专利名称：非特异性富集细菌细胞的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用阳离子或阴离子聚合物和磁性载体非特异性富集(enrichment)细菌细胞的方法。
几乎每一种细胞成分的处理、分析或分离的起始点都是细胞的富集，即“细胞收获(cell harvest)”。后者通常是以离心来实施。因为除了将离心机整合到相应的自动设备所用的高技术之外，在离心程序的起始与停止位置都需要极端高的精确度，所以此离心步骤成为在方法完全自动化(例如质粒纯化)中的主要问题。所以，在细胞化合物的处理、分析或分离中之自动化方法通常是用已经在自动设备以外富集、离心或沉积过的细胞起始的。但是，实现相关方法的尽可能的完全自动化对于例如完整基因组、蛋白质组(proteomes)的快速分析，以及对于高通量方法中结构和功能的迅速解析等都是必要的。不过，部份步骤的自动化程度，例如在基因组分析方面，已经非常先进。例如，细菌培养和质粒分离都可以自动地实施。然而，现在仍缺乏一种行之有效的包括细胞收获在内的简单、低成本且完全自动化的方法。
标准的细胞收获方法为细菌培养物的离心。对此而言，需要用到微滴定板离心机(micro-titre-plate centrifuge)，特别是要设计用于较高通量的方法之中者。
另一种方法系利用过滤膜将培养的细胞富集(例如WO 01/51206，3M Innovative Properties Co(US)与US 5,464,541，Diagen Institut f.Molekularbiologie)。不过，此种方法在使用高度富集的细胞悬液且因此溶液具有高粘度的情况中，显然会非常易于出现堵塞等意外事件。类似地，对于采用离子交换装置(例如结合到一多孔型基质并过滤)和真空技术的情况也是如此(WO 92/07863，Qiagen)。此种情形会产生许多问题，尤其是对于自动化方法。
利用以磁性颗粒为基底的方法进行微生物的富集在原则上适合于自动化。到目前为止已经有三种细菌富集所用方法被述及，不过其在菌株特异性方面以及生产成本方面都明显地显示存在缺点。
EP1 118676 A2，Chemagen AG和WO 01/53525 A2，Genpoint AS述及一种以固相富集微生物的方法，其使用一经共价键或非共价键方式固定化在此固相的非特异性配体。就此方法而言，所用固相为聚乙烯醇珠，其可为磁性或非磁性。于此方法的要旨中，将可以作为微生物所用的养分的分子视为配体。此方法的缺点在于某些配体必须固定化到一支持物上，此可能导致生产费用之显著增加。另一项缺点在于对于不同的菌株可能需要固定化不同的配体，此意味着该磁珠和该方法将缺乏通用性。
于另一专利申请中，亦即WO 98/51693，Genpoint述及使用含有盐类、醇类和聚乙二醇或可与聚乙二醇相比的聚合物的混合物在磁性颗粒上面富集细菌。于WO 98/51693中所述的方法需要花5-20分钟及添加2-50％(w/v)的聚合物。此种高浓度的盐类和聚合物会在细菌的后续处理中产生问题，这是因为，例如30％的聚乙二醇非常粘稠，或高浓度的盐会干扰SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。
WO 00/29562，Merck Patent GmbH述及一种从微生物分离出质粒DNA的方法，包括a)将微生物培养物酸化，并与固体表面材料(solidface material)(二氧化硅-磁性颗粒)温育与混合，及b)随后将质粒纯化。不过，此种方法并非对于所有大肠杆菌(E.coli)菌株而言都是可行的，因为其可能导致一定程度的产率上的损失。此种方法的另一项缺点在于所需的珠之量，因为珠的费用会构成细菌富集费用的主要中心，而特别是二氧化硅珠相当昂贵。由于二氧化硅珠可能主要结合到DNA，因此用该二氧化硅珠来分离质粒的过程中，也会观察到产率的减损。
