非线性振幅介电电泳波形用于细胞融合的制作方法

文档序号:410601阅读:260来源:国知局
专利名称:非线性振幅介电电泳波形用于细胞融合的制作方法
技术领域
本发明涉及生物细胞之间融合的方法和装置。更具体地,本发明涉及提供用电场处理生物细胞的方法和装置,使生物细胞排列(align)并在进行细胞融合前提高细胞膜的接触。
背景技术
如果一个天然带电的生物细胞放置于均匀电场中,如由一对平面的电极提供的电场,生物细胞并不向一个或另一个电极移动,因为来自于两个电极的吸引力是相同的。
另一方面如果天然带电的生物细胞放置于非均匀电场,如由一对非平面的电极提供的电场,如图1现有技术,生物细胞形成偶极(dipole),被相比另一个具有更大吸引力的电极所吸引,向具有更大吸引力的电极移动。
这样的非均匀电场用于介电电泳(dielectrophoresis),使用介电电泳排列活的细胞,然后融合/电穿孔脉冲以融合细胞已自七十年代早期见于文献中。此方法用于产生用于医疗目的的两种不同细胞类型的杂种,用于生产单克隆抗体的杂交瘤生产,用于核融合,用于生产其它杂种细胞。介电电泳是对天然带电的颗粒,如活细胞,施加电场力的方法。该电场力来自于非均匀电场,其在细胞内分别加电形成偶极。偶极形成后,非均匀电场使细胞向最低或最高电场强度移动。该移动取决于生物细胞或颗粒,介质的相对电导率和介电常数。该双向电场力是电场平方的函数,所以电场极性并不重要。该力是生物细胞或颗粒,介质的相对电导率和介电常数的函数。典型地,AC电压波,如正弦波,施加于电极间以产生交替电场。正弦波电压,频率,持续时间(duration)根据特定细胞类型优化。施加AC以排列细胞后,施加一或多个融合/电穿孔脉冲以在细胞膜上形成通道,在此来自两个细胞的细胞膜混合。这样的通道使多个细胞的成分混合以形成杂种细胞。融合脉冲后,可施加另一AC电场以保持细胞在一起从而使融合细胞稳定。在某些情况下,AC电压线性增加或减少以阻止由于电场的突然施加而对细胞的损害。
细胞融合的应用实例包括杂交瘤生产和细胞核传递。电融合的最近应用是生产用于癌症免疫治疗的治疗杂种。这些杂种产生自体外(ex-vivo)方法的癌症肿瘤细胞和免疫系统树突状细胞。每一治疗需要大量活杂种,这提出了对高效生产杂种的方法的要求。
有很多技术可用于进行细胞融合(电的,机械的,化学的)。本发明涉及电的方法。现今的电技术使用与电极装置相连的电压波形发生器。根据相关的已知电的,机械的,化学的技术,下列文献引用作为参考4,326,934 April 27,1982 Pohl4,441,972 April 10,1982 Pohl4,764,473 Augustl′6,1988 Matschke等4,784,954 November 15,1988 Zimmermann5,304,486 April 19,1994 Chang6,010,613 January 4,2000 Walters等WO00/60065 October 12,2000 Walters等根据上述,已知使用具有固定振幅(amplitude),参见图3现有技术,或线性增加振幅,参见图4现有技术,的融合前电场波形(pre-fusionelectric field waveform)。图5表示了现有技术进行电场波的细胞融合整体方案,其中融合前电场波形后是融合/电穿孔脉冲,然后是融合后电场波(post-fusion electric field waveform)。
然而,融合前电场波形固定振幅或线性增加振幅后的细胞融合的效率不能达到应用于癌症免疫治疗的治疗杂种生产所需的较高效率。因此,需要提供融合前电场波形,其可相对用固定振幅或线性增加振幅融合前电场波形,提高生物细胞的细胞融合效率。
更具体地,根据Chang的U.S.5,304,486,其中图2E公开了线性低电压presine AC波形,高电压线性电穿孔AC波形,和低电压线性后穿孔AC波形。Chang的发明仅局限在融合/电穿孔脉冲。Chang只公开了线性低电压presine AC波形。Chang没有公开非线性低电压presine AC波形。Chang没有关注presine AC波形,而只是泛泛提及。
