专利名称：Sars冠状病毒的假病毒及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及SARS冠状病毒的假病毒及其制备方法，本发明还涉及SARS冠状病毒的假病毒在进行SARS冠状病毒中和抗体研究及药物筛选研究方面的用途。
背景技术：
在开展疾病防治的研究工作中，如寻找病原体的受体、研究该病原体的致病机理，以及寻找抗体、研制疫苗和筛选对抗药物时，往往需要利用该疾病的病原体进行研究。在传染病的研究，尤其是烈性传染病的研究中，直接研究病原体具有极大的危险性，不适于迅速开展大规模的药物筛选和科学实验。因此在传染病的研究中，假病毒技术是一种非常有效的研究手段。已有不少成功制备假病毒的报道，如HIV、Marburg和Ebo1a病毒等。
SARS冠状病毒是引起2003年在我国和世界范围内爆发的“非典型肺炎”的病原体，目前对SARS病毒的研究主要依赖活病毒体外培养。已知“非典型肺炎”具有高度传染性，且病死率较高，直接用SARS冠状病毒开展研究具有相当大的危险性，且需要苛刻的实验条件。因此研制SARS冠状病毒的假病毒感染模型非常必要和急需。
发明内容
本发明的目的是建立安全、可靠、高效的体外研究SARS侵染宿主细胞的感染模型，即制备出SARS冠状病毒的假病毒。
本发明提供的SARS冠状病毒的假病毒是
SARS病毒的囊膜蛋白SPIKE参与到带有报告基因的缺损型病毒基因组的包装中而得到的SARS冠状病毒假颗粒；所述报告基因可以是GFP，EGFP，YFP，RFP，BFP，AP，SEAP，Luc，LacZ等；所述缺损型病毒基因组或其一部分可以来源于VSV，HIV，SARS，Mulv，HTLV，SIV以及其它病毒；所述缺损型病毒基因组中所包含的一个或多个结构基因可以去除；所述缺损型病毒基因组中所包含的一个或多个结构基因可以受到调控而失活；所述SARS冠状病毒假颗粒可以在带有或不带有报告基因序列的情况下包括一段或一段以上编码生物活性物质的外源序列。
本发明提供的假病毒的囊膜表面带有SARS病毒的囊膜蛋白，而囊膜内则是其它病毒的带有报告基因的缺损型基因组和结构蛋白。用本发明制备的SARS假病毒颗粒感染SARS易感细胞，能在细胞内表达缺损型病毒基因组所携带的报告基因，检测报告基因的表达量就可定量判断假病毒的感染效率。
经实验证明，SARS恢复期病人血清中存在SARS病毒的中和抗体能有效阻断本发明所制备的SARS冠状病毒的假病毒对靶细胞的感染，使GFP阳性细胞数明显下降。由此证实本发明得到的SARS冠状病毒的假病毒能够作为行之有效的检测手段，用于SARS中和抗体的研究。此外，利用本发明提供的SARS冠状病毒的假病毒还可以检测药物对SARS感染的阻断活性。
本发明提供的SARS冠状病毒的假病毒制备方法是1.质粒一的制备将SARS囊膜蛋白SPIKE的基因插入真核细胞表达质粒中；2.质粒二的制备将某一病毒基因组中的囊膜蛋白基因去除或使其表达失活，并且使该病毒基因组带有报告基因；3.将含有SARS囊膜蛋白的质粒一、含有携带报告基因的缺损型的其它病毒基因组的质粒二转染到包装细胞系中，30～60小时后收集细胞上清，然后从中提取并纯化所得的SARS假病毒颗粒。
所述包装细胞包括BHK21，293T，293，293GP，Cos，3T3，Hela等来源真核生物的传代细胞系。
所述转染的方法可以是磷酸钙转染法、脂质体转染法、电转染法等。
可将所述两个质粒或其分解后的部分共转染或将两个质粒或其分解后的部分先后分步转染。分步转染可以先将含有缺损型病毒基因组的假病毒包装扩增后再感染转染有质粒一或其分解后部分的细胞。
所述纯化方法是超速离心。