WO 91/12079，Amersham述及一种在可非特异性地结合到聚合物(细胞)的磁珠上沉淀细胞的方法。于此方法中，必须强制地遵守所需药剂(醇和盐类)与磁珠的添加顺序。在使用之前将药剂及/或药剂与珠混合是不可能的，如此一来就不能省却吸移步骤，而省却吸移步骤对于自动设备的最优利用的自动化是必要的。另外，其可使用的磁性颗粒仅局限于纤维素/氧化亚铁颗粒。
US 6,284,470 B1，Promega述及完整细胞与磁性颗粒形成复合体。就可应用的磁珠而言，此方法仅局限于二氧化硅颗粒。由于此种方法指定需要将一体积的醇加到一体积的细胞悬液，因此该方法显然不能在产率没有任何明显减损之下应用深孔板(deep-well-plates)进行细胞收获。再者，高浓度的醇可能导致蛋白质沉淀。
有许多研究显示阳离子聚合物可能与细菌交互作用。例如，实验显示出阳离子聚合物例如脱乙酰壳多糖(chitosan)(脱乙酰壳多糖为一种经去乙酰基的壳多糖(chitin))非常适合用于单细胞实验中对活的微生物细胞进行包囊化(encapsulation)或“封装(sealing)”(参阅例如MethodsEnzymol.1987，vol.135，259-268，或US 5,489,401)。脱乙酰壳多糖也可用来对珠聚合物之内活性生物材料进行包囊化处理(US 4,647,536和WO 01/46266)。脱乙酰壳多糖也可用来——视情况也以其改质形式——包被免疫检测所用的对象或实验试剂盒(US 5,208,166)。
不过，有关阳离子聚合物对于微生物细胞壁所具疏水性的影响的文章业已证明，在pH值高于3时，疏水性表面的粘着力会显著地增加，但在pH值低于3时会减低到几乎为0％(参考资料Goldberg，S.，Doyle，R.J.和Rosenberg，M.，1990，J.Bacteriol.vol.172，5650-5654)。
使用以磁性颗粒支持的方法可具有进一步的优点，因为如此一来便有可能分别进行单个孔(例如在深孔板中)的收获，而不需要收获整个板。如此一来，例如在表达研究(expression Study)的范围之内，可以依时间相关方式进行收获。
总之，可以确定的是，在目前还没有一种不需离心步骤即可完成且可同时用于多种不同细菌的简单方法可以用来有效率、快速、低成本地富集细菌细胞。所以，本发明的任务为提供一种不需离心步骤即可完成非特异性地富集细菌细胞的方法。
此问题由后附权利要求书所界定的主题予以解决。
本发明要用下列图式予以更详细地示范说明。
图1显示出使用不同的磁性颗粒进行大肠杆菌(E.coli)LE392(浅色条)和TG2(黑色条)细胞收获所得产率之结果。数值指示的是以上清液的浊度与所用细胞悬液的光密度的比值测定得到的产率％。缩写代表Silica(二氧化硅)MagPrep Silica Beads(Fa.MERCK，Darmstadt，Germany)；NH2氨基聚苯乙烯珠(Fa.Estapor，MERCK-Eurolab)；COOH羧基聚苯乙烯珠(Fa.Estapor，MERCK-Eurolab)；PS聚苯乙烯珠(Spherotech，Illinois，USA)；PVA聚乙烯醇珠(Chemagen，Baesweiler，Germany)。
图2显示出使用二氧化硅珠(黑色条)和脱乙酰壳多糖/氨基聚苯乙烯珠(浅色条)在酸性pH值下进行细胞收获所得产率之结果。于图2中将根据本发明的方法所得细胞收获产率(浅色条)与使用得自WO 00/29562的方法所得细胞收获产率(黑色条)相比较。将根据本发明的方法所得细胞产率定为100％，且相对于此定出根据WO 00/29562所得产率。所有值都是得自数个实验的平均值附上标准偏差。根据本发明的方法的细胞收获系按照实施例5中所述实施的。对于WO 00/29562/MERCK，则是采用制造商的实验程序。
