专利名称：一种新式核酸聚合酶反应方法
技术领域：
本发明涉及一种生物技术，更具体地说涉及一种生物化学反应的方法。
核酸是生物物种的遗传物质，它包括核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)。核酸的基本组成是四种核苷酸(或碱基)，在DNA中它们分别由A、C、G、T代表，在RNA中它们分别由A、C、G、U代表。核苷酸(碱基)在核酸中以串联的方式组成链状结构，DNA一般为双链结构，RNA为单链结构；DNA的双链结构可以在适当的条件下分解成单链，单链的DNA也可以与单链的RNA形成双链结构。在一核酸结构中，一部分可以是单链另一部分可以是双链。在双链的核酸结构中碱基A与另一链的T(U)通过氢键形成碱基对，同理G与另一链的C形成碱基对，能形成碱基对的碱基为互补碱基。如一核酸链与另一核酸链有完全互补的碱基序列，则这两条核酸链称为互补核酸链，互补的核酸链可形成稳定的双链结构，由互补的两单链分子结构形成双链分子结构的过程称为分子杂交。非完全互补的核酸链(部分互补)在特定条件下也会形成双链分子结构。在生物体及试管中，单链的核酸链可在酶的作用下复制出互补的核酸链，在复制过程中，被复制的核酸链称为模板分子，所需的酶为聚合酶，聚合酶可分为DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶等。DNA聚合酶以DNA为模板合成DNA互补链，RNA聚合酶以DNA为模板合成RNA互补链，逆转录酶以RNA为模板合成DNA互补链。引物为核酸片段，它与模板分子互补并杂交形成双链结构。核酸聚合酶反应的始点决定于引物的位置，DNA的聚合反应从引物的3’末端开始(DDNA及cDNA聚合反应)。RNA聚合酶反应需要有双链的被RNA聚合酶识别的结构，称为驱动子。引物核酸片段可以由几个或几十个碱基(核苷酸)组成，引物可以是DNA，也可以是RNA，它可以是通过降解自然核酸而取得的片段，也可以通过人工化学合成。人工合成的核酸片段可具有非自然的组成单位(结构)，非自然的组成单位(结构)包括在自然界中不是核酸组分的结构，也包括不存在于自然界的化学结构。通过引物与模板分子的杂交，可以控制模板分子的复制以技模板分子的扩增。聚合酶链反应(PCR)是利用两个引物分别与DNA的两条互补链杂交，在聚合酶的作用下复制出相应的互补链，用同样的引物对同样序列的核酸模板反复进行如上反应，即可得到数量巨大的核酸分子。这一被复制或被扩增的模板序列称为靶序列。由引物引发的聚合反应或扩增反应常用于分子生物学的基础研究，基因工程，以及遗传诊断和与分子生物学相关的检测。在这些应用中，反应中所需要的试剂(反应试剂)要进行混合然后在试管或其他反应器中进行反应。反应试剂根据反应性质可分为通用试剂如水、缓冲液等；和专一试剂，专一试剂包括引物、酶等。一种反应试剂在某个反应中可能是专一试剂，在另一反应中可能是通用试剂。一般来说通用试剂指的是同一批的多个反应中的共同试剂，专一试剂是多个反应中，个别反应所需的试剂。另外反应中可以加入添加剂，添加剂在反应中不参与反应。常用的添加剂包括蛋白质(如牛血清蛋白、明胶)、多糖类化合物(如淀粉、藻胶)等，另外有些人工合成的化合物也可以用作添加剂(如线形聚丙烯酰胺)。添加剂一般为水溶性的，在低溶度下(＜10％)不会影响酶反应。添加剂的特性包括溶于水后会膨胀并可形成胶状物态，可起到胶合剂作用；去水后会收缩、结块，也可以固化，形成固化物。反应器一般由塑料制成，有管状、槽状、盘状等，反应器可以是单独的反应空间也可以是多个反应空间反应器组。条件化反应器是指预先置有专一试剂的反应器(即置有专一试剂的反应器称为条件化反应器)。当对一个样品中核酸的多个靶片段进行聚合酶反应时，要有多个专一的反应引物或其他相应的专一试剂。已有的常用的反应方法是在反应前把相应的专一试剂和通用试剂混合，然后分配到指定的容器中，这种方法是要将多个(种)专一试剂与通用试剂分别进行混合，这需要大量的工作量，很容易出现差错。另外还有一种方法是将专一试剂预先放入到反应器中，但专一试剂干后成散粉状态，影响专一试剂的可靠性、稳定性，并容易造成污染，不利于保存、运输。
