专利名称：微囊化功能细胞的制备方法
技术领域：
本发明属生物治疗技术领域，涉及一种生物微囊制备技术，尤其涉及一种微囊化功能细胞的制备方法，可以制备出高度组织相容性、通透性及牢固性的微囊化功能细胞，可有效应用于肿瘤的生物治疗。
微囊化细胞(microencapsulated cells)是将活细胞包裹在半透膜内的球囊。将功能细胞微囊化包裹后植入机体可保持存活，并维持正常的生理功能，从而获得可以在体内长时间、持续地分泌目的活性蛋白的微囊化基因修饰细胞，达到治疗疾病的目的。应用微囊化功能细胞治疗疾病是否成功的关键之一是制备具有良好组织相容性、通透性及牢固性的微囊。
微囊包裹是十分有效的免疫隔离技术，可应用于许多能分泌生物活性物质并发挥功能的细胞移植，还可以包裹小分子的酶及其它活性物质发挥免疫保护作用。微囊化细胞技术与基因工程的结合可解决体外转基因细胞移植到体内后存活率低、细胞因子半衰期短等问题，可为生物治疗提供一条行之有效的新途径。
目前，微囊化技术主要应用于国内微囊化胰岛细胞移植治疗糖尿病及将嗜铬细胞的微囊化用于帕金森氏病及疼痛的研究等；国外也有应用微囊化基因修饰细胞用于疾病治疗的研究，靶基因主要有人生长激素(hGH)基因、人神经生长因子(hNGF)基因等。据文献报道，目前微囊的获得是通过“微囊静电发生器”及“双腔微囊发生器”制备。
本发明的制备方法包括取过滤除菌的微囊包裹液和生长状态良好的细胞，将功能细胞按要求比例混合于微囊包裹液中，混匀，将混合液吸入注射器中，置于微量注射泵上，连接并开通多通道微囊发生装置，将细胞悬浮液喷射形成微囊，并落入收集槽中，收集微囊，处理，备用。
所用的微囊包裹液可以是海藻酸钠、多聚赖氨酸、琼脂糖、聚丙烯胺等。
可制备出不同直径大小的微囊(φ0.35-0.75mm)。
本发明的另一个目的是提供一种用于制备上述微囊化功能细胞的多通道微囊发生装置。
该多通道微囊发生装置包括活塞式注射泵、连接管、管接头、管芯、压盖、密封圈、固定圈、外套、压缩气体发生器，连接管的一条管路与活塞式注射泵连接，其余各管路通过管接头连接相应数的管芯，管芯依次穿过压盖、密封圈、固定圈的中心，密封圈位于压盖和固定圈之间，外套套于管芯、密封圈、固定圈外，另一个连接管的一条通路与压缩气体发生器连接，其余各管路通过管接头与外套和管芯间的空隙相通。
连接管有多条管路，形成多条通路。
外套与管芯间有空隙。
本发明具有以下优点(1)微囊制作过程相对简单，制备速度快，可用于快速制备大量的微囊；(2)制备的微囊对包裹细胞的活性影响小；(3)通过调整相应参数可制备出不同直径大小的微囊(φ0.35-0.75mm)；(4)微囊的均质性、牢固性、通透性及生物相容性好；(5)以上这些特点能有效提供应用于生物治疗的微囊化功能细胞。(6)多通道微囊发生装置结构设计合理、新颖；(7)装置制备简便，成本低。
图2为微囊化CHO-mIFN-γ细胞图。
图3为CHO/mIFN-γ细胞及其细胞微囊分布曲线图。
实施例1参见
图1，多通道微囊发生装置的一种结构包括活塞式注射泵1、连接管2及2-1、管接头3、管芯4、压盖5、密封圈6、固定圈7、外套8、压缩气体发生器9，连接管2有多个通路，其中的一个通路与活塞式注射泵1连接，其余各通路通过管接头3连接相应数的管芯4，管芯4的另一端为微囊的出口，管芯4依次穿过压盖5、密封圈6、固定圈7的中心，密封圈6位于压盖5和固定圈7之间，外套8套于管芯4、密封圈6、固定圈7外，形成圆柱体，圆柱体上端用压盖5盖住，下端成为微囊的出口，外套8与管芯4间有空隙，连接管2-1有多个通路，其中一个通路与压缩气体发生器9连接，其余各通路通过管接头3穿过外套8，与外套8和管芯4间的空隙相通。
实施例2细胞的微囊化包裹取生长状态良好、达90％融合的CHO细胞，用0.25％胰蛋白酶消化生理盐水洗涤2次，离心、计数，取过滤除菌的微囊包裹液海藻酸钠，将细胞按比例(1.5×109L-1海藻酸钠)混合于海藻酸钠溶液中，轻轻吹打混匀。用多通道微囊发生装置将细胞悬浮液喷射入装有4.9％的BaCl2溶液(pH7.4)的接收槽中，10min后，用1×PBS液洗涤3次。收集微囊，镜下动态观察囊内细胞的生存情况。置于含10％小牛血清的DMEM中，孵箱中培养(37℃ 5％ CO2)备用。
所用的微囊包裹液还可以是多聚赖氨酸、琼脂糖、聚丙烯胺等。
可通过调节活塞式注射泵的注射速率和压缩气体发生器的压缩气体的气流量，制备出不同直径大小的微囊(φ0.35-0.75mm)。
实施例3海藻酸钠微囊理化性能的测定(一)实验材料仪器材料激光扫描共聚焦显微镜(LSCM 510)；恒温振荡器TH2-c；异硫氰酸荧光标记的葡聚糖(FITC-dextran，FD)(FD-40、FD-75和FD-167)。FITC标记的羊抗小鼠IgG(F-IgG)，胰蛋白酶；DMEM培养基，新生牛血清。CHO细胞。
