专利名称：由在其分子中具有包含芳环的残基的烷烃制备聚羟基链烷酸酯的方法
技术领域：
本发明涉及使用取代的烷烃衍生物作为原料制备用作聚酯的聚羟基链烷酸酯(在下文中可简写为“PHA”)的方法。更具体来说，本发明涉及通过使用取代的烷烃衍生物作为原料，并使用能够在细胞中产生PHA并积聚PHA的微生物来制备PHA的方法。
背景技术：
据报道，有许多微生物在细胞中产生聚-3-羟基丁酸(在下文中可简写为“PHB”)或其它PHA，并积聚这些聚合物(“Biodegradable Plastic Handbook”，Society ofBiodegradable Plastic Research编写，N.T.S.Co.，Ltd.，pp.178-197(1995))。象常规塑料一样，这些聚合物可用于通过熔化加工等生产多种产品。此外，这些聚合物是生物可降解的，因此能由自然界中的微生物完全分解，这是很有利的。所以，与合成聚合物不同，这些聚合物不会污染环境。上述聚合物还具有优良的生物相容性。因此，预计它们可形成软医疗材料等。
已知，根据生产所用的微生物的类型、培养基组成、培养条件等，可由微生物产生的PHA具有不同组成和结构。因此，已经进行了研究来控制PHA的组成和结构，这主要是为了改善它们的物理性质。
例如，据报道，通过在培养物中使用不同的碳源，真养产碱菌(Alcaligenes eutropus)H16(ATCC No.17699)或其突变体产生具有不同组成比例的3-羟基丁酸(“3HB”)与3-羟基戊酸(“3HV”)的共聚物(日本专利出版物6-15604、7-14352和8-19227)。
日本专利出版物2642937公开了向食油假单胞菌(Pseudomonasoleovorans)ATCC 29347菌株中加入非环脂族烃作为碳源，来产生具有包含6-12个碳原子的3-羟基链烷酸酯作为单体单元的PHA。
日本专利特开平5-7492公开了一种方法，其中是将甲基杆菌属(Methylobacterium sp.)、副球菌属(Paracoccus sp.)、产碱菌属(Alcaligenes sp.)和假单胞菌属(Pseudomonas sp.)微生物与具有3-7个碳原子的伯醇接触来产生3HB和3HV的共聚物。
日本专利特开平5-93049和7-265065公开了将豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)与作为碳源的油酸和橄榄油一起培养来产生3HB与3-羟基己酸(“3HHx”)的二元共聚物。
日本专利特开平9-191893公开了将食酸丛毛单胞菌(Comamonasacidovorans)IFO 13852菌株与作为碳源的葡糖酸和1，4-丁二醇一起培养来产生具有3HB和4-羟基丁酸作为单体单元的聚酯。
上述PHA在侧链中具有烷基，即“普通PHA”。然而，考虑到可由微生物产生的PHA的广泛应用，预计具有引入到侧链中的除烷基以外的取代基例如苯基等的PHA将是有用的聚酯。其它取代基的实例包括不饱和烃、酯基、烯丙基、氰基、卤代烃、环氧化物等。特别是对具有芳环的PHA进行了充分研究。
(a)具有苯基或部分取代的苯基的PHA据Macromolecules，24，5256-5260(1991)中报道，通过使用5-苯基戊酸作为底物，食油假单胞菌产生了具有3-羟基-5-苯基戊酸作为单元的PHA。
更具体来说，其报道，通过使用5-苯基戊酸(在下文中简写为“PVA”)和壬酸作为底物(摩尔比为2∶1；总浓度为10mmol/L)，食油假单胞菌以160mg/升培养基的量(相对于细胞31.6％的干重比例)产生了含有比例为0.6∶16.0∶41.1∶1.7∶40.6的3HV、3-羟基庚酸、3-羟基壬酸、3-羟基十一烷酸和3-羟基-5-苯基戊酸(作下文中缩写为“3HPV”)作为单体单元的PHA。其还报道，通过使用PVA和辛酸作为底物(摩尔比为1∶1；总浓度为10mmol/L)，食油假单胞菌以200mg/升培养基的量(相对于细胞39.2％的干重比例)产生了含有比例为7.3∶64.5∶3.9∶24.3的3HHx、3-羟基辛酸、3-羟基癸酸和3HPV作为单体单元的PHA。
除了上述报道以外，相关描述还可参见Makromol.Chem.，191，1957-1965(1990)和Chirality，3，492-494(1991)，其中认识到了由于存在3HPV单元，聚合物物理性质发生了改变。
据Macromolecules，29，1762-1766(1996)中报道，通过使用5-(4’-甲苯基)戊酸作为底物，食油假单胞菌产生具有3-羟基-5-(4’-甲苯基)戊酸作为单元的PHA。
据Macromolecules，32，2889-2895(1999)中报道，通过使用5-(2’，4’-二硝基苯基)戊酸作为底物，食油假单胞菌产生具有3-羟基-5-(2’，4’-二硝基苯基)戊酸和3-羟基-5-(4’-硝基苯基)戊酸作为单元的PHA。
(b)含有苯氧基或部分取代的苯氧基的PHA据Macromol.Chem.Phys.，195，1665-1672(1994)中报道，通过使用11-苯氧基十一烷酸作为底物，食油假单胞菌产生3-羟基-5-苯氧基戊酸与3-羟基-9-苯氧基壬酸的PHA共聚物。
据Macromolecules，29，3432-3435(1996)中报道，食油假单胞菌由6-苯氧基己酸产生含有3-羟基-4-苯氧基正丁酸和3-羟基-6-苯氧基正己酸作为单元的PHA，由8-苯氧基辛酸产生含有3-羟基-4-苯氧基正丁酸、3-羟基-6-苯氧基正己酸和3-羟基-8-苯氧基正辛酸作为单元的PHA，以及由11-苯氧基十一烷酸产生含有3-羟基-5-苯氧基正戊酸和3-羟基-7-苯氧基正庚酸作为单元的PHA。在该报道中，摘录了聚合物的产率并如表1所示。表1
日本专利出版物2989175公开了涉及下述内容的发明由3-羟基-5-(一氟苯氧基)戊酸酯(3H5(MFP)P)或3-羟基-5-(二氟苯氧基)戊酸酯(3H5(DFP)P)组成的均聚物，由至少3H5(MFP)P或3H5(DFP)P组成的共聚物，和通过使用恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)-用于合成聚合物的假单胞菌属来产生这些聚合物的方法。
这些聚合物是通过下述两阶段培养方法制备的。
培养时间第一个阶段，24小时；第二个阶段，96小时在每个阶段使用的底物和所得聚合物如下。
(1)所得聚合物3-羟基-5-(一氟苯氧基)戊酸酯均聚物第一个阶段中的底物柠檬酸、酵母提取物第二个阶段中的底物一氟苯氧基十一烷酸(2)所得聚合物3-羟基-5-(二氟苯氧基)戊酸酯均聚物第一个阶段中的底物柠檬酸、酵母提取物第二个阶段中的底物二氟苯氧基十一烷酸(3)所得聚合物3-羟基-5-(一氟苯氧基)戊酸酯共聚物第一个阶段中的底物辛酸或壬酸、酵母提取物第二个阶段中的底物一氟苯氧基十一烷酸(4)所得聚合物3-羟基-5-(二氟苯氧基)戊酸酯共聚物第一个阶段中的底物辛酸或壬酸、酵母提取物第二个阶段中的底物二氟苯氧基十一烷酸对于效果，具有被1-2个氟原子取代的侧链末端的含有苯氧基的聚合物可通过具有取代基的中链脂肪酸的同化作用来合成，并且可给聚合物赋予立体有规性和斥水性，同时保持高熔点和良好的可加工性。
除了被氟取代的聚合物以外，还已经研究了氰基或硝基取代的聚合物。
Can.J.Microbiol.，41，32-43(1995)和PolymerInternational，39，205-213(1996)公开了含有3-羟基对氰基苯氧基己酸或3-羟基对硝基苯氧基己酸作为单体单元的PHA是通过使用食油假单胞菌ATCC 29347和恶臭假单胞菌KT 2442菌株和作为底物的辛酸以及对氰基苯氧基己酸或对硝基苯氧基己酸制得的。
与在侧链中具有烷基的一般的PHA不同，在该报道中公开的PHA在侧链中具有芳族基团，因此有利于获得具有源自芳环的物理性质的聚合物。
(c)预计具有包含环己基的单体单元的PHA会表现出不同于具有包含通常的脂族羟基链烷酸的单体单元的PHA的聚合物物理性质。Macromolecules，30，1611-1615(1997)中报道了用食油假单胞菌生产的实例。
在该报道中，将食油假单胞菌菌株在含有壬酸和环己基丁酸或环己基戊酸的培养基中培养，以获得具有包含环己基的单元和衍生自壬酸的单元(比例是未知的)的PHA。
至于产率，其报道在20mmol/L的总底物浓度条件下改变壬酸与环己基丁酸的比例，获得了如表2所示的结果。表2
CDW干的细胞重量(mg/L)，PDW干的聚合物重量(mg/L)，产率PDW/CDW(％)然而，在该实例中，每升培养基所产生的聚合物是不足的，并且所得PHA自身在单体单元中含有衍生自壬酸的脂族羟基链烷酸。
已经研究了一类新的PHA，其中产生在侧链中具有适当官能团的PHA，以便不仅简单地改变物理性质，而且还通过使用官能团产生新的官能团。
例如，据Macromolecules，31，1480-1486(1996)和Journalof Polymer SciencePart A；Polymer Chemistry，36，2381-2387(19998)中报道，合成具有在侧链末端包含乙烯基的单元的PHA，然后用氧化剂环氧化，以合成在侧链末端具有高反应性环氧基团的PHA。
预计产生高反应性的、具有包含硫化物基团而不包含乙烯基的单元的PHA的合成实例是在Macromolecules，32，8315-8318(1999)中报道的PHA，其中通过使用11-苯硫基戊酸(11-phenylsulfanylvaleric acid)作为底物，恶臭假单胞菌27N01菌株产生3-羟基-5-(苯硫基)戊酸与3一羟基-7-(苯硫基)庚酸的PHA共聚物。
如上所述，具有不同组成和结构的可由微生物产生的PHA可通过改变用于生产的微生物的类型、培养基组成以及培养条件来获得。然而，生产上述PHA仅是为了改善作为塑料的物理性质。
另一方面，由于所引入的取代基的性质，预计具有引入到侧链中的取代基的上述“不普通的PHA”可用作具有有用功能和性质的“功能高分子”。因此，据信将非常有用和重要的是，开发具有上述功能和生物可降解性的优良聚合物，能够在细胞中产生聚合物并积聚聚合物的微生物，以及有效地生产高纯度聚合物的生物合成方法。
用微生物生产具有引入到侧链中的任何各种基团的“不普通的PHA”，即具有式(7)所代表的单体单元的PHA的方法一般包括，化学合成具有欲引入的取代基的式(8)所代表的取代的脂肪酸，将所述脂肪酸提供给微生物以进行培养，然后提取所产生的PHA，例如在上述关于食油假单胞菌的实例报道中公开的方法。
其中R代表至少一个选自具有芳环的残基的残基，且r代表1-8的任何整数。
其中R代表至少一个选自具有芳环的残基的残基，且r代表1-8的任何整数。
然而，在包括化学合成作为底物的取代的脂肪酸并将该取代的脂肪酸提供给微生物的上述一般PHA制备方法中，取代的脂肪酸的羧基是化学反应中的活性基团，因此脂肪酸的化学合成受到了所引入的取代基的类型、数目和位置的很大限制。所以经常需要在化学合成的反应步骤中将活性羧基保护起来，和将羧基脱保护这样的复杂操作，并因此需要包括几个步骤的化学反应。因此工业生产水平上的合成很困难，或者合成需要大量时间、劳动和成本。
然而，如果“不普通的PHA”可通过使用与取代的脂肪酸相比更易于化学合成的取代的烷烃作为原料制得，则可以解决上述问题。
由烷烃衍生物制备PHA的常规实例包括使用下述物质作为原料通过微生物来生物合成PHA的实例直链烷烃和烯烃(含有双键的烷烃)(Appl.Environ.Microbiol.，54，2924-2923(1988))、氯代烷烃(Macromolecules，23，3705-3707(1990))、氟代烷烃(Biotechnol.Lett.，16，501-506(1994))和含有乙酰氧基残基的烷烃(Macromolecules，33，8571-8575(2000))。没有关于使用具有包含芳环作为取代基的残基的烷烃来合成PHA的实例的报道。
发明内容
为了开发使用与取代的脂肪酸相比易于合成或获得的原料制备“不普通的PHA”的方法，本发明人们进行了悉心的研究，结果发现，“不普通的PHA”可通过使用与取代的脂肪酸相比易于化学合成的取代的烷烃作为原料制得。该发现导致获得了使用取代的烷烃制备PHA的新方法。
本发明的使用微生物制备聚羟基链烷酸酯的方法包括将能够产生聚羟基链烷酸酯的微生物在包含至少一种选自式(1)所代表的取代的烷烃的原料化合物的培养基中培养，以产生在其分子中具有至少一个选自式(2)所代表的3-羟基取代的链烷酸酯单元的单元的聚羟基链烷酸酯
R-(CH2)n-CH2-CH2-CH3(1)其中R代表含有取代的芳环的残基，且n代表1-8的任何整数； 其中R代表含有取代的芳环的残基，且m代表1-8的任何整数。
在式(1)和(2)中，含有取代的芳环的残基R是至少一个选自下列的残基式(3)所代表的取代的苯硫基残基和式(4)所代表的(取代的苯基甲基)硫基残基 其中R1代表芳环的取代基，并选自H原子、卤素原子、CN、NO2、CH3、C2H5、CH3CH2CH2、(CH3)2CH和(CH3)3C； 其中R2代表芳环的取代基，并选自H原子、卤素原子、CN、NO2、CH3、C2H5、CH3CH2CH2、(CH3)2CH和(CH3)3C。
通过下面结合附图的优选实施方案的描述，本发明的其它目的、特征和优点将变得显而易见。
附图简述附
图1是表明在本发明的实施例1中制得的聚羟基链烷酸酯的1H-NMR光谱的图。
具体实施例方式
