述制剂包括生物相容性聚合物，用作为载体或者基质。这种聚合物载体包括聚合物的粉末，基质或者微粒递送介质等聚合物形式。聚合物可以为植物，动物或者合成来源。通常，聚合物是交联的。此外，在这些递送系统中，肽可以共价结合到聚合物，并且通过简单的清洗不能与聚合物分开的方式加以官能团化。在其它的实施方案中，聚合物用酶抑制剂或者其它试剂进行化学修饰，所述试剂能够降解或者使生物活性剂和/或递送增强剂失活。
基于生物可降解聚合物的药物递送系统在许多生物医学应用方面是优选的，因为这种系统或者通过水解或者通过酶解反应被分解成非毒性分子。降解的速率通过操控生物可降解聚合物基质的组合物进行控制。因此，这些类型的系统可以特定的设置用于长期释放生物活性剂。生物可降解聚合物，诸如聚(乙醇酸)(PGA)，聚-(乳酸)(PLA)，和聚(D，L-乳酸-共聚-乙醇酸)(PLGA)，在作为可能的药物递送载体方面已受到了广泛的关注，因为已经发现这些聚合物的降解产物低毒性。在机体发挥正常代谢功能的过程中，这些聚合物降解成二氧化碳和水(Mehta等，J.Control.Rel.29375-384，1994)。这些聚合物也表现优良的生物相容性。
为了延长促炎或者抗炎结合肽的生物活性，促炎或者抗炎结合肽可被掺入聚合物基质，例如聚原酸酯，聚酐或者聚酯。这种行为将产生持续的活性和持续释放的活性试剂，例如通过降解聚合物基质所确定的(Heller，蛋白和肽的制剂以及递送(Formulation and Delivery ofProteins and Peptides)，292-305，Cleland等编辑，ACS Symposium Series567，Washington DC，1994；Tabata等，Pharm.Res.10487-496，1993；和Cohen等，Pharm.Res.8713-720，1991，每个都在此引入作为参考)。虽然将生物治疗分子胶囊化在合成聚合物内可以在储存和运输的过程中对生物治疗分子起到稳定化的作用，但是基于聚合物释放技术的最大障碍在于在制剂加工过程中治疗分子的失活，所述制剂加工过程一般包括热，超声波或者有机溶剂处理(Tabata等，Pharm.Res.10487-496，1993；以及Jones等，药物靶向和递送系列，重组蛋白的新的递送系统-从理论证明到临床的实践(Drug Targeting and Delivery Series，New Delivery Systems for Recombinant Proteins-Practical Issues fromProof of Concept to Clinic)，Vol.4，pp.57-67，Lee等编辑，HarwoodAcademic出版，1995)。
本发明范围内使用的合适聚合物单独和与选择的生物活性剂以及其它的粘液制剂的组分结合时通常应是稳定的，并且在从大约pH1到pH10的范围内形成稳定的水凝胶。更典型的，不用其它的保护性包被，它们在从大约3到9的pH范围内应是稳定的并且形成聚合物。但是，需要的稳定性特征可以适合于递送靶向位点的生理参数特征(例如，鼻粘膜或者诸如全身性循环的二级递送位点)。因此，在特定的制剂中，在特定pH以及在选择的化学或者生物环境中较高或者较低的稳定性是更需要的。
本发明的促进吸收的聚合物可以包括来自基于下列乙烯基单体的多种组合的同聚物-或者共聚物丙烯和甲基丙烯酸，丙烯酰胺，甲基丙烯酰胺，羟乙基丙烯酸酯或者甲基丙烯酸酯，乙烯吡咯烷酮，以及聚乙烯醇和其共聚物和三元共聚物，聚乙酸乙烯酯，其具有上述单体和2-丙烯酰胺-2-甲基-丙烷磺酸(AMPS)的共-聚物和三元共聚物。非常有用的是上述例举的带有可共聚的官能单体，诸如丙烯酰基或者甲基丙烯酰胺丙烯酸酯或者甲基丙烯酸酯的共聚物，其中酯基来自直链或者支链烷基，带有多达4个芳香环的芳香基，所述芳香环可以含有1到6个碳原子的烷基取代基；甾族的，硫酸酯，磷酸酯或者阳离子单体，诸如N，N-二甲基氨基烷基(甲基)丙烯酰胺，二甲基氨基烷基(甲基)丙烯酰胺，(甲基)丙烯氧烷基三甲基铵氯化物，(甲基)丙烯氧烷基二甲基苄基铵氯化物。
用于本发明的其它促进吸收的聚合物为那些被分类为葡聚糖，糊精和来自被分类为天然胶和树脂的材料，或者来自天然聚合物，诸如加工的胶原蛋白，几丁质，脱乙酰壳多糖，普鲁兰多糖(pullalan)，zooglan，藻酸盐和改性的藻酸盐，诸如“Kelcoloid”(一种聚丙二醇改性的藻酸盐)结冷胶(gellan Gum)，诸如“Kelocogel”，黄原胶(Xanthangum)诸如“Keltrol”，estastin，α-羟基丁酸酯和其共聚物，透明质酸及其衍生物，聚乳酸和聚乙醇酸。
用于本发明的一种非常有用的聚合物为含有至少一种活化的碳-碳烯双键，和至少一个羧基的烯属-不饱和羧酸；换言之，容易转化成含烯双键的酸的酸或者官能团，所述烯双键很容易在聚合中发挥作用，因为其在单体分子中的存在，或者存在于相对于羧基的α-β位，或者作为末端亚甲基的一部分。这类烯属-不饱和酸包括的材料例如由丙烯酸自身形成的丙烯酸，α-氰基丙烯酸，β-甲基丙烯酸(丁烯酸)，α-苯基丙烯酸，β-丙烯酰氧基丙酸，肉桂酸，对-氯肉桂酸，1-羧基-4-苯基丁二烯-1，3，亚甲基丁二酸，甲基丁烯二酸，甲基富马酸，戊烯二酸，丙烯三甲酸，马来酸，反丁烯二酸，和三羧基乙烯。这里的术语“羧酸”包括多元羧酸以及酸酐，诸如马来酐，其中酸酐基是从位于相同羧酸分子中的两个羧基消去一个水分子而形成的。
在本发明的范围内用作吸收促进剂的代表性丙烯酸酯包括丙烯酸甲酯，丙烯酸乙酯，丙烯酸丙酯，丙烯酸异丙酯，丙烯酸丁酯，丙烯酸异丁酯，甲基丙烯酸甲酯，乙基丙烯酸甲酯，甲基丙烯酸乙酯，丙烯酸辛酯，丙烯酸庚酯，甲基丙烯酸辛酯，甲基丙烯酸异丙酯，甲基丙烯酸2-乙基己基酯，丙烯酸壬酯，丙烯酸己酯，甲基丙烯酸正-己酯，等。高级烷基丙烯酸酯为丙烯酸癸酯，甲基丙烯酸异癸酯，丙烯酸月桂酯，丙烯酸十八酯，丙烯酸二十二酯和丙烯酸三十酯及其甲基丙烯酸酯形式。两三个或更多长链丙烯酸酯的混合物可与一种含羧基单体成功聚合。其它共聚用单体包括烯烃，包括α-烯烃，乙烯醚，乙烯基酯及其混合物。
然而其它有用的促进吸收材料为含有从2到18个碳原子，更优选地从2到8个碳原子的α-烯烃；含有从4到10碳原子的二烯；乙烯基酯和烯丙酯诸如醋酸乙烯酯；乙烯基芳族化合物诸如苯乙烯，甲基苯乙烯和氯-苯乙烯；乙烯基和烯丙基醚以及酮诸如乙烯基甲基醚和甲基乙烯基酮；氯丙烯酸酯；氰烷基丙烯酸诸如丙烯酸α-氰甲酯，和丙烯酸α-，β-，γ-氰丙酯；烷氧基丙烯酸酯诸如丙烯酸甲氧基乙酯；卤代丙烯酸酯如丙烯酸氯乙酯；卤乙烯和氯乙烯，偏二氯乙烯等等；二乙烯基，二丙烯酸酯及其他多官能单体诸如二乙烯醚，二丙烯酸二甘醇酯，二甲基丙烯酸乙二醇酯，亚甲双丙烯酰胺，烯丙基季戊四醇，等等；和双(β-卤烷基)烯基膦酸酯诸如双(β-氯乙基)乙烯基膦酸酯等本领域技术人员公知的材料。其中含有单体的羧基为次要组分，而其它亚乙烯基单体作为主要组分存在的共聚物根据在此处公开的方法能够很容易的制备。
在另外的相关方面，提供了一种多配体连接的肽复合体，其包含一种促炎或者抗炎结合肽，通过聚二醇间隔基与三甘油酯骨架部分共价结合，以及至少一种脂肪酸部分共价直接结合于甘油酯骨架部分的碳原子上，或者通过聚二醇间隔部分共价结合，所述聚二醇间隔基结合在甘油酯骨架部分的碳原子上(参见，例如美国专利No.5,681,811，这里引作参考)。在这样一种多配体结合的治疗剂复合体中，甘油酯生物活性部分的α’和β-碳原子可具有通过共价键直接结合其上，或者通过聚二醇间隔部分间接共价结合其上的脂肪酸部分。或者，脂肪酸部分可直接或者通过聚二醇间隔部分共价结合到甘油酯骨架部分的α和α′碳上，生物活性治疗剂与甘油酯骨架部分的γ-碳原子共价结合，或者直接共价结合其上或者通过聚亚烷基间隔部分间接结合其上。将会认识到各式各样的结构，组成，和构象的形成都可能用作本发明范围内的包含甘油酯骨架部分的多配体结合的治疗剂复合体。另外应该注意在这样的多配体结合的治疗剂复合体中，生物活性剂可被优选地通过本发明范围内的烷基间隔基团，或者其它可接受的间隔基团共价结合到甘油酯修饰的骨架部分。在本发明使用的可接受的间隔基团是指空间排列的，组成的和最终应用特定的可接受的特征。
在本发明的其它方面，提供了一种结合稳定的复合体，其包括含有聚山梨酸酯部分的聚山梨酸酯复合体，所述聚山梨酸酯部分包括一种共价结合到其官能团的α，α′和β-碳原子上的甘油酯骨架，所述官能团包括(i)脂肪酸基团；和(ii)具有促炎或者抗炎结合肽共价结合其上的聚乙二醇基团，例如结合到适当的聚乙二醇基团的官能团上(参见，例如美国专利No.5,681,811，其内容在此引入作为参考)。这样的共价键可能直接，例如，连接到聚乙二醇官能团的羟基末端，或者共价键可间接，例如，通过对聚乙二醇基团的羟基末端用末端羧基官能团间隔基团进行反应性加帽，以便产生的加帽的聚乙二醇基团具有末端羧基的官能团，所述官能团可能共价结合促炎或者抗炎结合肽。
脂质体和微胞递送介质本发明的协调给药方法和组合制剂任选包含有效的基于脂肪或者脂肪酸的载体，加工剂，或者递送介质，以提供改良的制剂用于递送促炎或者抗炎结合肽。例如，提供了多种的制剂和方法用于粘膜递送，所述粘膜递送包括一种或者多种促炎或者抗炎结合肽，以脂质体，混合的微胞载体，或者乳胶混合或者胶囊化，或者协同给药以提高生物活性剂在粘膜转运后的化学和物理稳定性并且延长半衰期(例如，通过减低对蛋白酶解，化学修饰和/或变性作用的敏感性)。
在本发明的特定方面，用于促炎或者抗炎结合肽的具体的递送系统包括以脂质体著称的小脂类泡囊(参见，例如Chonn等人，Curr.Opin.Biotechnol.6698-708，1995；Lasic，Trends Biotechnol.16307-321，1998；以及Gregoriadis，Trends Biotechnol.13527-537，1995，每个都在此处引入作为参考)。这些通常由天然的，可生物降解的，非毒的，以及非免疫原性的脂质分子制备而来，并且可有效的俘获或者结合药物分子，包括肽和蛋白进入或者到其膜上。在本发明范围内的脂质体作为肽和蛋白输送系统的吸引力经下列事实得以提高胶囊化的蛋白可保持在其优选的水性环境的泡囊内，同时脂质体膜保护它们免遭蛋白酶解及其它不稳定因素。即使不是所有已知的脂质体制备方法由于其独特的物理和化学性质，在肽和蛋白的胶囊化作用中是可行的，但是一些方法使得这些大分子进行胶囊化作用，同时基本上不失活(参见，例如，Weiner，Immunomethods 4201-209，1994，在此引入作为参考)。
多种方法可有效用于制备本发明应用的脂质体(例如，描述于Szoka等人，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9467，1980；和美国专利4,235,871，4,501,728和4,837,028，每个都在此引入作为参考)。为了用在脂质体递送上，所述生物活性剂通常俘获在脂质体，或者脂类泡囊内，或者结合到泡囊外。多个策略已被设计通过靶向脂质体到特定的组织和特定的细胞类型中提高脂质体介导的递送的有效性。包括那些含有阳离子脂类的脂质体制剂已经显示在病人中是安全的并且耐受性良好(Treat等人，J.Natl.Cancer Instit.821706-1710，1990，其内容在此引入作为参考)。
如同脂质体，也具有增强粘膜吸收活性的不饱和长链脂肪酸可形成具有类似双层结构的闭合泡囊(通常所说的“ufasomes”)。例如利用油酸，可形成这些不饱和长链脂肪酸来可形成俘获生物活性肽以及蛋白，用于本发明的粘膜的，例如鼻内递送。
本发明使用的其它递送系统组合使用聚合体以及脂质体从而联合两个介质的有利特性。作为此类杂合递送系统的例子，含有模型蛋白辣根过氧化酶(HRP)的脂质体被有效装入天然聚合物血纤维蛋白的胶囊中(Henschen等人，Blood Coagulation，第171-241页，Zwaal等人编辑，Elsevier Amsterdam，1986，在此引入作为参考)。因为其生物相容性以及生物降解性，血纤维蛋白是一种本发明给药系统中有用的聚合基质(参见，例如Senderoff等人，J.Parenter.Sci.Technol.452-6，1991；以及Jackson，Nat.Med.2637-638，1996，其内容在此引入作为参考)。另外，通过利用共价交联以及添加纤溶对抗物到纤维蛋白多聚体，从这种递送系统释放生物治疗化合物是可控制的(Uchino等人，Fibrinolysis 593-98，1991，在此引入作为参考)。
本发明使用的更简化的输送系统包括利用阳离子脂类作为递送介质或者载体，阳离子脂类可被有效用于提供脂类载体和诸如蛋白以及多阴离子核酸的带电生物活性剂之间的静电相互作用(参见，例如Hope等人，Molecular Membrane Biology 151-14，1998，在此引入作为参考)。这使得有效的包装所述药物成为适于粘膜给药和/或随后递送到全身区室的形式。这些以及相关系统尤其适合递送聚合核酸，例如，以基因构建体，反义寡核苷酸以及核酶的形式递送。这些药物为大的，通常分子量对于基因为106，对于寡核苷酸为103的带负电荷的分子。这些药物的靶为胞内，但是其物理性质阻止它们通过如传统药物一样的被动扩散与细胞膜交联。此外，未保护的DNA在几分钟内通过存在于标准血浆中的核酸酶进行降解。为了避免内源核酸酶的失活，反义寡核苷酸以及核酶可通过多种已知的方法进行化学修饰成为酶抗性的反义寡核苷酸和核酶，但是质粒DNA必须通过病毒或者非病毒包膜的胶囊化作用被通常保护起来，或者通过诸如蛋白或者阳离子脂类泡囊的聚阳离子缩聚成为一种密封包装的微粒形式。近年来，由阳离子脂类和二顺油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)组成的小单层泡囊(SUV)已被成功用作核酸，诸如质粒DNA的介质以形成能够运送活性多核苷酸穿过细胞膜进入广谱细胞的细胞质内的颗粒。这个过程(称为脂转染或者细胞转染)现在被广泛用作将质粒构建体导入细胞的工具以研究基因瞬时表达的效果。用于本发明范围内的这种类型的示范性递送介质包括阳离子脂类(例如，N-(2，3-(二油酰氧)丙基)-N，N，N-氯化三甲基铵氯化物(DOTMA)，季铵盐(例如，N，N-二油酰-N，N-二甲铵氯化物(DODAC))，胆固醇的阳离子衍生物(例如，3□(N-(N′，N-二甲基氨基乙烷-甲氨酰基-胆固醇(DC-chol))，以及由多价首基(例如，二辛癸基二甲基铵氯化物(DOGS)，市售的商品名为Transfectam表征的脂类。
在本发明使用的其他递送介质包括长链和中链脂肪酸，以及带有脂肪酸的表面活性剂混合胶束(参见，例如Muranishi，Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.71-33，1990，在此引入作为参考)。大多数以酯的形式天然存在的脂类在它们自己递送通过粘膜表面方面具有重要意义。具有极性基团附着的游离脂肪酸和其单酸甘油酯已经显示以混合胶束的形式作为渗透增强剂对肠壁起作用。这种游离脂肪酸(带有从12到20个碳原子链长的羧酸)及其极性衍生物对肠壁具有修饰功能，这一发现已经激发了对这些试剂作为粘膜吸收增强剂应用的广泛研究。
对本发明方法内的应用而言，长链脂肪酸，特别是融合脂类(不饱和脂肪酸以及诸如油酸，亚油酸，甘油一油酸酯等的单酸甘油酯)对提高在此处公开的促炎或者抗炎结合肽，类似物以及模拟物的递送提供了有用的载体。中链脂肪酸(C6到C12)以及单酸甘油酯也已经显示出具有增强肠药物吸收的活性并且可适用于本发明的递送制剂和方法中。另外，中链和长链脂肪酸的钠盐是有效的递送介质和促进吸收试剂用于递送本发明的促炎或者抗炎结合肽。因此，脂肪酸可以可溶性钠盐的形式采用或者通过添加非毒性的表面活性剂，例如，聚氧乙烯氢化的蓖麻油，牛磺胆酸钠等得以使用。天然存在的不饱和长链脂肪酸(油酸或者亚油酸)和其带有胆汁盐的单酸甘油酯的混合胶束已经显示出基本上对肠粘膜无害的促进吸收的能力(参见，例如Muranishi，Pharm.Res.2108-118，1985；和Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.71-33，1990，在此引入作为参考)。在本发明使用的其它脂肪酸和混合胶束制剂包括但是不局限于辛酸钠(C8)，癸酸钠(C10)，月桂酸钠(C12)或者油酸钠(C18)，任选与胆汁盐，诸如甘胆酸盐和牛磺胆酸盐相组合。