实验动物BALB/c小鼠，8-10周龄，体重20-25g。(二)微囊理化性能的测定方法1.微囊的通透性测定·静态观察将上述制备的各种微囊分别悬浮于0.5ml含有FD-40、FD-75或FD-167溶液(均为100mg/L)以及F-IgG溶液(100mg/L)中，室温、避光放置24hr，并不断摇动，使荧光素标记物能够充分扩散到微囊内。调整好激光扫描共聚焦显微镜(LSCM 510)，并预热15min。将少许上述至于液体中的微囊置于35mm一次性培养皿上，在LSCM 510普通光下聚焦于微囊，然后再更换成激光光源，在显示屏上观察激光共聚焦图象，并保存相关图片资料。·动态观察将新制备待测微囊置于35mm一次性培养皿上，分别依次滴加入适量的FD-40、FD-75或FD-167溶液(均为100mg/L)。立即将LSCM设置为时间扫描方式，每隔1min扫描一幅图象，连续扫描30min。动态观察FD向待测微囊内扩散的情况，并保存相关图片资料。·细胞微囊的通透性观察制备包含有细胞的微囊，置于DMEM培养基(含10％新生牛血清)中孵育24hr(37℃，5％CO2)。以经同样处理的空微囊为对照。然后用LSCM按上述方法进行微囊的通透性测定。2.微囊牢固性的测定按上述流程通过调整氧气流量及微量注射泵推注速度，制备出小微囊(直径0.40-0.50mm)及大微囊(0.70-0.80mm)。将微囊用1×PBS冲洗3次，以生理盐水重新悬浮。取12只10ml无菌离心管，6管吸入3ml约含1000个左右小微囊的上述悬浮液，另6管吸入相同量的大微囊悬浮液。置于恒温振荡器中于37℃150次/min震荡，震荡时间分别为8、16、24、32、40及48hr。然后在纤维镜下观察微囊形态及计算破损率。3.微囊生物相容性的测定取8只BALB/C小鼠，皮下注入NIH3T3细胞微囊，约1000个/每只。分别于2、4、8及12周各取2只小鼠，处死后仔细切开皮肤，在原注射部位取出皮下的微囊。用生理盐水冲洗，在显微镜下仔细观察形态，了解微囊在受体内的稳定性及囊内细胞的存活情况。即观察微囊的生物相容性。(三)微囊理化性能测定的结果1.微囊的通透性测定结果1.1空微囊的通透性静态观察结果采用1.5％和2％的海藻酸钠制成的空微囊，将其与不同分子量的FD或F-IgG共孵育24hr，用激光共聚焦显微镜测得的图象显示FD-75、FD-167和F-IgG的共聚焦图象微囊轮廓清晰，囊内无明显荧光亮点，表明平均分子量为75kD以上的葡聚糖及免疫球蛋白IgG不能通过微囊膜扩散进入囊内。FD-40的荧光强度微囊内、外基本一致，表明分子量为40kD的葡聚糖可以自由进入微囊。1.2 FD-40向微囊内扩散的动态观察利用LSCM的时间扫描功能可动态观察FD-40向微囊内的扩散过程。1.3细胞微囊的通透性将CHO细胞微囊在含10％新生牛血清的DMEM培养基中孵育24hr后，再用LSCM对其进行通透性测定。结果表明CHO细胞微囊与空微囊的通透性无明显差异。2.微囊牢固性的测定结果本实验结果显示微囊直径大小与其牢固性相关，小微囊(直径0.45mm)较大微囊(直径0.75mm)具有更好的牢固性(表1)。
表1不同类型微囊在不同时间的破损率(％)时间(hr)8 16 24 32 40 48大微囊(直径0.75mm) 3.84.9 6.58.611.2 15.3小微囊(直径0.45mm) 1.11.65 1.82.13.25.63.微囊的生物相容性测定结果3.1微囊移植入小鼠皮下后2周、4周、8周分别取出微囊，在光镜下观察到形态完整、呈圆形、囊壁光洁，未见纤维化包绕。微囊内细胞仍存活良好(从微囊内取出后继续在常规DMEM培养基内培养，细胞仍可增殖)。3.2微囊移植入小鼠皮下后12周时，绝大多数微囊形态仍完整，呈圆形，囊壁光洁、未见纤维化包绕；少部分微囊有变形，囊壁增厚。将回收的微囊置于常规DMEM培养基内培养，微囊内细胞仍存活良好。
①RPMI-1640组皮下注射RPMI-1640；②CHO细胞微囊组皮下注射CHO微囊，1×105个细胞/只；③CHO/LacZ/Ad微囊组皮下注射CHO/Ad/lacZ细胞微囊，1×105个细胞/只；④CHO/IFN-γ微囊组；皮下注射CHO/IFN-γ细胞微囊，1×105个细胞/只。(四)结果1.微囊化CHO/mIFN-γ细胞的制备采本发明提供的多通道微囊发生装置，参照实施例2的方法，制备了大小均一、直径约0.5mm的微囊(参见图2)，显示微囊内细胞分布均匀。
2.微囊化细胞及CHO/mIFN-γ细胞培养上清中IFN-γ水平将CHO/mIFN-γ包裹成直径为0.5mm左右的微囊，CHO/mIFN-γ细胞与微囊化CHO/mIFN-γ细胞的体外培养上清中检测到的mIFN-γ，在其转染20小时后达高峰分别为81.2和78.9ng/ml，绘制出分泌曲线(参见图3)。两组之间无明显差别(P＜0.05)。随后持续稳定表达，转染后14d，培养上清中仍可检测到mIFN-γ。而转染空载体(CH0/LacZ)和CHO细胞未检测到IFN-γ。表明腺病毒将IFN-γ基因转染至CHO细胞并使之有效表达。囊内细胞可较长时间存活并持续产生mIFN-γ，mIFN-γ能够自由通透海藻酸钠微囊膜。