作为在本发明中用作原料化合物的化合物的第一个实例，至少一种化合物选自式(9)所代表的1-[(取代的苯基)硫基]烷烃。在这种情况下，制得了在其分子中具有至少一个选自式(10)所代表的3-羟基-ω-[(取代的苯基)硫基]链烷酸酯单元的聚羟基链烷酸酯。
其中R1代表芳环的至少一个取代基，并选自H原子、卤素原子、CN、NO2、CH3、C2H5、CH3CH2CH2、(CH3)2CH和(CH3)3C，且n代表1-8的任何整数。
其中R1代表芳环的至少一个取代基，并选自H原子、卤素原子、CN、NO2、CH3、C2H5、CH3CH2CH2、(CH3)2CH和(CH3)3C，且m代表1-8的任何整数。
作为在本发明中用作原料化合物的化合物的第二个实例，至少一种化合物选自式(11)所代表的1-{[(取代的苯基)甲基]硫基}烷烃。在这种情况下，制得了在其分子中具有至少一个选自式(12)所代表的3-羟基-ω-{[(取代的苯基)甲基]硫基}链烷酸酯单元的聚羟基链烷酸酯。
其中R2代表芳环的至少一个取代基，并选自H原子、卤素原子、CN、NO2、CH3、C2H5、CH3CH2CH2、(CH3)2CH和(CH3)3C，且n代表1-8的任何整数。
其中R2代表芳环的至少一个取代基，并选自H原子、卤素原子、CN、NO2、CH3、C2H5、CH3CH2CH2、(CH3)2CH和(CH3)3C，且m代表1-8的任何整数。
下面详细地描述本发明方法。本发明制备方法包括这样一个步骤将微生物在含有至少一种式(9)和(11)所代表的化合物的培养基中培养，以产生在其分子中具有至少一个式(10)和(12)所代表的3-羟基链烷酸单元的聚羟基链烷酸酯。
在包括培养微生物的步骤，即用微生物产生聚羟基链烷酸酯的步骤的上述制备方法中，式(9)或(11)所代表原料的亚甲基链长度“h”和存在于通过本发明方法制得的聚羟基链烷酸酯分子中的式(10)或(12)所代表单元的亚甲基侧链长度“m”具有下述关系(1)m＝n-21...(1)其中1是0≤1＜(1/2)n的任何整数。
例如，当使用式(13)所代表的7-(苯硫基)庚烷作为原料时，所制得的聚羟基链烷酸酯具有式(14)所代表的3-羟基-7-(苯硫基)庚酸单元和式(15)所代表的3-羟基-5-(苯硫基)戊酸单元。
通过本发明方法制得的PHA可在其聚合物分子中含有至少一个式(5)所代表的3-羟基链烷酸单元 其中p代表0-8的任何整数，且p在聚合物中可以是一个或多个值，或式(6)所代表的3-羟基烷-5-烯酸单元(6) 其中q代表3-5的任何整数，且q在聚合物中可以是一个或多个值。
通过本发明方法制得的PHA的数均分子量为约5000-1000000。
下面描述本发明中的微生物、培养步骤和收集步骤。
微生物作为本发明方法中使用的微生物，可使用任何微生物，只要满足下述条件即可通过使用具有式(3)或(4)所代表的含有取代的芳环的残基的式(1)所代表的取代的烷烃作为原料，即底物原料，可产生在其分子中具有式(2)所代表的3-羟基取代的链烷酸酯单元，并且所述单元的侧链中包含式(3)或(4)所代表的具有芳环的残基的聚羟基链烷酸酯。依据该要求，可以使用可实现本发明目的的多种类型的微生物。
在本发明方法中使用的微生物需要至少具有将烷烃转化成链烷酸的能力，以及还具有由链烷酸产生PHA的能力。将烷烃转化成链烷酸的能力一般是由使用烷烃单加氧酶作为引发酶的一组酶体系表现出来的。
假单胞菌属微生物已知是用于本发明中的微生物。更具体来说，微生物的实例包括由土壤中分离出来的微生物，例如在日本专利特开平2002-178484中公开的菊苣假单胞菌(Pseudomonas cichorii)YN2菌株，和在日本专利特开平63-226291中公开的食油假单胞菌ATCC 29347。所述YN菌株于1999年6月3日保藏在国立生命科学与人体技术研究所，日本茨城县筑波市东1丁目1番3号(邮编306-8566)，保藏号为FERM BP-7375。
培养步骤在本发明制备聚羟基链烷酸酯(PHA)的方法的培养步骤中，在其分子中具有至少一个选自式(2)所代表的3-羟基取代的链烷酸酯单元的单元的聚羟基链烷酸酯是通过使用能够产生聚羟基链烷酸酯的微生物，由至少一种选自式(1)所代表的取代的烷烃的取代的烷烃产生的。
为了正常地培养在培养步骤中使用的微生物，例如为了制备原料菌株并增殖微生物以获得产生PHA所需的微生物数目并保证其活性状态，适当地选择含有增殖所用微生物所必需的组分的培养基。例如，可以使用任何培养基，例如一般的天然培养基(肉汤培养基、酵母提取物等)、含有营养源的合成培养基等，只要培养基对微生物的生长和存活没有任何不利影响即可。依据所用的微生物适当地选择温度、换气、搅拌等培养条件。
另一方面，在使用上述产生PHA的微生物产生在其分子中具有至少一个选自式(1)所代表的3-羟基取代的链烷酸酯单元的单元的目标PHA的培养步骤中，可使用无机培养基，所述培养基含有至少一种选自相当于单体单元的式(1)所代表的取代的烷烃的取代的烷烃作为产生PHA的原料和用于增殖微生物的碳源。至少一种式(1)所代表且用作原料的取代的烷烃的初始含量优选为占培养基的0.01％-1％(v/v)、更优选为0.02％-0.2％(v/v)。
作为培养步骤，制备方法可包括在作为烷烃氧化系统诱导物质的二环丙基酮存在下培养微生物的步骤。通常已知的是，烷烃氧化系统是由用作代谢途径底物的直链烷烃例如辛烷、壬烷等有效地诱导的。然而，当使用上述直链烷烃作为诱导物质时，必须小心中链脂肪酸PHA单元在所生成的PHA中的比例增加这一现象。这是因为直链烷烃被烷烃氧化系统转化成直链链烷酸，并经由β氧化系统变成PHA单体底物。
用作本发明单体底物的取代的烷烃还可以诱导烷烃氧化系统，并且可作为象直链烷烃的PHA单体单元引入。已经开发了烷烃氧化系统作为直链烷烃的代谢系统，但是用于本发明的取代的烷烃在某些情况下不足以诱导烷烃氧化系统。
虽然二环丙基酮在烷烃氧化系统中起诱导物质的功能，其不会变成氧化系统的底物(其不被烷烃单加氧酶氧化)。即，已知二环丙基酮已知是不可代谢的诱导物质(Journal of Bacteriology，123，546-556(1975))。因此，在本发明制备方法中，当烷烃氧化系统受诱导不足时，或当希望进一步改善激活时，或者当希望中链脂肪酸PHA单元在目标PHA中的比例较低时，二环丙基酮可用作烷烃氧化系统的优选诱导物质。在这种情况下，烷烃氧化系统是通过二环丙基酮有效地诱导，并且底物代谢被完全利用以转化用于本发明的取代的烷烃。结果可有效地生成源自取代的烷烃的单体单元，从而提高PHA产率以及源自取代的烷烃的单体单元的比例。
二环丙基酮可以与用于本发明的取代的烷烃一起加到培养基中，或者单独加到培养基中。在这种情况下，二环丙基酮的含量可依据条件例如培养基中增殖底物的类型、存在的取代的烷烃、取代的烷烃的浓度、培养类型(单阶段培养或多阶段培养)、多阶段培养的阶段数目等适当地选择。其含量优选为占每升培养基的0.001％-1％(v/v)、更优选为0.01％-0.1％(v/v)。
式(1)所代表且用作原料的取代的烷烃一般是疏水性的，并因此无需具有高的水溶解度。然而，上述微生物具有将其中取代的烷烃用作底物的性质，因此即使当取代的烷烃的量超过其溶解度从而在培养的初始阶段产生部分悬浮液部分时，在连续的培养期间，取代的烷烃也能逐渐被微生物吸收，从而逐渐溶解在培养基中，所以不会有任何问题。而且，微生物分泌表面活性剂样物质以将取代的烷烃有效地吸收，因此有助于被用作底物的取代的烷烃的摄取。
为了改善可分散性，根据具体情况，可将式(1)所代表且用作原料的取代的烷烃溶解在溶剂例如1-十六碳烯或正十六碳烷中，或者可作为细分散的悬浮液加到培养基中。在这种情况下，溶剂例如1-十六碳烯或正十六碳烷的浓度必须是3％(v/v)或更低，其中所述百分比是相对于培养基计的。
此外，将由微生物用于增殖的增殖底物单独加入到培养基中。作为增殖底物，可使用营养物如酵母提取物、蛋白胨或肉提取物。同样，作为有用碳源，增殖底物可适当地选自糖类、在TCA循环中作为中间物产生的有机酸、在TCA循环中由单阶段或二阶段生化反应产生的有机酸或其盐、氨基酸或其盐、具有4-12个碳原子的直链烷烃或其盐，等等。它们的选择依所用菌株而定。
作为这些增殖底物的糖类，至少一种化合物优选选自醛糖例如甘油醛、赤藓糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖等；糖醇例如甘油、赤藓醇、木糖醇等；醛糖酸例如葡糖酸等；醛糖酸例如葡糖酸等；糖醛酸例如葡糖醛酸、半乳糖醛酸等；二糖例如麦芽糖、蔗糖、乳糖等。
作为有机酸或其盐，至少一种化合物优选选自丙酮酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸、琥珀酸及其盐。作为氨基酸或其盐，至少一种化合物优选选自谷氨酸、天冬氨酸及其盐。
在多种增殖底物当中，优选使用多胨(polypeptone)或糖类，特别是，至少一种化合物优选选自葡萄糖、果糖和甘露糖，并用作所述糖类。增殖底物的含量优选为占培养基的0.1％-5％(w/v)、更优选为0.2％-2％(w/v)。
进行在微生物中产生和积聚PHA的培养步骤的另一方法包括将微生物充分增殖，将细胞转移到其中限制了氮源例如氯化铵的培养基中，然后将细胞在含有作为目标单元的底物加入的化合物的培养基中进一步培养。在该方法中可提高生产率。例如，可使用包括在不同培养条件下进行的多个步骤的多步骤系统。
更具体来说，优选的两步培养法包括将微生物在含有式(1)所代表的取代的烷烃和多胨作为碳源的培养基中培养直至达到指数生长后期或稳定期，并通过离心收集细胞的步骤1-1，和将在前一步骤1-1中培养和增殖的微生物细胞在含有式(1)所代表的取代的烷烃以及有机酸或其盐作为碳源，且不含氮源的培养基中进一步培养的步骤1-2。另一优选的两步培养法包括将微生物在含有式(1)所代表的取代的烷烃和葡萄糖作为碳源的培养基中培养直至达到指数生长后期或稳定期，并通过离心收集细胞的步骤1-3，和将在前一步骤1-3中培养和增殖的微生物细胞在含有式(1)所代表的取代的烷烃以及葡萄糖作为碳源，且不含氮源的培养基中进一步培养的步骤1-4。另一优选的两步培养法包括将微生物在含有式(1)所代表的取代的烷烃和多胨作为碳源的培养基中培养直至达到指数生长后期或稳定期，并通过离心收集细胞的步骤1-5，和将在前一步骤1-5中培养和增殖的微生物细胞在含有式(1)所代表的取代的烷烃和糖类作为碳源，且不含氮源的培养基中进一步培养的步骤1-6。
在每一个这些两步培养法中，在第一个步骤，由式(1)所代表且在细胞增殖期间用作原料的相应的取代的烷烃产生在其分子中含有至少一个选自式(2)所代表的3-羟基取代的链烷酸酯单元的单元的PHA。然后在第二个步骤中，将培养的细胞置于主要用于在不含氮源的培养基中产生PHA的培养条件下，由此进一步增加PHA在细胞中积聚的量。
作为有效地诱导包含烷烃单加氧酶作为引发酶的烷烃氧化途径的物质的二环丙基酮可在步骤1-1和1-2、步骤1-3和1-4或步骤1-5和1-6当中的至少一个步骤中加入，以有效地促进取代的烷烃代谢来产生相应的取代的链烷酸，由此提高PHA产率和目标PHA单体单元的比例。
此外，在主要诱导烷烃氧化系统的第一个培养步骤，即步骤1-1、步骤1-3或步骤1-5中，可单独加入二环丙基酮以代替取代的烷烃。
在培养步骤中，可将温度设定为足以增殖菌株的温度。例如，培养温度适当地为15℃-40℃、更优选为20℃-35℃、最优选为20℃-30℃。
可使用任一种液体培养方法、固体培养方法等，只要所用的微生物可以增殖以由至少一种选自式(1)所代表的取代的烷烃且用作包含在培养基中的原料的取代的烷烃产生在其分子中含有至少一个选自式(2)所代表的3-羟基取代链烷酸酯单元的单元的PHA即可。此外，可使用任一种分批培养、补料分批培养、半连续培养、连续培养等，只要适当地供给原料、碳源和氧即可。液体分批培养方法的实例包括其中通过摇动摇瓶来供氧的方法，和其中在使用广口瓶发酵器的搅拌加气系统中供氧的方法。
作为用于培养方法的无机培养基，可使用任何培养基，只要其含有增殖微生物所必需的组分即可，例如磷源(例如磷酸盐等)、氮源(例如铵盐、硝酸盐等)等。例如可使用MSB培养基或M9培养基。
下面描述用于本发明方法中的M9培养基的组成。
Na2HPO46.2g
KH2PO43.0gNaCl0.5gNH4Cl 1.0g(每升培养基，pH7.0)为了进一步改善增殖和PHA产量，例如必须加入约0.3％(v/v)的下述微量组分溶液以补偿必需的微量元素。
(微量组分溶液)氨三乙酸 1.5gMgSO43.0gMnSO40.5gNaCl 1.0gFeSO40.1gCaCl20.1gCoCl20.1gZnSO40.1gCuSO40.1gAlK(SO4)20.1gH3BO30.1gNa2MoO40.1gNiCl20.1g(每升微量组分溶液，pH7.0)作为上述培养方法，可使用用于培养微生物的任一常规方法，例如成批培养、流动成批培养、半连续培养、连续培养、反应器系统培养、固体培养等。
提取/纯化步骤依据本发明，可使用任何常规方法来从产生并积聚PHA的微生物细胞中获得PHA。通过用有机溶剂提取来从培养的微生物细胞中回收PHA是最简单的方法。有机溶剂的实例包括氯仿、二氯甲烷、丙酮、二氧杂环己烷、四氢呋喃、乙腈等。
在其中难以使用有机溶剂的环境中，可使用化学处理方法。
在这种情况下，可通过用下述物质处理将除PHA之外的细胞组分除去来回收PHA表面活性剂例如SDS等；酶例如溶菌酶等；或化学物质例如EDTA、氨等。还可以通过用次氯酸钠将除PHA之外的细胞组分除去来回收PHA，但是结构可能发生改变。此外，可通过物理破碎微生物细胞将除PHA之外的细胞组分除去来回收PHA。在这种情况下，可使用任一种方法例如超声破碎法、匀化器法、压力破碎法、玻珠冲击法、研制法、研磨法和冷冻融解法。