图3以图解方式显示出使用经溶解的脱乙酰壳多糖(浅色条)和经固定化在珠上的脱乙酰壳多糖(脱乙酰壳多糖珠，Fa.Chemicell，Berlin，Germany)(黑色条)进行大肠杆菌(E.coli)DH5α和HB101细胞收获所得产率之结果。数值指示的是以上清液与所用细胞悬液的光密度的比值测定得到的产率％。
图4显示出利用15种大肠杆菌克隆菌珠进行细胞收获(如实施例5所述实施)的生产效率的结果。产率系以上清液的光密度与细胞悬液光密度的比值测定得到的％绘出(得自数个实验的平均值，n＝27)。
图5显示出不同细菌菌种的收获结果。图5显示出根据本发明的细胞收获系统可以广泛用于多种菌群(革兰氏阳性和革兰氏阴性两者)。于每一种情况中标绘出细胞收获的产率。细胞以类似于实施例7所述的方式收获。E.faecalis粪肠球菌(Enterococcus faecalis)；B.vallismortisBacillus vallismortis；P.mirabilis奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)，M.luteus藤黄微球菌(Micrococcus luteus)；S.haemolyticus溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)；C.freundii弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)。
图6以图解方式显示出使用含有聚赖氨酸的0.5M HCl与不含聚赖氨酸的0.5M HCl进行大肠杆菌菌株JM83的细胞收获所得产率之结果。数值指示出通过上清液光密度与细胞悬液光密度的比值测定得到的产率％。PL/HCl含有聚赖氨酸的0.5M HCl；HCl只有0.5M HCl(不含聚赖氨酸的对照样品)。
图7显示出大肠杆菌细胞，脱乙酰壳多糖和磁珠的网状结构形成。此网状结构的形成是经由将溶解在0.5M甲酸中的游离脱乙酰壳多糖加入到大肠杆菌(菌株HB 101)悬液中(C和D)而促成的。于没有脱乙酰壳多糖的对照样品中(只有0.5M甲酸)，没有产生网状结构(A和B)。细菌仍然呈现为单个细胞之形式。A和C亮视野图，于A中可以看到单个细胞与磁性颜料，而在C中可看到聚集体。B和D于使用碘化丙啶/Syto9(Propidiumiodide/Syto9)(BacLightTMViability Kit，Molecular Probes，Eugene，Oregon，USA)染色大肠杆菌细胞之后的荧光图象。于B中可以看到具有荧光的单个细胞；D显示出经包埋在网状结构内的细胞的荧光。
图8以显示出在根据本发明的方法进行细胞收获之后与经由离心收获之后分别所得的大肠杆菌的β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)的酶活性。酶活性的值以相对于包括300微升收获细胞的用于分析的细胞成分相对单位表示(％)。空心菱形示出经离心收集的细胞的值。三角形和方形示出以本发明方法收获的细菌的值。三角形于添加30微升的125微克/毫升脱乙酰壳多糖/0.5M甲酸溶液之后，将细胞温育3分钟并用磁性分离程序予以分离3分钟。方形将细菌温育5分钟并于添加所述溶液之后在磁场中分离5分钟。
图9显示出在将异源性表达性大肠杆菌菌株BL21(DE3)以根据本发明的方法予以收获，然后使用Strep-Tactin珠(IBA GmbH，Gttingen，Germany)富集N-Strep-T4-p12蛋白质所得的结果。A未经诱导的细胞；B经诱导的细胞；1粗制细胞裂解物；2结合N-Strep-T4-p12之后的strep-tactin珠；3洗脱出的天然的、三聚体形式的N-Strep-T4-p12蛋白质；4洗脱出的单体形式的N-Strep-T4-p12蛋白质(在95℃下煮沸之后)；5洗脱之后的strep-tactin珠；6标准品(经纯化的N-Strep-T4-p12蛋白质)。