聚乙二醇化作用(PEGYLATION)在本发明的范围内提供的其它方法和组合物包括通过共价连接聚合材料，例如葡聚糖，聚乙烯基吡咯烷酮，糖肽，聚乙二醇和聚氨基酸化学修饰促炎或者抗炎结合肽。产生的结合肽保持了其用于临床给药的生物活性和可溶性。在其它的实施方案中，促炎或者抗炎结合肽结合到聚环氧烷聚合物，尤其是聚乙二醇(PEG)上(参见，例如美国专利4,179,337，在此引入作为参考)。很多文献中的报道描述了聚乙二醇化肽和蛋白的潜在优点，通常显示出对溶解蛋白降解抗性的增强，血浆半衰期的延长，可溶性的提高以及抗原性和免疫原性的降低(Nucci等，Advanced Drug Deliver Reviews 6133-155，1991；Lu等人，Int.J.Peptide Protein Res.43127-138，1994，在此引入作为参考)。大量的蛋白，包括L-天冬酰胺酶，链球菌激酶，胰岛素，白介素-2，腺苷脱酰胺酶，L-天冬酰胺酶，干扰素α2b，超氧化物歧化酶，链激酶，组织纤溶酶原激活剂(tPA)，尿激酶，尿酸酶，血红蛋白，TGF-β，表皮生长因子，及其它生长因子，已被结合到PEG并被评价其作为治疗剂的改变的生化特性(参见，例如Ho等人，Drug Metabolism andDisposition 14349-352，1986；Abuchowski等人，Prep.Biochem.9205-211，1979；以及Rajagopaian等人，J.Clin.Invest.75413-419，1985，Nucci等人，Adv.Drug Delivery Rev.4133-151，1991，每个都在此引入作为参考)。虽然聚乙二醇化蛋白的体外生物活性可能降低，但是这种活性损失通常为血流中体内半衰期的延长所抵消(Nucci等人，Advanced Drug Reviews 6133-155，1991，在此引入作为参考)。因此，这些及其它聚合物偶合的肽以及蛋白当根据此处的方法和制剂通过粘膜给药时显示出改良的特性，诸如半衰期的延长以及免疫原性的降低。
已经报道了用于将PEG附着到蛋白和肽上及其随后纯化的多个步骤(Abuchowski等人，J.Biol.Chem.2523582-3586，1977；Beauchamp等人，Anal.Biochem.13125-33，1983，每个都在此引入作为参考)。另外，Lu等人Int.J.Peptide Protein Res.43127-138，1994(在此引入作为参考)描述了多种技术的重要性并且比较了用于蛋白与肽的聚乙二醇化的步骤(同样参见，Katre等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA841487-149l，1987；Becker等人，Makromol.Chem.Rapid Commun.3217-223，1982；Mutter等人，Makromol.Chem.Rapid Commun.13151-157，1992；Merrifield，R.B.，J.Am.Chem.Soc.852149-2154，1993；Lu等人，Peptide Res.6142-146，1993；Lee等人，BioconjugateChem.10973-981，1999，Nucci等，Adv.Drug Deliv.Rev.6133-151，1991；Francis等人，J.Drug Targeting 3321-340，1996；Zalipsky，S.，Bioconjugate Chem.6150-165，1995；Clark等人，J.Biol.Chem.27121969-21977，1996；Pettit等人，J.Biol.Chem.2722312-2318，1997；Delgado等人，Br.J.Cancer 73175-182，1996；Benhar等人，Bioconjugate Chem.5321-326，1994；Benhar等人，J.Biol.Chem.26913398-13404，1994；Wang等人，Cancer Res.534588-4594，1993；Kinstler等人，Pharm.Res.13996-1002，1996，Filpula等人，Exp.Opin.Ther.Patents 9231-245，1999；Pelegrin等人，Hum.Gene Ther.92165-2175，1998，每个都在此引入作为参考)。
按照现有技术的这些及其它教导，促炎或者抗炎结合肽与聚乙二醇聚合物的结合很容易实现，预计结果具有循环周期延长和/或免疫原性减低，同时保持聚乙二醇化活性剂可接受程度的活性。在本发明范围内使用的胺活性PEG聚合物包括分子量为2000，5000，10000，12000，以及20000的SC-PEG；U-PEG-10000；NHS-PEG-3400-生物素；T-PEG-5000；T-PEG-12000；以及TPC-PEG-5000。这些聚合物的化学结合作用已经发表(参见，例如，Zalipsky，S.，Bioconjugate Chem.6150-165，1995；Greenwald等人，Bioconjugate Chem.7638-641，1996；Martinez等人，Macromol.Chem.Phys.1982489-2498，1997；Hermanson，G.T.，Bioconjugate Techniques，第605-618页，1996；Whitlow等人，Protein Eng.6989-995，1993；Habeeb，A.F.S.A，Anal.Biochem.14328-336，1966；Zalipsky等人，聚乙二醇的化学和生物学应用(Poly(ethyleneglycol)Chemistry and Biological Applications)，第318-341页，1997；Harlow等人，抗体实验室手册(AntibodiesaLaboratory Manual)，第553-612页，Cold Spring harbor Laboratory，Plainview，NY，1988；Milenic等人，Cancer Res.516363-6371，1991；Friguet等人，J.Immunol.Methods 77305-319，1985，每个都在此引入作为参考)。尽管磷酸盐缓冲液通常用在这些方案中，但选择硼酸盐缓冲液可能有利地影响聚乙二醇化的反应速率以及最后得到的产品。
聚乙二醇化的生物活性肽以及蛋白可通过羧基位的修饰得以实现(例如，除了羧基末端之外的天冬氨酸或者谷氨酸基团)。在酸性条件下在选择性修饰碳二亚胺活化的蛋白中应用PEG-酰肼已经得以描述(Zalipsky，S.，Bioconjugate Chem.6150-165，1995；Zalipsky等人，聚乙二醇的化学和生物学应用(Poly(ethyleneglycol)Chemistry andBiological Applications)，第318-341页，美国化学学会，Washington，DC，1997，在此引入作为参考)。或者，可以采用生物学活性肽以及蛋白的双官能的PEG修饰。在一些步骤中，带电荷的氨基酸残基，包括赖氨酸，天冬氨酸，以及谷氨酸具有明显的在蛋白表面溶解的倾向。结合到蛋白的羧酸基是生产蛋白生物共聚物不经常使用的方法。但是，由Zalipsky及其同事描述的酰肼/EDC化学(Zalipsky，S.，Bioconjugate Chem.6150-165，1995；Zalipsky等人，聚乙二醇的化学和生物学应用(Poly(ethyleneglycol)Chemistry and BiologicalApplications)，第318-341页，美国化学学会，Washington，DC，1997，每个都在此引入作为参考)提供了一种连接PEG聚合物到蛋白羧基位点的切实可行的方法。例如，这种替代的结合化学已经证明优于用于来自大脑的神经营养因子(BDNF)的聚乙二醇化的胺键，同时保持了生物活性(Wu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，96254-259，1999，在此引入作为参考)。Maeda及其同事也已经发现针对羧基的聚乙二醇化是用于胆红素氧化酶结合的优选方法(Maeda等人，聚乙二醇化学生物技术和生物医学的应用(Poly(ethylene glycol)Chemistry.Biotechnicaland Biomedical Applications)，J.M.Harris编，第153-169页，PlenumPress，纽约，1992，在此引入作为参考)。
通常，在本发明使用的聚乙二醇化肽涉及用官能团激活PEG，所述官能团与肽或者蛋白表面上的赖氨酸残基起化学反应。在本发明特定的其它方面，生物活性肽以及蛋白由诸如组氨酸，色氨酸，半胱氨酸，天冬氨酸，谷氨酸等等的其它残基的聚乙二醇化进行修饰，同时基本上没有活性损失。如果选择的肽或者蛋白的PEG修饰进行到结束，肽或者蛋白的活性常常降低。因此本文的PEG修饰步骤通常限于肽或者蛋白的部分聚乙二醇化，产生低于大约50％，更一般低于大约25％的活性损失，但是半衰期基本上延长(例如，血清半衰期)以及聚乙二醇化活化剂需要的有效剂量基本上减少。
活性试剂的其它稳定修饰除了聚乙二醇化之外，促炎或者抗炎结合肽可通过结合到其它已知的保护或者稳定性化合物来保护促炎或者抗炎结合肽，例如，通过与活性肽，蛋白，类似物，或者模拟物连接到诸如一种或者多种免疫球蛋白链的一种或者多种载体蛋白形成融合蛋白进行修饰，以延长循环半衰期(参见，例如美国专利5,750,375；5,843,725；5,567,584和6,018,026，每个都在此引入作为参考)。这些修饰将降低肽的降解，螯合作用或清除并且产生在生理环境中(例如，在循环系统，或者在粘膜的表面)延长的半衰期。因此，由这些及其它稳定的结合方法修饰的活化剂可以高效地用于本发明方法内。尤其是，如此修饰的肽与非修饰的活性剂相比在递送或者作用的靶位点保持更长时间的活性。甚至当这样修饰活化剂时，与未修饰的化合物的生物活性相比基本上保持了生物活性。
在本发明的其它方面，促炎或者抗炎结合肽与相对的低分子量化合物，诸如氨基卵磷脂，脂肪酸，维生素B12以及葡萄糖苷结合提高了其稳定性(参见，例如，Igarishi等人，Proc.Int.Symp.Control.Rel.Bioact.Materials，17，366，(1990)。用于本发明组合物和方法范围内的其它示范性修饰肽可通过如下方法有利地进行体内修饰(a)化学或者重组DNA的方法连接哺乳动物信号肽(参见，例如，Lin等人，J.Biol.Chem.27014255，1995，在此引入作为参考)或者细菌肽(参见，例如，Joliot等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 881864，1991，在此引入作为参考)到活性肽，所述活性肽用于指导活性肽或者蛋白穿过细胞质和细胞器膜和/或运输活性肽或者蛋白到期望的胞内区室(例如，抗原递呈细胞(APC)的内质网(ER)，诸如用于提高CTL诱导作用的树状细胞)；(b)添加生物素残基到活性肽，用于指导活性结合物依靠其特异性结合的能力穿过细胞膜(即，结合亲和性大于大约106，107，108，109，或者1010M-1)到在细胞的表面上存在的转运蛋白(Chen等人，AnalyticalBiochem.227168，1995，在此引入作为参考)；(c)在活性肽的氨基和羧基末端的一端或者两端添加阻断剂以提高体内稳定性。这可用于活性肽或者蛋白的末端趋于在细胞吸收之前或者在胞内运输期间由蛋白酶降解的情形中。这种阻断剂可包括，无需限制，其他相关或者未相关的肽序列，其可以结合到有待给药的治疗多肽或者肽的氨基和/或羧基末端残基。这个过程可以在肽合成期间通过化学或者通过重组DNA技术进行。诸如焦谷氨酸或者其它本领域公知的分子的阻断剂也可连接到氨基和/或羧基末端残基，或者在氨基末端的氨基或者在羧基末端的羧基可被不同部分取代。
前体药物修饰用于本发明内的另一加工和制剂策略是前体药物修饰。通过瞬时(即，生物可逆的)衍生小的有机分子中的诸如羧基，羟基和氨基的基团，这些分子的不需要的物理化学特征(例如，电荷，氢键合势等等减少粘膜渗透的特性)可在没有永久性改变分子药理特性的情况下被“掩蔽”。治疗用小分子药物的生物可逆转性前体药物衍生物已经显示提高了多种示范性治疗剂的物理化学(例如，可溶性，亲脂性)特征，尤其那些含有羟基和羧酸基的衍生物。
一种制造含胺活性剂前体药物，诸如本发明的肽的方法是通过氨基的酰化作用完成的。任选的，已经讨论了利用胺的酰氧基烷氧基氨基甲酸酯衍生物作为前体药物。3-(2′-羟基-4′，6′-二甲苯)-3，3-二甲基丙酸已被采用于制备线性，酯酶-，磷酸酶-和脱氢酶敏感的胺前体药物(Amsberry等人，Pharm.Res.8455-461，1991；Wolfe等人，J.Org.Chem.576138，1992，在此引入作为参考)。这些系统已经显示通过一种两步机制进行降解，第一步是缓慢的由酶催化(酯酶，磷酸酶或者脱氢酶)确定速率的步骤，第二步是快速的(t1/2＝100秒，pH值7.4，37℃)的化学步骤(Amsberry等人，J.Org.Chem.555867-5877，1990，在此引入作为参考)。有趣地是，最近已经采用了磷酸酶敏感系统以制备一种完全水溶性(大于10毫克/毫升)的紫杉醇(TAXOL)的前体药物，所述紫杉醇显示显著的体内抗癌活性。这些及其他前体药物修饰系统和产生的治疗剂在本发明的方法和组合物内是有用的。
为了制备用于本发明内的肽的前体药物，美国专利5,672,584(在此引入作为参考)更进一步的描述了制备和利用生物活性肽和肽核酸(PNA)的环前体药物。为了产生这些环前体药物，生物学活性肽或者PNA的N-末端氨基和C-末端羧基通过接头连接，或者肽的C-末端羧基通过接头连接到侧链氨基或者侧链羟基，或者上述肽的N-末端氨基通过接头连接到侧链羧基，或者上述肽的侧链羧基通过接头连接到侧链氨基或者侧链羟基。本发明的有用接头包括3-(2′-羟基-4′，6′-二甲基苯基)-3，3-二甲基丙酸接头及其衍生物，以及酰氧基烷氧基衍生物。这里引用的公开内容提供了对产生和鉴定从线性肽合成的环前体药物，例如，显示出对细胞膜通透性和代谢稳定性提高的有利物理化学的特征(例如，大小减小，分子内氢键减弱，以及两亲性特征)的阿片样肽的有用方法。用于肽前体药物修饰的这些方法也对制备本发明的方法以及组合物内所用的修饰肽治疗剂衍生物有用处。
纯化以及制备本发明的肽可利用多种方法进行制备。因为其相对的小尺寸，肽可在溶液中或者在固相载体上根据常规技术合成。多种自动合成仪是市售的，并且可根据已知的的流程使用。参见，例如，Stewart和Young，固相肽合成(Solid Phase Peptide Synthesis)，第二版，Pierce Chemical Co.(1984)；Tam等人，J.Am.Chem.Soc 1056442(1983)；Merrifield，Science232341-347(1986)；和Barany和Merrifield，The Peptides，Gross和Meienhofer编，Academic Press，New York，第1-284页(1979)，其中每个都在此引入作为参考。