在本发明中，微生物培养、使用微生物产生PHA、PHA在细胞中积聚和从细胞中回收PHA不限于上述方法。
实施例下面描述本发明的实施例。在下面的描述中，除非另有说明，否则“％”是按重量计的。
实施例1制备含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器除菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将菊苣假单胞菌YN2菌株接种到培养基中之后以125次冲程/分钟的速度在30℃培养。48小时后，通过离心收集细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥。
将冷冻干燥的离心团悬浮在20mL氯仿中，在60℃搅拌20小时以提取PHA。将所得提取物经由孔径为0.45μm的膜滤器过滤，用旋转蒸发仪浓缩，然后将浓缩的溶液在冷的甲醇中再沉淀。此外，仅回收沉淀物，然后真空干燥，获得了96mg PHA。
通过凝胶渗透色谱法(GPC；Toso HLC-8220，柱；Toso TSK-GELSuper HM-H，溶剂；氯仿，聚苯乙烯转化)测定由此获得的PHA的分子量。结果是Mn＝125000，且Mw＝278000。用核磁共振仪在下列测定条件下分析PHA<测定仪器>FT-NMRBruker DPX400
共振频率1H＝400MHz<测定仪器>测定核种类1H所用溶剂CDCl3参照物毛细管密封的TMS/CDCl3测定温度室温附图1是1H-NMR光谱图，表3显示了鉴定结果(称为式(16)) 表3化学位移(ppm)积分比例分裂类型鉴定结果1.872H m d2.41-2.56 2H m b2.78-2.91 2H m e5.251H m c6.93-7.14 2H m i7.20-7.45 5H m g，h，j，k
如表3所示，证实了PHA是含有97％的3-羟基-5-(苯硫基)戊酸单元和包含具有4-12个碳原子的饱和或不饱和3-羟基链烷酸的其它单元的PHA。
实施例2制备含有0.5％(w/v)多胨的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器灭菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将菊苣假单胞菌YN2菌株接种到培养基中，并以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动培养物。48小时后，通过离心收集细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥。
将冷冻干燥的离心团悬浮在20mL氯仿中，在60℃搅拌20小时以提取PHA。将所得提取物经由孔径为0.45μm的膜滤器过滤，用旋转蒸发仪浓缩，然后将浓缩的溶液在冷的甲醇中再沉淀。此外，仅回收沉淀物，然后真空干燥，获得了52mg PHA。
通过按照与实施例1所述相同的方法进行的GPC分析测定由此获得的PHA的分子量。结果是Mn＝135000，且Mw＝324000。按照与实施例1所述相同的方法进行的PHA的1H-NMR分析的结果证实了所得PHA含有63％的3-羟基-5-(苯硫基)戊酸单元和包含具有4-12个碳原子的饱和或不饱和3-羟基链烷酸的其它单元。
实施例3制备含有0.5％(w/v)谷氨酸钠的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器灭菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将菊苣假单胞菌YN2菌株接种到培养基中，之后通过以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动来进行培养。48小时后，通过离心收集细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥。
将冷冻干燥的离心团悬浮在20mL氯仿中，在60℃搅拌20小时以提取PHA。将所得提取物经由孔径为0.45μm的膜滤器过滤，用旋转蒸发仪浓缩，然后将浓缩的溶液在冷的甲醇中再沉淀。此外，仅回收沉淀物，然后真空干燥，获得了200mg PHA。
通过按照与实施例1所述相同的方法进行的GPC分析测定由此获得的PHA的分子量。结果是Mn＝122000，且Mw＝278000。按照与实施例1所述相同的方法进行的PHA的1H-NMR分析的结果证实了所得PHA含有10％的3-羟基-5-(苯硫基)戊酸单元和包含具有4-12个碳原子的饱和或不饱和3-羟基链烷酸的其它单元。
实施例4制备含有0.1％(v/v)壬酸的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器灭菌的1-(苯硫基)戊烷0.1％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将菊苣假单胞菌YN2菌株接种到培养基中，通过以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动来进行培养。48小时后，通过离心收集细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥。
将冷冻干燥的离心团悬浮在20mL氯仿中，在60℃搅拌20小时以提取PHA。将所得提取物经由孔径为0.45μm的膜滤器过滤，用旋转蒸发仪浓缩，然后将浓缩的溶液在冷的甲醇中再沉淀。此外，仅回收沉淀物，然后真空干燥，获得了70mg PHA。
通过按照与实施例1所述相同的方法进行的GPC分析测定由此获得的PHA的分子量。结果是Mn＝135000，且Mw＝324000。按照与实施例1所述相同的方法进行的PHA的1H-NMR分析的结果证实了所得PHA含有8％的3-羟基-5-(苯硫基)戊酸单元和包含具有4-12个碳原子的饱和或不饱和3-羟基链烷酸的其它单元。
实施例5制备含有0.5％(w/v)酵母提取物的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器灭菌的1-(苯硫基)戊烷0.1％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将菊苣假单胞菌YN2菌株接种到培养基中，之后通过以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动来进行培养。48小时后，通过离心收集细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥。
将冷冻干燥的离心团悬浮在20mL氯仿中，在60℃搅拌20小时以提取PHA。将所得提取物经由孔径为0.45μm的膜滤器过滤，用旋转蒸发仪浓缩，然后将浓缩的溶液在冷的甲醇中再沉淀。此外，仅回收沉淀物，然后真空干燥，获得了45mg PHA。
通过按照与实施例1所述相同的方法进行的GPC分析测定由此获得的PHA的分子量。结果是Mn＝138000，且Mw＝331000。按照与实施例1所述相同的方法进行的PHA的1H-NMR分析的结果证实了所得PHA含有61％的3-羟基-5-(苯硫基)戊酸单元和包括具有4-12个碳原子的饱和/不饱和3-羟基链烷酸的其它单元。
实施例6制备含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器灭菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将菊苣假单胞菌YN2菌株接种到培养基中，之后通过以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动来进行培养。当培养基在600nm的浊度为0.1时，将二环丙基酮以0.05％(v/v)的比例加到培养基中，并充分搅拌。在摇动下继续培养90小时后，通过离心收集细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥。
将冷冻干燥的离心团悬浮在20mL氯仿中，在60℃搅拌20小时以提取PHA。将所得提取物经由孔径为0.45μm的膜滤器过滤，用旋转蒸发仪浓缩，然后将浓缩的溶液在冷的甲醇中再沉淀。此外，仅回收沉淀物，然后真空干燥，获得了65mg PHA。
通过按照与实施例1所述相同的方法进行的GPC分析测定由此获得的PHA的分子量。结果是Mn＝121000，且Mw＝281000。按照与实施例1所述相同的方法进行的PHA的1H-NMR分析的结果证实了所得PHA含有92％的3-羟基-5-(苯硫基)戊酸单元和包含具有4-12个碳原子的饱和或不饱和3-羟基链烷酸的其它单元。
实施例7制备含有0.5％(w/v)多胨的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器灭菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将菊苣假单胞菌YN2菌株接种到培养基中，之后通过以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动来进行培养。当培养基在600nm的浊度为0.1时，将二环丙基酮以0.05％(v/v)的比例加到培养基中，并充分搅拌。在摇动下继续培养48小时后，通过离心收集细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥。
将冷冻干燥的离心团悬浮在20mL氯仿中，在60℃搅拌20小时以提取PHA。将所得提取物经由孔径为0.45μm的膜滤器过滤，用旋转蒸发仪浓缩，然后将浓缩的溶液在冷的甲醇中再沉淀。此外，仅回收沉淀物，然后真空干燥，获得了58mg PHA。
通过按照与实施例1所述相同的方法进行的GPC分析测定由此获得的PHA的分子量。结果是Mn＝108000，且Mw＝245000。按照与实施例1所述相同的方法进行的PHA的1H-NMR分析的结果证实了所得PHA含有70％的3-羟基-5-(苯硫基)戊酸单元和包含具有4-12个碳原子的饱和或不饱和3-羟基链烷酸的其它单元。
实施例8制备含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器灭菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将菊苣假单胞菌YN2菌株接种到培养基中，以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动培养物。90小时后，通过离心收集细胞。
然后，制备含有0.5％(w/v)葡萄糖、并且不含作为氮源的NH4Cl的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器灭菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将收集的细胞再悬浮在该培养基中，以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动培养物。90小时后，通过离心收集细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥。
将冷冻干燥的离心团悬浮在20mL氯仿中，在60℃搅拌20小时以提取PHA。将所得提取物经由孔径为0.45μm的膜滤器过滤，用旋转蒸发仪浓缩，然后将浓缩的溶液在冷的甲醇中再沉淀。此外，仅回收沉淀物，然后真空干燥，获得了125mg PHA。
通过按照与实施例1所述相同的方法进行的GPC分析测定由此获得的PHA的分子量。结果是Mn＝125000，且Mw＝272000。按照与实施例1所述相同的方法进行的PHA的1H-NMR分析的结果证实了所得PHA含有87％的3-羟基-5-(苯硫基)戊酸单元和包含具有4-12个碳原子的饱和或不饱和3-羟基链烷酸的其它单元。
实施例9制备含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器灭菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将菊苣假单胞菌YN2菌株接种到培养基中，通过以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动来进行培养。90小时后，通过离心收集细胞。
然后，制备含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，并通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，向该培养基中加入用滤器灭菌的1-(苯硫基)戊烷以使得其浓度为0.1％(v/v)，并充分搅拌。然后将收集的细胞再悬浮在该培养基中，通过以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动来进行培养。90小时后，通过离心收集细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥。
将冷冻干燥的离心团悬浮在20mL氯仿中，在60℃搅拌20小时以提取PHA。将所得提取物经由孔径为0.45μm的膜滤器过滤，用旋转蒸发仪浓缩，然后将浓缩的溶液在冷的甲醇中再沉淀。此外，仅回收沉淀物，然后真空干燥，获得了147mg PHA。