图10显示出从使用根据本发明的方法(如实施例4中所述)收获所得的大肠杆菌XL1Blue分离质粒DNA所得的结果。1使用根据本发明的方法收获细菌；2以离心法收获细菌；a用PstI消化过的质粒pUC19；b未经消化的质粒；MDNA标准品(Lambda-DNAEcoRI/HindIII)。
本文中所使用的术语“纯化”或“富集”是指将细菌细胞或细胞成分从水溶液(即其中含有细菌细胞或细胞成分的培养基)中分离出来。该纯化或富集是使用磁性颗粒进行的。
本文中所使用的术语“非特异性富集”是指在所选条件下进行的富集与细菌的种、株、属等无关。
本发明的一方面涉及提供一种非特异性地纯化细菌细胞的方法，包括下列步骤a)将含有细菌细胞的样品与阳离子聚合物在酸性pH值下或与阴离子聚合物在碱性pH值下接触；b)添加一磁性载体；c)从样品分离出其上面结合着细菌细胞的该磁性载体。
具体地，该方法的特征在于下列步骤将细菌培养物与阳离子或阴离子聚合物混合，特别是无支链的(unbranched)阳离子聚合物，优选地为脱乙酰壳多糖(例如FLUKAProd.No.22741，22742 or 22743，Sigma C-3646或Roth 5375.1)或聚赖氨酸(例如Sigma P2636)。优选的阴离子聚合物为硫酸葡聚糖(dextransulfate)、硫酸软骨素(chondroitinsulfate)、聚谷氨酸(polyglutamate)、聚苹果酸(polymalate)、聚半乳糖醛酸(polygalacturonicacid)、聚磷酸盐(polyphosphate)和硫酸化寡糖(sulfated oligosaccharides)。
细菌培养物与聚合物形成的混合物必须根据所使用的聚合物配合相应的缓冲液而具有某一pH值。该pH值于阳离子聚合物的情况中优选地要低于或等于3或4，且于阴离子聚合物的情况中优选地要高于或等于8。在添加聚合物之前可以利用缓冲液溶液的添加或直接添加酸或碱调整细菌培养物而将pH值调整到合意的pH值。此外，也可以将聚合物溶解在个别的缓冲液溶液内或直接溶解在酸或碱之中而调整该pH值。再者，可以在添加聚合物之后，利用缓冲液溶液的添加或直接添加酸或碱调整细菌培养物和聚合物的混合物而调整pH值。该阳离子聚合物可经溶解在酸性缓冲液之中或直接溶解在酸之中。该溶液的调整方式为使得细菌培养物和该阳离子聚合物的混合物得到根据本发明的合意pH值。对于根据本发明的方法而言，优选地，该细菌培养物和聚合物的混合物具有一酸性pH值。该pH值可以用任何缓冲液或酸予以调整，优选地使用0.5M HCl/25％醋酸、0.5M HCl或0.5M甲酸。使用何种缓冲液系分别取决于细菌的后续处理方式与后续的方法。若要使用根据本发明的方法来纯化质粒之时，缓冲液HCl/HAc的pH值优选地在约2至约3的范围之间，因为DNA在低于1.8的pH值下会水解。若要使用根据本发明的方法来纯化蛋白质之时，优选地是使用pH值在大约4的范围之内的甲酸作为缓冲液，因为对于功能性蛋白质的分离而言，pH值应该在大约4至大约9的范围内。
阳离子聚合物的浓度范围要确保细菌的充分纯化。用于进行沉淀的聚赖氨酸的浓度范围在12.5微克/毫升培养物至150微克/毫升培养物之间，优选地在25微克/毫升培养物至150微克/毫升培养物的范围之间，特别优选地在40微克/毫升培养物至75微克/毫升培养物的范围之间，更优选地为50微克/毫升。最适浓度于此分别取决于细菌菌种和细菌菌株，不过也取决于所使用的聚赖氨酸的供应来源或分子量。
