专利名称：一种厚垣孢轮枝孢液体发酵大量产生厚垣孢子的方法
技术领域：
本发明涉及一种厚垣孢轮枝孢液体发酵大量产生厚垣孢子的方法，属真菌学技术领域。
背景技术：
植物寄生线虫是一种世界范围内普遍发生的植物病害，每年对农作物造成巨大的损失。在线虫的生物防治中，厚垣孢轮枝孢是一类重要的真菌，目前利用厚垣孢轮枝孢研制开发的线虫生物制剂已经上市。本发明人前期申请的“一种微生物及其生产生物杀线虫制剂的方法”专利就是利用以厚垣孢轮枝孢为出发菌株，研制开发了一种防治根结线虫的生物农药，目前开发的产品一线虫必克已经大量上市。
在利用厚垣孢轮枝孢研制开发的线虫生物农药中，产生厚垣孢子的能力是非常重要的一个指标。因为研究发现厚垣孢子内含丰富的内源营养，可使其在土壤中定殖而不需添加外源营养。
厚垣孢子是侵染线虫最有效的接种体，其抗逆性大大高于分生孢子和菌丝体。因此，线虫生防制剂中，液体发酵大量产生厚垣孢子一直是本领域的技术关键。但在液体发酵生产中，大量产生的主要是芽生孢子和分生孢子，一般不产生厚垣孢子。在固体发酵中，可产生较多的厚垣孢子，但固体发酵又因难以实现工业化，生产规模小而限制其应用。世界上研究厚垣孢轮枝孢的权威，英国的Kerry曾指导他的学生对液体发酵产生厚垣孢子进行研究，但仍未突破。
参考文献Kerry B.R.A manual for research on Verticillium chlamydosporium，a potentialbiological control agent for root-knot nematodes.2002，IOBC/WPRS Publication，UK.1-8
发明内容
本发明的目的就是在前项发明的基础上，研究克服液体发酵不产生厚垣孢子的缺点，研究开发一厚垣孢轮枝孢液体发酵大量产生厚垣孢子的方法。
本发明通过在发酵过程中添加抑制剂，以及将液体发酵所用的液体菌种改为固体菌种两种方式，启动厚垣孢轮枝孢产生厚垣孢子的调控基因，创造大量产生厚垣孢子的条件，改变了常规下液体发酵不产生厚垣孢子的状况。本发明在现有设备条件下，只需通过改变接种及在培养基中添加抑制剂即可大量产生厚垣孢子，具有很大的实用价值。
本项发明采用的真菌为厚垣孢轮枝孢Verticillium chlamydosporium的ZK7菌株，该菌株已于1999年9月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号CGMCC NO.0418。以该菌研制开发的微生物杀线虫剂——线虫必克已获国家临时农药登记(登记号LS 20011571)和国家发明专利(专利号99117391.0)。
本发明的抑制剂由下述组分制成(用量为重量份，1份用量)40％甲基托布津1-4毫克50％多菌灵2-6毫克硅藻酸钠5-15毫克本发明抑制剂即用即配，每100毫升液体培养基用1份抑制剂。在配制液体培养基时加入，灭菌后使用。
固体菌种制备常规液体发酵生产中，其种子是试管、摇瓶、发酵罐逐级扩大的液体种。本发明利用固体发酵产生大量厚垣孢子，其控制厚垣孢子产生的基因已经开启，用固体发酵后获得的菌丝和孢子进行接种，将有利于液体发酵过程中产生厚垣孢子。
固体培养基配方为(以下为重量百分比)红薯粉20％，玉米粉15％，麸皮30％，玉米芯30％，过磷酸钙1％，碳酸钙1％，豆饼粉3％，pH自然，含水量60％。
培养基配制好后，按1∶0.2的比例(体积比)与40目细沙混合，装入三角瓶中灭菌，然后接入培养好试管种，于22℃下培养15-20天获得固体菌种，然后按5-10％比例接入到液体发酵培养基中。
具体实施例方式以下是本发明的具体实施例，但本发明的内容并不局限于此。
实施例一1、固体菌种制备将红薯粉100克，玉米粉75克，麸皮150克，玉米芯150克，过磷酸钙5克，碳酸钙5克，豆饼粉15克充分混合后加入清水，水份为60％。按1∶0.2的比例(体积比)与40目细沙混合后，装入三角瓶中120℃灭菌40分钟，然后接入培养好试管种V.chlamydosporium ZK7，于22℃下培养18天获得固体菌种。
2、抑制剂制备(按培养基10000毫升配制100份抑制剂)