本发明提供的一个制备SARS冠状病毒的假病毒的实例是用磷酸钙转染法，将含有受调控的SARS病毒囊膜蛋白基因Spike序列的质粒一转染到BHK21细胞系中；用磷酸钙转染法，将含有除去G蛋白的VSV病毒基因组序列并含有Egfp报告基因序列的质粒二和表达VSV其他结构基因的质粒共转染BHK21细胞系，使其包装为囊膜带有G蛋白的假病毒并进行扩增培养；将扩增培养所得的病毒感染转染有质粒一的BHK21细胞系；收获囊膜蛋白为SPIKE的SARS假病毒颗粒。
在此实例中，SARS病毒的囊膜蛋白参与到带有报告基因Egfp的缺损G蛋白基因的VSV病毒基因组的包装中，制备出SARS冠状病毒假颗粒。
本发明的优点是SARS病毒的假病毒不具有复制能力，也不会引起SARS导致的特异性的细胞病变，因此可以最大程度降低SARS病毒研究过程中的各种风险。由于假病毒的亲噬性和感染过程与真病毒相同，因此可以模拟病毒感染的早期过程，而且假病毒内携带有报告基因，可以非常方便地快速地进行各种检测和分析，因此假病毒不仅可以用来研究病毒与宿主细胞的关系，克隆细胞表面受体，更重要的是可以用于筛选抗病毒药物、测定感染者体内的中和抗体的效价、寻找SARS病毒表面抗原上中和抗体结合的表位，评价疫苗免疫的效果，是研究烈性传染病病毒安全有效的重要途径。
假病毒感染模型的建立将为寻找SARS病毒的受体，研究该病毒的侵染机理，寻找抗病毒的药物，研究抗病毒的中和抗体和疫苗提供了新的简便的实验方法。
利用这一模型研究SARS病毒侵染宿主细胞的全过程和阻断这一过程的途径，从而为大规模的体外药物筛选提供简便安全的方法。
具体实施例方式
实施例1 SARS病毒SPIKE蛋白基因的克隆和修饰1.SARS病毒样本的总RNA的提取(1)用1ml trizol(GIBCO)抽提含有SARS病毒样本；(2)加200μl氯仿，剧烈振荡15秒；(3)室温静置3-5min，10000g 4℃离心15min；(4)吸出500μl水相，转移到新管中；(5)加入500μl异丙醇，充分振荡混匀；室温静置10min；(6)10000g 4℃离心10min，得到SARS病毒RNA沉淀。
2.SARS病毒SPIKE蛋白基因的克隆
(1)将SARS病毒RNA基因组反转录为DNA反转录引物SPIKE蛋白antisense primer反转录酶MMLV-RT(promega)(2)通过PCR方法扩增出SPIKE的DNA序列。
扩增引物Sense5′-cgggatccaacgaacatgtttattttcttattatttc-3′antisense5′-cggaattcgtttatgtgtaatgtaatttgacaccc-3′(3)将PCR产物连接到pcDNA 3.1+载体中连接方式BamHI，EcoRI双切连接。
3.将SARS病毒SPIKE蛋白表达载体的构建(1)将SARS病毒S蛋白的胞外区(SARS S)对应氨基酸14-1195序列前连接VSV G蛋白的信号肽(G SP)后面连接VSV G蛋白的跨膜区和胞内区(G TMC)中间连接的酶切位点是XhoI-(G SP)-EcoRI-(SARS S)-XbaI-(G-TMC)-NheI(2)插入到载体的XhoI和XbaI位点间。
载体是pSK-Ter，即在pSK+的XbaI和SacI位点间插入了T7的Terminator序列。
实施例2 VSVΔG*-G病毒的制备1.VSV印第安那株来源于北京大学生命科学院2.构建VSVΔG*-G病毒相关载体(1)按PNAS(1995)V92 p4477-81的方法，去除VSV载体上的G蛋白，构建成带有GFP作为报告基因的VSVΔG*载体；