或者，可采用重组DNA技术，其中编码目的促炎或者抗炎结合肽的核苷酸序列被插入表达载体中，转化或者转染到合适的宿主细胞并在适合表达的条件下进行培养。这些步骤在本领域中是普遍公知的，一般描述于例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(MolecularCloning，A Laboratory Manual)，冷泉港出版社，冷泉港，纽约(1982)，以及Ausubel等人(编辑)当代分子生物学方法(Current Protocols inMolecular Biology)，John Wiley & Sons，Inc纽约(1987)，以及美国专利4,237,224，4,273,875，4,431,739，4,363,877以及4,428,941，在此引入作为参考。因此，包括一种或者多种本发明的肽序列的融合蛋白可用于呈递促炎或者抗炎结合肽。
因为这里设想的长度的肽的编码序列可通过化学方法，例如，Matteucci等人，J.Am.Chem.Soc.1033185(1981)的磷酸三酯法进行合成，可通过简单取代那些编码天然肽顺序的合适碱基进行修饰。然后，可以给编码序列提供合适的接头并且连接到本领域通常可获得的表达载体中，并且载体用于转化合适的宿主以产生期望的融合蛋白。现在，大量的这些载体和合适的宿主系统是可用的。为了表达融合蛋白，可提供编码序列，操作性地连接起始和终止密码子，启动子和终止子区以及通常连接一个复制系统以提供一种用于在期望的细胞宿主中表达的表达载体。例如，和细菌宿主相容的启动子序列提供在含有方便的限制性位点的质粒中，所述限制位点用于插入所需的编码序列。得到的表达载体被转化到合适的细菌宿主中。当然，采用合适的载体和控制序列，也可使用酵母或者哺乳动物细胞宿主。
本发明的肽和其药物和痘苗组合物可用于哺乳动物给药，尤其是人类，以治疗和/或阻止各种疾病和病症。促炎或者抗炎结合肽通常以基本上纯化的形式提供用于对受试对象直接给药。这里使用的术语“基本上纯化的”是指完全或者部分从天然的结合蛋白和其它污染物分离的肽，蛋白，核酸或者其它化合物，其中肽，蛋白，核酸或者其它活性化合物纯化到相对于其天然存在状态可测量的程度，例如相对于其在细胞提取物中的纯度。
在特定的实施方案中，术语“基本上纯化的”是指一种肽组合物，其已经从细胞，细胞培养基，或者其它粗制剂中分离并且进行分级分离以除去最初制备物的多种组分，诸如蛋白，细胞碎屑，及其他组分。当然，这些纯化的制剂可能包括与活性剂共价结合的材料，诸如葡萄糖苷残基或者与活性剂掺杂或者结合的材料，可能期望产生活化剂的修饰的衍生物或者类似物，或者产生组合的治疗用制剂，结合物，融合蛋白等等。因此术语纯化的包括如肽和蛋白类似物或者模拟物或者其它生物活性化合物的期望的产物，其中其它化合物或者部分，诸如聚乙二醇，生物素或者其它部分结合到活化剂以便允许其它化合物的连接和/或提供对治疗法或者诊断程序有用的制剂。
当应用于多核苷酸时，术语基本上纯化的代表不含通常相伴的物质的多核苷酸，但是可在编码序列的5′和/或3′端包括其它序列，当DNA来自于cDNA文库时，所述其他序列可来自于，例如，信使RNA的反转录的非编码区，或者可包括信号序列的反转录本以及成熟蛋白编码序列。
当参考本发明的肽，蛋白和肽类似物(包括与其它肽和/或蛋白融合的肽)时，术语基本上纯化的通常是指一种组合物，其部分到完全的不含其它在非纯化的，例如天然状态或者环境中与肽，蛋白或者类似物结合的细胞组分。纯化的肽和蛋白通常以均一或者接近均一的状态存在，虽然它可处于干燥状态或者在水溶液中。通常利用分析化学技术，诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳或者高效液相色谱法确定纯度和均一性。
一般而言，在本发明使用的基本上纯化的肽，蛋白及其他活性化合物包括在肽，蛋白或者其它活性剂与药物载体，赋形剂，缓冲液，吸收增强剂，稳定剂，防腐剂，佐剂或者其它在完整药物制剂中用于治疗剂给药的共成分混合或者配制之前的制备物中存在超过80％的所有大分子物种。更典型地，肽或者其它活性剂纯化到大于90％，常常大于95％的所有大分子物种存在于在与其它制剂配料混合之前的制备物中。在其它情况下，活性剂的纯化制备物可能基本上是均一的，其中其它大分子物种通过常规方法是不能检测得到的。
适合用于肽和蛋白纯化的多种技术是本领域技术人员所公知的。这些技术包括，例如用硫酸铵，PEG，抗体等等或者通过热变性继之以离心作用进行沉淀；层析步骤诸如离子交换作用，凝胶过滤，反相，羟磷灰石和/或亲和层析法；等电聚焦；凝胶电泳；以及这些和其它技术的组合。尤其有用的纯化方法包括用诸如硫酸铵的物质进行选择沉淀；柱层析法；亲和性方法，包括免疫纯化方法；及其他方法(参见，例如，R.Scopes，蛋白纯化原理和应用(Protein PurificationPrinciplesand Practice)，Springer Verlag纽约，1982，在此引入作为参考)。通常，生物活性肽和蛋白可从表达肽的组织或者细胞培养物中提取然后进行免疫沉淀，其中在肽以及蛋白可通过标准蛋白质化学/层析法进一步纯化。
用于本发明方法以及组合物中的肽和蛋白可通过各种方法获得。很多肽和蛋白可以纯化的形式从市售来源获得。较小的肽(小于100个氨基酸长)可通过本领域技术人员所熟知的标准化学方法方便地合成(例如，参见Creighton，蛋白结构和分子原理(ProteinsStructures andMolecular Principles)，W.H.Freeman和Co N.Y.，1983)。较大的肽(长于100个氨基酸)可通过多种方法，包括重组DNA技术产生(参见，例如，技术描述在Sambrook等人，分子克隆实验室手册(MolecularCloning，A Laboratory Manual)，冷泉港出版社，N.Y.，1989；和Ausubel等人编辑，当代分子生物学方法(Current Protocols in MolecularBiology)，Green Publishing Associates，Inc.，以及John Wiley & Sons，Inc.N.Y，1989，每个都在此引入作为参考)。或者，编码蛋白的RNA可化学合成。参见，例如，技术描述在，寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)，Gait，M.J.编辑，IRL Press，Oxford，1984(在此引入作为参考)。
在本发明的特定实施方案中，生物活性肽或者蛋白可利用肽合成技术，诸如固相肽合成(Merrifleld合成)等等，或者通过本领域公知的重组DNA技术进行构建。肽和蛋白类似物以及模拟物也可根据这些方法产生。用于在DNA的预订位点制造取代突变的技术包括例如M13诱变。对DNA序列进行操作产生取代，插入或者缺失突变方便地描述在别处，诸如在Sambrook等人分子克隆实验室手册(MolecularCloningA Laboratory Manual)，冷泉港实验室出版社，N.Y.，1989)。根据这些以及相关教导，通过多种常规方法，例如编码选择的肽片段，结构域或者基元的部分基因的cDNA拷贝的定点突变，将确定的突变引入生物活性肽或者蛋白以产生目的类似物和模拟物。这可通过以及中间单链的形式实现，诸如利用Bio-Rad实验室(Richmond，CA)的MUTA-gen试剂盒或者利用直接作为模板的双链质粒的方法进行，诸如Strategene的Chameleon的突变发生试剂盒(La Jolla，CA)，或者通过采用寡核苷酸引物或者模板两者之一的聚合酶链式反应进行，所述引物或模板包含目的突变。突变的亚片段能被装配成完整的编码cDNA的肽类似物。多种的其它致突变技术是已知的，并且可常规适用于在本发明使用的生物活性肽和蛋白中产生突变。
制剂和给药促炎或者抗炎结合肽通常与一种或者多种药物可接受载体以及，任选的其它治疗成分混合在一起。载体必须是“可药用”，意思是与制剂的其它成分相容并且不引发受试对象不可接受的有害效应。这些载体如上所述或者是药物学领域的技术人员所公知的。人们希望，制剂将不会包括诸如已知与有待给药的生物活性剂不相容的酶或者氧化剂的物质。可通过在药物学领域公知的任一方法制备制剂。
用于预防疾病和治疗的目的，此处公开的促炎或者抗炎结合肽可通过任一合适的给药途径给药，包括静脉内，皮下，肿瘤内，肺内，灌注等等。为了治疗的目的，本发明的肽也可通过减毒的病毒载体或者其它基因治疗递送构建体表达。如牛痘或者禽痘病毒的这些载体是这些广泛公知的方法的示例。所述方法包括利用，例如牛痘病毒作为载体表达编码本发明肽(或者连接物)的核苷酸序列。通过导入到靶位点(例如，肿瘤内位点，炎症位点，或者病毒感染位点)，重组牛痘病毒表达促炎或者抗炎结合肽，从而调节促炎或者抗炎的免疫应答。用于免疫流程的牛痘载体和方法描述于，例如美国专利4,722,848(在此引入作为参考)。另一有用的载体是BCG(结核活菌苗)。BCG载体描述在Stover等人(Nature 351456-460，1991(在此引入作为参考)。用于本发明肽的治疗给药或者免疫接种的多种其它载体，例如伤寒沙门氏菌载体等等，根据本发明的说明书对于本领域技术人员而言将是显而易见的。
促炎或者抗炎结合肽可以单次大剂量(bolus)递送的形式通过连续递送(例如，连续经皮，粘膜，或者静脉内递送)经过一个延长的时间段，或者重复给药方案(例如，每小时，每天或者每周的重复给药)进行给药。在本发明中，促炎或者抗炎结合肽的治疗有效剂量可能包括在延长的预防或者治疗方案的重复剂量，将引起临床上显著的效果以减轻一种或者多种与上述列举的靶向疾病或者病症相关的症状或者可检测的病症。在本发明中，有效剂量的确定通常基于动物模型的研究，随后是人临床试验，并且由确定显著降低受试对象靶向病症状或者病症的发生或者严重性的有效剂量和给药方案而加以指导。在这方面合适的模型包括，例如，鼠，大鼠，猪，猫，非人类的灵长类动物，及其他可接受的本领域公知的动物模型受试对象。或者，可利用体外模型(例如，免疫以及组织病理学分析方法)确定有效剂量。利用这些模型，通常仅仅需要普通的计算和校正就可确定合适的浓度和剂量从而施用治疗有效量的促炎或者抗炎结合肽。在可选择的实施方案中，为了治疗或者诊断的目的，生物活性剂的“有效量”或者“有效剂量”可简单的抑制或者提高与上述的疾病或者病症相关的一种或者多种选择的生物活性。
促炎或者抗炎结合肽的实际剂量当然根据下列因素而改变诸如疾病指标以及具体是受试对象的身体状况(例如，受试对象的年龄，身材，健康度，症状的程度，敏感因素等等)，给药次数和途径，同时给药的其它药物或者治疗，以及用于引发受试对象期望的活性或者生物效应的生物活性剂的特定药理学。可以调整给药方案以提供最佳的疾病预防或者治疗的反应。治疗的有效量也是促炎或者抗炎结合肽的任一毒性或者不良副作用在临床术语上被治疗上有利效果所超过的剂量。在本发明的方法和制剂中，生物活性剂的非限制范围的治疗有效量是0.01μg/kg-10mg/kg，更典型地在大约0.05和5mg/kg之间，并且在特定实施方案中在大约0.2和2mg/kg之间。在这个范围之内的剂量可通过单独或者多次给药实现，包括，例如每天多次给药，每日或者每周给药。每次给药，需要给普通的受试人施用至少一微克的促炎或者抗炎结合肽，更典型地在大约10μg和5.0mg之间，并且在特定实施方案中在大约100μg和1.0或者2.0mg之间。另外值得注意的是，对于每个具体的受试对象，特定的给药方案应该随着时间的推移根据个人需要和个人专业判断来加以评价或者调整，所述个人施用或监督给药可渗透肽及其他生物活性剂。
促炎或者抗炎结合肽的剂量可由主治临床医师加以改变从而在靶位点保持所需的浓度。例如在血流或者CNS中选择的生物活性剂的局部浓度可能在大约每升1-50纳摩尔，有时在大约1.0纳摩尔每升和10，15或者25纳摩尔每升之间，这取决于受试对象的身体状况以及反映出来的或者测量的反应。也可基于递送方式，例如粘膜还是静脉内或者皮下递送，选择较高或者较低的浓度。也可基于给药制剂，例如鼻喷雾剂还是粉末，持续释放的口服还是注射微粒或者透皮的递送剂型等的释放速度进行调整。为了达到相同的血清浓度水平，例如具有5纳摩尔(在标准条件下)释放速度的缓释颗粒应该给药大约两倍的颗粒剂量，释放速度10纳摩尔。
至于选择用于本发明生物活性剂的特定剂量的其它指导可以广泛发现在分散的文献中。
本发明更进一步通过以下具体的实施例进行说明，所述实施例不是为了限制本发明的范围。
HLA-E分子也可结合来自示范性应激诱导的蛋白，人热激蛋白60(hsp 60)的肽，以下实施例记录了这一发现。根据上述公开物，用于结合HLA-E的候选hsp60肽在hsp60蛋白的信号序列(相应于线粒体靶序列)中进行鉴定。在细胞应激期间，该肽可以接近新生的HLA-E分子并且引起HLA-E在细胞表面上的上调。明显地，结合这些hsp60肽的HLA-E分子不再被抑制性CD94/NKG2A受体对所识别。
因此，在正常细胞生长期间，HLA-E结合来自MHC I型信号序列的信号肽，以及这些细胞被保护起来避免自然杀伤细胞介导的攻击。在细胞应激期间，HLA-E分子可主要结合来自其它内源性蛋白质的肽，诸如，hsp60信号肽。
当HLA-E与全长的hsp60前导序列一起被转染到K562细胞(一种红白血病细胞系K562缺乏HLA I型细胞表面表达)中时，观察到细胞表面HLA-E表达有轻微增加。相反，如果这些细胞受到细胞培养应激，例如，以高密度细胞生长条件的形式，观察到大量的上调。用相同的HLA-E构建体(以及用hsp60前导序列的点突变变异体)转染的k562细胞中观察到HLA-E仅仅稍微上调，这一事实清楚地显示，在hsp60前导序列之内发现的重要肽序列能够接近HLA-E。这种观察指出了在细胞应激期间HLA-E的一种新的肽呈递-作用。
通过HLA-E介导的呈递应激诱导肽，未偶合在自然杀伤细胞上的CD94/NKG2A显示了一个新的机制，据此在例如持续慢性炎症期间自然杀伤细胞(和表达CD94/NKG2A的T细胞)可以检测并且除去应激的自身细胞。
在此呈现的发现显示从应激诱导蛋白呈递示范性HLA-E结合肽的HLA-E不再能够接合CD94/NKG2A抑制性受体—既通过针对肽-负载的HLA-E转染的细胞的NK细胞细胞毒性测定，也通过利用四聚体HLA-E/β2微球蛋白/hsp60肽-复合体测定，所述复合体结合到内源性和功能性表达在NK上的或者由细胞转染子表达的CD94/NKG2A上。这些结果表明由HLA-E呈递的示范性hsp60肽及其他有关肽形成未偶合CD94/NKG2A抑制性受体的复合体，可引起携带CD94/NKG2A受体的细胞的细胞激活。
细胞培养K562(人HLA-I型阴性红白血病)以及721.221(人HLA-I型低B-淋巴样干细胞)培养在补充有10％的热灭活FCS，2mM的L-谷氨酰胺，100U/ml的青霉素，以及1000μg/ml链霉素的RPMI 1640(LifeTechnologies，Gaithersburg，MD)。将两种人CD94/NKG2A+(但KIR-)细胞毒性的NK细胞系(NKL，由M.Robertson博士惠赠，Indiana大学医学院，Indianapolis，IN)，以及Nishi(由H.Wakiguchi博士惠赠，儿科系，光知医科学校，日本)生长在补充有7％混合的热灭活人AB+血清，200U IL-2/ml(PeproTech公司，Rocky Hill NJ)，2mM L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素，以及100μg/ml的链霉素(Life Technologies)的IMDM上。用CD94以及NKG2A，CD94，DAP-2和NK2G-GFP或者CD94和DAP-12共转染的Ba/F3细胞同前描述(Lanier等，Immunity6371-378，1997，在此引入作为参考)。HB-120(泛-HLA I型特异性杂交瘤)获自美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD，并且培养在补充有10％的FCS，2mM的L-谷氨酰胺，丙酮酸钠，HAT，100U/ml的青霉素，1000μg/ml的链霉素(Life Technologies)的DMEM中。