40％甲基托布津250毫克，50％多菌灵450毫克，硅藻酸钠1000毫克，充分混合后待用。
3、制备本发明的生防制剂10000毫升PDA中添加120克糖蜜、30克硫酸铵，40克氯化钠，10克硫酸二氢钾，20克柠檬酸三钠，80克蔗糖，80毫升甘油。再加入上述2配制的抑制剂，灭菌后接入上述1配制的固体菌种。28℃下，摇床(转速170rpm)培养10天，从第3天起每天镜检发酵液1次，观察其厚垣孢子形成的情况。
另外，采用上述液体培养基配方配制500毫升培养基，不加抑制剂，接入液体菌种作对照。
4、产生厚垣孢子的结果从第3天开始用显微镜观察菌丝变化和产孢情况，镜检结果清楚表明，从3天本发明产品部份菌丝开始膨大，逐步形成厚垣孢子，到第7天达到高峰，同时基本不形成分生孢子；而对照则始终未出现菌丝膨大现象，从第4天开始形成分子孢子，未见厚垣孢子。
镜检结果同时观察到，本发明产品产生厚垣孢子的过程是首先菌丝局部膨大，然后形成厚垣孢子，而所形成的厚垣孢子相互粘在一起形成串。对照菌丝始终是光滑，并可见大量分生孢子。
表1厚垣孢子产生情况 注因厚垣孢子成串难以计数，故用描述记载实施例二1、固体菌种制备与实施例1相同。
2、抑制剂制备(按培养基10000毫升计配制100份抑制剂)40％甲基托布津100毫克，50％多菌灵200毫克，硅藻酸钠500毫克，充分混合后待用。
3、制备本发明的生防制剂10000毫升PDA中添加120克糖蜜、30克硫酸铵，40克氯化钠，10克硫酸二氢钾，20克柠檬酸三钠，80克蔗糖，80毫升甘油。再加入上述2配制的抑制剂，按与实施例1相同的方法，灭菌接种后培养，镜检观察其厚垣孢子形成的情况。
另外，采用上述液体培养基配方配制500毫升培养基，不加抑制剂，接入液体菌种作对照。
4、产生厚垣孢子的结果镜检结果表明，第3天无论是本发明产品还是对照，未见菌丝膨大，第4天后开始观察到本发明产品已有菌丝开始膨大，逐步形成厚垣孢子，随后几天能镜检观察到厚垣孢子，但厚垣孢子的数量低于实施例1；而对照则始终未出现菌丝膨大现象，从第4天开始形成分子孢子，未见厚垣孢子。
实施例三1、固体菌种制备与实施例1相同2、抑制剂制备(按培养基10000毫升计配制100份抑制剂)40％甲基托布津400毫克，50％多菌灵600毫克，硅藻酸钠1500毫克，充分混合后待用。
3、制备本发明的生防制剂10000毫升PDA中添加120克糖蜜、30克硫酸铵，40克氯化钠，10克硫酸二氢钾，20克柠檬酸三钠，80克蔗糖，80毫升甘油。再加入上述2配制的抑制剂，按与实施例1相同的方法，灭菌接种后培养，镜检观察其厚垣孢子形成的情况。
另外，采用上述液体培养基配方配制500毫升培养基，不加抑制剂，接入液体菌种作对照。
4、产生厚垣孢子的结果镜检结果表明，从第4天后开始观察到本发明产品菌丝膨大并逐步形成厚垣孢子，但厚垣孢子的数量比较少，低于实施例1；而对照则始终未出现菌丝膨大现象，从第4天开始形成分子孢子，未见厚垣孢子。
权利要求
1.一种厚垣孢轮枝孢液体发酵大量产生厚垣孢子的方法，按现有方法制备，其特征在于液体发酵采用的菌种为固体菌种；在液体发酵生产生物制剂中，在液体培养基中添加抑制剂；其中1.1、固体菌种培养基配方为红薯粉20％，玉米粉15％，麸皮30％，玉米芯30％，过磷酸钙1％，碳酸钙1％，豆饼粉3％，pH自然，含水量60％；按体积比1∶0.2的比例添加40目细沙；1.2、抑制剂的配方为40％甲基托布津1-4毫克、50％多菌灵2-6毫克、硅藻酸钠5-15毫克。
全文摘要
本发明涉及一种厚垣孢轮枝孢液体发酵大量产生厚垣孢子的方法，属真菌学技术领域。本发明在前期技术的基础上，通过将液体菌种改变为固体菌种，同时添加由甲基托布津、多菌灵、硅藻酸钠组成的抑制剂，创造了有利于厚垣孢轮枝孢Verticillium chlamydosporium的ZK7菌株产生厚垣孢子的条件，生产了大量产生厚垣孢子的线虫生防菌剂，而厚垣孢子将有利于提高和稳定其对线虫的防效。
文档编号C12N1/38GK1513975SQ0313513
公开日2004年7月21日 申请日期2003年6月3日 优先权日2003年6月3日
发明者莫明和, 张克勤, 周薇 申请人:云南大学