细胞融合系统的第一步是将细胞接触。在任何情况下,必须对细胞施加足够的力以克服负表面电荷。只施加均匀电场将不会移动细胞,因为细胞的静电荷是零。因此,从电场的定义没有施加力力=(电场)*(电荷)然而,非均匀电场在细胞内移动正离子到一侧,负离子到另一侧而产生偶极,如图1现有技术所示。一旦诱导产生了偶极,因为在一侧的电场强度大于另一侧,对细胞就会产生净余的力。细胞在一个方向的移动引起细胞在某一区域集中。由于细胞现在是偶极,细胞的负电侧会吸引另一细胞的正电侧以克服负表面电荷,如图2现有技术所示。由电极装置产生非均匀电场。非均匀性是电极参数的函数,如图1和2现有技术所示。
通常,要融合的细胞类型放置于低电导介质(低于0.01S/m)以最小化电阻加热(ohmic heating),其可能损害细胞并引起扰动(turbulence)而减少融合杂种数。因此,需要要进行细胞融合的生物细胞被处理以降低细胞排列和细胞膜接触过程中的热量。
波形发生器具有两个功能。第一个是产生AC电压波,其通过电极装置转化为AC电场。此AC电场然后使细胞排列/接触。第二个功能是产生脉冲电压,其电穿孔细胞膜,融合细胞。在某些情况下,AC电压在融合脉冲后产生以保持细胞成列,直到融合产物成活或稳定。
成功融合的因素之一是相邻细胞间的膜接触。融合脉冲施加前的此接触越接近,融合效率越高。在U.Zimmermann等,″Electric Field-InducedCell to-Cell Fusion”,J.Membrane Biol.67,165-182(1982)中,Zimmermann指出提高融合脉冲前AC波电场强度可能是优选方法。明显地,需要待融合生物细胞用融合前电场波形预处理,其产生增加的细胞膜接触而没有扰动或加热。
此外,为什么不希望马上提供高振幅排列波形给待融合细胞有几方面的原因。第一个原因是机械原因。马上施加高振幅排列波形会引起极端力在细胞上,引起细胞向电极快速移动。该快速移动会在细胞周围介质引起扰动力。此扰动力使不会形成细胞的完整串珠链(pearl chains),扰动力会引起已经形成的细胞串珠链破裂。
第二个原因是这样的高振幅排列波形会引起细胞悬浮于其中的介质加热。加热也会引起扰动,从而使排列细胞的完整的串珠链不能形成,并引起已经形成的细胞串珠链破裂。介质中的热量也会降低细胞存活力。
如上所述,希望避免由于马上施加高振幅排列波形给待融合生物细胞而引起的机械力,扰动,加热。
因此,现有技术中指出在采用电穿孔脉冲进行细胞融合前,使用融合前电场波形是已知的,上述技术没有教导或提示用于细胞融合的介电电泳波形,其具有下列特征组合(1)提供融合前电场波形给生物细胞,其提高用固定振幅或线性增长振幅融合前电场波形的生物细胞的细胞融合效率;(2)避免了由于马上施加高振幅排列波形给待融合生物细胞而引起的机械力,扰动,加热;(3)降低了用于在细胞融合前提高细胞排列和细胞膜接触的用融合前电场波形处理的生物细胞的加热;(4)在进行细胞融合前,提高了用融合前电场波形处理的生物细胞间的细胞膜接触。上述希望的特征由用于本发明细胞融合的独特的非线性介电电泳波形提供,下面将予以说明。本发明相对现有技术的其它优势是显而易见的。
感兴趣的其它美国专利为4,561,961 December 31,1985 Hofmann5,001,056 March 19,1991 Snyder等5,589,047 December 31,1996 Coster等5,650,305 July 22,1997 Hui等其它参考文献包括1.R.Bischoff,等.,″Human Hybridoma Cells ProducedbyElectro-Fusion″,Red.Bur.Biochem.Soc.Lett.147,64-68(1982).