用于进行沉淀的脱乙酰壳多糖的浓度范围在0.05微克/毫升培养物至100微克/毫升培养物的范围之间，优选地在0.25微克/毫升培养物至50微克/毫升培养物的范围之间，特别优选地在0.5微克/毫升培养物至50微克/毫升的范围之间，更特别优选地在1微克/毫升培养物至50微克/毫升的范围之间，更加优选地为2.5-50微克/毫升。可从下表中所列的缓冲液决定其它优选的浓度。最适浓度于此系分别取决于细菌菌种和细菌菌株，不过也取决于所使用的脱乙酰壳多糖的供应来源或分子量以及脱乙酰壳多糖的脱乙酰化程度。脱乙酰壳多糖的优选的浓度总览于下表。
于添加聚合物之后，应该将细菌培养物与聚合物的溶液混合，优选地为经由吸液管吸上和放下或经由摇荡。经混合，可以更快速且直接地使所有涉及的成分彼此接触。
酸化的或碱性的聚合物与细菌的混合物可以立即处理。不过，也可以将该混合物温育一段短时间，优选地6-10分钟，特别优选地5分钟。温育温度可为室温至40℃，优选地为37℃，特别优选地为室温。
于该酸化的或碱性的聚合物与细菌的混合物中加入磁性载体。优选地，该磁性载体为磁性颗粒(于下文中也称为磁珠)，例如聚苯乙烯珠或磁性颜料。于根据本发明的方法之范围内，可以使用其表面经过化学官能化过的聚苯乙烯珠，特别是具有NH2-、COOH-或OH-表面者，其中优选地为具有NH2-表面者。有关经官能化过的颗粒，优选地为使用商业上可取得的珠例如Estapor公司的氨基珠(EM2 100/40，直径1.43微米)或羧基珠(EM1 100/40，(23710)直径1.3微米)。有关磁性颜料，可以使用商业上可以取得的珠例如Bayferrox 318M、Bayoxid E 8706或BayoxidE8713H(Bayer AG)。珠的优选的直径在0.5微米到2微米的范围之内，优选地该直径在1微米到5微米的范围之内，特别优选地为约1微米。
根据本发明的方法包括形成细菌与聚合物的网状结构，其中有掺入不论何种类型的磁性颗粒，例如聚苯乙烯珠或颜料。由此可以经由施加磁场通过包含在网状结构内的磁性颗粒而分离出细菌。
根据本发明的方法于此不限于特别类型的经表面官能化的磁性颗粒，而是任何类型的磁性颗粒，此意味着可以使用例如具有各种表面的珠或颜料。于表A或B中列出具有不同的表面的常见类型磁铁之概述。如果在根据本发明的方法中使用磁性颜料，可以将此颜料溶解在醇类中，也可以溶解在水性缓冲液之内。
表A列出至今已经测试过且在根据本发明的方法中有功能的所有磁性颗粒。表A以制造商为索引的磁性颜料。表B以制造商为索引的具有不同的官能团的不同基础基质的磁珠。PS聚苯乙烯；Silica二氧化硅基质；PVA聚乙烯醇。
磁性颗粒的浓度范围要确保细菌的充分纯化，不过该纯化的费用要在合理的范围之内。优选地，该聚苯乙烯珠以1％的聚苯乙烯珠溶液的形式，按照细菌培养物体积的约1/10至1/70的浓度添加。特别优选的浓度为约1/20至1/50，特别是1/20或1/50的浓度。于此，该浓度取决于细菌培养物的体积大小。若细菌培养物的体积为例如0.2或1或1.5毫升时，优选地为1/20的1％该聚苯乙烯珠溶液的浓度，且若细菌培养物的体积为例如10毫升之时，优选地为1/50的1％该聚苯乙烯珠溶液的浓度。细菌培养物的体积愈大，该聚苯乙烯珠的浓度可以愈低。磁性颜料优选地用5％溶液的形式，按照细菌培养物的1/10体积的浓度使用。
于添加磁性颗粒之后，应该将细菌培养物、聚合物和磁性颗粒的溶液混合，优选地经由用吸液管抽吸与放下、摇荡或使用磁搅拌棒。经混合，可以使所有涉及的成分更快速且直接地彼此接触。
该混合物可以立即处理。不过，也可以将该混合物温育一段短时间，优选地3-10分钟，特别优选地5分钟。温育温度可为室温至40℃，优选地为37℃，特别优选地为室温。
随后，可以将经结合到磁性载体的细菌从样品分离出来。于此将细菌培养物、聚合物和磁性颗粒的混合物置于一磁场中，且使复合物沉淀出来。
