专利名称：一种应用微生物立体选择性转化制备光学纯苯基乙二醇的方法及其专用微生物的制作方法
技术领域：
一种应用微生物立体选择性转化制备光学纯苯基乙二醇的方法及其专用微生物，属于生物法拆分外消旋化合物技术领域。
背景技术：
光学纯苯基乙二醇，即(S)-苯基乙二醇，又可记作(S)-PED，不仅是液晶材料中不可缺少的重要手性添加剂，而且已成为制备具有光学活性的医药、农药和功能材料的重要中间体，开展苯基乙二醇拆分方法的研究极有意义。
手性化合物在人们生活中具有重要作用，由于两个对映体在药理、毒理及功能作用等各方面均有所不同，因此，制备光学纯的手性模块化合物在医药、农业、材料以及环保等领域都具有广泛的价值。
苯基乙二醇的化学结构为
由于苯基乙二醇结构中含有两个羟基，利用化学法制备光学纯苯基乙二醇需对羟基选择性保护，易生成其他衍生物，拆分难度较大，反应中所添加的手性催化剂和保护剂具有毒性，会对环境造成危害，因此利用生物法转化光学纯苯基乙二醇就成为研究的热点。
目前，国际上拆分外消旋化合物常见方法主要包括化学拆分法，色谱拆分法，液体膜拆分法和手性固体膜拆分的膜拆分法，和生物法。
表1几种常见拆分方法的比较
利用生物法转化制备光学纯的手性化合物具有反应条件温和，产物单一，立体选择性、区域选择性和化学选择性较高，并能完成一些化学合成难以进行的反应等优点。合成光学活性物质的生物转化反应大致可分为两类一类是把外消旋体拆分为两个具有光学活性的对映体；另一类是从外消旋或前手性的前体出发，通过催化反应得到不对称的光学活性产物。
90年代起国际上对微生物及酶拆分手性化合物进行大量的研究。酶由L-氨基酸构成，其活性中心构成了一个不对称环境，有利于对消旋体的识别，是一种高度手性的催化剂。其催化效率高，有较强的专一性。酶促拆分消旋体是比较理想的选择。利用完整细胞对外消旋化合物进行转化，可以获得光学纯对映体，在非水相及有机一水双相反应体系中，也可酶促转化制备光学纯化合物。
据报道，目前生物法制备光学纯苯基乙二醇的方法主要包括Aldo等利用脂肪酶催化不对称转酯拆分外消旋苯基乙二醇，酯化后产物组成比较复杂，经碱水解和酶水解后，得到产物(S)-PED，但产率最高只能达到50％；Andreas等利用甘油脱氢酶(GDH)催化不对称氧化还原，但反应需在体系中加入辅酶(NAD+)及其再生循环系统。
Kyoung等利用萘双氧化酶(NDO)选择性氧化苯乙烯，但所得产品光学纯度较低，仅为78.6％e.e.。
发明内容
(1)要解决的技术问题本发明的目的是提供一种微生物立体选择性转化制备光学纯苯基乙二醇的方法及其专用微生物。本发明目的不仅仅在于制备高光学纯度的苯基乙二醇，而是通过筛选寻找不同于以往研究的新菌种，从而考察在手性拆分方面微生物菌种的多样性。进而比较不同菌种在转化途径及反应机理上的差别。
(2)技术方案本发明首先从微生物出发，筛选能够高效转化外消旋苯基乙二醇的菌种。在此基础上，对该菌种的培养条件及不对称转化的反应条件进行优化，并考察该菌种来源的转化用粗酶的酶学性质，不对称转化的反应途径及机理。
设计该转化方法的途径如下
苯基乙二醇简称为PED一、外消旋PED转化用菌株的筛选培养基细菌培养基成分(g/100ml)葡萄糖05～2.5，肉膏0.5～2.0，蛋白胨0.5～2.0，酵母膏0.15～0.5，无机盐溶液3.5～7.0％(V/V)，pH6.0～7.5。
酵母培养基成分(g/100ml)葡萄糖3.5～5.0，酵母膏0.15～0.5，无机盐溶液7.5～10％(V/V)，pH6.0～7.5。
霉菌培养基成分(g/100ml)葡萄糖0.5～2.5，肉膏0.5～2.0，蛋白胨0.5～2.0，酵母膏0.15～0.5，无机盐溶液3.5～7.0％(V/V)，pH6.0～7.5。
无机盐溶液成分(g/100ml)(NH4)2HPO410～15，KH2PO45～10，MgSO4·7H2O0.5～1.8，NaCl 0.025～0.1，ZnSO4·7H2O 0.025～0.1，FeSO4·7H2O 0.025～0.1，CuSO4·5H2O 0.0025～0.01，MnSO4·4H2O 0.025～0.1。
主要试剂外消旋苯基乙二醇 购于北京化学试剂公司(R)-PED，(S)-PED，(R，S)-PED 购于美国Sigma-Aldrich公司菌种的培养菌种在装液量为10％的50ml摇瓶中于30℃、150rpm振荡培养48小时。培养结束后，将菌体离心并用生理盐水洗涤两次，收集细胞用于拆分反应。