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发明内容
本发明是现有技术的改进。根据本发明,在施加一或多个融合/电穿孔脉冲前,对生物细胞施加在振幅上具有非线性改变的非线性电压波形。本发明的施加非线性电压波形的结果,是首先引起或迫使相邻细胞的切向细胞接触和排列。然后,作为进一步应用非线性电压波形的结果,本发明引起或迫使相邻细胞间的靠近细胞膜接触。在此,由于振幅上非线性变化的波形的影响,生物细胞10相互之间被压缩。生物细胞可以是相似的真核细胞,或是不相似的真核细胞。
振幅上非线性变化的融合前非线性电压波形,可以是非线性AC电压波形。AC电场波形可包括正弦波。波形的振幅的非线性变化的参数可设定为使融合过程可根据细胞类型优化。由于AC波形的振幅随时间而非线性改变,可以较低能量(较少加热)和较高融合效率进行生物细胞排列和融合。
优选地,融合前电场波形包括相对低的振幅,长的持续时间的电场波形,然后是相对短的持续时间,高振幅电场波形。更具体地,相对低的振幅,长持续时间电场波形慢慢有利于生物细胞串珠链形成和排列,而不会引起扰动或细胞死亡。一旦细胞排列和成串珠链,相对高的振幅,短的持续时间融合前电场波形施加于生物细胞。这些细胞已经排列较短的时间,在加热发生前,没有扰动发生细胞压缩。
融合前电场波形振幅能根据时间,以阶段式(stepped)的非线性方式改变。融合前电场波形振幅能根据时间,以连续的非线性方式改变。
融合前电场波形包括AC电场波形,其在振幅上以非线性根据时间改变。AC电场波形的振幅可按照非线性算法(algorithm)根据时间以非线性改变。
优选的,AC电场波形具有AC波形电场强度10volts/cm~1000volts/cm。
非线性阶梯式(step-wise)振幅提高波形可以作为融合前电场波形以相邻梯级或不相邻梯级施加。
施加振幅以非线性方式改变的融合前电场波形后,对生物细胞进行细胞融合脉冲。此外,细胞融合脉冲后可以用非线性AC电场波形处理生物细胞。
有多个非线性波形的实施方式,其振幅根据时间以非线性改变,如其中AC振幅的融合前类型根据时间改变。可用于振幅随时间非线性改变的算法实例包括指数,对数,多项式,幂函数,阶跃函数,s形曲线函数(sigmoidfunction),一般非线性算法(non-linear algorithm generally)等。
如上所述,本发明的一个目的是提供新的,改进的非线性融合前电场波形,其作为细胞融合前的介电电泳波形,振幅根据时间以非线性改变。
本发明另一方面是提供细胞融合用的非线性介电电泳波形,其中AC电场波形施加与生物细胞,提高用固定振幅或线性增加振幅融合前电场波形处理的生物细胞细胞融合效率。
本发明另一方面是提供新的,非线性用于细胞融合的非线性介电电泳波形,其降低用融合前电场波形处理的生物细胞细胞的加热,在细胞融合前用于提高细胞排列和细胞膜接触。
本发明另一方面是提供新的,改进的非线性介电电泳波形用于细胞融合,其避免机械力,扰动,加热,这些都是当生物细胞进行细胞融合马上时间高振幅排列波形给待融合生物细胞而产生的。
本发明的另一方面是提供新的改进的非线性介电电泳波形用于细胞融合,其提高用融合前电场波形在进行细胞融合前处理的生物细胞间的细胞膜接触。
这些连同其它本发明目标,在说明书中予以指出,并形成本发明的一部分。为更好理解本发明,其运行优势和具体目标,参考要与附图和说明部分同时,其中有本发明的优选实施方式。


参考附图,更有利于理解本发明。以下为

图1表示了非对称电极产生的非均匀电场影响下,生物细胞中现有技术偶极的形成。
图2表示了非对称电极产生的非均匀电场中,生物细胞的移动的现有技术通道,也表示了生物细胞串珠链排列和形成。
图3表示了现有技术固定振幅融合前电场波形图4表示了现有技术线性增长振幅融合前电场波形。
图5表示了整体现有技术方式,用于采用电场波形进行细胞融合,其中融合前电场波形后是融合/电穿孔脉冲,其是融合后电场波形。
图6表示了施加本发明的非线性介电电泳波形前的独立的生物细胞。