肽，HLA-E稳定化以及细胞培养应激分析购买自Research Genetics的合成肽溶于PBS中。使用肽为B7sp(VMAPRTVLL)，hsp60sp(QMRPVSRVL)，B7R5V(VMAPVTVLL)，hsp60 V5R(QMRPRSRVL)，以及P18I10(RGPGRAFVTI)(所有都来自Research Genetics，Huntsville，AL)。细胞及其HLA-E转染的衍生物与合成肽(3-300μM)在26℃培养在不含血清的AIM-V培养基(GibcoBRL，Paisley Scotland)中15-20小时，浓度为1-3×106个细胞/ml。然后收集细胞，用PBS清洗，用mAb染色并由流式细胞仪进行分析。细胞通过生长在细胞密度增加的条件下进行应激。
简而言之，在不同的时点在0.2×106个细胞/ml的细胞浓度条件下建立细胞培养物直到6天的时间。在最后的时间点，由锥石蓝排阻术确定细胞浓度和存活率。通过流式细胞仪评价HLA I型分子的细胞表面表达。存活率高于90％以及在三个不同密度的细胞培养物被选为细胞毒性测定的靶。
HLA-E四聚体的产生HLA-E四聚体复合体如前所述生成(Michaёlsson等，Eur.J.Immunol.30300，2000；Braud等，Nature 391795-799，1991，每个都在此引入作为参考)。简要地，HLA-E以及□2-微球蛋白(□2m)过表达在E.coli BL 21pLysS中，从包含体中纯化，溶解到8M尿素溶液中，然后通过合成肽(B7sp，hsp60sp，B7R5V或者hsp 60 V5R)(ResearchGenetics)进行体外再折叠。HLA-E重链，□2m以及肽的复合体利用大小排阻层析法在Superose12柱(Amersham-Pharmacia Biotech)上进行纯化，用BirA酶(Avidity，Denver CO)根据厂家的说明书进行生物素酰化，然后迅速冷冻并保存在-80℃。四聚体HLA-E复合体通过将生物素酰化的单体与链霉亲和素-藻红蛋白(Molecular Probes，Leiden，荷兰)以4∶1的摩尔比混合产生。类似质量的不同四聚体通过凝胶迁移分析以及通过泛-HLA特异性杂交瘤(HB-120)染色而得以证实。
抗体以及流式细胞仪使用的单克隆抗体(Mab)是DX 22(抗-CD94，DNAX，Palo Alto，CA)，抗-NKG2A(Z199，由Lorenzo Moretta博士惠赠，Istituto Nazionaleper la Ricerca sul Cancro，Genova，意大利)，CD56(B159，BDPharmingen)，抗-MHC I型mab(DX17，DNAX)以及W6/32(美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection))。3H5(抗-MICA)以及3D12(抗-HLA-E)mAb分别由T.Spies以及D Geraghty博士提供(FredHutchinson癌症中心，西雅图，美国)。抗hsp60(ML30)由J.Ivanyi博士提供(伦敦大学，英国)。抗-MICB(7C5)在我们的实验室通过用P815细胞免疫老鼠产生，所述P815细胞是用含有N-末端CD8前导肽继之以FLAG抗原决定簇以及细胞外的，跨膜和胞质MICB cDNA的pCDNA3表达载体稳定转染的。选择杂交瘤7C5(抗-MICB)并且杂交瘤7C5(抗-MICB)显示结合721.221和结合用MICB*002cDNA表达载体转染的P815细胞，而未转染的或者对照转染的细胞以及MICA*005转染的细胞是阴性的。第二步试剂是FITC-和PE-连接的山羊抗-小鼠IgG(都来自Dakopatts，Glostrup，丹麦)。DAK-GO1用作三重染色(Dakopatts)的阴性对照mAb。在FACScanTM(Becton Dickinson，SanJose，CA)上分析细胞。根据常规操作流程进行免疫荧光染色。简要地，用野生型(wt)或者突变的全长hsp60信号肽-GFP转染的K562细胞用核染料Hoechst33342在37℃染色30分钟，并用线粒体染料四甲基若丹明乙酯(TMRE)在37℃染色15分钟，继之以3次洗涤的步骤。利用连接到HanmamatsuC4742-98数码相机的Nikon Eclipse E400万能显微镜分析细胞。使用用于免疫荧光分析标记细胞的合适过滤器并且利用Jasc Paint Shop Pro 6.0获得影像并输入Adobe PhotoshopTM。
表达载体和转染细胞的产生合成的编码全长hsp60信号肽的有义和反义DNA，侧接5′EcoRI/3′BamHI位点(5′CGGAATTCATGCTTCGGTTACCCACAGTCTTTCGCCAGATGAGACCGGTGTCCAGGGTACTGGCTCCTCATCTCACTCGGGCTTATGGATCCGC3′)购买自Interactiva(Ulm，德国)。退火和消化的产物连接到pEGFP-N3表达载体(Clontech，Palo Alto，美国)。编码hsp60信号肽11位的甲硫氨酸-残基的三联体利用以下寡核苷酸引物5′CAGTCTTTCGCCAGGGGAGACCGGTGTCCAG-3′和利用定点突变试剂盒根据该厂家的说明书(QuikChangeTMStratagene，La Jolla CA)被突变为编码甘氨酸-残基的三联体，并通过测序进行验证。HLA-E*0101以及HLA-E*01033cDNA的编码质粒(pCDNA3)由M.Ullbrecht和E.Weiss博士提供(Institut fuer Anthropologie undHumangenetik，慕尼黑，德国)。721.221和K562细胞根据常规流程通过电穿孔法(Gene pulser，BioRad，Hercules CA)进行转染。对于用编码HLA-E和嵌合GFP的质粒进行的瞬时共转染试验，我们使用10∶1的比率(HLA-E∶GFP)。在补充有1mg/mlG418(BioRad)的完全培养基中选择转染的细胞。通过流式细胞仪(FACScanTM)根据其绿色萤光特性分离稳定转染的细胞。
NK细胞-介导的细胞毒性试验利用2小时标准51Cr放射性同位素释放分析测量NK细胞介导的细胞毒性。简要的，靶细胞与浓度范围为1-300μM的多种肽在26℃温育15-20小时，然后用51Cr进行标记。在进行试验之前冲洗掉肽，除了在一些实验中，其中非保护的hsp60sp，B7R5V和hsp60V5R在整个分析期间保留，以保证与用保护的B7sp温育的靶相比有高水平的HLA-E表达。在mAb封闭试验中，事先细胞与小鼠血清，或者不相关的同种型匹配抗体一起预温育以封闭Fc受体。在4℃用mAb封闭靶或者效应细胞，并且在试验期间抗体也包括在内。
实施例IHsp60sp稳定HLA-E的细胞表面表达为了鉴定来源于人hsp60的肽与HLA-E的结合潜能，扫描hsp60的全长氨基酸序列寻找显示HLA-E允许基元的肽(在C-末端，甲硫氨酸在2位，后面是在9位的亮氨酸或者异亮氨酸)。在所鉴定的四种肽中(图1；表3)，一种肽(QMRPVSRVL，命名为hsp60sp)的最初选择是基于其在hsp60前导序列中的定位。另外，hsp60sp不仅在2位带有甲硫氨酸和在9位带有亮氨酸，而且和已知有效结合到HLA-E的一些肽一样在4和8位具有相同的氨基酸(表1)。尤其是，在hsp60sp的9个氨基酸中有4个与在HLA I型前导序列中发现的一些肽的氨基酸相同(例如，HLA-A*0201，和-A*3401，表1)。
对于肽和HLA-E相互作用的研究已经显示，或者提供于转染的eDNA表达质粒中，或者通过外加合成肽而存在的HLA-E结合肽足以稳定和上调HLA-E细胞表面表达到通过流式细胞仪可检测的水平(Braud等人，Nature 391795-799，1991；Lee等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 955199，1998；Borrego等人，J.Exp.Med.187813，1998，每个都在此引入作为参考)。为了测试hsp60-来源的肽是否能够结合HLA-E，用不同的合成肽通过在26℃的过夜培育而稳定HLA-E细胞表面的表达。为了这种目的，使用MHC I型缺陷细胞系诸如721.221(缺乏HLA-A，-B，-C，和-G，但是胞内表达HLA-E和-F)，以及用HLA-E*01033的K562细胞(K562-E*01033)或者HLA-E*0101转化的K562细胞。721.221细胞和HLA-E转染的，而不是未转染的K562细胞在正常细胞生长期间在细胞表面表达低水平的HLA-E。这些基础水平的HLA-E表达显示微量胞内肽的存在足以稳定新生的HLA-E分子。
如图2所示，利用hsp60sp，在HLA-E*01033和HLA-E*0101转染的K562细胞中观察到HLA-E表达的大量增长。用hsp60sp负载后，HLA-E的表达水平可与负载有来源于HLB*0701(B7sp，VMAPRTVLL)前导序列的肽的细胞的表达水平相当(图2)。但是，在37℃，HLA-E/hsp60sp复合体比HLA-E/B7sp离解更迅速，之后大约到达基础水平。除hsp60sp外，hsp60.4肽(GMKFDRGYI)也能够使转染的K562细胞以及721.221细胞上的HLA-E分子稳定。这种肽先前也显示结合到小鼠Qa-1b分子(Lo等人，Nature Med.6215，2000，在此引入作为参考)。用其它两种hsp60来源的肽(hsp60.2和hsp60.3；表I)没有观察到HLA-E的稳定化，可能应归于在分析介质中较差的溶解度。
实施例IIHsp60信号肽可以接近胞内的HLA-E并且HLA-E/hsp60sp的水平在细胞应激期间上调Hsp60是一种线粒体基质蛋白，编码在基因组DNA中(Bukau等人，Cell 923351，1998；Itoh等人，J.Biol.Chem.27013429，1995，每个都在此引入作为参考)。用由26个氨基酸组成的N-末端线粒体靶序列合成为前体蛋白(hsp60L，参见图1)。生化分析已经建立了hsp60L的裂解需要将前体蛋白输入线粒体基质，而且这种裂解不可能发生在细胞质中，因为在不存在hsp60L时没有观察到线粒体中输入的hsp60(Singh等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.1692391，1990，在此引入作为参考)。Hsp60L裂解之后的最终目的地尚不清楚。应激时，通过增加转录以及通过影响其胞内水平和分布的转录后事件调节hsp60(Belles等人，Infect.Immun.674191，1999；Samali等人，EmboJ.182040，1999；Feng等人，Blood 973505，2001；Soltys等人，Exp.Cell.Res.22216，1996，每个都在此引入作为参考)。
为了跟踪hsp60L的定位，尤其是为了确定hsp60sp是否可以接近HLA-E分子，发展了一种基于用含有野生型hsp60L，或者突变体的嵌合构建体转染的K562细胞的模型系统，在突变体中11位的甲硫氨酸由甘氨酸取代。上述的甲硫氨酸残基相应于hsp60sp九聚体的2位，并且对于稳定结合到HLA-E是必须的。野生型和突变的hsp60L以框的形式嫁接到绿色荧光蛋白(GFP)的N-端，以确保转染后，绿色荧光细胞也翻译每一个单独的hsp60前导序列。跟踪转染，GFP定位在两种hsp60L-GFP转染的细胞系的线粒体内，表明11位甲硫氨酸的取代没有改变运输到线粒体中。当GFP基因单独转染时，GFP显示没有明显的亚细胞定位。
先前，已经报道了小鼠Qa-1b分子的细胞表面的水平在细胞应激期间是基本上上调的(Imani等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8810475，1991，在此引入作为参考)。考虑到在Qa-1b和HLA-E之间的同源性，就序列、生物学功能和肽结合特异性而言，试验被设计成能测试位于hsp60的线粒体靶向序列中的九聚体肽是否可能最终进入HLA-E，尤其在细胞应激的条件下。为此目的，K562细胞用编码HLA-E*01033的质粒与野生型hsp 60L-GFP构建体或者与其突变体一起共转染。然后当培养物利用生长在递增细胞密度的方法进行应激时监控这些转染子的HLA-E细胞的表面表达。
用野生型hsp60L-GFP构建体转染的细胞比用突变构建体共转染的细胞持续表达更高水平的HLA-E。人们应该注意到，这种不同依赖于生长的条件；在第一天，在表达野生型和突变的hsp60sp之间HLA-E细胞表面水平的差异是中等的，而在第五天差异是显著的。当生长在与正常条件相比应激条件下时，在用突变的hsp60L-GFP构建体转染的细胞中还有特定的HLA-E水平的提高(图3a，第一天与第五天相比)。这可能是由于突变的肽结合HLA-E的残余能力，或者通过内源性衍生的hsp60肽与HLA-E的接近。与后者的可能性一致，由于培养诱导的应激在K562细胞中HLA-E水平增加，所述K562细胞已经单独用HLA-E基因进行了转染(图3b，下图)，而未转染的K562细胞保持HLA-E阴性(图3b，上图)。还有一种可能性，受到其它HLA-E结合肽以及转录后影响，但是肽独立调节应激细胞中的HLA-E。也应该注意K562-E*01033细胞系以及存在于图4a中的共转染的细胞系是独立产生和选择的，这可说明在第一天观察到的高的HLA-E背景水平更高。因此，HLA-E的绝对水平不一定在图3a和3b之间可直接比较。
上述转染子研究表明应激反应导致胞内线粒体hsp60sp对于HLA-E的可达性增加，最终引起HLA-E/hsp60sp细胞表面水平的上调。这似乎至少部分是由于在应激反应期间hsp60sp的转录后控制，因为使用的hsp60L-GFP和HLA-E构建体都在相同CMV启动子的控制下，并且GFP表达水平没有随着细胞密度的增加而发生改变(图3a)。最终，虽然K562组成性表达活化的NKG2D配体MIC-A和MIC-B，但是在这些分析期间没有观察到进一步细胞表面上调这些应激可诱导的MHCI型-类分子。但是，不能排除其它活化的应激诱导的配体，例如UL16结合蛋白(ULBP)的上调。
实施例IIIHLA-E介导的hsp60sp的呈递取消由CD94/NKG2A和CD94/NKG2C受体的识别抑制的凝集素-类受体异二聚体CD94/NKG2A存在于人和小鼠外周血大约50％的所有NK细胞中。这种HLA-E特异性受体通过与呈递各种保护性HLA-I型信号肽的HLA-E结合后介导负信号，导致NK细胞效应子功能的失活。以类似的方式，在具有允许的MHC I型前导肽的复合体中的Qa-1b被鼠CD94/NKG2A受体有效地辨别，显示在人和小鼠中受体和配体水平进化的保守性。为了鉴定可能的NK细胞受体，其与带有hsp60sp或者MHC I型信号肽的复合体中的HLA-E互作，已经设计了研究用来确定MHC四聚体复合体是否可以结合表达在转染子和NK细胞上的CD94/NKG2受体。重组的可溶性HLA-E分子在存在人β2-微球蛋白和B7sp(VMAPRTVLL)或者hsp60sp(QMRPVSRVL)的情况下体外重新折叠。重新折叠的MHC复合体用来产生四聚体HLA-E分子，能够用于分析HLA-E结合受体。通过凝胶-迁移分析，肽不仅允许体外有效重新折叠HLA-E而且被有效地生物素酰化。这些研究显示HLA-E/B7sp四聚体有效地与用CD94和NKG2A或者CD94，NKG2C和DAP12共转染的小鼠Ba/F3前-B细胞结合起来(图4，图a和b)。该结果通过表达抑制受体CD94/NKG2A的NK-细胞系(图4，图c)，或者新近分离的主要表达CD94/NKG2A受体的NK细胞的染色进行证实。相反，HLA-E/hsp60sp四聚体不能结合用CD94/NKG2A或者CD94/NKG2C/DAP12共转染的Ba/F3前-B细胞以及所有检测到的NK细胞(图5，图a-c)。然而，HLA-E/B7sp和HLA-E/hsp60sp都以类似程度结合到对照B细胞杂交瘤，所述对照B细胞杂交瘤特异于HLA I型分子(图5，图d)。因此，虽然hsp60sp在生理学上可有效地接近HLA-E，此复合体不再被CD94/NKG2A和CD94/NKG2C受体识别，显示它们是肽选择性的。
