专利名称：Lss基因第七号外显子多态性的制作方法
技术领域：
本发明涉及LSS基因第七号外显子的单核苷酸多态性。本发明还涉及分析LSS基因第七号外显子的等位基因突变的方法。
背景技术：
Holoprosencephaly(HPE)是最常见的一种人脑先天性缺陷症。其表现为大脑左右两个半球不同程度地不完全分离开来，同时颅骨也不规则。研究发现，人的羊毛甾醇合成酶基因LSS(lanosterol synthase gene)和HPE1基因同处在人21号染色体相近区段，并在HPE患者中普遍表现为LSS基因异常。因此，研究者认为，LSS基因在HPE发病机理中扮演了关键角色。(Hum Genet 1999 Nov；105(5)489-95)。
在本申请之前，还没有LSS基因第七号外显子多态性的相关报道。
发明内容
本发明的目的就是提供LSS基因第七号外显子的多态性及其检测方法。
在本发明的第一方面，提供了一种检测人LSS基因第七号外显子的单核苷酸多态性的方法，它包括步骤(a)确定在人LSS基因第七号外显子的SEQ ID NO1所示序列的第129位的核苷酸；(b)检测在所述位置是否存在单核苷酸多态性。
在一优选例中，所述的单核苷酸多态性是在第129位存在C。
在本发明的第二方面，提供了一种分离核酸，它具有SEQ ID NO1所示的序列，且第129位为C。
在本发明的第三方面，提供了一种等位基因特异性的核酸引物，其长度为15-50bp，且特异性地杂交并扩增出含人LSS基因第七号外显子的SEQ ID NO1所示序列中第129位单核苷酸多态性的扩增产物。
在本发明的第四方面，提供了一种等位基因特异性的寡核苷酸探针，其长度为15-50bp，且特异性地杂交并检测含人LSS基因第七号外显子的SEQ ID NO1所示序列中第129位单核苷酸多态性。
一种试剂盒包括(1)特异性扩增人LSS基因第七号外显子的引物对，(2)检测扩增产物与正常的LSS基因第七号外显子相比是否存在变化所需的试剂，所述的SEQ ID NO1所示序列中第129位单核苷酸多态性。
另一种诊断试剂盒包括本发明上述的引物和/或本发明上述的寡核苷酸探针。
具体实施例方式
本发明人通过广泛而深入的研究，已经发现了LSS基因第七号外显子所编码的蛋白序列中第7位Ser(S)->Pro(P)多态(即mRNA上129位T->C多态性)，在此基础上完成了本发明。
根据对正常人LSS基因测序结果，发现了该SNP。经分析发现，该SNP导致第7位氨基酸由Ser(S)->Pro(P)。由于这是不同性质氨基酸的置换，因此，会导致LSS基因第七号外显子所编码的蛋白活性发生改变。
LSS基因第七号外显子的cDNA序列列于SEQ ID NO1，其中开放阅读框为第111-245位，其所编码的氨基酸序列列于SEQ ID NO2。LSS基因第七号外显子的基因组序列可以从GenBank中获得。
本领域的技术人员知道，有大量的分析技术可用于检测LSS基因第七号外显子中所述位点是否存在单核苷酸多态性。这些技术包括(但并不限于)DNA测序、杂交测序；酶促错配切割、异源双链分析、点杂交、寡核苷酸阵列(DNA芯片)、Mini-sequencing、Taqman技术、分子信标等，变性高效液相色谱法(DHPLC)。
另一方面，本发明的检测方法被用于评估个体患LSS基因第七号外显子相关疾病的易感性。
用于本发明的测试样品没有特别限制，对于检测SNP而言，可以是从血液、组织等样品中抽提出的DNA或mRNA。对于检测LSS基因第七号外显子活性而言，可以任何含有LSS基因第七号外显子的样品，如血液等。
用于本发明方法或检测试剂盒的引物和探针，根据LSS基因第七号外显子的cDNA序列(SEQ ID NO1的序列)或基因组序列进行设计，并可用常规的合成技术进行合成即可。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1基因的抽提和测序用常规酚氯仿法从人的血液中提取DNA，浓度校正至20ng/ul后，用于常规PCR扩增。引物是有义引物5’-aatagccatc caccagtgtt c-3’(SEQ ID NO3)反义引物5’-actgtcccat agcacaagtc c-3’(SEQ ID NO4)扩增出的450bp的产物，纯化后进行DNA测序。
实施例2SNP的获得对LSS基因进行直接测序。将测定的各样本序列进行比较，从而得出序列的差异，获得SNP。
实施例3检测试剂盒制备一检测LSS基因相关疾病易感性的检测试剂盒，其中，含有下列可扩增出129位SNP的引物对有义引物5’-aatagccatc caccagtgtt c-3’(SEQ ID NO3)
反义引物5’-actgtcccat agcacaagtc c-3’(SEQ ID NO4)对扩增产物与正常对照用变性高效液相色谱仪(DHPLC)进行色谱分析，可轻易地检测出129位的T->C型SNP。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