图7表示了应用本发明相对低振幅,长持续时间融合前电场波形期间,串珠链排列中切向接触生物细胞。
图8表示了在图7所应用的相对低振幅,长持续时间融合前电场波形后,应用本发明相对高振幅,短持续时间融合前电场波形期间,紧密接触并压缩的生物细胞。
图9表示采用幂函数在应用于生物细胞的融合前电场波形中的变化,其在幂函数的常数“k”上有变化。每一次选择的常数“k”,有相对低振幅,长持续时间融合前电场波形部分,然后是相对高振幅,短持续时间融合前电场波形部分。
图10表示了选择的“k”可调整的非线性增长连续的AC波形,其作为采用图9所示挑选的幂函数常数“k”的幂函数的融合前电场AC波形应用,显示相对低振幅,长持续时间融合前电场波形后跟相对高振幅,短持续时间融合前电场波形。
图11表示了作为融合前电场波形应用的非线性S形(sigmoidallyshaped)波形,其中从相对低振幅,长持续时间融合前电场波形到相对高振幅,短持续时间融合前电场波形的转换相对慢。
图12表示了作为融合前电场波形应用的非线性S形波形,其中从相对低振幅,长持续时间融合前电场波形到相对高振幅,短持续时间融合前电场波形的转换相对快。
图13表示了作为融合前电场波形应用的非线性阶梯式增长波形,其中提供的融合前电场波形是非相邻阶梯,其中第一融合前电场波形是相对低振幅,长持续时间融合前电场波形,其中提供关闭时间(off-time),其中第二融合前电场波形是相对高振幅,短持续时间融合前电场波形。
图14表示了作为融合前电场波形应用的非线性阶梯式增长波形,其中提供的融合前电场波形是相邻阶梯,其中第一融合前电场波形是相对低振幅,长持续时间融合前电场波形,其中提供关闭时间(off-time),其中第二融合前电场波形是相对高振幅,短持续时间融合前电场波形并且紧接在第一融合前电场波形之后应用。
具体实施例方式
提供非线性介电电泳波形用于细胞融合的方法和装置,参考附图,如下提供。
本发明是现有技术的改进。根据本发明,在应用一或多个细胞融合脉冲前,非线性电压波形,其振幅以非线性方式改变,应用于生物细胞。分离的生物细胞10如图6所示。作为应用非线性电压波形的结果,本发明首先引起或迫使相邻细胞间的膜切向接触,如图7所示。然后,作为应用非线性电压波形的结果,本发明首先引起或迫使相邻细胞间的膜紧密接触,如图8所示。如图8所示,在非线性电压波形影响下,生物细胞10相互之间压缩。
非线性电压波形,其振幅以非线性方式改变,可以是非线性AC电压波形。波形的非线性参数可以设定,以使根据细胞类型优化融合过程。由于AC波形的振幅随时间非线性改变,可以较低能量(较少加热)和更高效率进行生物细胞排列和融合。
更具体地,根据图10,采用非线性AC电压波形,优选非线性AC电压波形在波形的第一部分具有相对低的AC电压振幅,其引起生物细胞密切接近和排列。正好在用施加融合脉冲前,波形的第二部分然后提高振幅。此振幅的提高产生短期的,密集的,非均匀电场,其迫使生物细胞紧密接触。由于排列所需较低的电压和较短的持续时间强度AC部分,加热被减少。
有多种AC振幅随时间改变的类型,例如指数,对数,多项式,幂函数,阶跃函数,s形曲线函数(sigmoid function),一般非线性算法等。
此非线性波形的一个实施方式是幂函数,其可有下列的数学式或算法表示。
作为时间的函数AC波形的振幅=[(时间/总的AC持续时间)k×(停止振幅-起始振幅)]-起始振幅总的AC波形持续时间,AC起始振幅,AC停止振幅和幂指数“k”都根据所用细胞类型优化。
图9中的图说明了改变幂指数“k”的效果。图10表示了具体的幂指数图,其中“k”是2。因此,本发明提供了相对低振幅,长持续时间融合前电场波形,其产生相对低强度电场以排列生物细胞,然后正好在AC波结束和细胞融合/电穿孔脉冲前开始提供了相对高振幅,短持续时间融合前电场波形以使细胞密切接触。本发明的振幅方法中的非线性改变也产生较少的加热和较少的扰动,其进一步可提供细胞杂种产量和生产效率升高。
如上所述,图10中表示了作为融合前电场波形应用的非线性,振幅增加的连续波形,其是幂函数采用幂指数“k”为2。