通过按照与实施例1所述相同的方法进行的GPC分析测定由此获得的PHA的分子量。结果是Mn＝129000，且Mw＝286000。按照与实施例1所述相同的方法进行的PHA的1H-NMR分析的结果证实了所得PHA含有89％的3-羟基-5-(苯硫基)戊酸单元和包含具有4-12个碳原子的饱和或不饱和3-羟基链烷酸的其它单元。
实施例10制备含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器灭菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将菊苣假单胞菌YN2菌株接种到培养基中，以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动培养物。90小时后，通过离心收集细胞。
然后，制备不含作为氮源的NH4Cl的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器灭菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将收集的细胞再悬浮在该培养基中，以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动培养物。90小时后，通过离心收集细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥。
将冷冻干燥的离心团悬浮在20mL氯仿中，在60℃搅拌20小时以提取PHA。将所得提取物经由孔径为0.45μm的膜滤器过滤，用旋转蒸发仪浓缩，然后将浓缩的溶液在冷的甲醇中再沉淀。此外，仅回收沉淀物，然后真空干燥，获得了70mg PHA。
通过按照与实施例1所述相同的方法进行的GPC分析测定由此获得的PHA的分子量。结果是Mn＝138000，且Mw＝298000。按照与实施例1所述相同的方法进行的PHA的1H-NMR分析的结果证实了所得PHA含有96％的3-羟基-5-(苯硫基)戊酸单元和包含具有4-12个碳原子的饱和或不饱和3-羟基链烷酸的其它单元。
实施例11制备含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器灭菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将菊苣假单胞菌YN2菌株接种到培养基中，通过以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动来进行培养。当培养基在600nm的浊度为0.1时，将二环丙基酮以0.05％(v/v)的比例加到培养基中，并充分搅拌。在摇动下继续培养14小时后，通过离心收集细胞。
然后，制备含有0.5％(w/v)葡萄糖、并且不含作为氮源的NH4Cl的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器灭菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例和二环丙基酮以0.05％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将收集的细胞再悬浮在该培养基中，之后通过以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动来进行培养。90小时后，通过离心收集细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥。
将冷冻干燥的离心团悬浮在20mL氯仿中，在60℃搅拌20小时以提取PHA。将所得提取物经由孔径为0.45μm的膜滤器过滤，用旋转蒸发仪浓缩，然后将浓缩的溶液在冷的甲醇中再沉淀。此外，仅回收沉淀物，然后真空干燥，获得了8mg PHA。
通过按照与实施例1所述相同的方法进行的GPC分析测定由此获得的PHA的分子量。结果是Mn＝128000，且Mw＝278000。按照与实施例1所述相同的方法进行的PHA的1H-NMR分析的结果证实了所得PHA含有94％的3-羟基-5-(苯硫基)戊酸单元和包含具有4-12个碳原子的饱和或不饱和3-羟基链烷酸的其它单元。
实施例12制备含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器灭菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将菊苣假单胞菌YN2菌株接种到培养基中，通过以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动来进行培养。当培养基在600nm的浊度为0.1时，将二环丙基酮以0.05％(v/v)的比例加到培养基中，并充分搅拌。在摇动下继续培养14小时后，通过离心收集细胞。
然后，制备含有0.5％(w/v)葡萄糖、并且不含作为氮源的NH4Cl的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器灭菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将收集的细胞再悬浮在该培养基中，之后通过以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动来进行培养。90小时后，通过离心收集细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥。
将冷冻干燥的离心团悬浮在20mL氯仿中，在60℃搅拌20小时以提取PHA。将所得提取物经由孔径为0.45μm的膜滤器过滤，用旋转蒸发仪浓缩，然后将浓缩的溶液在冷的甲醇中再沉淀。此外，仅回收沉淀物，然后真空干燥，获得了14mg PHA。
通过按照与实施例1所述相同的方法进行的GPC分析测定由此获得的PHA的分子量。结果是Mn＝125000，且Mw＝282000。按照与实施例1所述相同的方法进行的PHA的1H-NMR分析的结果证实了所得PHA含有88％的3-羟基-5-(苯硫基)戊酸单元和包含具有4-12个碳原子的饱和或不饱和3-羟基链烷酸的其它单元。
实施例13制备含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器灭菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将菊苣假单胞菌YN2菌株接种到培养基中，通过以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动来进行培养。当培养基在600nm的浊度为0.1时，将二环丙基酮以0.05％(v/v)的比例加到培养基中，并充分搅拌。在摇动下继续培养14小时后，通过离心收集细胞。
然后，制备含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器灭菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将收集的细胞再悬浮在该培养基中，之后通过以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动来进行培养。90小时后，通过离心收集细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥。
将冷冻干燥的离心团悬浮在20mL氯仿中，在60℃搅拌20小时以提取PHA。将所得提取物经由孔径为0.45μm的膜滤器过滤，用旋转蒸发仪浓缩，然后将浓缩的溶液在冷的甲醇中再沉淀。此外，仅回收沉淀物，然后真空干燥，获得了90mg PHA。
通过按照与实施例1所述相同的方法进行的GPC分析测定由此获得的PHA的分子量。结果是Mn＝138000，且Mw＝298000。按照与实施例1所述相同的方法进行的PHA的1H-NMR分析的结果证实了所得PHA含有90％的3-羟基-5-(苯硫基)戊酸单元和包含具有4-12个碳原子的饱和或不饱和3-羟基链烷酸的其它单元。
实施例14制备含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将菊苣假单胞菌YN2菌株接种到培养基中，以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动培养物。当培养基在600nm的浊度为0.1时，将二环丙基酮以0.05％(v/v)的比例加到培养基中，并充分搅拌。在摇动下继续培养14小时后，通过离心收集细胞。
然后，制备含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器灭菌的1-(苯硫基)戊烷0.1％(v/v)的比例和二环丙基酮以0.05％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将收集的细胞再悬浮在该培养基中，之后通过以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动来进行培养。90小时后，通过离心收集细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥。
将冷冻干燥的离心团悬浮在20mL氯仿中，在60℃搅拌20小时以提取PHA。将所得提取物经由孔径为0.45μm的膜滤器过滤，用旋转蒸发仪浓缩，然后将浓缩的溶液在冷的甲醇中再沉淀。此外，仅回收沉淀物，然后真空干燥，获得了51mg PHA。
通过按照与实施例1所述相同的方法进行的GPC分析测定由此获得的PHA的分子量。结果是Mn＝121000，且Mw＝283000。按照与实施例1所述相同的方法进行的PHA的1H-NMR分析的结果证实了所得PHA含有80％的3-羟基-5-(苯硫基)戊酸单元和包含具有4-12个碳原子的饱和或不饱和3-羟基链烷酸的其它单元。
实施例15制备含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将菊苣假单胞菌YN2菌株接种到培养基中，以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动培养物。当培养基在600nm的浊度为0.1时，将二环丙基酮以0.05％(v/v)的比例加到培养基中，并充分搅拌。在摇动下继续培养14小时后，通过离心收集细胞。
然后，制备含有0.5％(w/v)葡萄糖、并且不含有作为氮源的NH4Cl的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器灭菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将收集的细胞再悬浮在该培养基中，以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动培养物。90小时后，通过离心收集细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥。
将冷冻干燥的离心团悬浮在20mL氯仿中，在60℃搅拌20小时以提取PHA。将所得提取物经由孔径为0.45μm的膜滤器过滤，用旋转蒸发仪浓缩，然后将浓缩的溶液在冷的甲醇中再沉淀。此外，仅回收沉淀物，然后真空干燥，获得了14mg PHA。
通过按照与实施例1所述相同的方法进行的GPC分析测定由此获得的PHA的分子量。结果是Mn＝119000，且Mw＝245000。按照与实施例1所述相同的方法进行的PHA的1H-NMR分析的结果证实了所得PHA含有89％的3-羟基-5-(苯硫基)戊酸单元和包含具有4-12个碳原子的饱和或不饱和3-羟基链烷酸的其它单元。
实施例16制备含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将菊苣假单胞菌YN2菌株接种到培养基中，之后通过以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动来进行培养。当培养基在600nm的浊度为0.1时，将二环丙基酮以0.05％(v/v)的比例加到培养基中，并充分搅拌。在摇动下培养14小时后，通过离心收集细胞。
然后，制备含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器灭菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将收集的细胞再悬浮在该培养基中，之后通过以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动来进行培养。90小时后，通过离心收集细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥。
将冷冻干燥的离心团悬浮在20mL氯仿中，在60℃搅拌20小时以提取PHA。将所得提取物经由孔径为0.45μm的膜滤器过滤，用旋转蒸发仪浓缩，然后将浓缩的溶液在冷的甲醇中再沉淀。此外，仅回收沉淀物，然后真空干燥，获得了65mg PHA。