已经在本方法前面步骤中结合到细菌的磁性颗粒可以根据后续处理的类别——例如质粒制备、RNA或基因组DNA制备——而通过摇荡从细菌分离下来并丢弃，或者也可以将其与细菌一起用于后续的处理步骤之中。若要将细菌从磁性颗粒分离开时，可以将细菌、聚合物和磁性颗粒的混合物于从样品中分离出来之后再悬浮于相应的缓冲液内，且予以取出及例如转移到一新的反应管之内，同时使用磁铁保留住磁性颗粒。要将细菌从细菌、聚合物和磁性颗粒的网状结构脱离出来之时，优选地为使用Tris缓冲液(200mM，pH8-9.5)。要脱离时，优选地为以高速度，例如以1200rpm(Eppendorf旋转摇荡器)实施摇荡步骤。
根据本发明的方法可以在所有常用的反应管内进行，优选地为在所有类别的Eppendorf反应管内或在微滴定板之内进行。
可以使用根据本发明的方法予以富集的细菌可为所有类型的细菌，优选地为真细菌(eubacteria)和原始细菌(archaebacteria)，特别者为大肠杆菌，尤其是大肠杆菌BL21、JM109、大肠杆菌B、DH1、LE392、大肠杆菌K12、DH5α、NM522、大肠杆菌C、DH10b、Sure、GM2163、TG2、HB101、Top10、InvaF’、XL1Blue、JM83、以及微球菌(Micrococcus spec.)，尤其是藤黄微球菌(Micrococcus luteus)，变形菌(Proteus spec.)，尤其是奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)，肠球菌(Enterococcus spec.)，尤其是粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，柠檬酸杆菌(Citrobacter spec.)，尤其是弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)，芽孢杆菌(Bacillus spec.)，尤其是Bacillus.vallismortis，葡萄球菌(Staphylococcus spec.)，尤其是溶血葡萄球菌(Staphylococcushaemolyticus)。
根据本发明的方法可以用来替代离心且因而有助于对细菌细胞进行自动化纯化。使用所述方法，可以在约5-10分钟之内将细菌从培养物内非特异地富集。由于所使用的阳离子聚合物的浓度非常低，在1％以下，因此能够以与根据现有技术的程序相比显著低成本的程序来实施富集。再者，在根据本发明的方法之中，可以使用相当少量的珠，即每个细菌1-15个珠，而不是在例如WO 00/29562中所述的每个细菌30-50个珠。
下面的实施例用来说明而不是用来在任何方面限制本发明的范围。
实施例1.脱乙酰壳多糖溶液的制备秤取脱乙酰壳多糖，再悬浮于0.5N HCl/25％HAc中并加热该溶液(约80-90℃)一直到脱乙酰壳多糖完全溶解为止。随后将该溶液稀释并在0.5N HCl/25％HAc中稀释且调整到25微克/毫升(＝工作溶液H)，或在0.5N甲酸中稀释且调整到125微克/毫升(＝工作溶液A)。该工作溶液(25微克/毫升)在室温之下保持稳定的溶液并以该方式贮存。
2.聚赖氨酸溶液的制备秤取聚赖氨酸，再悬浮于0.5N HCl之中且在0.5N HCl中调整到0.5毫克/毫升(＝工作溶液)。将该工作溶液贮存在-20℃直到使用为止。
3.以0.2毫升培养物的规模收获细菌网状结构的形成在0.5毫升96-孔聚丙乙烯微滴定板中，使用每孔0.2毫升培养物，将大肠杆菌HB101培养过夜。分别加入20微升脱乙酰壳多糖工作溶液A和20微升0.5M甲酸，于对照样品中没有脱乙酰壳多糖，且于培养物中加入20微升5％磁性颜料Bayoxid E8706(溶于PBS溶液)，且经由吸液管吸上与放下予以混合。于在室温之下温育5分钟后，以显微镜检查网状结构的形成(图7)。