3.微囊化CHO/IFN-γ细胞治疗后荷瘤鼠血清细胞因子水平荷瘤小鼠经微囊化CHO-IFN-γ细胞治疗后2周，治疗组血清mIFN-γ呈高水平表达，与对照组、RPMI-1640组及lacZ组比较，差异均有显著性(P＜0.05)。(表2)表2微囊化细胞治疗荷瘤鼠15天后血清IFN-γ水平(x±s)(pg/ml)RPMI-1640 CHO细胞微 CHO/LacZ/A CHO/IFN-γ囊囊 d囊205.1±63.9 197.6 ± 239.2 ± 2673.8±80.3 71.1 576.2*与对照组、RPMI-1640组及lacZ组比较，n＝20，*p＜0.01本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
本发明涉及的部分参考文献1.Leblond FA，Tessier J，Halle JP.Quantitative method for the evaluation of biomicrocapsuleresistance to mechanical stress.Biomaterials，1996，17(21)2097-2102.2.Peirone M，Ross CJ，Hortelano G et al.Encapsulation of various recombinant mammaliancell types in different alginate microcapsules.J Biomed Mater Res.1998，42(4)587-596.3.Hobbs HA，Kendall WF，Darrabie M，et al.Prevention of morphological changes inalginate microcapsules for islet xenotransplantation.JInvestig Med，2001，49(6)572-575.4.Charles K，Harland RC，Ching D，et al.torage and microencapsulation of islets fortransplantation.Cell-Transplant.2000，9(1)33-38.5.Uludag H，De-Vos P，Tresco PA.Technology of mammalian cell encapsulation.AdvDrug Deliv Rev.2000，42(1-2)29-64.6.Rayat GR，Rajotte RV，Ao Z，et al.Microencapsulation of neonatal porcine isletsProtection from human antibody/complenent-mediated cytolysis in vitro and long-termreversal of diabetes in nude mice.Transplantation，2000，691084-1890.7.Tai IT，Sun AM.Microencapsulation of recombinant cellsA new delivery system for genetherap y.FASEB，1993，71061-1069.8.Uludag H，De Vos P，Patrick A，et al.Technology of mammalian cell encapsulation.Advanced Drug Delivery Revies，2000，42，29-64.9.Aebischer P，Lysaght MJ.Immunoisolation and cellular xenotransplantation.Xeno，1995，343-46.10.Ezzell C.Tissue enginnering and the human body shopencapsulated-cell transplants enterthe clinic.J NIH Research.1995；747-50.11.Chang PL，Shen N，Westcott AJ.Delivery of recombinant gene products withmicroencapsulated cells in vivo.Hum Gene Ther.1993，4(4)433-440.12.Calafiore R.Transplantation of microencapsulated pancreatic human islets for therapy ofdiabetes meilitus.ASAIO，1992；3834.13.Cai