通过按照与实施例1所述相同的方法进行的GPC分析测定由此获得的PHA的分子量。结果是Mn＝137000，且Mw＝299000。按照与实施例1所述相同的方法进行的PHA的1H-NMR分析的结果证实了所得PHA含有72％的3-羟基-5-(苯硫基)戊酸单元和包含具有4-12个碳原子的饱和或不饱和3-羟基链烷酸的其它单元。
实施例17制备含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器灭菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将菊苣假单胞菌YN2菌株接种到培养基中，以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动培养物。当培养基在600nm的浊度为0.1时，将二环丙基酮以0.05％(v/v)的比例加到培养基中，并充分搅拌。在摇动下继续培养14小时后，通过离心收集细胞。
然后，制备含有0.5％(w/v)葡萄糖、并且不含有作为氮源的NH4Cl的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器灭菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例和二环丙基酮以0.05％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将收集的细胞再悬浮在该培养基中，以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动培养物。90小时后，通过离心收集细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥。
将冷冻干燥的离心团悬浮在20mL氯仿中，在60℃搅拌20小时以提取PHA。将所得提取物经由孔径为0.45μm的膜滤器过滤，用旋转蒸发仪浓缩，然后将浓缩的溶液在冷的甲醇中再沉淀。此外，仅回收沉淀物，然后真空干燥，获得了5mg PHA。
通过按照与实施例1所述相同的方法进行的GPC分析测定由此获得的PHA的分子量。结果是Mn＝118000，且Mw＝262000。按照与实施例1所述相同的方法进行的PHA的1H-NMR分析的结果证实了所得PHA含有89％的3-羟基-5-(苯硫基)戊酸单元和包含具有4-12个碳原子的饱和或不饱和3-羟基链烷酸的其它单元。
实施例18制备含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器灭菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将菊苣假单胞菌YN2菌株接种到培养基中，通过以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动来进行培养。当培养基在600nm的浊度为0.1时，将二环丙基酮以0.05％(v/v)的比例加到培养基中，并充分搅拌。在摇动下继续培养14小时后，通过离心收集细胞。
然后，制备含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器灭菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例和二环丙基酮以0.05％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将收集的细胞再悬浮在该培养基中，通过以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动来进行培养。90小时后，通过离心收集细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥。
将冷冻干燥的离心团悬浮在20mL氯仿中，在60℃搅拌20小时以提取PHA。将所得提取物经由孔径为0.45μm的膜滤器过滤，用旋转蒸发仪浓缩，然后将浓缩的溶液在冷的甲醇中再沉淀。此外，仅回收沉淀物，然后真空干燥，获得了60mg PHA。
通过按照与实施例1所述相同的方法进行的GPC分析测定由此获得的PHA的分子量。结果是Mn＝110000，且Mw＝262000。按照与实施例1所述相同的方法进行的PHA的1H-NMR分析的结果证实了所得PHA含有78％的3-羟基-5-(苯硫基)戊酸单元和包含具有4-12个碳原子的饱和或不饱和3-羟基链烷酸的其它单元。
实施例19制备含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将菊苣假单胞菌YN2菌株接种到培养基中，以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动培养物。当培养基在600nm的浊度为0.1时，将二环丙基酮以0.05％(v/v)的比例加到培养基中，并充分搅拌。在摇动下继续培养14小时后，通过离心收集细胞。
然后，制备含有0.5％(w/v)葡萄糖、并且不含有作为氮源的NH4Cl的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器灭菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例和二环丙基酮以0.05％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将收集的细胞再悬浮在该培养基中，以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动培养物。90小时后，通过离心收集细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥。
将冷冻干燥的离心团悬浮在20mL氯仿中，在60℃搅拌20小时以提取PHA。将所得提取物经由孔径为0.45μm的膜滤器过滤，用旋转蒸发仪浓缩，然后将浓缩的溶液在冷的甲醇中再沉淀。此外，仅回收沉淀物，然后真空干燥，获得了8mg PHA。
通过按照与实施例1所述相同的方法进行的GPC分析测定由此获得的PHA的分子量。结果是Mn＝121000，且Mw＝278000。按照与实施例1所述相同的方法进行的PHA的1H-NMR分析的结果证实了所得PHA含有89％的3-羟基-5-(苯硫基)戊酸单元和包含具有4-12个碳原子的饱和或不饱和3-羟基链烷酸的其它单元。
实施例20
制备含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将菊苣假单胞菌YN2菌株接种到培养基中，之后通过以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动来进行培养。当培养基在600nm的浊度为0.1时，将二环丙基酮以0.05％(v/v)的比例加到培养基中，并充分搅拌。在摇动下继续培养14小时后，通过离心收集细胞。
然后，制备含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器灭菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例和二环丙基酮以0.05％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将收集的细胞再悬浮在该培养基中，通过以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动来进行培养。90小时后，通过离心收集细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥。
将冷冻干燥的离心团悬浮在20mL氯仿中，在60℃搅拌20小时以提取PHA。将所得提取物经由孔径为0.45μm的膜滤器过滤，用旋转蒸发仪浓缩，然后将浓缩的溶液在冷的甲醇中再沉淀。此外，仅回收沉淀物，然后真空干燥，获得了30mg PHA。
通过按照与实施例1所述相同的方法进行的GPC分析测定由此获得的PHA的分子量。结果是Mn＝122000，且Mw＝269000。按照与实施例1所述相同的方法进行的PHA的1H-NMR分析的结果证实了所得PHA含有72％的3-羟基-5-(苯硫基)戊酸单元和包含具有4-12个碳原子的饱和或不饱和3-羟基链烷酸的其它单元。
实施例21制备含有0.5％(w/v)多胨的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器灭菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将菊苣假单胞菌YN2菌株接种到培养基中，以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动培养物。将培养物继续摇动48小时后，通过离心收集细胞。
然后，制备含有0.5％(w/v)葡萄糖、并且不含作为氮源的NH4Cl的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器灭菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将收集的细胞再悬浮在该培养基中，以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动培养物。90小时后，通过离心收集细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥。
将冷冻干燥的离心团悬浮在20mL氯仿中，在60℃搅拌20小时以提取PHA。将所得提取物经由孔径为0.45μm的膜滤器过滤，用旋转蒸发仪浓缩，然后将浓缩的溶液在冷的甲醇中再沉淀。此外，仅回收沉淀物，然后真空干燥，获得了121mg PHA。
通过按照与实施例1所述相同的方法进行的GPC分析测定由此获得的PHA的分子量。结果是Mn＝121000，且Mw＝278000。按照与实施例1所述相同的方法进行的PHA的1H-NMR分析的结果证实了所得PHA含有94％的3-羟基-5-(苯硫基)戊酸单元和包含具有4-12个碳原子的饱和或不饱和3-羟基链烷酸的其它单元。
实施例22制备含有0.5％(w/v)多胨的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器灭菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将菊苣假单胞菌YN2菌株接种到培养基中，之后通过以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动来进行培养。将培养物继续摇动48小时后，通过离心收集细胞。
然后，制备含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器灭菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将收集的细胞再悬浮在该培养基中，之后通过以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动来进行培养。90小时后，通过离心收集细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥。
将冷冻干燥的离心团悬浮在20mL氯仿中，在60℃搅拌20小时以提取PHA。将所得提取物经由孔径为0.45μm的膜滤器过滤，用旋转蒸发仪浓缩，然后将浓缩的溶液在冷的甲醇中再沉淀。此外，仅回收沉淀物，然后真空干燥，获得了115mg PHA。
通过按照与实施例1所述相同的方法进行的GPC分析测定由此获得的PHA的分子量。结果是Mn＝121000，且Mw＝282000。按照与实施例1所述相同的方法进行的PHA的1H-NMR分析的结果证实了所得PHA含有93％的3-羟基-5-(苯硫基)戊酸单元和包含具有4-12个碳原子的饱和或不饱和3-羟基链烷酸的其它单元。
实施例23制备含有0.5％(w/v)多胨的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器灭菌的1-(苯硫基)戊烷0.1％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将菊苣假单胞菌YN2菌株接种到培养基中，以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动培养物。将培养物继续摇动48小时后，通过离心收集细胞。
然后，制备不含作为氮源的NH4Cl的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器灭菌的1-(苯硫基)戊烷0.1％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将收集的细胞再悬浮在该培养基中，以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动培养物。90小时后，通过离心收集细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥。
将冷冻干燥的离心团悬浮在20mL氯仿中，在60℃搅拌20小时以提取PHA。将所得提取物经由孔径为0.45μm的膜滤器过滤，用旋转蒸发仪浓缩，然后将浓缩的溶液在冷的甲醇中再沉淀。此外，仅回收沉淀物，然后真空干燥，获得了51mg PHA。