4.1.5毫升培养物规模的细菌收获DNA-分离在96-DWP中使用1.25毫升培养物体积每孔在有100微克/毫升氨苄青霉素的LB培养基中实施经质粒pUC19转染过的大肠杆菌XL1Blue之过夜培养。于该过夜培养物中加入125微升脱乙酰壳多糖工作溶液H与125微升的5％颜料珠溶液(Bayferrox 318M在异丙醇内)，并经由以吸液管吸上与放下予以充分混合。于在室温下5分钟的温育期之后，在一磁分离器(Bilatc AG，Mannheim，Germany)上分离出该细菌/珠复合物。将上清液完全取出并使用DNA分离试剂盒Wizard MagneSilTM质粒纯化系统(Promega，Madison，USA)，根据制造商的实验程序从细胞沉积物中分离出质粒DNA(图10)。
5.10毫升培养物规模的细菌收获在一聚丙烯管中以10毫升培养物体积实施大肠杆菌JM83的过夜培养。于该过夜培养物中加入1毫升(1/10体积)的脱乙酰壳多糖工作溶液H并经由以吸液管吸上与放下两次予以混合。其后，加入0.2毫升的1％氨基聚苯乙烯珠溶液。随后经由吸液管吸上与放下(两次)混合该溶液。之后在室温下温育5分钟。将该管置于一永久磁铁(Bilatec AG，Mannheim，Germany)的磁场中10分钟，以沉积该细菌/珠-复合物。丢弃其上清液并直接处理细菌细胞。
6.大肠杆菌培养物之培养在标准培养基例如LB、2x YT、SOB或SOC中过夜培养大肠杆菌培养物(Maniatis，1987)，于200微升过夜培养物中加入20微升脱乙酰壳多糖工作溶液H和与20微升的氨基聚苯乙烯珠并充分混合。于温育5分钟之后，于一磁性分离器(Bilatc AG，Mannheim，Germany)上进行该细菌/珠复合物的分离。若使用上面所述的培养基时，可能需要调整该工作溶液和珠的浓度。
7.0.2毫升培养物规模的细菌收获在一96微孔板中于37℃下实施0.2毫升粪肠球菌、奇异变形杆菌、溶血葡萄球菌培养物的过夜培养。在一96微孔板中于30℃下实施0.2毫升Bacillus vallismortis、奇异变形杆菌、藤黄微球菌、弗氏柠檬酸杆菌培养物的过夜培养。于该过夜培养物中加入20微升(1/10体积)脱乙酰壳多糖工作溶液H。其后加入10微升的1％氨基聚苯乙烯珠溶液。随后经由吸液管吸上与放下(1或2次)充分地混合该溶液。接着在室温下温育5分钟。将该微滴定板管置于磁性分离器(Bilatec AG，Mannheim，Germany)上温育5分钟以沉积该细菌/珠复合物。丢弃其上清液并直接处理细菌细胞。
8.活细菌之收获在0.5毫升的96孔PP微滴定板中，在300微升的大肠杆菌BL21(DE3)过夜培养物中加入30微升的脱乙酰壳多糖工作溶液A和30微升的5％颜料珠溶液(Bayferrox 318M于PBS中)，并经由吸液管吸上与放下予以充分混合。其后在室温下分别实施3和5分钟的温育步骤。随后在一适当的磁性分离器(Bilatec AG，Mannheim，Germany)上温育该细菌/珠复合物，以使之分别沉积3和5分钟。丢弃其上清液并将细菌/珠沉丸再悬浮于200微升的200mM Tris pH8.0之中。对于对照组，将300微升的该过夜培养物离心，并也将其沉淀再悬浮于200微升的200mMTris pH8.0之中。经由在琼脂板上将稀释系列平板培养且在过夜培养之后计数菌落以查验细胞的生命力。有关细胞的活性和生命力之进一步检定，系测量细胞本身的β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)的酶活性(Apte et al.，1995，Wat.Res.29，1803-1806)(图8)。