本发明的目的是提供一种新式聚合酶反应方法，它能克服现有技术的上述不足。
一种新式核酸聚合酶反应方法，包括预先制备条件化反应器，把液相试剂分配到多个条件化反应器中，然后对多个不同的核酸靶分子进行复制或扩增，其特征是一种液相试剂与多个条件化反应器中置有的固化试剂进行聚合酶反应，反应时液相试剂与多个固化试剂接触，并使固化试剂溶解释放出各自的反应试剂共同参与反应。
实施一种新式核酸聚合酶反应方法的装置，包括条件化反应器2，其特征是条件化反应器2内装置有固化试剂3。
本发明的优点是在进行重复性多的聚合酶反应时，只须在条件化反应器中加入通用试剂，反应后可得到专一的反应结果。这一方法可以大量减少聚合酶反应(包括PCR)的操作，因而能降低成本，在医疗诊断中减少差错，并可防止产物污染。
下面通过实施例和
本发明。
附图为本发明装置的结构示意图。
本发明的装置有反应容器1，其内侧底面有条件化反应器2，条件化反应器2内装置有固化试剂3。
对病人的血样品进行甲、乙、丙肝炎病毒的检验，首先按已知的病毒核酸序列设计出扩增核酸所需的6个引物(PCR引物)共3对(专一试剂)，它们分别与相应的病毒核酸序列有专一性。用化学方法合成这些引物并测定其浓度，用水配制10％的淀粉液添加剂加热溶解后分成三份，每份1毫升，这三份淀粉液分别与三对引物混合形成复合物，使引物的浓度为5微摩尔浓度(5μM)，淀粉浓度为5％，然后把10微升与甲型肝炎相对应的混合物分配到标有“甲”的条件化反应器2中，用同样方法分别把10微升与乙型和丙型肝炎相关的复合物分别分配到标有“乙”和“丙”的条件化反应器2中，复合物在条件化反应器2中固化形成固化试剂，最后得到标有甲、乙、丙的三种含有固化试剂的条件化反应器2。对病人进行检测时，从病人体中抽取血样，分别提取核酸(RNA和DNA)，提取的核酸(核酸样品)与一液相试剂混合，液相试剂的成分包括聚合酶(具有逆转录酶活性和DNA聚合酶活性)、三磷酸脱氧核糖核苷(dNTP)、缓冲液等。把病人的核酸样品、液相试剂分配到各条件化反应器2中，条件化反应器2中的固化试剂溶解并释放出专一试剂(专一引物)，专一引物与核酸样品的核酸杂交，在聚合酶的作用下，对病毒RNA进行逆转录反应，然后对DNA、cDNA进行PCR扩增。所有聚合酶反应在定量PCR仪中进行，扩增的结果可直接从仪器中取得。根据反应结果可以对病人的病情做出判断。
根据本发明方法所生产的固化试剂可以制成小颗粒状，可具不同形状(如圆、矩形等)。小颗粒状的固化试剂是在一个较大的反应器中混合制成后，然后压(拉)长再分割成许多微小的颗粒，颗粒的形状与大小可用机械加工；小颗粒状的固化试剂外表包裹着一层添加剂制成的保护膜。在使用时可将多种(个)不同的小颗粒状的固化试剂固定在反应器内，然后再加入液相试剂进行反应。小颗粒状的固化试剂的体积≤8mm3。
本发明方法所述的液相试剂是溶于水和缓冲液的通用试剂；或者是溶于水和缓冲液的专一试剂；或者是溶于水和缓冲液的通用试剂和专一试剂的复合物。
本发明方法所述的固化试剂是专一试剂和添加剂的复合物，其中添加剂的含量≤99.996；或者是通用试剂和添加剂的复合物，其中添加剂的含量≤99.9％。固化试剂基本不含水分。