实施例IV在细胞毒性试验中，HLA-E/hsp60sp不能抑制CD94/NKG2A+NK细胞；在肽5位的重要作用为了确定增加的HLA-E/hsp60sp细胞表面水平功能上的重要性，设计了研究用于确定表达这些MHC复合体的细胞是否被保护起来免遭CD94/NKG2A+NK细胞的杀伤。在26℃与hsp60sp或者B7sp肽过夜培养的K562-E*01033细胞作为2小时铬释放试验的对象，用CD94/NKG2A+NK细胞系Nishi和NKL作为效应子进行试验。当敏感的K562-E*01033细胞与B7sp一起培养时观察到清楚的免于杀伤的保护性，而与hsp60sp一起培养时不产生任何显著的保护性(图5，图a)。如上所述，hsp60sp和B7sp具有与HLA-E不同的离解速率，这可说明靶敏感性差异。因此在细胞毒性测定前后监控HLA-E的表面表达以保证在整个试验期间靶上HLA-E可比的水平。
为了查明对由CD94/NKG2A导致丧失HLA-E识别负责的残基，将靶向突变导入B7sp和hsp60sp中。以前已经显示在Qa-1b结合肽Qdm中p5R的一个变化取消了由CD94/NKG2A在小鼠中的识别(Kraft等，J.Exp.Med.192613，2000，在此处引作参考)。为了试验在两种肽的5位上功能保守性的程度，生成了试验性的肽B7 R5V(VMAPVTVLL)和hsp60 V5R(QMRPRSRVL)。这些肽保护K562-E*01033细胞的能力在如上所述的细胞毒性试验中进行试验。K562-E*01033细胞与表达高水平的HLA-E的B7 R5V在26℃进行培养(图6，图c)，然而它们被CD94/NKG2A+NK细胞有效地杀伤(图5，图b)。因此该突变足够取消b7sp的保护能力。然而，利用相同的效应细胞导入hsp60sp中的V5R突变不能足以恢复免于杀伤的保护性(图5，图b)。
最近已经报道了hsp60.4肽(GMKFDRGYI)可以与Qa-1b结合起来，但是没有诱导免于CD94/NKG2A+NK细胞杀伤的保护性(Gays等，J.Immunol.1661601-1610，2001，此处引作参考)。然而，该肽不能与用于结合Qa-1b的保护性Qdm-肽竞争，即使当用1nM Qdm(Id.)以100,000倍过量混合时。相反，本发明的公开内容显示了hsp60sp可以通过与MHC I型信号肽的竞争干扰HLA-E介导的保护。
简要地，K562-E*01033细胞与0.1□M B7sp连同浓度增加的竞争肽一起培养，并在细胞毒性试验中进行测定。与0.1□□M B7sp和对照肽培养的细胞在所有试验浓度下保持细胞免于杀伤，而与0.1□□M B7sp和hsp60sp培养的细胞随着hsp60sp的浓度增加对杀伤更加敏感(图6d)。B7R5V肽是比hsp60sp更强的竞争者(图6d)。如Gays等人(36)报道符合Qa-1b肽结合竞争的结果，hsp60.4不能与B7sp竞争结合HLA-E(图5d)。
然而另外的研究也在进行，旨在确定在K562-E*01033细胞中观察到的应激诱导的HLA-E细胞表面上调是否引起保护细胞免于NK细胞介导的溶解。在不同密度下生长的K562-E*01033细胞在2小时铬释放分析中作为靶用NKL和Nishi作为效应细胞进行试验。尽管显示增加的HLA-E水平，杀伤增加而非减少，表明在这些细胞上诱导的HLA-E分子不是保护性的。由Annexin V染色和锥石蓝测定的所有的靶细胞具有高于90％的存活率(数据未包括在内)。此外，并且重要地，在高密度条件下生长的细胞可以通过添加B7sp肽免于杀伤而得以拯救(图6，图b)。这就显示增加的杀伤性最终不取决于细胞的培养条件，而且HLA-E的水平足够保护细胞，只要有适当的肽存在。数据也显示由应激诱导的HLA-E表达不足以保护细胞免于NK细胞介导的杀伤。值得注意的是，虽然K562组成型表达用于激活受体NKG2D的MIC-A以及MIC-B配体，但是在这些分析中没有被施加的细胞应激进一步上调。因此，细胞应激以后在本文一些试验中观察到的杀伤增加现象未必是由于MIC-A或者MIC-B表达的增加。其它激活配体，例如ULBP的上调可能负责杀伤的增加。
总结上述实施例，HLA-E已经显示结合来自hsp60信号顺序的新的应激相关肽。产生的复合体不能被抑制性CD94/NKG2A受体有效地识别。通过缺乏结合HLA-E/hsp60sp四聚体到CD94/NKG2A的表达细胞并且通过NK细胞介导的杀伤表达这种HLA-E/肽复合体的细胞进行显示。此外，基于转染的细胞的研究显示hsp60sp可以接近体内的HLA-E分子，尤其是在细胞应激的条件下。因此，表明HLA-E在带有这种肽的复合体中的比例在应激期间增加，引起在HLA-E肽所有组成中从NK细胞保护性到非保护性复合体的逐渐变化。
依据这种模型，NK细胞可以以肽选择性方式通过监视HLA-E/肽复合体在感染性和炎性应答期间检测应激的细胞。这对于均一地表达CD94/NKG2A作为它们的主要抑制受体的NK细胞亚型尤其重要，以及对于那些表达此受体的激活的T-细胞亚型也很重要。
以前已经讨论缺失自身识别是否可以基于肽的特异性识别，在某种意义上，带有MHC I型的复合体中正常的自身肽可允许结合抑制的受体，而病毒及其它非自身肽是不允许的。有很好的证据显示一些受体受到结合肽的强烈影响。这适用于免疫球蛋白-类以及C-型凝集素-类受体，包括CD94/NKG2A。然而，保护性能力不与肽的来源相关，即，不论它代表自身还是非自身，或者健康的还是有病的。然而，在不同的HLA-E复合体之间的平衡可能代表一种情形，其中细胞可以通过竞争MHC依赖的呈递以信号表示“正常”与“反常”。因此，HLA-E介导的保护不仅依赖于是否产生足够的容许信号肽(主要来自各种的MHC I型分子)，而且依赖于他们通过非允许的应激诱导的肽如何进行平衡。
虽然KIR识别MHC I分子可以受结合肽的影响，但是基于肽选择性监视应激细胞的机制可能主要与CD94/NKG2受体相关，因为它们被特异性的设计以识别在带有限制组的保护性肽的复合体中的寡态性(oligo morphic)HLA-E分子。另一方面，KIR已经基本上进化到识别高度不同的的多态性HLA-A，-B，以及-C分子。如果通过KIR操作，应激细胞的类似监视机制将需要一大批能够被装载到每个HLA I型等位基因上的应激-诱导的肽。
在此关于应激诱导的肽干扰(SPI)抑制性识别的研究的第一个焦点涉及不同HLA-E肽复合体的结构方面。HLA-E/B7sp的晶体结构显示五个肽残基位于HLA-E分子的明确的口袋中(O′Callaghan等，Mol.Cell.1531，1998，此处引作参考)，限制了肽在整个结合沟中的构象。在hsp60sp以及MHC I型信号肽序列之间的比较(表1)显示在五个位点p1，p3，p5，p6以及p7的差异。其中，p3，p6以及p7分别埋在口袋D，C以及E中，而p1和p5暴露于表面。
基于HLA-E/B7sp的结构，O′Callaghan等人认为在B7sp中的p5R起到HLA-E结合受体的HLA-E接触残基的作用。实际上，在B7sp中的5位从精氨酸到缬氨酸(在hsp60sp中的相应残基)的改变足以完全地取消HLA-E介导的防止被表达CD94/NKG2A的NK细胞杀伤。然而，在hsp60sp(5位的缬氨酸到精氨酸)中互换不足以获得保护，显示在这个肽中其它的氨基酸是重要的。特别的关注聚焦在3和7位的精氨酸，似乎难以适合浅并且疏水的D-和E-口袋中。改变这些侧链的位点或者同一性预计用于直接地或者间接地通过改变在HLA-E沟中肽的全部构象，来干涉受体结合，并因此将用于本发明的特定方面。
用于进一步在本发明内发展的另一个重要的焦点涉及HLA-E/hsp60sp复合体的生物学相关性。上述的证据显示在应激期间观察到的HLA-E水平的增加起因于hsp60起源的肽流入HLA-E呈递通道。为了精密地进行研究，用HLA-E*01033以及偶联GFP的全长hsp60信号序列(hsp60L-GFP)共转染这些K562细胞。这产生线粒体表达GFP，而HLA-E在细胞内的高水平表达在细胞表面仅有低水平的表达。当它们受到培养诱导的应激时，与用HLA-E*01033以及突变的hsp60L-GFP构建体转染的对照相比，细胞表面HLA-E的水平在这种细胞中增加，在突变的hsp60L-GFP构建体中重要的HLA-E锚定残基已被取代。此外，HLA-E的上调预计作为在应激期间内源性hsp60sp较高水平以及改变分布的结果。与这些一致，用HLA-E*01033单独转染的K562细胞也显示细胞表面HLA-E在应激后水平增加。此外，HLA-E在细胞表面的上调，作为应激的结果在任何试验中没有防止NK细胞介导的杀伤。
通过添加保护性肽，例如B7sp肽可能恢复HLA-E介导的保护。实际上，仅仅通过在分析中添加保护性B7sp肽就可保护应激的细胞。这就显示在应激期间内源hsp60sp可通过HLA-E进行呈递。因此，HLA-E被认为是在感染，自体免疫以及炎症期间作为应激诱导肽的呈递者对于NK细胞以及T细胞是重要的。从生长在正常情况下的细胞以及暴露于各种应激刺激的细胞中分离HLA-E分子，其中的肽的洗脱以及测序可加以评价以估测hsp60sp实际上是否主要由在这些及其它疾病状态和条件下的应激细胞所呈递。
上述结果进一步显示至少一部分应激-诱导hsp60sp到HLA-E的易接近性增加是由于转录后因素的作用。这种因素可以包括在蛋白酶活性方面的改变，更有效从线粒体运输肽到内质网(ER)，改良的hsp60的分布，或者在线粒体膜的渗透性方面的改变。大多数(80-90％)的hsp60混合物定位在健康细胞中的线粒体基质中(Soltys等，Exp.Cell.Res.22216，1996，此处引作参考)。可是，有报告显示细菌感染后(Belles等，Infect.Immun.674191，1999，在此引入作为参考)，以及细胞应激和proapoptotic事件后(Feng等，Blood 973505，2001；Samali等EmboJ.182040，1999，每个都在此处引作参考)线粒体外hsp60水平增加。虽然用成熟hsp60已经观察到这一现象，然而至少对于线粒体渗透性的影响也适用于剪切的信号肽。
除肽负载的改良机制以及hsp60sp表达增加之外，能够结合HLA-E的其它肽可在应激期间上调。据报道即使L-细胞的短暂热处理就增加了Qa-1b的细胞表面水平(Imani等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8810475，1991，此处引入作为参考)。最近据报道，一种hsp60来源的肽(沙门氏菌中的GMQFDRGYL和小鼠中的GMKFDRGYI)结合到Qa-1b。(Lo等，Nature Med.6215，2000，此处引入作为参考)。此外，这里进行的研究证实肽GMKFDRGYI(在表I中的hsp60.4)也可结合到HLA-E。与hsp60sp相反，此肽不能与B7sp竞争结合到HLA-E上(图5，图d)，据报道也不能竞争结合到Qa-1b上(Gays等，J.Immunol.1661601-1610，2001，此处引作参考)。还据报道呈递hsp60.4的Qa-1b不能保护细胞免于NK细胞介导的溶解(Id.)。因此，这些配体似乎不能接合CD94/NKG2A受体，但是在沙门氏菌感染小鼠期间反而能被克隆型T细胞受体检测(Lo等，2000，如上所述)。因此来自其它应激诱导的以及热激蛋白质的肽，包括另外的hsp60-来源的肽，有可能在由胞内感染引发的细胞应激期间变得易结合HLA-E。这些肽的提出是为了把HLA-E分子作为CD94/NKG2受体的配体转化为复合体的功能作用，所述复合体能被特定的T细胞在感染期间通过它们的抗原-特异性TCR所识别。
人们注意到，T细胞还可以表达CD94/NKG2A抑制受体，并且因此HLA-E分子与hsp60sp以及MHC I型信号肽之间的平衡也被提出以调节在炎症应答中的T细胞。在这方面，最近公布的报道支持了本发明的发现针对抗病毒抗原的效应细胞毒性T-淋巴细胞可通过表达CD94/NKG2A受到抑制(Moser，J.M.等，Nature Immunol.3189-196，2002，此处引作参考)。通过该受体识别Qa-1b抑制了T-细胞的增殖以及效应子的功能，显著影响了急性感染以及由多形瘤病毒引起的肿瘤发生。作者推测负载Qa-1b的肽可在下病理条件受到影响，也可能影响与受限的T-细胞之间的互作。
本发明显示用肽负载HLA-E的能力通常是由HLA-E赋予的，所述肽不仅在应激细胞中被诱导，而且也干扰针对CD94/NKG2A+NK细胞的保护。这些发现阐明在调节T细胞应答期间CD94/NKG2A表达的作用。不仅通过检测到MHC I型分子产量的降低而且通过检测应激诱导肽对HLA-E易接近性的提高，该受体的共表达可在分辩健康的以及有病的细胞中补充TCR途径。为了进一步阐明这些机制，设计了一些研究以确定表达CD94/NKG2的人T细胞是否可被靶细胞中应激诱导的改变所影响。在上下文中，来自健康供体的外周血的分析证实CD94/NKG2A+T细胞亚型也结合到HLA-E/B7sp四聚体。此外，在这里另外的研究显示没有检测到HLA-E/hsp60sp四聚体与CD94/NKG2A+或者CD94/NKG2A-T细胞的结合，表明T细胞以和NK细胞相同的方式在不同的HLA-E复合体之间进行辨别，而且表达特异于HLA-E/hsp60sp的TCR的T细胞在健康的个体中是不足的。
HLA-E分子被CD94/NKG2A抑制复合体以及CD94/NKG2C激活复合体识别。激活形式的作用还不确定。HLA-E/hsp60sp复合体被CD94/NKG2C或者另一个未知的活化NK受体识别的可能性很有吸引力。这可以解释，尽管HLA-E水平提高了，为什么应激K562-E*01033细胞被NK细胞更有效地杀伤。可是，NKL细胞系没有表达活化的NKG2C受体，并且HLA-E/hsp60sp四聚体没有结合到CD94/NKG2C转染子，也没结合到检验的任何NK细胞。因此，触发NK细胞活化受体的其它配体可能包括在内。NKG2D的MIC-A或MIC-B配体在培养应激的K562或者K562-E*01033细胞上都上调。然而，NKG2D的其他配体或者其它活化受体可能影响K562和K562-E*01033细胞的敏感性。利用特异性阻断活化NK细胞受体的试剂，其它试验可有助于阐明在培养应激后NK细胞敏感性提高的背后机制。
基于CD56细胞表面表达的水平(CD56暗和CD56亮)，NK细胞可被分成两个主要的亚型(Sedlmayr等，Int.Arch.Allergy.Immunol.110308，1996，此处引入作为参考)。属于较少CD56亮亚型的细胞全部表达高水平的CD94/NKG2A，并且仅仅小部分表达KIR。相反，大多数CD56暗NK细胞表达KIR并且显示较低的细胞表面水平的CD94/NKG2A(Jacobs等人，Eur.J.Immunol.313121，2001，此处引入作为参考)。CD56暗和CD56亮之间的表型区别相关于不同效应子的功能(Cooper等人，Blood 973146，2001，此处引入作为参考)。当受刺激时，CD56亮NK细胞较少产生细胞毒性，并且更倾向于产生细胞因子，因此被认为具有免疫调节特性(Chen等，J.Immunol.1623212，1999，此处引作参考)。这些细胞对促炎信号有潜在的反应(基于他们的趋化因子受体和粘附分子的表达图谱)，并且在炎症位点大量过呈递(如下所述)。此外，巨噬细胞已被报道对人hsp60有反应，引起IL-12和IL-15的产量增加(Id.)，所述IL-12和IL-15是这种NK细胞亚型的重要活化剂。基于此处所述的发现以及hsp60在炎症期间上调的事实，可以预测HLA-E与hsp60sp的结合主要导致CD94/NKG2A+CD56亮NK细胞产生细胞因子。