通过按照与实施例1所述相同的方法进行的GPC分析测定由此获得的PHA的分子量。结果是Mn＝119000，且Mw＝278000。按照与实施例1所述相同的方法进行的PHA的1H-NMR分析的结果证实了所得PHA含有96％的3-羟基-5-(苯硫基)戊酸单元和包含具有4-12个碳原子的饱和或不饱和3-羟基链烷酸的其它单元。
实施例24制备含有0.5％(w/v)多胨的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器灭菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将菊苣假单胞菌YN2菌株接种到培养基中，通过以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动来进行培养。当培养基在600nm的浊度为0.1时，将二环丙基酮以0.05％(v/v)的比例加到培养基中，并充分搅拌。在摇动下继续培养14小时后，通过离心收集细胞。
然后，制备含有0.5％(w/v)葡萄糖、并且不含作为氮源的NH4Cl的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器灭菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将收集的细胞再悬浮在该培养基中，之后通过以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动来进行培养。90小时后，通过离心收集细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥。
将冷冻干燥的离心团悬浮在20mL氯仿中，在60℃搅拌20小时以提取PHA。将所得提取物经由孔径为0.45μm的膜滤器过滤，用旋转蒸发仪浓缩，然后将浓缩的溶液在冷的甲醇中再沉淀。此外，仅回收沉淀物，然后真空干燥，获得了160mg PHA。
通过按照与实施例1所述相同的方法进行的GPC分析测定由此获得的PHA的分子量。结果是Mn＝140000，且Mw＝308000。按照与实施例1所述相同的方法进行的PHA的1H-NMR分析的结果证实了所得PHA含有85％的3-羟基-5-(苯硫基)戊酸单元和包含具有4-12个碳原子的饱和或不饱和3-羟基链烷酸的其它单元。
实施例25制备含有0.5％(w/v)多胨的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器灭菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将菊苣假单胞菌YN2菌株接种到培养基中，以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动培养物。当培养基在600nm的浊度为0.1时，将二环丙基酮以0.05％(v/v)的比例加到培养基中，并充分搅拌。将培养物继续摇动14小时后，通过离心收集细胞。
然后，制备含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器灭菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将收集的细胞再悬浮在该培养基中，之后通过以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动来进行培养。90小时后，通过离心收集细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥。
将冷冻干燥的离心团悬浮在20mL氯仿中，在60℃搅拌20小时以提取PHA。将所得提取物经由孔径为0.45μm的膜滤器过滤，用旋转蒸发仪浓缩，然后将浓缩的溶液在冷的甲醇中再沉淀。此外，仅回收沉淀物，然后真空干燥，获得了118mg PHA。
通过按照与实施例1所述相同的方法进行的GPC分析测定由此获得的PHA的分子量。结果是Mn＝138000，且Mw＝312000。按照与实施例1所述相同的方法进行的PHA的1H-NMR分析的结果证实了所得PHA含有93％的3-羟基-5-(苯硫基)戊酸单元和包含具有4-12个碳原子的饱和或不饱和3-羟基链烷酸的其它单元。
实施例26制备含有0.5％(w/v)多胨的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将菊苣假单胞菌YN2菌株接种到培养基中，通过以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动来进行培养。当培养基在600nm的浊度为0.1时，将二环丙基酮以0.05％(v/v)的比例加到培养基中，并充分搅拌。在摇动下继续培养14小时后，通过离心收集细胞。
然后，制备含有0.5％(w/v)葡萄糖、并且不含作为氮源的NH4Cl的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器灭菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将收集的细胞再悬浮在该培养基中，之后通过以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动来进行培养。90小时后，通过离心收集细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥。
将冷冻干燥的离心团悬浮在20mL氯仿中，在60℃搅拌20小时以提取PHA。将所得提取物经由孔径为0.45μm的膜滤器过滤，用旋转蒸发仪浓缩，然后将浓缩的溶液在冷的甲醇中再沉淀。此外，仅回收沉淀物，然后真空干燥，获得了160mg PHA。
通过按照与实施例1所述相同的方法进行的GPC分析测定由此获得的PHA的分子量。结果是Mn＝139000，且Mw＝309000。按照与实施例1所述相同的方法进行的PHA的1H-NMR分析的结果证实了所得PHA含有86％的3-羟基-5-(苯硫基)戊酸单元和包含具有4-12个碳原子的饱和或不饱和3-羟基链烷酸的其它单元。
实施例27制备含有0.5％(w/v)多胨的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将菊苣假单胞菌YN2菌株接种到培养基中，以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动培养物。当培养基在600nm的浊度为0.1时，将二环丙基酮以0.05％(v/v)的比例加到培养基中，并充分搅拌。将培养物继续摇动14小时后，通过离心收集细胞。
然后，制备含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器灭菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将收集的细胞再悬浮在该培养基中，之后通过以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动来进行培养。90小时后，通过离心收集细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥。
将冷冻干燥的离心团悬浮在20mL氯仿中，在60℃搅拌20小时以提取PHA。将所得提取物经由孔径为0.45μm的膜滤器过滤，用旋转蒸发仪浓缩，然后将浓缩的溶液在冷的甲醇中再沉淀。此外，仅回收沉淀物，然后真空干燥，获得了121mg PHA。
通过按照与实施例1所述相同的方法进行的GPC分析测定由此获得的PHA的分子量。结果是Mn＝141000，且Mw＝302000。按照与实施例1所述相同的方法进行的PHA的1H-NMR分析的结果证实了所得PHA含有85％的3-羟基-5-(苯硫基)戊酸单元和包含具有4-12个碳原子的饱和或不饱和3-羟基链烷酸的其它单元。
实施例28制备含有0.5％(w/v)多胨的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器灭菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将菊苣假单胞菌YN2菌株接种到培养基中，以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动培养物。将培养物继续摇动48小时后，通过离心收集细胞。
然后，制备含有0.5％(w/v)丙酮酸钠、并且不含作为氮源的NH4Cl的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器灭菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将收集的细胞再悬浮在该培养基中，通过以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动来进行培养。48小时后，通过离心收集细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥。
将冷冻干燥的离心团悬浮在20mL氯仿中，在60℃搅拌20小时以提取PHA。将所得提取物经由孔径为0.45μm的膜滤器过滤，用旋转蒸发仪浓缩，然后将浓缩的溶液在冷的甲醇中再沉淀。此外，仅回收沉淀物，然后真空干燥，获得了145mg PHA。
通过按照与实施例1所述相同的方法进行的GPC分析测定由此获得的PHA的分子量。结果是Mn＝135000，且Mw＝288000。按照与实施例1所述相同的方法进行的PHA的1H-NMR分析的结果证实了所得PHA含有72％的3-羟基-5-(苯硫基)戊酸单元和包含具有4-12个碳原子的饱和或不饱和3-羟基链烷酸的其它单元。
实施例29制备含有0.5％(w/v)多胨的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器灭菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将菊苣假单胞菌YN2菌株接种到培养基中，以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动培养物。当培养基在600nm的浊度为0.1时，将二环丙基酮以0.05％(v/v)的比例加到培养基中，并充分搅拌。将培养物继续摇动14小时后，通过离心收集细胞。
然后，制备含有0.5％(w/v)丙酮酸钠、并且不含作为氮源的NH4Cl的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器灭菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将收集的细胞再悬浮在该培养基中，通过以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动来进行培养。48小时后，通过离心收集细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥。
将冷冻干燥的离心团悬浮在20mL氯仿中，在60℃搅拌20小时以提取PHA。将所得提取物经由孔径为0.45μm的膜滤器过滤，用旋转蒸发仪浓缩，然后将浓缩的溶液在冷的甲醇中再沉淀。此外，仅回收沉淀物，然后真空干燥，获得了80mg PHA。
通过按照与实施例1所述相同的方法进行的GPC分析测定由此获得的PHA的分子量。结果是Mn＝129000，且Mw＝288000。按照与实施例1所述相同的方法进行的PHA的1H-NMR分析的结果证实了所得PHA含有81％的3-羟基-5-(苯硫基)戊酸单元和包含具有4-12个碳原子的饱和或不饱和3-羟基链烷酸的其它单元。
实施例30制备含有0.5％(w/v)多胨的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将菊苣假单胞菌YN2菌株接种到培养基中，以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动培养物。当培养基在600nm的浊度为0.1时，将二环丙基酮以0.05％(v/v)的比例加到培养基中，并充分搅拌。将培养物继续摇动14小时后，通过离心收集细胞。
然后，制备含有0.5％(w/v)丙酮酸钠、并且不含作为氮源的NH4Cl的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器灭菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例和二环丙基酮以0.05％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将收集的细胞再悬浮在该培养基中，以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动培养物。48小时后，通过离心收集细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥。
将冷冻干燥的离心团悬浮在20mL氯仿中，在60℃搅拌20小时以提取PHA。将所得提取物经由孔径为0.45μm的膜滤器过滤，用旋转蒸发仪浓缩，然后将浓缩的溶液在冷的甲醇中再沉淀。此外，仅回收沉淀物，然后真空干燥，获得了80mg PHA。