本发明方法所述的固化试剂是在条件化反应器2内混合合成；也可以先混合合成再加入到条件化反应器2内。
本发明方法所述的条件化反应器，是含有一反应空间的反应器；可以是含有多个反应空间的反应器组；也可以是一形状各异的反应器；也可以是一平面反应器；也可以是生物芯片，即将生物芯片做为一反应器。
根据本发明方法可以生产一种新型的生物芯片，一种方法是在生物芯片基板上制作多个小孔(不透孔)每个小孔都是一个反应器，在小孔内加入专一试剂的复合物并使之固化形成固化试剂；二是将已制作好的多种(个)小颗粒状的固化试剂固定在生物芯片上。
根据本发明方法可以生产试剂盒，试剂盒内包括含有条件化反应器2或者小颗粒状的固化试剂，包括反应所需的酶、溶液、冲洗液以及用于信号检测的荧光材料。
用此方法进行的聚合酶反应是在定量PCR进行，定量PCR仪能在PCR反应过程中通过光学系统观测反应的进行程度。
此方法可用于RNA靶分子，进行逆转录反应然后进行聚合酶链反应。用反应结果判断基因表达或测定RNA病毒(微生物)的种类和数量。
此方法可用于DNA靶分子进行聚合酶链反应，或由逆转录反应、DNA聚合反应、RNA聚合反应等组成的恒温扩增反应。通过扩增的结果判定靶片段的存在或判断靶片段的基因型，以及判断相关物种的数量。
此方法可对病毒和微生物进行检测，用于商检、环保、医疗、食品卫生等。
此方法可对人类、动物、植物进行检测，用于防病治病、药物开发、遗传育种、物种鉴定、刑侦等。
权利要求
1.一种新式核酸聚合酶反应方法，包括预先制备条件化反应器，把液相试剂分配到多个条件化反应器中，然后对多个不同的核酸靶分子进行复制或扩增，其特征是一种液相试剂与多个条件化反应器中置有的固化试剂进行聚合酶反应，反应时液相试剂与多个固化试剂接触，并使固化试剂溶解释放出各自的反应试剂共同参与反应。
2.实施一种新式核酸聚合酶反应方法的装置，包括条件化反应器2，其特征是条件化反应器2内装置有固化试剂3。
3.如权利要求1所述的方法，其特征是固化试剂是专一试剂和添加剂的复合物，其中添加剂的含量≤99.9％。
4.如权利要求1所述的方法，其特征是固化试剂是通用试剂和添加剂的复合物，其中添加剂的含量≤99.9％。
5.如权利要求1所述的方法，其特征是固化试剂是在条件化反应器2内混合合成。
6.如权利要求1所述的方法，其特征是固化试剂是先混合合成再加入到条件化反应器2内。
7.如权利要求1所述的方法，其特征是一种成小颗粒状的固化试剂，小颗粒状的固化试剂的体积≤8mm3。
8.如权利要求1所述的方法，其特征是固定多个小颗粒状的固化试剂在反应容器内，然后再加入液相试剂进行反应。
9.如权利要求2所述的装置，其特征是所述的条件化反应器是具有多孔结构的生物芯片。
10.如权利要求2所述的装置，其特征是所述的条件化反应器是一生物芯片，在生物芯片基板上固定多个小颗粒状的固化试剂。
全文摘要
一种新式核酸聚合酶反应方法，其特征是一种液相试剂与多个条件化反应器中置有的固化试剂进行聚合酶反应，反应时液相试剂与多个固化试剂接触，并使固化试剂溶解释放出各自的反应试剂共同参与反应。所用的装置包括条件化反应器内装置有固化试剂。本发明的优点是在进行重复性多的聚合酶反应时，只须在条件化反应器中加入通用试剂，反应后可得到专一的反应结果。这一方法可以大量减少聚合酶反应(包括PCR)的操作，因而能降低成本，在医疗诊断中减少差错，并可防止产物污染。
文档编号C12Q1/68GK1490412SQ0311205
公开日2004年4月21日 申请日期2003年3月28日 优先权日2003年3月28日
发明者吴昌, 吴 昌 申请人:吴昌, 吴 昌