在下面的实施例中，另外的发现包括显示表达功能性HLA-E特异性抑制受体的CD56亮自然杀伤细胞优选的积聚在关节炎患者的关节中。如上所述，自然杀伤细胞(NK细胞)是参与抗特定的微生物以及寄生虫感染的先天免疫反应的淋巴细胞。最近的报道显示NK细胞在试验性自身免疫模型中其它的重要作用，但是对于NK细胞在人患自身免疫病期间的功能还知之甚少。在下面实施例中，分析了特异于MHC I型分子的杀伤细胞免疫球蛋白(Ig)类(KIR)以及C-型凝集素类(CD94/NKG2)受体的表达，所述MHC I型分子位于NK细胞，以及□□T细胞和来自患关节炎的病人，主要是类风湿性关节炎(RA)病人的滑液(SF)以及外周血(PB)的□□T细胞。
从这些研究中，人们发现关节炎患者的SF与相应的PB相比，含有比例提高的NK细胞。与PB-NK细胞相反，SF-NK细胞群几乎均一地表达CD94/NKG2A细胞表面受体并且含有比例显著降低的KIR+NK细胞。功能分析显示体外培养的来自病人的多克隆SF-NK细胞和PB-NK细胞均完全能够杀伤大范围的靶细胞。然而SF-NK细胞的溶解由HLA-E在转染的靶细胞上的存在而受到抑制。当阻断SF-NK细胞上的CD94或者通过掩蔽自体细胞上的HLA时，SF-NK细胞能够进行自体指导的溶解。因此，HLA-E被认为在调节发炎关节中的主要NK细胞群中具有基本的作用。
病人，对照和细胞分离全部17个病人患有膝关节炎，并在分析时已接受了治疗性抽吸SF。RA病人满足美国风湿病学会对于RA的界定标准(Arnett，ArthritisRheum.31315-324，1988，此处引入作为参考)。全部病人，除了一个诊断为早期寡关节炎(oligoarthritis)的44岁女性病人以外，都接受缓解病情的抗风湿药物治疗。在RA病人中关节外的病症包括糖尿病(1个病人)，雷诺氏现象(2个病人)，以及次级舍格伦氏综合症(1个病人)。来自病人的SF和PB的成对样品，以及来自8个健康女性对照的PB(平均年龄52.7岁，范围49-61岁)收集到不含防腐剂的肝素中，并根据常规的操作流程通过FICOLL-HYPAQUE(Amersham PharmaciaBiotech，Uppsala，瑞典)密度梯度离心分离单核细胞。
NK细胞培养PB-和SF-NK细胞系的生成是利用抗-CD3 mAb(OKT3，美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD)和泛抗-小鼠Ig包被的dynabead(珠子与细胞的比率为4∶1)，根据厂家(Dynal AS，Oslo，挪威)的说明书通过排除CD3+细胞进行的。如以前所述，基本上保持了剩余的NK细胞富集群(Sderstrm等，J.Immunol.1591072-1075，1997，此处引作参考)，只带有微小的修饰。简要的，将CD3-细胞接种到24孔培养平板(Costar，Cambridge，MA)上，接种浓度为1×106细胞/毫升，接种在补充有2％混合的人AB+血清，10％FCS，2mM L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素，以及100μg/ml的链霉素和100U/ml的人重组IL-2的IMDM上。开始培养后两个到三个星期，在功能性分析中测定CD56+CD3-PB-NK细胞系和SF-NK细胞系。
mAb和流式细胞仪抗KIR mAb DX9(抗-KIR3DL1)，DX27(抗-KIR2DL2，KIR2DL3和KIR2DS2)，DX31(抗-KIR3DL2)和DX22(抗-CD94/NKG2A，-B，和-C)分别由Lewis L.Lanier和Joseph H.Phillips博士提供(UCSF，旧金山和DNAX，Palo Alto，CA)。其它的抗体抗NKG2A(Z199，由LorenzoMoretta博士提供，Istituto Nazionale per la Ricerca sul Cancro，Genova，意大利)，CD3(UCHT1，BD Pharmingen，San Diego，CA)，CD56(B159，BD Pharmingen)，CD16(Leu-llc，Becton & Dickinson，San Jose，CA)TCRαβ(WT31，Becton和Dickinson)以及TCRγβ(Immu510，Coulter-Immunotech，Miami，FL)，MHC I型分子(w6/32，美国典型培养物保藏中心)。第二步的试剂是FITC-和PE-连接的兔抗-小鼠IgG(都来自于Dakopatts，Glostrup，丹麦)和用于三重染色的阴性对照(DAK-GO1，Dakopatts)。利用标准操作流程进行免疫荧光染色。在FACScanTM上分析细胞。
细胞K562(人HLA-I型红白血病)，Daudi(人□2m-Burkitt氏淋巴瘤)，P815(鼠肥大细胞瘤)，721.221(人HLA-I-型B-类淋巴母细胞)培养在由RPMI 1640(Life Technologies)组成的完全培养基中，RPMI 1640补充有10％的热灭活FCS，2mM的L-谷氨酰胺，100U/ml的青霉素，以及100μg/ml链霉素。HLA-B*5801转染的721.221细胞和用由HLA-G前导序列融合到HLA-B*5801组成的嵌合基因转染的721.221细胞通过DNAX(Palo Alto，USA)生产。简言之，含有HLA-G前导区段以及HLA-B*5801的胞外，跨膜和胞质结构域的嵌合cDNA利用野生型HLA-G和HLA-B*5801 cDNA作为模板通过PCR产生(详细描述以及引物参见，Braud等，Nature 391795-799，1991，此处引入作为参考)。产物被插入pBJ-neo表达载体，并通过测序加以验证。721.221细胞通过电穿孔法进行转染并且在补充有1mg/mlG418的完全培养基上进行选择。表达高水平细胞表面HLA I型分子的转化细胞通过流式细胞仪进行分离。通过用B95-8 EBV-株体外感染病人的B-细胞建立EBV转化的B-类淋巴母细胞系(B-LCL)。简言之，来自病人PB的106个单核细胞与产生B95-8 EBV的细胞系(Miller等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA70190-194，1973，在此处引入作为参考)的上清液在37℃下5％的CO2中培养1小时。然后将感染的B-细胞培养在添加有5μg/ml环孢菌素A(Sigma，St Louis，MO)的完全培养基上大约两周。通过细胞聚集和增殖典型的体外建立的EBV-转化的B细胞来鉴定成功的转化。
NK细胞介导的细胞毒性试验利用4小时51Cr放射性同位素或者18小时Alamar蓝存活率分析(Alamar Biosciences，Sacramento，CA)如上所述(Sderstrm等人，J.Immunol.1591072-1075，1997，此处引入作为参考)测定NK细胞介导的细胞毒性。在一些实验中，添加终浓度为1μg/ml的封闭mAb并且在分析期间存在。
HLA-E四聚体的产生由Veronique Braud博士(Oxford，UK)提供用于四聚体产生的HLA-E表达载体。基本上按照如上所述的方法(Braud等人，Nature391795-799，1991，此处引入作为参考)产生四聚体HLA-E复合体。简要地，与BirA底物肽在C-末端融合的HLA-E重链以及人β2-微球蛋白(β2m)过表达在E.coli BL21pLysS中，从包含体中纯化，并溶解到含DTT的8M尿素溶液中。HLA-E-bsp，人β2m和合成的肽(VMAPRTVLL，来自HLA-B*0701前导序列，Research Genetics，Huntsville，AL)的复合体通过体外再折叠HLA-E-bsp，人β2m和肽生成。再折叠的复合体利用大小排阻层析法在Superose 12柱(Amersham-Pharmacia Biotech)上进行纯化，随后用BirA酶(Avidity，Denver，CO)根据厂家的说明书进行生物素酰化。利用NAP-5脱盐柱(Amersham Pharmacia Biotech)去除游离的生物素。通过凝胶迁移分析测定生物素酰化的程度为90％左右。四聚体通过将生物素酰化的HLA-E/β2m/肽单体与链霉亲和素-PE(Sigma)以4∶1的摩尔比混合产生。
统计分析阳性细胞的百分比显示为平均值±SEM。成对的学生氏T-测验用于比较SF和PB。
实施例V在来自关节炎患者的NK细胞上表达KIR和CD94/NKG2分子为测定新分离的源自关节炎患者的NK细胞的表型和亚型的分布，我们利用一组mAb进行三重染色继之以流动细胞计数分析。如图7所示，SF中NK细胞(CD3-CD56+)与患者PB中的相比观察到比例略微的增加。此外，病人和健康个体的大多数PB-NK细胞表达NK细胞标记CD16(FC□RIII)，而在SF中观察到CD16+NK细胞存在频率的降低，证实了其它的报道(Hendrich等，Arthritis Rheum.34423-431，1991，此处引入作为参考)。此外，在病人和健康对照的SF和PB中，小比例的T细胞对CD56和CD3是双-阳性的，但是在病人和对照的SF和PB之间没有观察到显著的差异。
显著地，所有病人SF中的KIR3DL1+，KIR2DL2/KIR2DL3+和KIR3DL2+NK细胞与相应的PB样品相比组分显著较低(表6)。病人PB-NK细胞上的这些KIR分子的表达是异源的且显然与健康对照的PB-NK细胞没有不同之处。表达特异于SF中特定经典HLA-A，-B，和-C分子的KIR分子的NK细胞的比例显著降低，显示SF-NK细胞可能依赖其它不同于KIR-型分子的MHC I型特异性抑制受体来调控它们的效应子功能。考虑到这些结果，分析了凝集素-类MHC I型-特异性受体(即，CD94/NKG2受体复合体)的表达，其中与NKG2A(或其剪接变体NKG2B)成对的CD94链形成一个抑制单元，特异性结合到非经典的HLA-E分子(Braud等，Nature 391795-799，1991，此处引入作为参考)。
表5.NK细胞上KIR分子的表达表达如下分子的NK细胞的百分比a)KIR3DL1 KIR2DL2/3 KIR3DL2受试对象SF PB SF PB SF PBRA1 3.2 18.7 3.5 17.5 3.7 13.4RA2 14.728.6 16.621.5 22.842.4RA3 7.7 15.4 8.6 25.7 11.918.6RA4 2.0 14.2 6.0 25.3 6.6 23.6RA5 2.0 2.8 5.6 22.0 12.821.7RA6 2.5 19.1 6.7 21.6 5.6 10.4RA7 5.0/4.8 20.9 10.6/10.3 38.2 15.6/14.2 30.9RA8 0.1 0.1 8.1 8.9 3.7 6.5RA9 0.8/1.8 9.4 5A/9.2 27.0 4.1/5.9 13.0PsorA 10.637.3 7.2 27.0 12.030.8AS 2.0 36.2 4.3 46.5 9.0 30.4MonoA 1.1 6.4 7.2 27.2 3.0 2.2Poly.A 1.0 9.3 5.9 23.6 6.7 28.3Oligo.A13.7 5.6 7.0 55.2 11.513.0Oligo.A20.8 8.0 6.7 33.8 8.0 31.0平均数± 3.8±0.915.5±3.08.4±1.127.1±3.39.2±1.321.1±2.9SEM对照PB(n＝8)平均数± 9.8±2.3 30.1±4.925.3±4.6SEMa)新分离自病人和健康受试对象(对照PB)的SF和PB的细胞用抗各种MHC I型特异性受体(KIR3DL1，KIR2DL2/L3和KIR3DL2)的mAb作为第一个步骤，以及用FITC-连接的山羊抗-小鼠抗体作为第二个步骤，接着用连接的抗CD3(Cychrome)和CD56(PE)的mAb进行三重-染色。每一个体患者的结果被显示为成对数据。SF值表示RA病人7和9相应的右/左膝。CD56+CD3-门控的淋巴细胞群中的KIR表达细胞的百分比被显示(这种NK细胞门控内获得5000-10000个结果)。当与成对的PB样品相比时，在病人样品的SF中，含有显著较低比例的表达KIR的NK细胞(用于KIR3DL1时p＜0.001，用于KIR2DL2/L3时p＜0.001，用于KIR3DL2时p＜0.001；成对的学生氏T检验)。在病人PB-NK细胞上表达的KIR无异于健康对照的PB-NK细胞的表达。
清晰，一致的发现是，大多数用抗CD94抗体亮染的SF-NK细胞作为柱状图的单一峰值，而在PB-NK细胞上的抗-CD94染色模式是双相的，这个群体划分为CD94暗和CD94亮两种亚型。图8A，显示典型病人的柱状图，而图8B概括了所有被研究病人的数据。有趣的是，大多数SF-NK细胞也显著地表达NKG2A分子，而仅有一小部分的PB-NK细胞为NKG2A+(图8A和8B)。这些发现，连同显示于表6的结果证明绝大多数的SF-NK细胞表达抑制性CD94/NKG2A受体复合体，并含有显著减少比例的KIR表达亚型。CD56的表达水平也证明了大多数SF-NK细胞属于CD56亮亚型(57.7±5.3％，n＝16)，而仅有较小比例的PB-NK细胞表达显著水平的CD56(与相应的SF-NK细胞相比，24.1±5.0％，n＝14，p＜0.001)，其接近于来自健康受试对象的PB-NK细胞中发现的比例(17.5±3.2％，n＝8)。
这些分析进一步证明在病人PB-NK细胞上的KIR表达总是限于CD56暗亚型，而少数CD56亮PB-NK细胞为CD94亮和NKG2A+。因此，基于CD56，KIR，CD94和NKG2A染色图谱，主要的SF-NK细胞亚型类似于这种存在于病人和健康个体PB中的CD56亮NK细胞的少数亚型(图8c)，其类似于高水平表达CD56，CD94和NKG2A分子的SF-NK细胞，但好象几乎完全缺乏至少KIR2DL2，KIR2DL3，KIR3DL1和KIR3DL2分子。总之，发炎的SF与病人和健康对照的PB相比似乎富集了具有更受限的MHC I型特异性受体所有组成部分的NK细胞亚型。
实施例VI慢性关节炎病人的T-淋巴细胞亚型上KIR和CD94/NKG2的表达测定在病人和健康受试对象的αβ-和γδ-T细胞上KIR和CD94/NKG2分子的表达。不管细胞是否获自SF或PB，当与γδT细胞相比时KIR和CD94/NKG2A，B，和C表达细胞在αβT细胞中的比例是较少的(分别在表6和表7)。然而这些并不令人惊奇，因为在文献中这些受体在γδT细胞上比在αβT细胞上更普遍已经得以充分记录。有趣的是，虽然表达这些分子的αβT细胞和γδT细胞的比例在一些病人的成对PB和SF样品中明显不同(分别在表6，和表7)，这表明表达特定MHC I型特异性受体的T细胞的优先累积可能发生在特定的病人中。SF和PB之间的差异对于γδT细胞更明显，尽管一些病人在SF中与成对的PB相比特定的KIR+亚型的比例显著下降(＞5倍)(参见，例如，病人RA1，RA4，RA5，RA8和Poly.A)，还观察到一种相反的模式。因此，该结果没有揭示任何清晰的趋势，表明表达特定KIR和/或CD94/NKG2的αβ-或者γδT细胞比例的增加或减少与RA病人的PB或SF相关。