微生物细胞的催化转化反应在2ml、0.1mol/L的磷酸钾缓冲溶液中(pH6.5)，加入0.2g菌体细胞及10mg外消旋苯基乙二醇，于30℃的恒温摇床上振荡反应48小时。反应后，混合物离心，取上清液用5ml乙酸乙酯萃取，得到的乙酸乙酯层用于分析。
上述反应进行12小时后的混合物经离心及乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层用于分析反应中间体。
(R)-PED和(S)-PED分析方法的确定(R)-PED、(S)-PED、(R，S)-PED标样在Chiralcel OB-H柱上通过手性固定相高效液相色谱(CSPHPLC)进行分析，(R)-PED的保留时间为13.9min，(S)-PED的保留时间为16.9min。所用高效液相色谱仪为HP1100，紫外检测器，手性柱Chiralcel OB-H(250×4.6mm)购于日本Daicel Chemical Ind.，Ltd.
确定具体色谱条件为手性柱Chiralcel OB-H(250×4.6mm)；流动相正己烷/异丙醇＝9/1；流速0.5ml/min；柱温30℃；柱压常压；紫外检测波长215nm；进样量5μl。
产物的光学纯度通过对映过量值(％e.e.)来评价。
(S)-PED ％e.e.＝[(Ss-SR)/(SS+SR)]×100％残余苯基乙二醇Residual(％)＝[(SS+SR)/S0]×100％产率yield(％)＝Residual×[1-(100-％e.e.)/200].
SS反应后(S)-对映体的峰面积；SR反应后(R)-对映体的峰面积；S0反应前(S)-和(R)-对映体的峰面积之和。
反应中间体的分析利用气相色谱质谱仪分析反应中间体。取反应12小时的样品，进行GC-MS分析，确定反应中间体的化学结构。所用气相色谱质谱仪Trace MS美国Finigon质谱公司出品。
GC-MS色谱条件为色谱柱ov17(30m×0.25mm×0.25μm)；起始温度60℃；终止温度240℃；程序升温速度10deg/min；停留时间15min；载气He；起始流速0.80ml/min。
经过对实验室保藏的包括细菌、酵母和霉菌等大量微生物进行筛选，从所得转化产物的光学纯度和产率两个方面考虑，选定二株菌种为催化转化反应用出发菌株。
Candida parapsilosis CCTCC M203011，产物(S)-PED，光学纯度为90～100％e.e.，产率为85～100％。Bacillus polymyxa CCTCC M203010，产物(S)-PED，光学纯度为90～100％e.e.，产率为45～50％。二、菌株的培养和产酶条件优化培养基成分优化分别考察了碳源、氮源、磷源对转化及菌体量的影响，并经过正交实验最终确定两株出发菌株1、近平滑假丝酵母C.parapsilosis CCTCC M203011培养基组成为(g/100ml)葡萄糖1～10，酵母膏0.1～3，(NH4)2HPO41.0～3.0，KH2PO40.1～1.5，MgSO4·7H2O0.01～0.25，NaCl 0.001～0.025，ZnSO4·7H2O 0.001～0.025，FeSO4·7H2O 0.001～0.025，CuSO4·5H2O 0.0001～0.025，MnSO4·4H2O 0.0001～0.025；培养条件优化分别考察了起始pH、装液量、温度、培养时间对转化及菌体量的影响。
最终确定了出发菌株C.parapsilosis CCTCC M203011培养条件为起始pH5.0～8.0，装液量5～30％，培养温度20～35℃，培养时间24～72小时。