图11表示了作为融合前电场波形应用的非线性S形波形,其振幅以非线性改变,其中从相对低振幅,长持续时间融合前电场波形到相对高振幅,短持续时间融合前电场波形的转换相对慢。
图12表示了作为融合前电场波形应用的非线性S形波形,其振幅以非线性改变,其中从相对低振幅,长持续时间融合前电场波形到相对高振幅,短持续时间融合前电场波形的转换相对快。
图13表示了作为融合前电场波形应用的非线性阶梯式增长波形,其振幅以非线性改变,其中提供的融合前电场波形是非相邻阶梯,其中第一融合前电场波形是相对低振幅,长持续时间融合前电场波形,其中提供关闭时间(off-time),其中第二融合前电场波形是相对高振幅,短持续时间融合前电场波形。
图14表示了作为融合前电场波形应用的非线性阶梯式增长波形,其振幅以非线性改变,其中提供的融合前电场波形是相邻阶梯,其中第一融合前电场波形是相对低振幅,长持续时间融合前电场波形,其中提供关闭时间(off-time),其中第二融合前电场波形是相对高振幅,短持续时间融合前电场波形并且紧接在第一融合前电场波形之后应用。
本发明可以通过能输送如上所述的波形的融合前电场波形进行。在此,可以对Cyto Pulse PA-4000系统进行软件改变,其采用了PA-101 AC波形发生器。该Cyto Pulse Sciences,Inc.PulseAgile(Reg.U.S.Pat.AndTm.Off.)系统软件现在可以产生该波形(参见US6010613)。用户输入非线性波形参数,计算机产生AC波形(融合前电场波形)和融合脉冲波形(电穿孔波形)。
采用阶段式(stepped)融合前电场波形进行试验,记录细胞融合改善,所述波形振幅以非线性改变。
A549细胞购买自ATCC。溶解细胞,放置于组织培养烧瓶中,采用ATCC推荐培养基。制备自处于细胞因子7天的外周血单核细胞培养液的树突状细胞参与融合。
每一细胞类型8百万细胞/ml相同混合以产生混合物中每一细胞类型4百万/ml的终浓度。3ml细胞悬浮液体积用于每一融合。
由以下步骤组成。细胞离心,重悬于10ml Cyto Pulse市售Cytofusion培养基(配方C)中。同一培养基中冲洗两次,冲洗后重悬于Cytofusion培养基中。细胞计数,调细胞浓度为8百万/ml。混合相同体积的A549细胞和树突状细胞。3ml细胞悬浮液放置于6ml容量同轴细胞融合电极中,其具有3.9cm直径的内部圆柱阳极,与阴极间隙4mm。采用下述细胞融合方法。
两个试验和对照组参数如下A组(本发明)第一融合前电场波形45V到45V,20秒,0.8MHz第二融合前电场波形75V到75V.10秒,0.8MHz融合/电穿孔脉冲1×800V,40微秒融合后/电穿孔脉冲(Post fusion/electroporation pulse)45V to 45V,50秒,0.8MHzB组(现有技术)第一融合前电场波形75V to 75V.10秒,0.8MHz融合/电穿孔脉冲1×800V,40微秒融合后/电穿孔脉冲45V到45V,50秒,0.8MHzC组(对照—不采用电)融合后,细胞静置30分钟使融合成熟(fusionmaturation)。具有10%胎牛血清的3ml组织培养基加入细胞融合电极中的细胞悬浮液中。15分钟后收获细胞进行分析。
采用市售Cytospin(Shandon)离心,将细胞等分样放置到silinized显微镜载玻片上。采用免疫组化鉴定细胞。A549细胞采用抗角蛋白单克隆抗体鉴定,采用抗人HLA-DR单克隆抗体鉴定树突状细胞。Meyershema toxylain用于核复染色。人工计数具有棕色角蛋白染色或红色HLA-DR染色或两者都有的细胞。
结果在下表中表示,其中显示了A组中混合A549和树突状细胞(其在细胞融合前用本发明的融合前电场波形处理)的融合细胞百分比,B组中混合A549和树突状细胞(其在细胞融合前用现有技术融合前电场波形处理)的融合细胞百分比,C组中混合A549和树突状细胞(其在细胞融合前没有用任何融合前电场波形处理)的融合细胞百分比。