(2)将VSV上的L，N，P，M，G五个蛋白分别克隆到“pBluescriptSKII+”(Clonetech)载体上。分别将这五个载体称作pSKL，pSKN，pSKP，pSKM，pSKG。
3.VSVΔG*-G病毒的制备(1)用VTF7-3转染BHK21细胞VTF7-3来源于PNAS(1986)，v83，p8122-8126；(2)磷酸钙法将如下六个质粒共转染事先经VTF7-3感染的BHK21细胞pSKL，pSKN，pSKP，pSKM，pSKG，pVΔG GFP培养体系为10CMDish中加DMEM+10％FCS 10ml；(3)48小时收集上清，12000转10分钟离心去除细胞碎片。
4.VSVΔG*-G病毒的扩增(1)用pSKG转染BHK21细胞；(2)用3(3)中得到的上清感染事先转染了pSKG的BHK21细胞培养体系为10CMDish中加DMEM+10％FCS10ml；(3)24小时后收集上清。
实施例3SARS假病毒VSVΔG*-S的制备1SARS假病毒的制备(1)用pSKG转染BHK21细胞；(2)用4(3)中得到的病毒上清感染事先转染了pSKG的BHK21细胞；培养体系为10CMDish中加DMEM+10％FCS10ml。
(3)18-40小时后收集上清。
实施例4 SARS假病毒的鉴定取150微升含有SARS假病毒VSVΔG*-S的上清液感染已知的SARS易感细胞VeroE6和非易感细胞Hep2。
(1)培养体系为10CMDish中加DMEM+10％FCS10ml，12-14小时后计算靶细胞GFP阳性细胞数，取VSVΔG*-G病毒为阳性对照；取无囊膜蛋白的VSVΔG*病毒作为对照。
(2)结果见下表SARS假病毒产毒实验结果
结果从上表中可看出，本发明提供的带有SARS囊膜蛋白的假病毒能够有效感染SARS病毒易感细胞系VeroE6，但未感染对SARS病毒不敏感的Hep2细胞系。这说明SARS冠状病毒的假病毒与真病毒有着相同的感染模式，利用SARS冠状病毒的假病毒研究SARS真病毒对宿主细胞的侵染是可行的和有效的。
实施例5利用SARS冠状病毒的假病毒检测SARS中和抗体的活性。
一、实验方法1、将SARS恢复期病人的血清以1∶20稀释。
2、将SARS冠状病毒的假病毒的浓度配制为每微升10IU(IU为感染单位，即病毒感染产生的GFP阳性细胞数)。
3、将20微升假病毒和1∶20稀释后的血清100微升在37℃孵育30分钟后，加入24孔板中的VeroE6细胞培养体系中，细胞汇合度为20％，培养体系500微升DMEM+10％FCS。
4、14小时后计算GFP阳性细胞数量。
二、实验结果SARS恢复期病人血清中存在SARS病毒的中和抗体能有效阻断本发明所制备的SARS冠状病毒的假病毒对靶细胞的感染，使GFP阳性细胞数明显下降。实验数据见下表SARS冠状病毒的假病毒对靶细胞的感染率
三、结论本发明得到的SARS冠状病毒的假病毒能够作为行之有效的检测手段，用于SARS中和抗体的研究。
实施例6利用假病毒检测药物对SARS感染的阻断活性一、实验方法1、将大肠杆菌表达的多肽药物样品按比例稀释。
序列如下ISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGK2、将SARS冠状病毒的假病毒的浓度配制为每微升10IU(感染单位)。
3、将20微升假病毒和1∶20稀释后的血清100微升在37℃孵育30分钟后，加入24孔板中的VeroE6细胞培养体系中，细胞汇合度为20％，培养体系500微升DMEM+10％FCS。
4、添加系列浓度的多肽样品检测其阻断假病毒感染的能力。
5、14小时后计算GFP阳性细胞数量。