2、或选用出发菌株多粘芽孢杆菌B.polymyxa CCTCC M203010培养基组成为(g/100ml)葡萄糖0.25～1，肉膏0.5～5，蛋白胨0.5～5，酵母膏0.1～1，(NH4)2HPO40.5～5，KH2PO40.15～0.5，MgSO4·7H2O 0.01～0.25，NaC1 0.005～0.05，ZnSO4·7H2O0.001～0.05，FeSO4·7H2O 0.001～0.05，CuSO4·5H2O 0.0001～0.005，MnSO4·4H2O0.0005～0.005；培养条件为起始pH6.5～8.0、装液量10～30％、培养温度25～35℃、培养时间24～72小时；优化后，C.parapsilosis CCTCC M203011转化产物(S)-PED的光学纯度为94～100％e.e.；B.polymyxa CCTCC M203010转化产物(S)-PED的光学纯度为94～100％e.e.。三、全细胞催化转化反应体系及反应条件的优化菌种的培养及全细胞的制备C.parapsilosis CCTCC M203011接种在装液量为5～30％的250ml摇瓶中于20～35℃、100～300rpm振荡培养24～72小时。B.polymyxa CCTCC M203010接种在装液量为10～30％的250ml摇瓶中于25～35℃、100～300rpm振荡培养24～72小时。培养结束后，将两菌株的菌体分别离心并用生理盐水洗涤两次，收集的细胞经冷冻干燥得到全细胞用于拆分反应。
微生物细胞的催化转化反应C.parapsilosis CCTCC M203011全细胞催化转化反应条件为细胞浓度1～15％(W/V)，底物浓度0.05～10％(W/V)，反应pH值5.0～8.0，反应温度20～40℃，反应时间24～72小时。
B.polymyxa CCTCC M203010全细胞催化转化反应条件为细胞浓度1～10％(W/V)，底物浓度0.05～10％(W/V)，反应pH值5.0～8.0，反应温度25～40℃，反应时间24～72小时。
通过对微生物细胞催化转化12小时的反应混合物进行GC-MS分析，发现除苯基乙二醇(保留时间9.85min)外，在9.00min还有另外一种物质存在并积累。通过对上述物质进行质谱分析，发现其分子离子为m/z 136.1，根据其碎片的结构可以确定该物质为β-羟基苯乙酮。因此，确定不对称转化外消旋苯基乙二醇的反应中间体为β-羟基苯乙酮。
考察转化反应过程，发现C.parapsilosis CCTCC M203011先将(R)-苯基乙二醇转化为中间体β-羟基苯乙酮，然后再将β-羟基苯乙酮不对称还原为(S)-苯基乙二醇。因此，反应后(S)-苯基乙二醇的含量高于反应前外消旋混合物中(S)-对映体的含量，产物的产率高于50％。而B.polymyxa CCTCC M203010将(R)-苯基乙二醇氧化转化为中间体β-羟基苯乙酮后不再被还原为(S)-苯基乙二醇。因此，反应后(S)-苯基乙二醇的含量保持基本不变，产率低于50％。
通过对立体选择性氧化还原酶粗酶酶学性质进行研究，认为来源于C.parapsilosis CCTCC M203011的氧化还原酶将(R)-苯基乙二醇不对称转化为(S)-苯基乙二醇的反应机理为在NADP+的存在下，先将(R)-苯基乙二醇选择性氧化为β-羟基苯乙酮，同时NADP+被还原为NADPH；然后在NADH的存在下，将中间体β-羟基苯乙酮不对称还原为(S)-苯基乙二醇，同时NADH被氧化为NAD+。
来源于B.polymyxa CCTCC M203010的氧化还原酶不对称转化(R)-苯基乙二醇的反应机理为在NAD+的存在下，只将(R)-苯基乙二醇选择性氧化为β-羟基苯乙酮，同时辅酶NAD+被还原为NADH。
C.parapsilosis CCTCC M203011氧化还原酶粗酶对5C的伯醇专一性较强。在包括仲醇和二元醇的手性醇中，对于二元醇的专一性较强。该酶催化氧化反应的pH值为pH8.0，温度为50℃。金属螯合剂及重金属离子会对该酶的活力产生抑制作用。
C.parapsilosis CCTCC M203011氧化还原酶粗酶催化还原反应时，对2-丁酮专一生较强。该酶催化还原反应的最适pH值为pH6.0，最适温度为40℃。
近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis CCTCC M203011)菌落形态为乳白色，表面光滑，有光泽，菌落不透明。菌体形态为卵圆形，细胞无性繁殖，芽殖，有时有假菌丝和有隔菌丝。生理生化特性为发酵葡萄糖，能利用D-半乳糖，D-木糖，L-阿拉伯糖，蔗糖，麦芽糖，海藻糖，甲基-a-D-比喃葡糖苷，松三糖，甘油，D-山梨醇，D-甘露醇，D-葡糖酸-1，5-内酯，2-酮-D-葡糖酸，琥珀酸，柠檬酸，乙醇作为唯一碳源，能利用乙胺，L-赖氨酸，尸胺作为唯一氮源。淀粉形成试验阴性，醋酸产生试验阴性，尿素水解试验阴性，重氮基蓝B反应阴性。最适生长温度30℃，最适起始作用pH6.5。该菌全细胞转化扁桃醇的最适温度33℃，最适作用pH6.5。
