去纤肽生物学活性的测定方法

专利名称：去纤肽生物学活性的测定方法
技术领域：
本发明涉及一种测定去纤肽(defibrotide)生物学活性的方法，更确切的说，涉及一种测定去纤肽生物学活性的间接酶学方法。
发明的技术领域去纤肽(Merke Index，1996，no.2915)是从动物器官提取、由低分子量的多脱氧核糖核苷酸钠盐组成的天然物质。
大量药理学研究以去纤肽为主题，并且提示去纤肽可以作为抗血栓试剂应用于治疗(US 3,829,567)。
另外，去纤肽还被成功的应用于外周动脉病、急性肾功能不全(US4,694,134)或急性心肌缺血(US 4,693,995)。
同其他经过提取获得的生物学物质类似，去纤肽的组成同样具有一定的可变性，其组成以天然的生物多聚体为典型。肝素是这种情况的一个经典例子，每一批肝素的链长、分子量、组成以及硫酸化程度等的可变性众所周知。这种可变性的结果就是，同样质量的去纤肽，实际上其特异性的生物学活性可能并不相同。
正是因为其固有的生物多聚体特性，提取、分离和纯化方法本身不能从根本上保证产物的绝对可重复性。然而，在良好的控制下，这种可变性有可能降低出于这个目的，对从器官提取的去纤肽进行分离的标准化工业方法的研究已经开展，例如，美国专利US 4,985,552所述。
按上述方法获得的产品，其特征通过测定某些具体的物理-化学参数(例如电泳迁移率、消光系数、旋光本领和可逆增色性)来表示。然而，这些参数主要依赖于去纤肽的结构，并不能提供有关其生物学活性的信息。
就我们所知，纤维蛋白平板试验(fibrin plate test)和优球蛋白溶解时间的血栓弹性描记记录是迄今为止仅有的被报道用来评价去纤肽生物学活性的方法[Prino G.，Mantovani M.，Niada R.，CoccheriS.，Butti A.，Indagini preliminari sull′attività fibrinolitica，nell′animale e nell′uomo，di una nuova sostanza presente indiversi organi animali，Simposio InternazionaleLa ricercascientifica nell′industria farmaceutica in Italia，Rome，2-4October 1975-I1 Farmaco，Ed.Prat.)(1969)，24，552-561]。
然而，上述方法的特征是，实验复杂，重复性和精确度不尽人意，而且在血栓弹性描记记录的情况中，反应线性局限在有限的浓度范围。
因此，至今仍无真正有效、精确并且可重复的方法来测定去纤肽的生物学活性。
我们发展了一种简单、可靠的方法来测定去纤肽的生物学活性，从而使通过提取得到的样品可以被控制，进而使基于去纤肽的药物制剂得以标准化。
本发明涉及的方法使得去纤肽与参考标准相比的特异性生物学活性得以测定，该方法具有高度的精确度、速度和重复性。
发明描述本发明描述了一种测定去纤肽样品的特定生物学活性的方法。该方法包括a)将去纤肽、血纤蛋白溶酶和血纤蛋白溶酶特异性底物相接触，所述的血纤蛋白溶酶特异性底物通过与血纤蛋白溶酶反应，产生可以测量的产物，以及b)随后逐次测定所形成的产物的量。
本发明的方法是一种以去纤肽和血纤蛋白溶酶功能性相互作用为基础、在体外间接测定去纤肽活性的方法。
由文献得知，血纤蛋白溶酶是凝血/纤维蛋白溶解级联中的一种蛋白水解酶，能够剪切纤维蛋白、纤维蛋白原和其他血浆蛋白。