SEQUENCE LISTING<110>上海人类基因组研究中心<120>LSS基因第七号外显子多态性<130>030115<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>450<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>CDS<222>(111)..(245)<223>
<400>1aatagccatc caccagtgtt cgtgcttgaa agggcccaag gtatggatgc tggcggaggg 60ggcaggcttg agtcttgggg tctcccactg actcctgctg ttgccccagg ctg ttt116Leu Phe1cct gac tgg gca tcg gca cac ccc tcc aca ctc tgg tgc cac tgc cgg 164Pro Asp Trp Ala Ser Ala His Pro Ser Thr Leu Trp Cys His Cys Arg5 10 15cag gtg tac ctg ccc atg agc tac tgc tac gcc gtt cgg ctg agt gcc 212Gln Val Tyr Leu Pro Met Ser Tyr Cys Tyr Ala Val Arg Leu Ser Ala20 25 30gcg gaa gac ccg ctg gtc cag agc ctc cgc cag gtaggacctc atcagggaac 265Ala Glu Asp Pro Leu Val Gln Ser Leu Arg Gln35 40 45aaagtgaagg cctctggggc tgggacccac agggcctggg gcttctggaa tctaaccaca 325cctgtccact cacctggtgg ccctgtggag cggagagccc tgtggagcag agcctccacc 385ttcctccatc ctataataaa cagtgagcaa gctctgccca gaggggactt gtgctatggg 445acagt 450
<210>2<211>45<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Leu Phe Pro Asp Trp Ala Ser Ala His Pro Ser Thr Leu Trp Cys His1 5 10 15Cys Arg Gln Val Tyr Leu Pro Met Ser Tyr Cys Tyr Ala Val Arg Leu20 25 30Ser Ala Ala Glu Asp Pro Leu Val Gln Ser Leu Arg Gln35 40 45<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>3aatagccatc caccagtgtt c 21<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>4actgtcccat agcacaagtc c 2权利要求
1.一种检测人LSS基因第七号外显子的单核苷酸多态性的方法，其特征在于，它包括步骤(a)确定在人LSS基因第七号外显子的SEQ ID NO1所示序列的第129位的核苷酸；(b)检测在所述位置是否存在单核苷酸多态性。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的单核苷酸多态性是在第129位存在C。
3.一种分离核酸，其特征在于，它具有SEQ ID NO1所示的序列，且第129位为C。
4.一种等位基因特异性的核酸引物，其特征在于，其长度为15-50bp，且特异性地杂交并扩增出含人LSS基因第七号外显子的SEQ ID NO1所示序列中第129位单核苷酸多态性的扩增产物。
5.一种等位基因特异性的寡核苷酸探针，其特征在于，其长度为15-50bp，且特异性地杂交并检测含人LSS基因第七号外显子的SEQ ID NO1所示序列中第129位单核苷酸多态性。
6.一种诊断试剂盒，其特征在于，它包括(1)特异性扩增人LSS基因第七号外显子的引物对，(2)检测扩增产物与正常的LSS基因第七号外显子相比是否存在变化所需的试剂，所述的SEQ ID NO1所示序列中第129位单核苷酸多态性。
7.一种诊断试剂盒，其特征在于，它包括权利要求4所述的引物和/或权利要求5所述的寡核苷酸探针。
全文摘要
本发明涉及LSS基因第七号外显子的单核苷酸多态性(SNP)。本发明提供了分析LSS基因第七号外显子的SNP或其活性的方法。本发明的SNP是SEQ ID NO1所示序列的人LSS基因第七号外显子的第129位的T－＞C多态性。该SNP导致编码蛋白第7位发生Ser(S)－＞Pro(P)改变，从而改变了蛋白活性。
文档编号C12N15/11GK1519354SQ03115049
公开日2004年8月11日 申请日期2003年1月22日 优先权日2003年1月22日
发明者黄薇, 施锦绣, 奚慧峰, 金力, 薇 黄 申请人:上海人类基因组研究中心