通过按照与实施例1所述相同的方法进行的GPC分析测定由此获得的PHA的分子量。结果是Mn＝131000，且Mw＝289000。按照与实施例1所述相同的方法进行的PHA的1H-NMR分析的结果证实了所得PHA含有80％的3-羟基-5-(苯硫基)戊酸单元和包含具有4-12个碳原子的饱和或不饱和3-羟基链烷酸的其它单元。
实施例31制备含有0.5％(w/v)多胨的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将菊苣假单胞菌YN2菌株接种到培养基中，通过以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动来进行培养。当培养基在600nm的浊度为0.1时，将二环丙基酮以0.05％(v/v)的比例加到培养基中，并充分搅拌。将培养物继续摇动14小时后，通过离心收集细胞。
然后，制备含有0.5％(w/v)丙酮酸钠、并且不含作为氮源的NH4Cl的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器灭菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例和二环丙基酮以0.05％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将收集的细胞再悬浮在该培养基中，通过以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动来进行培养。48小时后，通过离心收集细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥。
将冷冻干燥的离心团悬浮在20mL氯仿中，在60℃搅拌20小时以提取PHA。将所得提取物经由孔径为0.45μm的膜滤器过滤，用旋转蒸发仪浓缩，然后将浓缩的溶液在冷的甲醇中再沉淀。此外，仅回收沉淀物，然后真空干燥，获得了75mg PHA。
通过按照与实施例1所述相同的方法进行的GPC分析测定由此获得的PHA的分子量。结果是Mn＝131000，且Mw＝292000。按照与实施例1所述相同的方法进行的PHA的1H-NMR分析的结果证实了所得PHA含有78％的3-羟基-5-(苯硫基)戊酸单元和包含具有4-12个碳原子的饱和或不饱和3-羟基链烷酸的其它单元。
实施例32将在含有0.1％(w/v)壬酸的M9琼脂培养基上的YN2菌株的菌落悬浮在无菌生理盐水中，并将在600nm的浊度控制为1.0。将所得悬浮液铺在不含碳源并预先制备的40个M9琼脂培养基平板上，在壬烷气氛下于30℃进行静置培养。继续静置培养48小时后，收集细胞，然后悬浮在2ml生理盐水中。
然后，制备含有0.5％(w/v)葡萄糖、并且不含作为氮源的NH4Cl的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器灭菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将收集的细胞再悬浮在该培养基中，以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动培养物。90小时后，通过离心收集细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥。
将冷冻干燥的离心团悬浮在20mL氯仿中，在60℃搅拌20小时以提取PHA。将所得提取物经由孔径为0.45μm的膜滤器过滤，用旋转蒸发仪浓缩，然后将浓缩的溶液在冷的甲醇中再沉淀。此外，仅回收沉淀物，然后真空干燥，获得了10mg PHA。
通过按照与实施例1所述相同的方法进行的GPC分析测定由此获得的PHA的分子量。结果是Mn＝128000，且Mw＝282000。按照与实施例1所述相同的方法进行的PHA的1H-NMR分析的结果证实了所得PHA含有46％的3-羟基-5-(苯硫基)戊酸单元和包含具有4-12个碳原子的饱和或不饱和3-羟基链烷酸的其它单元。
实施例33将在含有0.1％(w/v)壬酸的M9琼脂培养基上的YN2菌株的菌落悬浮在无菌生理盐水中，并将在600nm的浊度控制为1.0。将所得悬浮液铺在不含碳源并预先制备的40个M9琼脂培养基平板上，在壬烷气氛下于30℃进行静置培养。培养48小时后，收集细胞，然后悬浮在2ml生理盐水中。
然后，制备含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器灭菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将收集的细胞再悬浮在该培养基中，通过以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动来进行培养。90小时后，通过离心收集细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥。
将冷冻干燥的离心团悬浮在20mL氯仿中，在60℃搅拌20小时以提取PHA。将所得提取物经由孔径为0.45μm的膜滤器过滤，用旋转蒸发仪浓缩，然后将浓缩的溶液在冷的甲醇中再沉淀。此外，仅回收沉淀物，然后真空干燥，获得了81mg PHA。
通过按照与实施例1所述相同的方法进行的GPC分析测定由此获得的PHA的分子量。结果是Mn＝131000，且Mw＝301000。按照与实施例1所述相同的方法进行的PHA的1H-NMR分析的结果证实了所得PHA含有15％的3-羟基-5-(苯硫基)戊酸单元和包含具有4-12个碳原子的饱和或不饱和3-羟基链烷酸的其它单元。
实施例34制备含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器灭菌的1-[(4-甲基苯基)硫基]戊烷以0.1％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将菊苣假单胞菌YN2菌株接种到培养基中，以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动培养物。将培养物继续摇动90小时后，通过离心收集细胞。
然后，制备含有0.5％(w/v)葡萄糖、并且不含作为氮源的NH4Cl的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器灭菌的1-[(4-甲基苯基)硫基]戊烷以0.1％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将收集的细胞再悬浮在该培养基中，以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动培养物。90小时后，通过离心收集细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥。
将冷冻干燥的离心团悬浮在20mL氯仿中，在60℃搅拌20小时以提取PHA。将所得提取物经由孔径为0.45μm的膜滤器过滤，用旋转蒸发仪浓缩，然后将浓缩的溶液在冷的甲醇中再沉淀。此外，仅回收沉淀物，然后真空干燥，获得了74mg PHA。
通过按照与实施例1所述相同的方法进行的GPC分析测定由此获得的PHA的分子量。结果是Mn＝72800，且Mw＝143000。按照与实施例1所述相同的方法进行的PHA的1H-NMR分析的结果证实了所得PHA含有40％的3-羟基-5-[(4-甲基苯基)硫基]戊酸单元和包含具有4-12个碳原子的饱和或不饱和3-羟基链烷酸的其它单元。
实施例35制备含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器灭菌的1-(苯硫基)庚烷以0.1％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将菊苣假单胞菌YN2菌株接种到培养基中，通过以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动来进行培养。在摇动下培养48小时后，通过离心收集细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥。
将冷冻干燥的离心团悬浮在20mL氯仿中，在60℃搅拌20小时以提取PHA。将所得提取物经由孔径为0.45μm的膜滤器过滤，用旋转蒸发仪浓缩，然后将浓缩的溶液在冷的甲醇中再沉淀。此外，仅回收沉淀物，然后真空干燥，获得了84mg PHA。
通过按照与实施例1所述相同的方法进行的GPC分析测定由此获得的PHA的分子量。结果是Mn＝128000，且Mw＝294000。按照与实施例1所述相同的方法进行的PHA的1H-NMR分析的结果证实了所得PHA含有40％的3-羟基-5-(苯硫基)戊酸单元、17％的3-羟基-7-(苯硫基)庚酸单元和包含具有4-12个碳原子的饱和或不饱和3-羟基链烷酸的其它单元。
实施例36制备含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器灭菌的1-[(4-氟苯基)硫基]戊烷0.1％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将菊苣假单胞菌YN2菌株接种到培养基中，通过以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动来进行培养。在摇动下培养48小时后，通过离心收集细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥。
将冷冻干燥的离心团悬浮在20mL氯仿中，在60℃搅拌20小时以提取PHA。将所得提取物经由孔径为0.45μm的膜滤器过滤，用旋转蒸发仪浓缩，然后将浓缩的溶液在冷的甲醇中再沉淀。此外，仅回收沉淀物，然后真空干燥，获得了80mg PHA。
通过按照与实施例1所述相同的方法进行的GPC分析测定由此获得的PHA的分子量。结果是Mn＝118000，且Mw＝252000。按照与实施例1所述相同的方法进行的PHA的1H-NMR分析的结果证实了所得PHA含有76％的3-羟基-5-[(4-氟苯基)硫基]戊酸单元和包含具有4-12个碳原子的饱和或不饱和3-羟基链烷酸的其它单元。
实施例37制备含有0.5％(w/v)多胨的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器灭菌的1-[(4-氰基苯基)硫基]戊烷0.1％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将菊苣假单胞菌YN2菌株接种到培养基中，通过以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动来进行培养。在摇动下培养48小时后，通过离心收集细胞。
然后，制备含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器灭菌的1-[(4-氰基苯基)硫基]戊烷以0.1％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将收集的细胞再悬浮在该培养基中，以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动培养物。90小时后，通过离心收集细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥。
将冷冻干燥的离心团悬浮在20mL氯仿中，在60℃搅拌20小时以提取PHA。将所得提取物经由孔径为0.45μm的膜滤器过滤，用旋转蒸发仪浓缩，然后将浓缩的溶液在冷的甲醇中再沉淀。此外，仅回收沉淀物，然后真空干燥，获得了45mg PHA。
通过按照与实施例1所述相同的方法进行的GPC分析测定由此获得的PHA的分子量。结果是Mn＝68000，且Mw＝137000。按照与实施例1所述相同的方法进行的PHA的1H-NMR分析的结果证实了所得PHA含有12％的3-羟基-5-[(4-氰基苯基)硫基]戊酸单元和包含具有4-12个碳原子的饱和或不饱和3-羟基链烷酸的其它单元。
实施例38制备含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器灭菌的1-[(4-硝基苯基)硫基]戊烷以0.1％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将菊苣假单胞菌YN2菌株接种到培养基中，以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动培养物。将培养物继续摇动90小时后，通过离心收集细胞。
然后，制备含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器灭菌的1-[(4-硝基苯基)硫基]戊烷以0.1％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将收集的细胞再悬浮在该培养基中，通过以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动来进行培养。90小时后，通过离心收集细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥。