血纤蛋白溶酶的酶活性通常通过不同的标准体外实验测定。最常用的方法是使用分光光度计或荧光光度计测定血纤蛋白溶酶与合适的底物反应释放的发光或荧光化合物[Haemostasis，(1978)，7，138-145]。通常使用具有分子式A1-A2-A3-X的肽底物，其中，A1和A2为具有显著非极性的氨基酸，A3为赖氨酸或精氨酸，X代表可以测量的释放化合物，例如对硝基苯胺(pNa)或2-萘胺(NA)[Haemostasis，(1978)，7，146-149]。除上述肽底物之外，使用其他的简单化合物(如对硝基苄基-对甲苯磺酰-L-精氨酸也取得成功[Haemostasis，(1978)，7，105-108]。
在这些试验中，化合物X被释放到孵育基质当中的速率与样品中血纤蛋白溶酶的活性(国际单位)成正比。
目前已经发现，在上述血纤蛋白溶酶评价试验中，去纤肽能够增加化合物X的释放速率，释放速率的增加与去纤肽的浓度成正比，这正是本发明的原理。
本发明涉及的方法首先要求将去纤肽样品、血纤蛋白溶酶和血纤蛋白溶酶底物相混合。
根据此发明，使用的去纤肽样品通常按照已知步骤(例如前面提到的美国专利US 4,985,552中所述)从器官提取制备。
选择一批正规工业制造的去纤肽为参照样品(标准)，按照本发明方法用其制备校正曲线。
总体而言，即使在存在如RNA、肝素、降解的去纤肽(失去嘌呤或嘧啶的去纤肽)或乙醇等污染物的情况下，如果污染物浓度不会削弱整个体系(通常，质量百分比低于10％)，本方法都可以对去纤肽进行精确而且准确的测量。
除了去纤肽，该方法同样可以用于测定来源于去纤肽的其它生物学等价物，例如脱氨基去纤肽，或者更简单的为热变性的去纤肽。
本方法具有充分的灵敏度，可以检测到等于或低于0.1μg/ml(检测体系中终浓度)的去纤肽，而且通常表现出良好的相关性，甚至在最大浓度等于或高于100μg/ml时。
所使用的血纤蛋白溶酶通常可以是各种哺乳动物血纤蛋白溶酶，例如牛、猪或者人的，优选人血纤蛋白溶酶。
但是，尽管所选用的酶为血纤蛋白溶酶，使用其他等价的酶系统，如血纤蛋白溶酶的前体如血纤蛋白溶酶原，或具有相关化学性和类似功能的血纤蛋白溶酶类似酶，也在本发明范围内。
本发明方法中，血纤蛋白溶酶底物为在本方法条件下，能够释放可测量的水解产物X的任何血纤蛋白溶酶特异性底物。
依赖于可检测基团X的性质，被本领域技术人员普遍了解的替代检测系统同样可以很好的采用。
分光光度或者荧光检测系统，特别是分光光度系统，具有独特的优势。
常用的底物具有血纤蛋白溶酶特异性，优选具有分子式A1-A2-A3-X的肽类，其中A1和A2为显著非极性的氨基酸，A3为赖氨酸或精氨酸，X为可检测基团。这种底物的实例为Val-Leu-Lys-pNa、Val-Phe-Lys-pNa或pyroGlu-Phe-Lys-pNa，其中可使用分光光度计检测的X基团为对硝基苯胺(pNA)。其他适宜的底物，如Val-Gly-Arg-2NA，含有可用荧光光度计检测的2-萘胺。一种特别优选的底物是化合物H-D-缬氨酰-L-亮氨酰-L-赖氨酸-对硝基苯胺(H-D-Val-Leu-Lys-pNA)。
用于去纤肽测定的血纤蛋白溶酶及其特异性底物一般均可商购获得。
本发明中的测定方法通过将去纤肽样品和试剂置于水溶液中于特定pH和摩尔浓度下实施。
尤其是，血纤蛋白溶酶的浓度是可变的，常在0.0016至0.20I.U./ml，优选0.0064至0.050I.U./ml之间，更加优选约0.0125I.U./ml。
然而，关于血纤蛋白溶酶底物，当其为生色底物时，浓度为0.3至4mM，优选2.5至3.5mM，有利地为3mM；当其为荧光底物时，浓度为0.05至0.15mM。
与其他酶学方法类似，本发明中的测定方法对介质的pH敏感。
事实上，在使酶系统失活的极端pH值下，不能使用本方法。