9.蛋白质分离要从已经通过本发明的方法收获的细胞中进行蛋白质所分离，使用了Strep-tag系统。使用分子生物学标准方法将p12(Selivanov，N.A.，etal.，1988，Nucleotide and deduced amino acid sequence of bacteriophage T4gene 12，Nucleic Acids Rs.；16(5)2334)融合到N-端Strep-tag(US 5,506,121)，且按照Burda，M.R.& Miller S.(Europ.J.Biochem，1999，265771-778)所述予以表达。在一96深孔板中使用1.25毫升培养物每孔实施可表达N-Strep-T4-p12的大肠杆菌菌珠BL21(DE3)pNS-T4-p12p57的培养。于OD600约为0.5的细胞密度时，使用1mM IPTG培养3小时。随后。于每一孔中分别加入125微升的脱乙酰壳多糖工作溶液A与125微升的5％颜料珠溶液(Bayoxid E8706 in PBS)，经由吸液管吸上与放下予以充分混合，并且在室温下温育5分钟。其后在一适当的磁性分离器(Bilatec AG，Mannheim，Germany)上温育，使该细菌/珠复合物沉积5分钟。将其上清液完全取出，并将沉淀再悬浮于150微升的缓冲液A(200mM Tris pH8.0，200mM NaCl，10mM EDTA，0.05％Tween20)之中。随后经由一摇荡步骤(以1200rpm进行5分钟，德国Eppendorf公司的摇荡器)使细菌从细菌/珠网状结构脱离开。经由重复地在磁性分离器上温育将珠与细胞分离开，分离的珠现存在于上清液中，将上清液转移到0.5毫升96孔PP微滴定板的一新孔之内。之后经由添加溶菌素(lysozyme)(1.6毫克/毫升)，以750rpm摇荡2分钟及在室温下温育15分钟将细胞溶裂，并经由添加5微克/毫升的DNAse将DNA消化。经由添加10微升的5％-StrepTactin珠(Company IBA，Gttingen，Germany)且在平稳摇荡之下温育20分钟使异源表达的N-Strep-T4-p12结合到StrepTactin珠并且从裂解液中富集。经添加5mM生物素(biotin)从珠上洗脱出该N-Strep-T4-p12(图9)。
权利要求
1.一种非特异性纯化细菌的方法，其包括下列步骤a)将含有细菌细胞的样品与一种阳离子聚合物在酸性pH值下接触，b)添加一种磁性载体，c)从所述的样品中分离出其上面结合了细菌细胞的该磁性载体。
2.权利要求1的方法，其中在步骤a)及/或步骤b)之后插入一温育步骤。
3.前述权利要求中任一项的方法，其中所述的阳离子聚合物为脱乙酰壳多糖或聚赖氨酸。
4.前述权利要求中任一项的方法，其中该脱乙酰壳多糖的添加浓度在0.05至100微克/毫升培养物的范围内，而聚赖氨酸的添加浓度在12.5至150微克/毫升培养物的范围内。
5.前述权利要求中任一项的方法，其中该pH值通过使用HCl/HAc调整到低于或等于3，或通过使用甲酸调整到低于或等于4。
6.前述权利要求中任一项的方法，其中该磁性载体为磁性颜料或磁性聚苯乙烯珠，特别是具有NH2-、COOH-或OH-表面的磁性聚苯乙烯珠。
7.前述权利要求中任一项的方法，其中该被纯化的细菌为大肠杆菌(E.coli)、芽孢杆菌(Bacillus spec)、变形菌(Proteus spec)、微球菌(Micrococcus spec)、葡萄球菌(Staphylococcus spec)或柠檬酸杆菌(Citrobacter spec)。
全文摘要
本发明涉及一种利用阳离子或阴离子聚合物和磁性载体非特异性富集细菌细胞的方法。
文档编号C12N1/20GK1568367SQ02819980
公开日2005年1月19日 申请日期2002年10月8日 优先权日2001年10月9日
发明者沙宾·迪乐, 雷瑞特·格拉贝尔, 史特方·米勒, 英格丽·罗伯, 迈可·修斯, 汤玛斯·詹德 申请人:普罗佛斯公司