ZH，Shi ZQ，Sherman M，et al.Development and evaluation of a system ofmicrocapsulation of primary rat hepatocytes.Hepatology，1989；10855.14.Tresco PA，Winn SR，Aebischer P.Polymer encapsulated neurotransmitter secreting cell.Potiential treatment for Pakinson’s disease.ASAIO J，1992；3817.15.Hoffman D，Brerakefield XO，Short MP，et al.Transplantation of polymer-encapsulated cellline genetically engineered to release.NGF Exp Neurol，1993；122100.16.Pheips CH，Gage FH，Growdon JH，et al.Potential use of nerve growth factor to treatAlzheimer’s disease.Neurobiol ofAging，1989；10205-207.17.Joki T，Machluf M，Atala A，et al.Continuous release of endostatin from microencapsulatedengineered cells for tumor therapy.Nat Biotechnol.2001，19(1)35-39.18.Read TA，Sorensen DR，Mahesparan R，et al.Local endostatin treatment of gliomasadministered by microencapsulated producer cells.Nat Biotechnol，2001，19(1)29-34.19.De Vos P，De Haan BJ，Wolters GHJ，et al.Improved biocompatibility but limited graftsurvival after purification of alginate for microencapsulation of pancreatic islets.Diabetologia，1997；40262-270.20.Kulseng B，Skjak BG，Ryan L，et al.Transplantation of alginate microcapsulesGenerationof antibodies against alginates and encapsulated porcine islet-like cell clusters.Translantation，1999，67978-984.21.于聪慧，冷希圣，魏玉华等。海藻酸钠纯度对大鼠微囊纤维化和囊内肝细胞功能的影响.中华医学杂志，1999，(6)460-462。22.冷希圣，魏玉华，刘继超等。海藻酸钠纯度对微囊化肝细胞腹腔移植中微囊纤维化的影响.中华外科杂志，2000，38(4)300-303.23.Zhang WJ，Marx SK，Lane C.HOH077 reduces fibrotic overgrowth around the bariumalginate microcapsules.Transplant Proc，2000，32206-209.24.Fritschy WM，De Vos P，Groen H，et al.The capsular overgrowth on microencapsulatedpancreatic islet grafts in streptozotocin and autoimmune diabetic rats.Transplant Int.1994；7264-271.25.Xue Y，Gao J，Wang Z，et al.Microencapsulated bovine chromaffin cell xenografts intohemiparkinsonian ratsa drug-induced rotational behavior and histological changes analysis.Artif Organs.2001，25(2)131-135.26.Tabler C，Wilks K，Sambanis A，et al.The effects of alginate compositionon encapsulated betaTC3 cells.Biomaterials.2001，22(11)1301-1310.