同样，在测量过程中的任何时间，介质的pH最好不要变化，因此，反应溶液通常选择血纤蛋白溶酶测定试验中常用的缓冲液来进行缓冲。合适的缓冲系统可以是例如磷酸盐缓冲液，柠檬酸盐缓冲液，或者三羟甲基氨基甲烷盐酸(TRIS)缓冲液。
本方法通常优选保持介质pH在接近7至8范围内，更加优选7.4左右。
此外，缓冲系统浓度保持在10到200mM范围内为佳，优选50mM左右。
本发明中测定去纤肽的方法，要保证将血纤蛋白溶酶、血纤蛋白溶酶底物和去纤肽混合。为了保证测量准确进行，尤其优选在开始测量步骤之前，将血纤蛋白溶酶，或其特异性底物，或者两者一起加入到含有去纤肽样品的缓冲溶液当中。血纤蛋白溶酶底物优选最后加入。
本测量方法的一个重要参数是温度。
无论是构建参考曲线，还是在测量阶段，在整个测量过程中，以及在所有样品的测定过程中，优选保持同样的温度。为此，优选使用温度控制仪器，有必要时可以用几套测量设备来进行，要适当的改变样品的位置，以保证系统具有最大的热同质性。
本测定方法通常应用于25～40℃范围内，优选35～39℃，更优选在37℃。
根据本发明，当加入所有试剂后，开始测量通过血纤蛋白溶酶反应释放到介质中的化合物X的浓度，并且持续一段预先确定的时间，其测量频率依赖于X的化学性质和检测系统。
与其他生物学测定方法类似，本发明方法同样提供了校正和测量过程，为了尽量减少试验可变性的发生率，校正和测量过程应平行进行。
校正过程包括获得已知的浓度渐升的去纤肽样品(标准)的光吸收数据，将这些数据进行统计学再加工，外推为表现本发明增加的酶反应速率与介质中去纤肽浓度相关性的校正曲线。
在测量过程中，由于在校正过程获得的相关性，可以根据在同样条件下测量并且处理的去纤肽样品光吸收值来测定其未知生物学活性。
实验方案通常更详细地提供已知不同浓度去纤肽的几个标准和未知样品。去纤肽样品依照预先确定的稀释因子，由母液逐步稀释。
本方法中，优选将标准和待测样品至少各准备5个浓度，通常用母液连续1∶2稀释，每个浓度的标准或待测样品各准备5份，更加优先选择准备10份。
去纤肽的标准和测试样品浓度通常为0.1至100μg/ml，优选0.3至50μg/ml，0.5至8μg/ml最佳。
测试样品的浓度优选与标准的浓度处于相同的数量级。
与上述说明一致，每个浓度的测量宜分别在两个微孔板上进行，相应浓度的每个样品(即标准与检测样品)在两块微孔板上的位置最好反转。排列方案在实验部分有更加详细的说明，按照此样品排列方案，每个浓度的去纤肽标准和测试样品，每次至少要测量5个光吸收值，优选10个。
上述测量在预先确定的时间进行，也就是说，首先在时间为t0(即添加所有组分后、本发明酶学反应开始之前)，继而在精确的时间间隔和足够获得必要数据的时期内进行。
吸光率测量的时间最大以90分钟为宜，每1到10分钟读取一次。更有利地，在t0时读取，然后在20-50分钟内每5分钟读取。
进行光度吸光率读取的波长依赖于酶水解反应中释放的可检测基团X的性质。具体到X为p-NA时，吸光率在405nm测量。
标准和未知去纤肽样品吸光率的读取，即原始数据，通常是从提供读取操作的同一仪器直接产生；原始数据通过一定方式列表，表示各孔的每次吸光率值。
接下来对原始数据进行处理，例如，使用Spread Sheet-MicrosoftExcel_。这是第一步加工处理，其计算了每次每组读数的吸光率平均值和相关的标准差，每组读数包括去纤肽标准和测试样品各个浓度的至少5份、优选10的读数。
数据的进一步处理由Sigma Plot Computer Program_type程序(SPSS，Chicago，USA)执行，获得各个浓度去纤肽样品的吸光率值与时间之间存在的数学关系式，得到斜率与去纤肽浓度成正比的直线。