在NADP+的存在下，先将(R)-苯基乙二醇选择性氧化为β-羟基苯乙酮，同时NADP+被还原为NADPH；然后在NADH的存在下，将中间体β-羟基苯乙酮不对称还原为(S)-苯基乙二醇，同时NADH被氧化为NAD+。
多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa CCTCC M203010)菌落形态为不规则形态，边缘波状，表面光滑，有光泽，菌落不透明，表面无皱纹，灰色。菌体形态为短杆状，分布无规则，有端生芽孢，芽孢椭圆形，芽孢囊有膨大现象，革兰氏染色不定。生理生化特性为接触酶阳性，发酵葡萄糖产酸产气。最适生长温度33℃，最适起始作用pH7.0。该菌全细胞转化扁桃醇的最适温度33℃，最适作用pH7.0。在NAD+的存在下，将(R)-苯基乙二醇选择性氧化为β-羟基苯乙酮，同时辅酶NAD+被还原为NADH。
(3)有益效果本发明通过筛选得到两株转化效果较好的菌株，它们是Candidaparapsilosis CCTCC M203011和Bacillus polymyxa CCTCC M203010。
用该两株菌株进行不对称转化外消旋苯基乙二醇得到产物(S)-苯基乙二醇，光学纯度均为90-100％e.e.。
经培养基组成和培养条件优化后，所用菌株不对称转化外消旋苯基乙二醇，产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度还有所提高，确定了优化的培养基组成和培养条件。
确定该两株菌株全细胞不对称转化外消旋苯基乙二醇的反应体系及反应条件。
对该两株菌株的氧化还原酶粗酶的酶系性质进行了研究；研究了其不对称转化的反应途径及辅酶依赖性，探讨了转化反应机理。这些工作有助于了解外消旋化合物拆分的生物多样性，对于今后拆分专用酶源的开发和拆分方法的研究具有较为重要的意义。
生物材料样品保藏近平滑假丝酵母保藏日期2003年3月1日，保藏单位名称及简称中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号NO.M203011。
多粘芽孢杆菌保藏日期2003年3月1日，保藏单位名称及简称中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号NO.M203010。
具体实施例方式
实施例1采用近平滑假丝酵母C.parapsilosis CCTCC M203011全细胞催化转化在2ml、0.1mol/L的磷酸钾缓冲溶液中(pH6.5)，加入0.1g菌体细胞及16mg外消旋苯基乙二醇，于33℃的恒温摇床上振荡反应48小时，反应后，混合物离心。产物(S)-PED光学纯度98.80％e.e.，产率92.86％。
实施例2采用多粘芽孢杆菌B.polymyxa CCTCC M203010全细胞催化转化在2ml、0.1mol/L的磷酸钾缓冲溶液中(pH7.0)，加入0.16g菌体细胞及10mg外消旋苯基乙二醇，于33℃的恒温摇床上振荡反应60小时，反应后，混合物离心。产物(S)-PED光学纯度提高至95.61％e.e.，产率提高至47.98％。
权利要求
1.一种生物法制备光学纯苯基乙二醇的方法，其特征是出发菌株采用近平滑假丝酵母C.parapsilosis CCTCC NO.M203011经过菌株的培养和产酶条件的优化，菌种的培养及全细胞的制备，以外消旋苯基乙二醇为底物进行微生物细胞催化转化反应细胞浓度1～15％(W/V)，底物浓度0.05～10％(W/V)，反应pH值5.0～8.0，反应温度20～40℃，反应时间24～72小时。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是菌株的培养和产酶条件的优化培养基组成为(g/100ml)葡萄糖1～10，酵母膏0.1～3，(NH4)2HPO41.0～3.0，KH2PO40.1～1.5，MgSO4·7H2O 0.01～0.25，NaCl 0.001～0.025，ZnSO4·7H2O0.001～0.025，FeSO4·7H2O 0.001～0.025，CuSO4·5H2O 0.0001～0.025，MnSO4·4H2O0.0001～0.025；培养条件为起始pH5.0～8.0，装液量5～30％，培养温度20～35℃，培养时间24～72小时。