将冷冻干燥的离心团悬浮在20mL氯仿中，在60℃搅拌20小时以提取PHA。将所得提取物经由孔径为0.45μm的膜滤器过滤，用旋转蒸发仪浓缩，然后将浓缩的溶液在冷的甲醇中再沉淀。此外，仅回收沉淀物，然后真空干燥，获得了20mg PHA。
通过按照与实施例1所述相同的方法进行的GPC分析测定由此获得的PHA的分子量。结果是Mn＝68000，且Mw＝137000。按照与实施例1所述相同的方法进行的PHA的1H-NMR分析的结果证实了所得PHA含有5％的3-羟基-5-[(4-硝基苯基)硫基]戊酸单元和包含具有4-12个碳原子的饱和或不饱和3-羟基链烷酸的其它单元。
实施例39制备含有0.5％(w/v)多胨的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器灭菌的1-[(苯基甲基)硫基]戊烷以0.1％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将菊苣假单胞菌YN2菌株接种到培养基中，通过以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动来进行培养。培养48小时后，通过离心收集细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥。
将冷冻干燥的离心团悬浮在20mL氯仿中，在60℃搅拌20小时以提取PHA。将所得提取物经由孔径为0.45μm的膜滤器过滤，用旋转蒸发仪浓缩，然后将浓缩的溶液在冷的甲醇中再沉淀。此外，仅回收沉淀物，然后真空干燥，获得了61mg PHA。
通过按照与实施例1所述相同的方法进行的GPC分析测定由此获得的PHA的分子量。结果是Mn＝38000，且Mw＝75000。按照与实施例1所述相同的方法进行的PHA的1H-NMR分析的结果证实了所得PHA含有72％的3-羟基-5-[(苯基甲基)硫基]戊酸单元和包含具有4-12个碳原子的饱和或不饱和3-羟基链烷酸的其它单元。
实施例40制备含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器灭菌的1-[(苯基甲基)硫基]戊烷以0.1％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将菊苣假单胞菌YN2菌株接种到培养基中，通过以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动来进行培养。培养48小时后，通过离心收集细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥。
将冷冻干燥的离心团悬浮在20mL氯仿中，在60℃搅拌20小时以提取PHA。将所得提取物经由孔径为0.45μm的膜滤器过滤，用旋转蒸发仪浓缩，然后将浓缩的溶液在冷的甲醇中再沉淀。此外，仅回收沉淀物，然后真空干燥，获得了58mg PHA。
通过按照与实施例1所述相同的方法进行的GPC分析测定由此获得的PHA的分子量。结果是Mn＝29000，且Mw＝57000。按照与实施例1所述相同的方法进行的PHA的1H-NMR分析的结果证实了所得PHA含有81％的3-羟基-5-[(苯基甲基)硫基]戊酸单元和包含具有4-12个碳原子的饱和或不饱和3-羟基链烷酸的其它单元。
实施例41制备含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器灭菌的1-{[(4-氟苯基)甲基]硫基}戊烷以0.1％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将菊苣假单胞菌YN2菌株接种到培养基中，通过以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动来进行培养。培养48小时后，通过离心收集细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥。
将冷冻干燥的离心团悬浮在20mL氯仿中，在60℃搅拌20小时以提取PHA。将所得提取物经由孔径为0.45μm的膜滤器过滤，用旋转蒸发仪浓缩，然后将浓缩的溶液在冷的甲醇中再沉淀。此外，仅回收沉淀物，然后真空干燥，获得了80mg PHA。
通过按照与实施例1所述相同的方法进行的GPC分析测定由此获得的PHA的分子量。结果是Mn＝28000，且Mw＝55000。按照与实施例1所述相同的方法进行的PHA的1H-NMR分析的结果证实了所得PHA含有73％的3-羟基-5-{[(4-氟苯基)甲基]硫基}戊酸单元和包含具有4-12个碳原子的饱和或不饱和3-羟基链烷酸的其它单元。
实施例42
制备含有0.5％(w/v)多胨的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器灭菌的1-{[(4-氰基苯基)甲基]硫基}戊烷以0.1％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将菊苣假单胞菌YN2菌株接种到培养基中，以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动培养物。将培养物继续摇动48小时后，通过离心收集细胞。
然后，制备含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器灭菌的1-{[(4-氰基苯基)甲基]硫基}戊烷以0.1％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将收集的细胞再悬浮在该培养基中，以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动培养物。90小时后，通过离心收集细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥。
将冷冻干燥的离心团悬浮在20mL氯仿中，在60℃搅拌20小时以提取PHA。将所得提取物经由孔径为0.45μm的膜滤器过滤，用旋转蒸发仪浓缩，然后将浓缩的溶液在冷的甲醇中再沉淀。此外，仅回收沉淀物，然后真空干燥，获得了26mg PHA。
通过按照与实施例1所述相同的方法进行的GPC分析测定由此获得的PHA的分子量。结果是Mn＝32000，且Mw＝66000。按照与实施例1所述相同的方法进行的PHA的1H-NMR分析的结果证实了所得PHA含有12％的3-羟基-5-{[(4-氰基苯基)甲基]硫基}戊酸单元和包含具有4-12个碳原子的饱和或不饱和3-羟基链烷酸的其它单元。
实施例43制备含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器灭菌的1-{[(4-硝基苯基)甲基]硫基}戊烷以0.1％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将菊苣假单胞菌YN2菌株接种到培养基中，通过以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动来进行培养。培养90小时后，通过离心收集细胞。
然后，制备含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培养基，置于500mL摇瓶中，然后通过高压釜灭菌。将摇瓶冷却至室温后，将用滤器灭菌的1-{[(4-硝基苯基)甲基]硫基}戊烷0.1％(v/v)的比例加到该培养基中，并充分搅拌。然后将收集的细胞再悬浮在该培养基中，以125次冲程/分钟的速度在30℃摇动培养物。90小时后，通过离心收集细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥。
将冷冻干燥的离心团悬浮在20mL氯仿中，在60℃搅拌20小时以提取PHA。将所得提取物经由孔径为0.45μm的膜滤器过滤，用旋转蒸发仪浓缩，然后将浓缩的溶液在冷的甲醇中再沉淀。此外，仅回收沉淀物，然后真空干燥，获得了10mg PHA。
通过按照与实施例1所述相同的方法进行的GPC分析测定由此获得的PHA的分子量。结果是Mn＝26000，且Mw＝53000。按照与实施例1所述相同的方法进行的PHA的1H-NMR分析的结果证实了所得PHA含有5％的3-羟基-5-{[(4-硝基苯基)甲基]硫基}戊酸单元和包含具有4-12个碳原子的饱和或不饱和3-羟基链烷酸的其它单元。
虽然已经用优选的实施方案描述了本发明，但是应当理解，本发明不限于这些公开的实施方案。相反，包括在权利要求书实质和范围内的各种不同的变型和等同方案都包括在本发明范围内。权利要求书的范围与最宽的解释一致，这样包括所有这样的变型和等同结构以及功能。
权利要求
1.使用微生物制备聚羟基链烷酸酯的方法，所述方法包括将能够产生聚羟基链烷酸酯的微生物在包含至少一种选自式(1)所代表的取代的烷烃的原料化合物的培养基中培养，以产生在其分子中具有至少一个选自式(2)所代表的3-羟基取代的链烷酸酯单元的单元的聚羟基链烷酸酯R-(CH2)n-CH2-CH2-CH3(1)其中R代表含有取代的芳环的残基，且n代表1-8的任何整数； 其中R代表含有取代的芳环的残基，且m代表1-8的任何整数；其中在式(1)和(2)中，含有取代的芳环的残基R是至少一个选自下列的残基式(3)所代表的取代的苯硫基残基 其中R1代表芳环的取代基，并选自H原子、卤素原子、CN、NO2、CH3、C2H5、CH3CH2CH2、(CH3)2CH和(CH3)3C；和式(4)所代表的(取代的苯基甲基)硫基残基 其中R2代表芳环的取代基，并选自H原子、卤素原子、CN、NO2、CH3、C2H5、CH3CH2CH2、(CH3)2CH和(CH3)3C。
2.权利要求1的方法，其中式(1)中的n与式(2)中的m具有下述关系(1)m＝n-21...(1)其中1代表0≤1＜(1/2)n的任何整数。
3.权利要求1的方法，其中所述聚羟基链烷酸酯在其聚合物分子中具有式(2)所代表的单元以及式(5)所代表的3-羟基链烷酸单元和式(6)所代表的3-羟基烷-5-烯酸单元当中的至少一个 其中p代表0-8的任何整数，且p可以是一个或多个值， 其中q代表3-5的任何整数，且q可以是一个或多个值。
4.权利要求1的方法，其中所述聚羟基链烷酸酯的数均分子量为5000-1000000。
5.权利要求1的方法，其中还包括将微生物在含有二环丙基酮的培养基中培养的步骤。
6.权利要求1的方法，其中所述培养基含有多胨。
7.权利要求1的方法，其中所述培养基含有酵母提取物。
8.权利要求1的方法，其中所述培养基含有糖类。
9.权利要求8的方法，其中所述糖类是至少一种选自下列的化合物甘油醛、赤藓糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、甘油、赤藓醇、木糖醇、葡糖酸、葡糖醛酸、半乳糖醛酸、麦芽糖、蔗糖和乳糖。
10.权利要求1的方法，其中所述培养基含有有机酸或其盐。
11.权利要求10的方法，其中包含在培养基中的有机酸或其盐是至少一种选自下列的化合物丙酮酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸、琥珀酸及其盐。
12.权利要求1的方法，其中所述培养基含有氨基酸或其盐。
13.权利要求12的方法，其中所述包含在培养基中的氨基酸或其盐是至少一种选自下列的化合物谷氨酸、天冬氨酸及其盐。
14.权利要求1的方法，其中所述培养基含有具有4-12个碳原子的直链链烷酸或其盐。
15.权利要求1的方法，其中培养微生物的培养步骤包括以下两个步骤(1)将微生物在含有至少一种选自式(1)所代表的取代的烷烃的取代的烷烃和多胨的培养基中培养；和(2)将在步骤(1)中培养的微生物在含有至少一种选自式(1)所代表的取代的烷烃的取代的烷烃和有机酸或其盐的培养基中进一步培养。
16.权利要求1的方法，其中培养微生物的培养步骤包括以下两个步骤(3)将微生物在含有至少一种选自式(1)所代表的取代的烷烃的取代的烷烃和糖类的培养基中培养；和(4)将在步骤(3)中培养的微生物在含有至少一种选自式(1)所代表的取代的烷烃的取代的烷烃和糖类的培养基中进一步培养。
17.权利要求1的方法，其中培养微生物的培养步骤包括以下两个步骤(5)将微生物在含有至少一种选自式(1)所代表的取代的烷烃的取代的烷烃和多胨的培养基中培养；和(6)将在步骤(5)中培养的微生物在含有至少一种选自式(1)所代表的取代的烷烃的取代的烷烃和糖类的培养基中进一步培养。
18.权利要求15的方法，其中还包括将微生物在含有二环丙基酮的培养基中培养的步骤。
19.权利要求1的方法，其中所述微生物具有烷烃单加氧酶。
20.权利要求19的方法，其中所述微生物是菊苣假单胞菌YN2；FERM RP-7375。
全文摘要
本发明提供了有效地制备在其单体单元中具有芳族基团取代的残基的聚羟基链烷酸酯的方法。在使用微生物制备聚羟基链烷酸酯的方法中，将能够产生聚羟基链烷酸酯的微生物在包含至少一种选自式(1)所代表的取代的烷烃的原料化合物的培养基中培养，以产生在其分子中具有至少一个选自式(2)所代表的3－羟基取代的链烷酸酯单元的单元的聚羟基链烷酸酯R——(CH
文档编号C12P7/62GK1495215SQ0312327
公开日2004年5月12日 申请日期2003年4月25日 优先权日2002年4月26日
发明者见目敬, 须川悦子, 矢野哲哉, 今村刚士, 本间务, 哉, 士, 子 申请人:佳能株式会社