二、实验结果该多肽的浓度为30nM时，对假病毒阻断率为50％。
三、结论受试多肽药物可以有效地阻断SARS冠状病毒的假病毒感染靶细胞，由此证实本发明所得到的SARS冠状病毒的假病毒能够作为行之有效的检测手段，用于SARS阻断药物的研究。
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
权利要求
1.SARS冠状病毒的假病毒，其特征是，将SARS病毒的囊膜蛋白SPIKE参与到带有报告基因的缺损型病毒基因组的包装中而得到的SARS冠状病毒假颗粒；所述报告基因是GFP，EGFP，YFP，RFP，BFP，AP，SEAP，Luc，LacZ等；所述缺损型病毒基因组或其一部分来源于VSV，HIV，SARS，Mulv，HTLV，SIV以及其它病毒。
2.权利要求1所述的SARS冠状病毒的假病毒，其特征是，所述缺损型病毒基因组中所包含的一个或多个结构基因可以去除。
3.权利要求1所述的SARS冠状病毒的假病毒，其特征是，所述缺损型病毒基因组中所包含的一个或多个结构基因可以受到调控而失活。
4.权利要求1、2或3所述的SARS冠状病毒的假病毒，其特征是，可以在带有或不带有报告基因序列的情况下包括一段或一段以上编码生物活性物质的外源序列。
5.权利要求4所述的SARS冠状病毒的假病毒，其特征是，所述缺损型病毒基因组是除去G蛋白的VSV病毒基因组。
6.权利要求4所述的SARS冠状病毒的假病毒，其特征是，所述报告基因是含有Egfp的报告基因。
7.权利要求1-6任一所述的SARS冠状病毒的假病毒的制备方法，其特征是，1)质粒一的制备将SARS囊膜蛋白SPIKE的基因插入真核细胞表达质粒中；2)质粒二的制备将某一病毒基因组中的囊膜蛋白基因去除或使其表达失活，并且使该病毒基因组带有报告基因；3)将含有SARS囊膜蛋白的质粒一、含有携带报告基因的缺损型的其它病毒基因组的质粒二转染到包装细胞系中，30～60小时后收集细胞上清，然后从中提取并纯化所得的SARS假病毒颗粒；所述包装细胞是来源于真核生物的传代细胞系，包括BHK21，293T，293，293GP，Cos，3T3，Hela。
8.权利要求7所述的SARS冠状病毒的假病毒的制备方法，其特征是，所述转染的方法是磷酸钙转染法、脂质体转染法、电转染法。
9.权利要求7所述的SARS冠状病毒的假病毒的制备方法，其特征是，所述包装细胞是BHK21细胞系。
10.权利要求1所述的SARS冠状病毒的假病毒作为检测手段进行SARS冠状病毒中和抗体研究的用途。
11.权利要求1所述的SARS冠状病毒的假病毒作为检测手段进行SARS冠状病毒药物筛选研究的用途。
全文摘要
本发明涉及SARS冠状病毒的假病毒及其制备方法和用假病毒进行SARS冠状病毒中和抗体及药物筛选研究方面的用途。所述假病毒是将SARS病毒的囊膜蛋白SPIKE参与到带有报告基因的缺损型病毒基因组的包装中而得到的。所述假病毒的制备方法是将含有SARS囊膜蛋白的质粒一、含有携带报告基因的缺损型的其它病毒基因组的质粒二转染到包装细胞系中，30～60小时后收集细胞上清，然后从中提取并纯化所得的SARS假病毒颗粒。假病毒感染模型的建立为寻找SARS病毒的受体，研究该病毒的侵染机理，寻找抗病毒的药物，研究抗病毒的中和抗体和疫苗效果评价提供了新的简便的实验方法。
文档编号C12N15/63GK1552851SQ03138168
公开日2004年12月8日 申请日期2003年6月6日 优先权日2003年6月6日
发明者邓宏魁, 丁明孝, 聂玉春, 史萱铃, 王葳, 凌晨, 王在, 于翔, 任立晨 申请人:北京大学