为了得到更高的精确度，在反应为线性的时间间隔内(优选20至50分钟)，用该程序对同一浓度的5份(优选10份)计算了回归线，以线性回归系数“b”、决定系数“r2”和截距“a”为特征。
按此程序产生的直线通常具有良好的相关性，表现为通常不小于0.97、优选大于或等于0.99的高r2值。
经该程序产生的每组浓度的数据可以制成数字数据列表，或者绘图表示。
如

图1所示，将时间置于横坐标、吸光率置于纵坐标，获得了以“b”为斜率的直线，斜率“b”与酶反应速率成正比增加去纤肽浓度，水解速率和“b”值成正比地增加。
如上所述对去纤肽标准和测试样品各份计算得到的斜率值，最后要与其对应的去纤肽浓度对数作相关性分析。
从图形上看，对于标准和测试样品，该相关性显示为S形(图2)；S形中央部分有两条直线，通常是相互平行的，两条直线之间的距离即为测试样品和标准之间的生物学活性差异的函数。
在此线性距离内，根据Finey DJ所著Statistical Method inBiological Assay，2nd ed.Ch.Griffin，London中介绍的平行线生物学测定方法，与标准相比较，测定未知去纤肽样品的活性(power)。
当生物学反应是待测物质的浓度对数的线性函数时，并且当分别与标准和未知浓度相关的直线之间具有平行性或线性时，可以应用本发明的方法学。
数据的统计学处理，活性比率和去纤肽的未知活性的测定，优选使用建立在上述方法学基础上的专用软件。
在常用化学分析尤其是本方法中，统计学数据处理使误差和实验可变性降至最低，然而，统计学分析处理却并不限于本发明方法，只是代表广为本领域技术人员所知的、并且普遍应用于本领域的一种评价结果的方法。
本发明还涉及与本发明方法一致的去纤肽生物学活性测定试剂盒，试剂盒至少包括a)已测数量的如前定义的血纤蛋白溶酶底物和b)已测数量的血纤蛋白溶酶。
优选的试剂盒包括，每单位血纤蛋白溶酶20至30mg血纤蛋白溶酶特异性底物，更优选的为每单位血纤蛋白溶酶25mg底物。
根据本发明，包含血纤蛋白溶酶特异性底物H-D-Val-Leu-Lys-pNA和人血纤蛋白溶酶的试剂盒尤其有利。
根据本发明，试剂盒还可以含有缓冲水溶液，优选以50mM，pH7.4的TRIS-HCl缓冲。
或者，本试剂盒也可以含有已测数量的去纤肽(标准)，以允许进行对照测量。
在本发明的优选实施方案中，去纤肽标准溶液和待测去纤肽样品溶液分别被加入微孔板的孔中。血纤蛋白溶酶溶液在使用时制备，加到含有去纤肽的孔中，最后加入含有血纤蛋白溶酶底物的溶液。随后将微孔板置于恒温读数仪中，快速搅拌后，在预定的时间内按照预定的时间间隔读取系统吸光率。将获得的原始数据进行处理，从而测定去纤肽样品的未知活性。
本发明提及的这些以及其他方面将在下面的实施例中得到更好的阐明，然而，这些实施例不能认为是对本发明的限制。
实施例此处提供的实施例使用以下材料仪器-96孔板检测仪MRX TCII(Dynex Technologies，Chantilly，VA，USA)，恒温且装备酶动力学程序。
-平底96孔板(Greiner L.，Kremunster，Austria，cat.655101)-可连续调节体积的移液枪Pipetman P200(30-200μl)和具有质量认证的8×200(20-200μl)以及200-μl枪头(Gilson，Milan，Italy)-pH计PHM85 Radiometer(Analitica De Mori，Milan，Italy)程序-Microsoft Exel_(Microsoft Corporat ion，Redmond，WA，USA)-Sigma Plot Computer Program_(SPSS，Chicago，USA)