表6.KIR和CD94/NKG2A，B，C分子在αβT细胞上的表达αβT细胞表达下列分子的百分比a)KIR3DL1 KIR2DL2/3KIR3DL2CD94/NKG2A，B，C受试对象SFPBSFPBSFPBSFPBRA1 0.1 0.1 0.2 0.1 0.4 0.4 1.5 0.8RA2 0.4 1.2 0.9 2.1 5.0 3.1 5.0 1.7RA3 0.2 0.2 0.7 2.2 0.4 2.0 1.4 2.9RA4 0.3 0.1 0.6 0.3 2.2 1.0 10.0 5.0RA5 2.2 0.9 4.4 3.1 3.5 2.0 12.1 10.6RA6 0.5 ＜0.1 0.4 11.6 1.0 0.3 4.8 0.1RA7 0.2/0.3 0.7 1.3/1.6 1.5 3.4/4.0 3.0 1.9/3.0 4.9RA8 0.1 0.3 0.2 2.0 1.8 1.4 7.3 18.2PsorA 0.3 0.6 0.6 1.9 1.1 1.1 1.5 4.4MonoA 0.2 0.3 3.3 6.3 3.4 2.3 5.4 15.2Poly.A 0.3 0.1 1.0 1.0 2.5 0.4 6.5 8.0平均数± 0.4±0.2 0.4±0.1 1.3±0.4 2.9±1.0 2.4±0.4 1.5±0.3 4.8±1.0 6.5±1.8SEM对照PB(n＝8)平均数± 0.8±0.43.5±0.64.5±1.013.9±3.2SEMa)新分离自关节炎病人和健康受试对象(对照PB)的SF和PB的细胞用抗各种MHC I型特异性受体(KIR3DL1，KIR2DL2/L3，KIR3DL2和CD94/NKG2A，B，C)的mAb作为第一个步骤，以及用FITC-连接的山羊抗-小鼠抗体作为第二个步骤，接着用连接的抗CD3(Cychrome)和TCRαβ(PE)的mAb进行三重-染色。每一个体患者的结果被显示为成对数据。结果表示RA病人7相应的右/左膝。CD3+TCRαβ+门控的淋巴细胞群中的KIR和CD94/NKG2表达细胞的百分比得以显示(门控内获得5000-10000个结果)。
表7.KIR和CD94/NKG2A，B，C分子在γδT细胞上的表达γδT细胞表达下列分子的百分比a)KIR3DL1KIR2DL2/3 KIR3DL2 CD94/NKG2A，B，C病人 SFPBSFPB SF PB SF PBRA1 1.4 21.8 1.2 3.214.1 16.0 80.2 89.5RA2 1.4 4.0 6.2 22.1 41.2 43.4 91.5 80.9RA3 6.5 24.5 32.5 23.8 56.0 32.0 78.1 86.0RA4 1.0 1.7 2.4 12.3 16.0 13.8 92.8 75.4RA5 1.4 9.3 20.0 28.2 27.7 19.6 73.5 88.6RA6 4.3 2.4 3.1 11.0 16.4 14.4 70.6 62.1RA7 1.3/1.7 8.3 8.4/10.9 17.6 41.7/39.9 31.5 54.4/53.2 65.1RA8 ＜0.1 2.1 8.2 16.6 13.0 14.8 55.3 66.3PsorA2.3 1.6 3.8 1.513.5 2.258.6 92.4MonoA0.8 0.8 8.0 12.8 13.8 10.8 81.0 87.0Poly.A 0.2 17.8 1.5 0.17.427.6 94.4 90.3平均数 1.8±0.5 8.6±2.6 8.6±2.6 13.6±2.8 25.0±4.5 20.6±3.6 72.8±4.2 80.3±3.4±SEM对照PB(n＝8)平均数± 3.0±0.435.5±0.6 36.6±1.0 87.1±8.3SEMa)详情参见表2。
来自RA病人的NK细胞系的功能分析成对的多克隆CD3-CD56+SF-NK和PB-NK细胞系在IL-2的存在下通过体外培养进行建立。1-2周后，测定这些NK-细胞系抗一组靶细胞的细胞毒性的潜能(721.221，K562，Daudi和P815)。如表5所示，多克隆的SF-NK细胞系和PB-NK细胞系能够溶解这些不同的靶细胞。这些NK-细胞系，如在表8中测定的，也产生可比水平的促炎细胞因子IFNγ，TNFα，和IL-6，并且还分泌类似量的IL-2和IL-10如通过ELISA试验平行测定，并且通过流式细胞仪测定，在用PMA刺激后，超过90％的SF-和PB-NK细胞染色发现胞内IFNγ。因此，在体外建立的SF-和PB-NK细胞系之间没有观察到细胞毒性潜能和细胞因子产量的明显区别。
表8.利用来自RA病人的SF和PB的多克隆NK细胞系，NK细胞-介导的抗一组靶细胞的细胞毒性特异性溶解的百分比a)721.221 K562Daudi P815E/T比率 SFPBSFPBSFPBSFPB4∶1 64765457766638512∶1 40694152515416321∶1 2034253038463 7a)靶细胞的溶解通过4小时51Cr-释放试验进行检测，并且利用体外培养来自相同RA病人的多克隆SF-NK细胞(SF-左膝值)和PB-NK细胞(PB-右膝值)数据被显示为三个E/T比率。短期PB-NK细胞系的表型相对于KIR和CD94/NKG2A的表达是异源的，而SF-NK细胞系同源表达CD94/NKG2A且基本上不表达KIR。
实施例VII滑液NK细胞系功能性识别被建议作为主要配体保护自体细胞免遭NK-细胞攻击的HLA-EHLA-E的表面表达取决于其结合来自其它HLA-A，-B，-C和-G分子的信号序列的九聚体肽。因此，CD94/NKG2A与HLA-E的相互作用可被认为是一种机制，据此特定的NK细胞间接地监控特定多态性和非多态性HLA I型分子的表达。在转染系统中，一些HLA分子的过表达(例如，HLA-G，其含有一个允许的HLA-E结合信号序列)可装配足量的HLA-E，以与在NK细胞上表达的CD94/NKG2A互作(Braud等，Nature 391795-799，1991，此处引入作为参考)。
为测试SF-NK细胞是否通过其CD94/NKG2A受体功能性识别HLA-E，利用稳定转染有其中HLA-G前导序列被嫁接到HLA-B*5801(GL-B*5801)的胞外结构域的嵌合基因的721.221细胞进行细胞毒性试验。作为表达全长HLA-B*5801分子的对照转染子(不参与CD94/NKG2A受体识别的HLA分子；参见Phillips等，Immunity5163-172，1996，此处引入作为参考)被采用。这些转染子都在细胞表面表达HLA-B*5801，其同样被先前表明为特异于HLA-Bw4型等位基因的受体的KIR3DL1+(和CD94/NKG2A-)NK细胞克隆所识别(Litwin等，J.Exp.Med.180537-543，1994；D′Andrea等，J.Immunol.1552306-2310，1995，每个都在此处引入作为参考)。除HLA-B*5801之外，GL-B*5801转染的细胞也表面表达HLA-E，其可通过CD94NKG2A+NK细胞克隆被功能性检测。如图9A所示，多克隆SF-NK细胞系有效地杀死未转染的721.221细胞以及用野生型HLA-B*5801转染的721.221细胞。然而通过表达嵌合的GL-B*5801分子赋予了防止NK细胞-介导的溶解。所述保护在抗CD94或HLA I型抗体的存在下被逆转，清晰地表明多克隆SF-NK细胞能均一地通过其抑制CD94/NKG2A受体识别HLA-E(图9B)。此外，当用HLA-E四聚体分子染色从病人PB和SF新分离的NK细胞时，大多数SF-NK细胞被HLA-E四聚体有效地染色，而新的PB-NK细胞被较少地染色(尽管是一些，包括大多数CD56亮PB-NK细胞是HLA-E四聚体-阳性的；图9C显示了一个典型的病人)，其中HLA-E四聚体分子在存在HLA-B*0701九聚体前导肽序列的存在下重新折叠。PB中许多NK细胞不能用HLA-E四聚体染色的原因极可能是由于CD94暗亚型上CD94/NKG2分子的水平较低。
为测试CD94/NKG2A和HLA-E的互作是否也能阻止SP-NK细胞杀死自体细胞，来自一个RA病人的B-LCL被用作NK细胞-介导的细胞毒性的靶点。如图10所示，PB-NK细胞和SF-NK细胞两者都不能溶解自体的B-LCL。然而，自体细胞的溶解通过利用两个多克隆的PB-NK细胞和SF-NK细胞作为效应子由抗-HLA I型mAb或抗-CD94mAb得以增加。利用SF-NK细胞作为效应子，抗-CD94mAb恢复溶解到与用抗-HLA I型mAb所观察到的几乎相同的水平--表示大多数HLA自身保护机制参与了CD94/NKG2A与HLA-E的互作。另一方面，多克隆的PB-NK细胞系也通过其它的受体-配体互作被调节，因为抗-CD94的加入仅仅部分地增加了细胞溶解，而抗-HLA I型分子几乎导致自体靶细胞的完全溶解。这些发现与下列事实相符仅仅一小部分多克隆PB-NK细胞是CD94/NKG2A+而几乎所有的SF-NK细胞是CD94/NKG2A+。此外，来自该病人的结果显示在图10中，表明了CD94/NKG2A是主要的存在SF-NK细胞上的自身特异性受体。
其他的研究进一步阐明应用本发明来调节HLA-E/CD94/NKG2细胞受体互作以及与RA和其它炎性和自身免疫疾病相关的免疫应答，包括不利的移植排斥反应的重要性。如上所述，人慢性关节炎是通过在滑膜以及滑液中产生的级联炎性细胞因子而永久存在的。NK细胞是细胞因子的重要生产者且存在于这些炎症位点，但是它们在慢性人关节炎中的作用在此以前基本上是未知的。NK细胞的功能是通过抑制和激活细胞表面受体与邻近细胞上的分子的互作来调节的。在本发明的公开物中，详细研究了滑液(SF)NK细胞表达杀伤免疫球蛋白类受体(KIR)和C-型凝集素类受体CD94/NKG2A。也详细研究了NK细胞产生促炎细胞因子IFN-γ和TNF-α的能力。报道了在表达抑制性HLA-E+肽复合体的靶细胞存在下，NK细胞细胞因子产生(IFN-γ和TNF-α)的新的调节。
作为上述实施例的补充，图11显示了SF-NK细胞结合到与示范性的VMAPRTVLL肽形成复合体的HLA-E上。图12显示了SF-NK细胞结合到与VMAPRTVLL(B7sp)肽形成复合体的HLA-E，而不结合到与QMRPVRSVL(hsp60sp)肽形成复合体的HLA-E。图13显示SF-NK细胞与RA病人或健康个体的PB-NK细胞相比，通过暴露于脂多糖(LPS)的情况下受刺激产生IFN-γ和TNF-α。图14显示SF-NK细胞与PB-NK细胞相比在暴露于IL-2后受刺激产生IFN-γ。图15显示在这些可接受的模型研究中，呈递B7信号肽(VMAPRTVLL)的HLA-E足以抑制NK细胞产生IFN-γ和TNF-α细胞因子。
上述补充的结果显示在患有慢性炎性关节炎病人的关节滑液中发现的人NK细胞属于NK细胞的一个表型和功能不同的亚型，类似于上述的CD56-亮外周血的NK细胞亚型。关节炎关节中的NK细胞通过响应于在关节中产生的其它细胞因子有效产生IFN-γ和TNF-α可以加入促炎级联，并且这些NK细胞细胞因子应答将通过细胞与表达HLA-E加之一个保护肽的细胞相接触被显著地下调，所述HLA-E加之一个保护肽是被CD94/NKG2A抑制受体识别的复合体。不被CD94/NKG2A抑制受体识别的HLA-E与非保护性肽的复合体不能够抑制NK细胞细胞因子的产生。
综述上文的实施例，来自关节炎病人SF的NK细胞被发现表型上属于NK-细胞的不同亚型，主要缺少KIR分子和同源表达抑制性CD94/NKG2A异二聚体。本发明确信是第一个描述特定NK细胞亚型在人任一自身免疫病中独特的疾病-相关的聚集。
从前的研究已经确证KIR在正常PB-NK细胞上的表达在个体之间被克隆性分布及可变性表达(Lanier等，Immunity 6371-378，1997，此处引入作为参考)。此外，在PB中，KIR的表面水平和至少一些KIR+NK细胞亚型的频率随时间是稳定的，且独立于个体的HLA I型单元型(Gumperz等，J.Exp.Med.1831817-1827，1996，此处引入作为参考)。因此，表达特定KIR同种型的NK细胞可能存在于缺少合适的自身-HLA I型分子的个体中并且可能在具有合适的自身-HLA I型分子(Id.)的个体中缺乏。因此，特定的个体似乎具有利用抑制KIR或CD94/NKG2A来自身识别MHC I型的NK细胞(Valiante等，Immunity7739-751，1997，此处引入作为参考)。尽管一些个体依赖于更“广泛地”反应性CD94/NKG2A系统，但KIR在其PB-NK细胞上的表达没有明显的减少。因此，KIR3DL1，KIR2DL2，/KIR2DL3和KIR3DL2分子在RA病人PB-NK细胞上的表面正常表达模式，以及其中大多数似乎缺乏这些KIR分子的表达，并相反主要表达CD94/NKG2A受体的SF-NK细胞的特异性聚集，表明发炎的关节提供仅仅适合特定NK细胞亚型的环境。
CD56亮PB-NK细胞的小亚型和主要的SF-NK细胞亚型之间的表型类似性，表明这些较少的PB亚型响应于局部产生的趋化因子优选地补充到发炎关节，所述趋化因子诸如，已知存在于发炎关节的巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)，MIP-1β或RANTES(Hosaka等，Clin.Exp.Immunol.97451-457，1994，此处引入作为参考)，并且这种设想的机制将加以评价来进一步改进此处的教导。基于表明CD56亮PB-NK细胞亚型也表达更亮水平的对于滚动在血管壁上的白细胞重要的分子(例如，CD62L)以及对于白细胞附着和外渗到炎性位点上所必需的分子(例如CD2，CD11c，CD44，CD49e，CD54)(26)的研究，有可能CD56亮CD94/NKG2A+KIR-NK细胞亚型被选择性地补充到发炎关节中。此外，存在于关节处的细胞因子(例如IL-15)可优选促进这种特定亚型的增殖和/或参其从细胞程序性死亡的拯救。
除上述的发现之外，这里的实施例证明了SF-NK细胞功能上能够识别HLA-E。也提供了这种识别是主要的功能性受体-配体相互作用阻止SF-NK细胞攻击自体细胞的证据。
均一表达的广泛的反应性系统的存在可能对于发炎关节中的NK细胞是重要的，因为CD94/NKG2A受体本身间接地识别大部分含有允许的前导肽的HLA-I型分子的存在(Braud等，Nature 391795-799，1991，此处引入作为参考)。然而，主要依赖于这种受体-配体相互作用也使这种系统易受损伤，因为SF-NK细胞的自身耐受性仅仅通过HLA-E的表达维持。因此，维持HLA-E在关节中细胞上的高水平表达将是必要的，以防止SF-NK细胞介导的细胞毒性。可以假定只要典型的MHC I型分子在正常水平产生，将产生足量的保护性前导-肽用于胞内负载HLA-E分子以及随后细胞表面定位来抑制SF-NK细胞应答。然而，据报道在带有各种自身免疫疾病包括RA的病人的淋巴细胞表面上发现了MHC I型表达的异常低水平(Fu等，J.Clin.Invest.912301-2307，1993，此处引入作为参考)。这里提出在合适的SF-NK-细胞刺激后，这些HLA-E水平会十分低，足以在与特定的淋巴细胞互作后诱导NK细胞的应答，所述特定的淋巴细胞在滑液隔室中起重要的调节作用。在这方面，很有趣的注意到患有与抗原加工相关的转运蛋白(TAP)遗传缺陷的病人，结果在所有细胞上不表达或表达低量的MHC I型细胞表面分子，在它们的NK细胞上过表达功能性CD94/NKG2A受体，表明对低水平MHC I型分子的适应与这种受体的表达相关(参见，例如，Zimmer等，J.Exp.Med.187117-122，1998，此处引入作为参考)。此外，来自这些病人的体外激活的NK细胞有效地溶解自体的LCL细胞和成纤维细胞，表明这种亚型的耐受性可能被破坏，使这些NK细胞能够自身免疫反应抗表达低水平MHC I型分子的细胞(Id.)。