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是菌种的培养及全细胞的制备C.parapsilosis CCTCC NO.M203011接种在装液量为5～30％的250ml摇瓶中于20～35℃、100～300rpm振荡培养24～72小时；培养结束后将菌株的菌体离心并用生理盐水洗涤两次，收集的细胞经冷冻干燥得到全细胞用于拆分反应。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是采用C.parapsilosis CCTCC M203011菌株全细胞不对称转化苯基乙二醇得到的(S)-苯基乙二醇光学纯度提高至90～100％e.e.，产率提高至85～100％。
5.一种如权利要求1生物法制备光学纯苯基乙二醇所用的菌种，为近平滑假丝酵母(Candida.Parapsilosis SYB-1)，其保藏编号为CCTCC NO.M203011。
6.一种生物法制备光学纯苯基乙二醇的方法，其特征是出发菌株采用多粘芽孢杆菌B.polymyxa CCTCC NO.M203010，经过菌株的培养和产酶条件的优化，菌种的培养及全细胞的制备，以外消旋苯基乙二醇为底物进行微生物细胞的催化转化反应细胞浓度1～10％(W/V)，底物浓度0.05～10％(W/V)，反应pH值5.0～8.0，反应温度25～40℃，反应时间24～72小时。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征是菌株的培养和产酶条件的优化培养基组成为(g/100ml)葡萄糖0.25～1，肉膏0.5～5，蛋白胨0.5～5，酵母膏0.1～1，(NH4)2HPO40.5～5，KH2PO40.15～0.5，MgSO4·7H2O 0.01～0.25，NaCl0.005～0.05，ZnSO4·7H2O 0.001～0.05，FeSO4·7H2O 0.001～0.05，CuSO4·5H2O0.0001～0.005，MnSO4·4H2O 0.0005～0.005；培养条件为起始pH6.5～8.0、装液量10～30％、培养温度25～35℃、培养时间24～72小时。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征是菌种的培养及全细胞的制备B.polymyxa CCTCC M203010接种在装液量为10～30％的250ml摇瓶中于25～35℃、100～300rpm振荡培养24～72小时；培养结束后将菌株的菌体离心并用生理盐水洗涤两次，收集的细胞经冷冻干燥得到全细胞用于拆分反应。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征是采用B.polymyxa CCTCC M203010菌株全细胞不对称转化苯基乙二醇得到的(S)-苯基乙二醇光学纯度提高至90～100％e.e.，产率提高至45～50％。
10.一种如权利要求6生物法制备光学纯苯基乙二醇所用的菌种，为多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa SYB-2)，其保藏编号为CCTCC，NO.M203010。
全文摘要
一种微生物立体选择性转化制备光学纯苯基乙二醇的方法及其专用微生物，属于生物法拆分外消旋化合物技术领域。本发明筛选得到两株菌株Candida parapsilosis CCTCCM203011和Bacillus polymyxa CCTCC M203010。用该两株菌株不对称转化外消旋苯基乙二醇得到产物(S)－苯基乙二醇，其光学纯度较高，均在90～100％e.e.。确定了优化的培养基组成和培养条件，其产物的光学纯度还有所提高。确定了该两株菌株全细胞不对称转化外消旋苯基乙二醇的反应体系和反应条件。本发明有助于了解外消旋化合物拆分的生物多样性，对于今后拆分专用酶源的开发和拆分方法的研究具有较为重要的意义。
文档编号C12N1/20GK1477203SQ03132140
公开日2004年2月25日 申请日期2003年6月27日 优先权日2003年6月27日
发明者徐岩, 王栋, 穆晓清, 聂尧, 徐 岩 申请人:江南大学