物质-去纤肽(Gentium)-人血纤蛋白溶酶，1单位，P-4895(Sigma Aldrich，Milan，Italy)-生色底物S-2251，820332-39(Chromogenix InstrumentationLaboratory S.p.A.，Milan，Italy)-三羟甲基氨基甲烷(TRIS)，255285-9(Sigma-Aldrich，Milan，Italy)-1N HCl 1090571000(Merck)-1N NaOH 1091411000(Merck)溶液TRIS-HCl缓冲液将2.4 2克TRIS溶解于蒸馏水中，稀释至体积为100ml。向溶液中加入1N HCl 16ml，继而加入更多蒸馏水，使终体积为400ml。最终溶液pH为7.4。如果数值有差异，通过加入1N HCl或者1N NaOH校正为所需的pH值。
血纤蛋白溶酶溶液将1单位(1I.U.)人血纤蛋白溶酶在0℃溶解于4ml TRIS-HCl缓冲液中。操作始终于冰上进行，溶液以每份200μl分装，置于10-ml塑料试管中，于-20℃保存。
生色底物S-2251的溶液25mg S-2251溶解于15.15ml蒸馏水中，于+4/+8℃保存。
标准去纤肽溶液标准溶液制备●0.1至100μg/ml的(终)浓度60mg去纤肽溶解于3ml TRIS-HCl缓冲液中，并用TRIS-HCl缓冲液以1∶15的比例稀释。这样得到的溶液浓度为1.333mg/ml，再经过连续1∶2稀释，产生浓度为666μg/ml、333μg/ml和166μg/ml的去纤肽溶液。最后的所述溶液作为母液，进一步稀释，得到浓度为83.33μg/ml、41.67μg/ml、33.33μg/ml、25μg/ml、16.66μg/ml、8.33μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml、1.66μg/ml、0.83μg/ml、0.5μg/ml和最终0.16μg/ml的溶液。
●0.5至8μg/ml的(终)浓度60mg去纤肽溶液于3ml TRIS-HCl缓冲液中，并用TRIS-HCl缓冲液按照1∶1500比例稀释。获得浓度为13.33μg/ml的溶液，经过连续1∶2稀释，产生浓度为6.66μg/ml、3.33μg/ml、1.66μg/ml和0.83μg/ml的去纤肽溶液。
步骤上述每个标准去纤肽溶液各150μl加入微孔板孔中。
迅速制备血纤蛋白溶酶溶液，即在0℃下将3.8ml TRIS-HCl缓冲液加入含有0.2ml人血纤蛋白溶酶溶液的试管中。轻轻搅动溶液体系直至溶解，取50μl加到微孔板孔中，随后向各孔加入50μl S-2251。
将微孔板置于37℃的MRX TCII测读仪上，搅拌约10秒钟；在405nm处，根据酶动力学程序，在初始时间t0以及此后10至20分钟期间内，每2分钟读取吸光率。
如下文作为举例的图1、图2所示，对浓度为0.1至100μg/ml去纤肽所测量的数据进行处理(Excel和Sigma Plot程序)及图示。
将去纤肽标准和测试样品相应直线的角系数b值(斜率)(图1)对去纤肽浓度(对数值)作图(图2)。
如图所见，体现为直线的线性反应在曲线中部获得。根据Finney DJ在Statistical Method in Biological Assay，2nd ed.Ch.Griffin，London中描述的平行线生物学测定方法，在此线性区间内，测定了相对于标准的未知去纤肽样品的活性。除了线性以外，标准和待测去纤肽分别对应的直线之间的平行性对于此方法的应用也非常重要。