尽管许多的报道已经表明新分离自RA病人的NK细胞通常显示溶解活性降低(综述在Lipsky，Clin.Exp.Rheumatol.4303-305，1982，此处引入作为参考)并且当受刺激时与IFNγ产生反应差(Berg等，Clin.Exp.Immunol.1174-182，1999，此处引入作为参考)，其它的报道已经表明体外SF单核细胞培养物中NK细胞的减少导致特定Ig-同种型产生的增加(Tovar等，Arthritis Rheum.291435-1439，1986，此处引入作为参考)。这就表明SF-NK细胞参与抗体产生的调节，也可能归因于特定B细胞的直接细胞溶解或间接地通过可依次诱导抑制性T细胞应答的细胞因子的产生(例如，TGFβ)(Horwitz等，Immunol.Today18538-542，1997，此处引入作为参考)。
总之，上述的结果表明患有自身免疫关节炎的病人的SF含有显著增加部分的NK细胞，其中绝大多数表达CD94/NKG2A受体且仅仅少数表达KIR3DL1，KIR3DL2/3和KIR3DL2分子。也提供了SF-NK细胞能够结合HLA-E，而且它们功能上识别转染细胞上的HLA-E的证据。此外，表达在多克隆SF-NK细胞系上的CD94/NKG2A受体似乎是参与自身MHC I型反应性调节的主要受体，如利用自体LCL细胞的阻断实验中所示。
实施例VIII筛选具有“开/关”能力接合CD94-NKG2受体-对的合成HLA-E结合肽当负载肽的细胞在NK细胞细胞毒性测定期间被转移到37℃时，带有hsp60前导肽的HLA-E复合体可能不稳定且易于离解。鉴定可能加强或降低这些结合互作稳定性的肽变异体将提供用于本发明方法和组合物的其他活性剂，包括用于体内治疗的应用。为改进本发明的这些方面，利用通过细微修饰hsp60肽主链鉴定的肽变异体可进行合成肽或肽类似物的大规模筛选。这种筛选可被用于分离稳定的HLA-E结合肽，所述结合肽可能显示出与激活的CD94/NKG2受体对功能性互作增强。这种肽类似物的分离对于抗大范围的肿瘤治疗具有深远的意义。下面是示范性大规模筛选程序来鉴定本发明有用肽变异体的简要描述。
材料-用HLA-E*0101或HLA-E*01033转染的K5 62细胞。
注为加速大范围肽-筛选的过程，这些细胞系也可与编码GFP的质粒一起共转染(参见下文)。
-RPMI 1640培养基-九聚体肽文库，基于hsp60前导肽主链的修饰肽，其它与HLA-E肽结合间隙结合的可能的合成或天然的结构类似物。
-26℃温箱-37℃温箱-带有96孔板固定器的细胞离心机-96孔圆底平板HLA-E稳定化的初始筛选肽和HLA-E互作的研究已经表明通过在培养基中添加合成的九聚体肽所提供的HLA-结合肽，可充分地稳定并上调HLA-E细胞表面表达水平，如流式细胞仪测定。为测试合成的肽/肽类似物是否结合HLA-E，我们将在26℃，利用HLAE*01033或HLA-E*0101转染的K562细胞过夜稳定HLA-E细胞的表面水平。
筛选出HLA-E*0101和HLA-E*01033结合肽/肽类似物的程序HLA-E转染的K562细胞将用没有FCS的RPMI培养基洗涤两次并置入96孔圆-底平板中，浓度为2×10e5个细胞/孔，以及200微升RPMI培养基中含有300mM肽。平板26℃过夜培养，然后用没有FCS的RPMI 1640培养基洗涤两次。一等分试样用抗I型mAb染色并通过流式细胞仪分析HLA I型的表达水平。剩余细胞被放回37℃并染色1，2，3，或4小时，随后得到该HLA-E肽复合体的稳定性评价。通过这种方法能够筛选出一组将形成相当稳定复合体的HLA-E结合肽。
通过其接合CD94/NKG2A(抑制)或CD94/NKG2C(激活)受体对的潜力来评价HLA-E肽复合体潜在功能的方法用于筛选的NK效应细胞
NKL和Nishi NK细胞系均携带抑制性CD94/NKG2A受体对，通过RT-PCR或在NKG2C特异性mAb和细胞表面染色的帮助下，然后通过流式细胞仪来首先分析NKG2C cDNA转录本的存在。如果这些细胞系缺少活化的NKG2C受体链，从类风湿性关节建立的异源多克隆NK-细胞群也将对活化NKG2C受体链的存在加以分析，所述异源多克隆NK-细胞群主要表达功能性CD94/NKG2A受体对。
方法HLA-E转染的K562细胞用GFP共转染后，将与如上所述我们选择的HLA-E稳定肽一起装载在96孔平板中。洗涤后，这些靶细胞平板与NK效应细胞一起在37℃培养2-4小时，且在没有事先洗涤的情况下通过流式细胞仪直接分析NK-细胞介导的细胞毒性。这种分析方法的精确细节和动力学要求通过实验利用示范性HLA-B*0701信号肽(VMAPRTVLL)和负载hsp60信号肽(QMRPVRSVL)的HLA-E*0101和HLA-E*01033转染的GFP-阳性的K562细胞首先进行确定。该试验是基于被保护免于NK-细胞介导的溶解的HLA-E转染的靶细胞将保持GFP-阳性(绿色荧光)且保留在活门控内，被溶解的细胞将释放荧光且最终死在活门控的外部。这个试验的优点在于可立刻快速筛选一个相当大的肽文库。一个可能的缺点可能是测定靶细胞与对照肽-处理的细胞相比是否以显著更高的比例溶解的阙值难以进行评价。因此，可能需要最初利用这种方法来选择显示出良好的防止溶解特性的肽或肽类似物。然后，剩余的选择性肽的作用通过传统方法测定(即，利用51-Cr放射性同位素标记的靶细胞进行的NK细胞-介导的细胞毒性)。这种实验方法能够筛选用作CD94/NKG2A抑制受体的“闭合开关”和可能作为CD94/NKG2激活受体的“启动开关”的新肽和肽类似物。最后，这个实验方法能够筛选形成稳定的保护性HLA-E复合体的新肽和肽类似物(即，CD94/NKG2A抑制受体的“启动开关”)。
实施例IX证明Qa-1b(HLA-E的鼠同系物)参与肿瘤逃逸，且表达Qa-1b的肿瘤的增强排斥可通过CD94-NKG2A解偶联肽的给药来实现。
HLA-E/hsp60复合体在细胞应激期间增加。这种复合体不能被抑制的CD94-NKG2A受体识别。CD94-NKG2A不仅在NK细胞上表达，而且在γ/δT细胞和CD8+细胞毒性T细胞(CTL)的亚型上表达。经典的MHC I型分子的下调在很多肿瘤中发生，也许作为从免疫检测逃避的机制。因此，例如，带有下调的经典的MHC I型但保留HLA-E表达的黑素瘤细胞，可能是免疫系统的攻击目标，抑制CTL和NK的活性。通过利用具有强烈结合HLA-E能力以及可能在HLA-E间隙竞争保护性MHC I型-肽的hsp60信号肽或其它促炎HLA-E结合肽(例如，来自应激蛋白，热激蛋白或此处公开的其它示范性蛋白)，及其类似物，可以开发一种新的治疗手段来诱导NK细胞的活化并降低激活表达CD94-NKG2A的CTL抗肿瘤细胞的阈值，其中的肿瘤细胞基于保留的保护性HLAE表达已逃避了免疫检测。
首先，表达Qa-1b的肿瘤细胞负载有一种选择的肽或肽类似物，和hsp60肽(GMKFDRGYI-一种已知Qa-1b结合的肽，CD94/NKG2A未偶联的肽(参见Lo等，Nature Med.6215-218，2000，此处引入作为参考)，以及AMAPRTLLL(Qa-1b结合的CD94/NKG2A偶联肽(Kraft，J.Exp.Med.192613-623，2000)。分析将在NK-细胞缺失的(抗-NK1.I处理的)和非缺失的小鼠上进行来确定通过利用CD94-NKG2A-去偶联肽是否观察到增强的NK-细胞依赖的肿瘤排斥，以及同样地利用CD94-NKG2A-偶联肽是否观察到增强的肿瘤建立。
实施例XIII在实验性诱导的关节炎中研究鼠NK细胞在这个模型中，确定了NK细胞在建立和维持胶原蛋白-诱导的关节炎(CIA)的潜在作用。通过在疾病诱导之前和在疾病确立期间利用NK-细胞缺失的抗体(NK1.1)，进一步阐明了NK细胞的存在和缺少在疾病发病中的作用。收集缺失NK细胞和非缺失NK细胞的小鼠的各种组织(例如，脾，淋巴结，血液，关节-组织)并分析NK细胞的存在及其各种细胞表面标记的表达。这些分析的主要目的是评价小鼠CIA中的发炎组织是否如人类风湿性关节炎(RA)的滑液一样积累某些独特的主要表达特异于小鼠中HLA-E同系物的CD94-NKG2A受体对的NK细胞亚型，该HLA-E同系物称为Qa-1b。这些研究进一步阐明了非典型的HLA-E/Qa-1b在炎症位点调节NK细胞的作用。
已经证明II型胶原蛋白的免疫接种引起C57B1/6小鼠的胶原蛋白-诱导的关节炎，关节组织病理的改变类似于人RA(Cambell等，Eur.J.Immunol.301568-1575，2000)。重要的是，C57B1/6小鼠携带含有Qalb-结合保护性九聚体信号-肽，称为qdm(AMAPRTLLL)的H-2b单体型，且具有可通过抗-NK1.1抗体检测的NK细胞。这种CIA模型能够进一步阐明Qalb+肽的作用以及与NK细胞和NK1.1-阳性T细胞上表达的小鼠CD94/NKG2受体的互作。
小鼠C57BL/6(H-2b)小鼠在实验的起始时间为6-8周龄。所有实验的进行遵循Karolinska学会的伦理原则。
诱导胶原蛋白诱导的关节炎完全弗氏佐剂(CFA)通过在20ml的弗氏不完全佐剂(IFA)(Difco)中混合100mg的热杀死的结核分支杆菌(M.tuberculosis)H37Ra(Difco，Detroit，MI)进行制备。Chick CII(Sigma，St.Louis，MO)通过在4℃温育过夜，以2mg/ml的浓度溶解在10mM乙酸(Sigma)中。然后ChickCII以1∶1乳化在CFA中。小鼠用100μl的乳剂皮内注射到尾根部。
诱导关节炎时的NK细胞缺失在用CII的CFA免疫接种前一天，对小鼠腹膜内注射小鼠抗-NK1.1(PK 136，BD Biosciences)缺失的mAb(200μg/小鼠的PBS)。NK1.1注射2天后通过血液的FACS分析，用泛-NK细胞抗体(DX5，BDBiosciences)染色来监控缺失的效率从而证实缺失的效率。第一次缺失之后10天进行第二次缺失(即，在用CII免疫接种后9天)。作为对照，动物腹膜腔内注射200μg/小鼠的鼠IgG(Sigma)或用相同体积(200μl)的PBS，与NK1.1平行进行。
关节炎的临床评估临床记分利用可见的数值范围进行，1分相当于一个关节(典型地一个脚趾)红肿且肿胀，2分相当于超过一个关节红肿且肿胀，以及3分为整个足受侵袭。每一动物可给出的最多分数为120。
CIA的发生率图16显示用抗-NK1.1的抗体(NK1.1)，IgG对照(IgG1)以及单独的PBS(CII/CFA)处理的小鼠的发病率。因为没有进行加强胶原蛋白II注射，在对照组(即，CII/CFA)中只有少数小鼠确立了CIA(在第28天10只小鼠中的1只具有CIA，在第42天处死)。相反，10只用抗-NK1.1抗体注射的小鼠中有8只在第42天确立了CIA，而在IgG对照处理的小鼠中10小鼠仅有5只在第42天显示出患病的迹象。
总的患病记分图17显示用抗-NK1.1抗体(NK1.1)，IgG对照(IgG1)以及单独的PBS(CII/CFA)处理的动物的总关节炎得分。用抗-NK1.1抗体处理的小鼠与IgG-处理以及PBS-处理的对照小鼠相反显示出严重的CIA。
上述这些结果表明表达NK1.1标记的细胞的存在对于防止CIA的诱导是必需的。
肽处理来调节关节炎结合保护性qdm-肽(AMAPRTLLL)，和来自小鼠hsp60(登录IDP19226)的九聚体(10-18位；QMRPVSRAL)hsp60信号-肽以及合成的qdmR5V-肽(AMAPVTLLL)的Qalb可在II型胶原蛋白注射之前和之后给药。这些实验阐明了在这个模型中Qalb和CD94/NKG2A互作在调节胶原蛋白-诱导的关节炎中的潜在调节作用。
利用Qa-1b结合肽的试验性治疗方法类似于HLA-E，Qa-1b主要结合来自MHC I型信号肽的九聚体肽。这种Qa-1b/肽复合体形成了CD94-NKG2A抑制受体的功能性配体。有证据表明HLA-E在细胞应激期间呈递一个来自热激蛋白60(hsp60)信号肽的九聚体肽。这种呈递似乎独立于与抗原呈递相关的转运蛋白1和2(TAP1/2)，否则其对于MHC I型信号肽负载在新生的HLA-E/Qa-1b分子上是必须的。明显地，HLA-E/hsp60信号肽复合体不被CD94-NKG2A抑制受体对所识别，所述受体对识别复合有合适的MHC I型信号肽的HLA-E复合体的(Braud等，Nature 391795-799，1991，此处引入作为参考)。已知Hsp60在人和试验性关节炎模型的关节炎组织中高效表达(Kleinau等人，Scand.J.Immunol.33195，1991；Karlsson-Parra等人，Scand.J.Immunol.31283，1991；Boog等人，J.Exp.Med.1751805，1992，每个都在此处引入参考)。可能地，炎症病灶主要含有HLA-E/hsp60信号肽复合体，所述信号肽复合体可能是局部NK细胞的一种重要的触发因子。作为实验性关节炎(即，CIA)模型的第一步，将评价施用的Qa-1b结合MHC I型信号肽(即，AMAPRTLLL)的可能治疗效果，所述MHC I型信号肽(即，AMAPRTLLL)已知形成可被抑制性CD94-NKG2A受体对识别的相对稳定的Qa-1b/肽复合体。其它小鼠将接受不相关的对照肽，而另一组将接受九聚体hsp60肽。这些肽首先在建立CIA期间给药以评价治疗潜能。这些肽也可在注射胶原蛋白II之前进行给药。然后进行关节炎的临床和组织评价。基于关节炎实验模型中的肽-治疗结果，这些发现将被转化成人临床试验以开发特异性针对HLA-E的新的治疗策略及其形成人CD94/NKG2A受体对的功能性配体的能力。
恢复带有正确保护性肽的HLA-E分子可用于治疗性调节进行性慢性免疫应答，所述保护性肽由CD94/NKG2A受体识别。根据下列发现主要包含CD94/NKG2A受体的NK细胞聚集在关节炎患者发炎的滑液中，现在应该可能根据本发明的方法治疗性施用合适的HLA-E结合肽，以在发炎的关节中恢复足够的CD94/NKG2A介导的应答。此外，局部施用未偶联CD94/NKG2A结合的HLA-E结合肽被认为在癌症治疗期间具有治疗价值以加强NK细胞(和T细胞)介导的抗肿瘤应答。因此，提供组成开关的HLA-E结合肽，从而NK-细胞介导的识别广泛表达的HLA-E配体被打开或者关闭。
虽然上述发明已通过目的在于清晰理解的实施例的方式进行了详细的描述，但是本领域技术人员应该明白，本发明的某些改变和修饰是可以理解的，并且可在附属权利要求的范围内无需过多实验就可加以实施。
权利要求
1.HLA-E结合肽在药物中的应用，其中所述肽调节CD94/NKG2细胞受体的效应。
2.根据权利要求1的应用，其中HLA-E结合肽来自应激诱导的蛋白的信号序列。
3.根据权利要求2的应用，其中应激诱导的肽为来自hsp(热激蛋白)60的肽。
4.根据权利要求1-3的应用，其中肽为重组或者合成的以及任选衍生化的或者肽类似物。
5.根据权利要求1-4的应用，其中肽为稳定的肽。
6.根据权利要求1-5中任一项的应用，其中CD94/NKG2受体为在NK和T细胞上的CD94/NKG2A抑制受体。
7.根据权利要求6的应用，用于肿瘤治疗。
8.根据权利要求3-7中任一项的应用，其中hsp60肽为九聚体。
9.一种肽，选自VMAPVTVLL和QMRPRSRVL
10.根据上述权利要求中任一项的肽，其与HLA-E形成复合体。
11.一种药物组合物，包括根据权利要求10的任一肽和可药用载体。
12.一种用于HLA-E结合肽或者类似物的分析方法，包括如下步骤a)提供一种肽库；b)形成HLA-E/肽复合体；c)选择能够抑制或者激活NK和T细胞上CD94/NKG2受体的稳定的复合体；以及d)从所述复合体分离稳定的肽/肽类似物。
全文摘要
本发明涉及一种新的调节免疫反应的机制。更具体的，本发明涉及通过HLA－E+结合的肽引起5 CD94/NKG2受体的抑制或者抑制的缺乏调节上述受体的功能。在一个优选的实施方案中，本发明涉及HLA－E结合hsp(热激蛋白)60肽。
文档编号C12N15/09GK1555272SQ02817957
公开日2004年12月15日 申请日期2002年7月31日 优先权日2001年7月31日
发明者卡尔·彼得·瑟得斯特伦, 卡尔 彼得 瑟得斯特伦 申请人:佩普根有限公司