专利名称：Itgb2基因第十三号外显子多态性的制作方法
技术领域：
本发明涉及ITGB2基因第十三号外显子的单核苷酸多态性。本发明还涉及分析ITGB2基因第十三号外显子的等位基因突变的方法。
背景技术：
ITGB2(Integrin gene beta 2)即整合蛋白基因2号β亚基，其变异被认为是犬科动物白细胞支持缺乏症(Canine leukocyte adhesion deficiency)的根本原因。(J Vet Intern Med.2002 Sep-Oct；16(5)518-23)。目前的研究也已经揭示，ITGB2基因变异也导致大量人群得了先天性白细胞支持缺乏症。(J BiomedBiotechnol 2001；1(3)114-121)在本申请之前，还没有ITGB2基因第十三号外显子多态性的相关报道。
发明内容
本发明的目的就是提供ITGB2基因第十三号外显子的多态性及其检测方法。
在本发明的第一方面，提供了一种检测人ITGB2基因第十三号外显子的单核苷酸多态性的方法，它包括步骤(a)确定在人ITGB2基因第十三号外显子的SEQ ID NO1所示序列的第189位的核苷酸；(b)检测在所述位置是否存在单核苷酸多态性。
在一优选例中，所述的单核苷酸多态性是在第189位存在G。
在本发明的第二方面，提供了一种分离核酸，它具有SEQ ID NO1所示的序列，且第189位为G。
在本发明的第三方面，提供了一种等位基因特异性的核酸引物，其长度为15-50bp，且特异性地杂交并扩增出含人ITGB2基因第十三号外显子的SEQ ID NO1所示序列中第189位单核苷酸多态性的扩增产物。
在本发明的第四方面，提供了一种等位基因特异性的寡核苷酸探针，其长度为15-50bp，且特异性地杂交并检测含人ITGB2基因第十三号外显子的SEQ ID NO1所示序列中第189位单核苷酸多态性。
一种试剂盒包括(1)特异性扩增人ITGB2基因第十三号外显子的引物对，(2)检测扩增产物与正常的ITGB2基因第十三号外显子相比是否存在变化所需的试剂，所述的SEQ ID NO1所示序列中第189位单核苷酸多态性。
另一种诊断试剂盒包括本发明上述的引物和/或本发明上述的寡核苷酸探针。
具体实施例方式
本发明人通过广泛而深入的研究，已经发现了ITGB2基因第十三号外显子所编码的蛋白序列中第18位Ser(S)->Ala(A)多态(即mRNA上189位T->G多态性)，在此基础上完成了本发明。
根据对正常人ITGB2基因测序结果，发现了该SNP。经分析发现，该SNP导致第18位氨基酸由Ser(S)->Ala(A)。由于这是不同性质氨基酸的置换，因此，会导致ITGB2基因第十三号外显子所编码的蛋白活性发生改变。
ITGB2基因第十三号外显子的cDNA序列列于SEQ ID NO1，其中开放阅读框为第138-353位，其所编码的氨基酸序列列于SEQ ID NO2。ITGB2基因第十三号外显子的基因组序列可以从GenBank中获得。
本领域的技术人员知道，有大量的分析技术可用于检测ITGB2基因第十三号外显子中所述位点是否存在单核苷酸多态性。这些技术包括(但并不限于)DNA测序、杂交测序；酶促错配切割、异源双链分析、点杂交、寡核苷酸阵列(DNA芯片)、Mini-sequencing、Taqman技术、分子信标等，变性高效液相色谱法(DHPLC)。
另一方面，本发明的检测方法被用于评估个体患ITGB2基因第十三号外显子相关疾病的易感性。
用于本发明的测试样品没有特别限制，对于检测SNP而言，可以是从血液、组织等样品中抽提出的DNA或mRNA。对于检测ITGB2基因第十三号外显子活性而言，可以任何含有ITGB2基因第十三号外显子的样品，如血液等。
用于本发明方法或检测试剂盒的引物和探针，根据ITGB2基因第十三号外显子的cDNA序列(SEQ ID NO1的序列)或基因组序列进行设计，并可用常规的合成技术进行合成即可。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1基因的抽提和测序用常规酚氯仿法从人的血液中提取DNA，浓度校正至20ng/ul后，用于常规PCR扩增。引物是有义引物5’-ccatgccttt tgctcagg-3’(SEQ ID NO3)反义引物5’-gtgcagaggt gctcactgg-3’(SEQ ID NO4)扩增出的457bp的产物，纯化后进行DNA测序。
实施例2SNP的获得对ITGB2基因进行直接测序。将测定的各样本序列进行比较，从而得出序列的差异，获得SNP。
实施例3检测试剂盒制备一检测ITGB2基因相关疾病易感性的检测试剂盒，其中，含有下列可扩增出189位SNP的引物对有义引物5’-ccatgccttt tgctcagg-3’(SEQ ID NO3)
反义引物5’-gtgcagaggt gctcactgg-3’(SEQ ID NO4)对扩增产物与正常对照用变性高效液相色谱仪(DHPLC)进行色谱分析，可轻易地检测出189位的T->G型SNP。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>上海人类基因组研究中心<120>ITGB2第十三号外显子多态性<130>030115<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>457<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>CDS<222>(138)..(353)<223>