未知去纤肽样品相对于标准去纤肽生物学活性的测定实验优选使用引起上面测定的S形曲线直线部分的浓度。标准和未知去纤肽尤其优选在0.5至8μg/ml的浓度范围内。
实验中，标准和样品的去纤肽各浓度的副本(replicate)在微孔板孔上的排列在下文给出。

标准去纤肽溶液置于2至6列，待测去纤肽样品置于7至11列，浓度如表所示。在第二块板上，样品的位置最好翻转。
微孔板的外列和外行未用作测量，但是以水添注，以保证整个系统的最大热同质性。
微孔板置于调至37℃的MRX II读数仪中，搅拌约10秒钟；根据酶动力学程序，于初始时间t0，以及此后的20至50分钟期间，每隔5分钟于405nm读取吸光率。
测得的吸光率值随后经处理(Excel和Sigma Plot程序)、制表及制图表示(回归线)。
继而可以使用与上述相同的计算系统计算活性比，测定未知去纤肽样品相对于标准的活性。
在下文中，作为例子将给出涉及去纤肽样品(分别在浓度0.5μg/ml，2.0μg/ml和8.0μg/ml测试)的表格(1、2和3)和图表(图3、4和5)。
权利要求
1.测定去纤肽生物学活性的方法，包括以下步骤a)使去纤肽、血纤蛋白溶酶和所述血纤蛋白溶酶的特异性底物接触，其中所述底物通过与血纤蛋白溶酶反应，提供可测量的产物，和b)随后逐次测量所形成的产物数量。
2.权利要求1的方法，其中血纤蛋白溶酶是哺乳动物血纤蛋白溶酶，优选人血纤蛋白溶酶。
3.权利要求1的方法，其中所述血纤蛋白溶酶的特异性底物是分子式为A1-A2-A3-X的化合物，其中，A1和A2为非极性氨基酸，A3为赖氨酸或精氨酸，X为可测量产物。
4.权利要求3的方法，其中所述可测量产物X选自对硝基苯胺和2-萘胺。
5.权利要求3的方法，其中血纤蛋白溶酶底物为H-D-缬氨酰-L-亮氨酰-L-赖氨酸-对硝基苯胺。
6.权利要求1的方法，其中所述血纤蛋白溶酶浓度为0.0064至0.050I.U./ml，血纤蛋白溶酶底物浓度为2.5至3.5mM。
7.权利要求6的方法，其中所述血纤蛋白溶酶浓度为0.0125I.U./ml，所述血纤蛋白溶酶底物浓度为3mM。
8.权利要求1的方法，其中可测量产物X使用分光光度法测定。
9.权利要求1的方法，其中反应介质为水溶液，缓冲到pH为7至8，优选pH7.4。
10.权利要求1的方法，其中所述体系温度保持在35至39℃，优选37℃。
11.权利要求1的测定去纤肽生物学活性的方法，包括以下阶段a)在酶反应过程中，测定标准和测试类型的每一个去纤肽样本的可测量产物X的释放速率，b)以算术和/或图形形式使上述释放速率与相应的去纤肽浓度相关联，c)获得去纤肽测试样品的生物学活性。
12.用于根据前述权利要求测定去纤肽生物活性的试剂盒，其至少包含a)已测定数量的血纤蛋白溶酶底物；和b)已测定数量的血纤蛋白溶酶。
13.权利要求12的试剂盒，其中所述血纤蛋白溶酶底物为H-D-Val-Leu-Lys-pNA，所述血纤蛋白溶酶为人血纤蛋白溶酶。
14.权利要求12的试剂盒，其中包括每单位血纤蛋白溶酶20至30mg血纤蛋白溶酶特异性底物，优选每单位血纤蛋白溶酶25mg特异性底物。
全文摘要
本发明描述了一种测定去纤肽生物学活性的酶学方法。该方法的基础是去纤肽具有增强血纤蛋白溶酶的酶活性的能力，步骤包括a)将去纤肽、血纤蛋白溶酶和一种血纤蛋白溶酶特异性底物相接触，所述的血纤蛋白溶酶底物通过与血纤蛋白溶酶反应，产生可以测量的产物，和b)随后逐次测定所形成的产物的含量。
文档编号C12Q1/68GK1612938SQ02826979
公开日2005年5月4日 申请日期2002年11月27日 优先权日2001年12月17日
发明者R·波尔塔, F·卡特尼奥, L·费罗 申请人:金蒂姆股份公司