上表第一列列出了进行融合处理的A549和树突状细胞的各自组别。第二列列出了A549细胞和另一个A549细胞融合形成的融合细胞百分比。第三列表示树突状细胞和另一个树突状细胞融合形成的融合细胞百分比。第四列表示树突状细胞和A549细胞形成的融合细胞百分比。
注意到每一类型的细胞融合(A549/A549,树突状细胞/树突状细胞,树突状细胞/A549),融合细胞的百分比A组(采用本发明的融合前电场波形)大于B组(采用现有技术的融合前电场波形)或C组(不采用融合前电场波形)。更具体地,7.2%大于6.8,大于2.2%。5.4%大于4.0%,大于2.2%。22.7%大于18.1%,大于10.8%。总之,采用本发明融合前电场波形提供了比现有技术和不采用融合前电场波形都高的融合效率。
本发明的使用和操作方式,如上所述是明显的,无需进一步的论述。
通过提供新的改进的非线性介电电泳波形用于细胞融合可以完成本发明的所有目标,其可有利的用于提供融合前电场波形,其可提高用固定振幅或线性增加振幅融合前电场波形处理的生物细胞的细胞融合效率。采用本发明,非线性介电电泳波形避免了由于立即施加高振幅排列波形到进行细胞融合的生物细胞而产生的机械力,扰动,加热。采用本发明,非线性介电电泳波形减少了用融合前电场波形处理的生物细胞的加热,以在细胞融合前提高细胞排列和细胞接触。采用本发明,非线性介电电泳波形提高了细胞融合前用融合前电场波形处理的生物细胞间的细胞膜接触。
因此,根据本发明公开,包括说明书,附图的详细说明,对本发明可以进行多种改变而不偏离本发明在此提出的原则和概念,这些改变包括,但不限于,尺寸,材料,形状,样式,操作的功能和方式,组成和使用等。
权利要求
1.在对生物细胞进行一或多个细胞融合/电穿孔脉冲前处理生物细胞的方法,包括如下步骤采用融合前电场波形处理细胞,所述波形振幅根据时间以非线性方式改变。
2.权利要求1的方法,其中生物细胞首先被排列,然后被压缩,使细胞在融合前提高细胞膜接触。
3.权利要求1的方法,其中融合前电场波形振幅包括相对低振幅,长持续时间电场波形,然后是相对高振幅,短持续时间电场波形。
4.权利要求1的方法,其中融合前电场波形振幅以阶段式的非线性方式根据时间改变。
5.权利要求1的方法,其中融合前电场波形振幅以连续的非线性方式根据时间改变。
6.权利要求1的方法,其中融合前电场波形包括AC电场波形,其振幅以非线性方式根据时间改变。
7.权利要求6的方法,其中所述AC电场波形的振幅按照非线性算法以非线性方式随时间改变。
8.权利要求6的方法,其中所述AC电场波形的AC波形电场强度在10伏特/cm到1000伏特/cm之间。
9.权利要求1的方法,其中融合前电场波形振幅包括非线性阶梯式提高的波形,其作为融合前电场波形施加,并且其中所述波形以相邻梯级或不相邻梯级提供。
10.权利要求1的方法,其还包括如下步骤对生物细胞施加细胞融合脉冲,细胞融合脉冲后用AC电场波形处理生物细胞。
11.生物细胞融合前处理生物细胞的方法,包括采用电场振幅处理生物细胞,所述振幅根据时间以非线性方式改变,从而生物细胞排列并提高了细胞膜接触,从而细胞融合前,生物细胞相互之间被压缩。
全文摘要
本发明涉及提供在生物细胞融合脉冲前处理生物细胞的方法,其包括用融合前电场波形处理生物细胞,其振幅随时间以非线性改变,从而采用相对低振幅,长持续时间融合前电场波形使生物细胞首先被排列,然后采用相对高振幅,短持续时间融合前电场波形压缩,使细胞融合前细胞膜接触提高。非线性融合前电场波形可以阶段式,连续的,S形的方式改变,按照非线性算法,采用阶梯式的提高相邻梯级的波形,采用阶梯式的提高非相邻梯级的波形。
文档编号C12N15/87GK1592787SQ02820027
公开日2005年3月9日 申请日期2002年4月5日 优先权日2001年8月31日
发明者理查德·E·沃尔特斯, 德林·C·沃尔特斯, 艾伦·D·金 申请人:塞托·帕尔斯科技公司
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