<400>1ccatgccttt tgctcaggaa catcccccag gctggaggag gcaggcgggc cggagggagc60aaccgcagtg gggtttcggg cgggtctcgg ttcccaggcc aagcaggagc ttagccgtgc 120tgccccgtct tccaggg agg ggg ctc tgc ttc tgc ggg aag tgc cgc tgc 170Arg Gly Leu Cys Phe Cys Gly Lys Cys Arg Cys1 5 10cac ccg ggc ttt gag ggc tca gcg tgc cag tgc gag agg acc act gag 218His Pro Gly Phe Glu Gly Ser Ala Cys Gln Cys Glu Arg Thr Thr Glu15 20 25ggc tgc ctg aac ccg cgg cgt gtt gag tgt agt ggt cgt ggc cgg tgc 266Gly Cys Leu Asn Pro Arg Arg Val Glu Cys Ser Gly Arg Gly Arg Cys30 35 40cgc tgc aac gta tgc gag tgc cat gca ggc tac cag ctg cct ctg tgc 314Arg Cys Asn Val Cys Glu Cys His Ala Gly Tyr Gln Leu Pro Leu Cys45 50 55cag gag tgc ccc ggc tgc ccc tca ccc tgt ggc aag tac atgtgagtgc 363Gln Glu Cys Pro Gly Cys Pro Ser Pro Cys Gly Lys Tyr60 65 70aggcggagca ggcagggcgg gcagggatcc ccactccccg gccacctacc cagcagccgg 423
gctcactcgg ggaccccagt gagcacctct gcac457<210>2<211>72<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Arg Gly Leu Cys Phe Cys Gly Lys Cys Arg Cys His Pro Gly Phe Glu1 5 10 15Gly Ser Ala Cys Gln Cys Glu Arg Thr Thr Glu Gly Cys Leu Asn Pro20 25 30Arg Arg Val Glu Cys Ser Gly Arg Gly Arg Cys Arg Cys Asn Val Cys35 40 45Glu Cys His Ala Gly Tyr Gln Leu Pro Leu Cys Gln Glu Cys Pro Gly50 55 60Cys Pro Ser Pro Cys Gly Lys Tyr65 70<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>3ccatgccttt tgctcagg 18<210>4<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>4gtgcagaggt gctcactgg 19
权利要求
1.一种检测人ITGB2基因第十三号外显子的单核苷酸多态性的方法，其特征在于，它包括步骤(a)确定在人ITGB2基因第十三号外显子的SEQ ID NO1所示序列的第189位的核苷酸；(b)检测在所述位置是否存在单核苷酸多态性。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的单核苷酸多态性是在第189位存在G。
3.一种分离核酸，其特征在于，它具有SEQ ID NO1所示的序列，且第189位为G。
4.一种等位基因特异性的核酸引物，其特征在于，其长度为15-50bp，且特异性地杂交并扩增出含人ITGB2基因第十三号外显子的SEQ ID NO1所示序列中第189位单核苷酸多态性的扩增产物。
5.一种等位基因特异性的寡核苷酸探针，其特征在于，其长度为15-50bp，且特异性地杂交并检测含人ITGB2基因第十三号外显子的SEQ ID NO1所示序列中第189位单核苷酸多态性。
6.一种诊断试剂盒，其特征在于，它包括(1)特异性扩增人ITGB2基因第十三号外显子的引物对，(2)检测扩增产物与正常的ITGB2基因第十三号外显子相比是否存在变化所需的试剂，所述的SEQ ID NO1所示序列中第189位单核苷酸多态性。
7.一种诊断试剂盒，其特征在于，它包括权利要求4所述的引物和/或权利要求5所述的寡核苷酸探针。
全文摘要
本发明涉及ITGB2基因第十三号外显子的单核苷酸多态性(SNP)。本发明提供了分析ITGB2基因第十三号外显子的SNP或其活性的方法。本发明的SNP是SEQID NO1所示序列的人ITGB2基因第十三号外显子的第189位的T－＞G多态性。该SNP导致编码蛋白第18位发生Ser(S)－＞Ala(A)改变，从而改变了蛋白活性。
文档编号C12P19/00GK1519342SQ0311503
公开日2004年8月11日 申请日期2003年1月22日 优先权日2003年1月22日
发明者黄薇, 施锦绣, 奚慧峰, 金力, 黄 薇 申请人:上海人类基因组研究中心