权利要求
1.微囊化功能细胞的制备方法，其特征是取过滤除菌的微囊包裹液和生长状态良好的细胞，将功能细胞按要求比例混合于微囊包裹液中，混匀，将混合液吸入注射器中，置于微量注射泵上，连接并开通多通道微囊发生装置，将细胞悬浮液喷射形成微囊，并落入收集槽中，收集微囊，处理，备用。
2.根据权利要求1所述的微囊化功能细胞的制备方法，其特征是所用的微囊包裹液可以是海藻酸钠、多聚赖氨酸、琼脂糖、聚丙烯胺等。
3.根据权利要求1所述的微囊化功能细胞的制备方法，其特征是可制备出不同直径大小的微囊(φ0.35-0.75mm)。
4.多通道微囊发生装置，包括活塞式注射泵(1)、压缩气体发生器(9)，其特征是还包括连接管(2)(2-1)、管接头(3)、管芯(4)、压盖(5)、密封圈(6)、固定圈(7)、外套(8)，连接管(2)的一个管路与活塞式注射泵(1)连接，其余各管路通过管接头(3)连接相应的管芯(4)，管芯(4)依次穿过压盖(5)、密封圈(6)、固定圈(7)的中心，密封圈(6)位于压盖(5)和固定圈(7)之间，外套(8)套于管芯(4)、密封圈(5)、固定圈(6)外，连接管(2-1)的一个管路与压缩气体发生器(9)连接，其余各管路通过管接头(3)与外套(8)连接。
5.根据权利要求4所述的多通道微囊发生装置，其特征是连接管(2)(2-1)有多个管路，形成多条通路。
6.根据权利要求4所述的多通道微囊发生装置，其特征是外套(8)与管芯(4)间有空隙。
7.根据权利要求4和6所述的多通道微囊发生装置，其特征是连接管(2-1)的其余各管路穿过外套(8)，与外套(8)和管芯(4)间的空隙相通。
全文摘要
一种微囊化功能细胞的制备方法，取过滤除菌的微囊包裹液和生长状态良好的细胞，按比例混匀，置于多通道微囊发生装置，将细胞悬浮液喷射形成微囊，并落入收集槽中，收集微囊，处理，备用。多通道微囊发生装置包括活塞式注射泵(1)、连接管(2)(2－1)、管接头(3)、管芯(4)、压盖(5)、密封圈(6)、固定圈(7)、外套(8)、压缩气体发生器(9)。本发明方法制作过程简单、快速，制备的微囊均质性、牢固性、通透性及生物相容性好，对包裹细胞的活性影响小，通过调整相应参数可制备出不同直径大小的微囊，提供的装置结构设计合理、新颖，可有效提供应用于生物治疗的微囊化功能细胞。
文档编号C12N5/00GK1438313SQ0311571
公开日2003年8月27日 申请日期2003年3月8日 优先权日2003年3月8日
发明者郑树, 孝作祥, 潘月龙, 董琦 申请人:浙江大学医学院附属第二医院